CN101135666B - 基于线粒体dna c3970t单核苷酸多态性检测高原肺水肿易感性的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于线粒体DNA C3970T单核苷酸多态性检测高原肺水肿易感性的试剂盒，其特征是该试剂盒包括以下分离包装的试剂：试剂一，引物混合液；试剂二，PCR反应混合液；试剂三，3970位点单核苷酸多态性C对照DNA；试剂四，3970位点单核苷酸多态性T对照DNA；试剂五，探针混合液；试剂六，连接反应混合液；试剂七，电泳混合液。本发明使用简单，操作方便，检测快速，能用于平原人进入高原前对高原肺水肿易感者的筛选，指导HAPE的预防和治疗，减轻急性重症高原病的威胁，有利于进入高原人群健康。

Description

基于线粒体DNA C3970T单核苷酸多态性检测高原肺水肿易感性的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种疾病检测用的试剂盒，具体涉及基于线粒体DNA C3970T单核苷酸多态性检测高原肺水肿易感性的试剂盒。

背景技术

平原人进入高原后将面临因高原缺氧导致的急性高原病的威胁，特别是由于急性重症高原病的发病率和病死率高，后果严重。高原肺水肿(highaltitude pulmonary edema，HAPE)是一种特发于高原低氧环境的肺水肿，起病急，进展快，危害大，如果救治不及时，可在较短的时间内发展至呼吸衰竭，甚至死亡，是严重威胁进入高原人群健康和生命的急性重症高原病。调查表明，在进入海拔3700m以上高原的人群中，高原肺水肿的发病率高达0.4％-2％。HAPE发病的种族特异性以及家族和个体易感倾向提示，环境因素和遗传因素均可以影响HAPE的发生，而机体对环境因素的易感性也受遗传因素的影响。近年来，遗传因素在HAPE发病机制中的作用逐渐受到重视【张雪峰，高原施工人群急性重型高原病患病率调查，高原医学杂志，2005；15(3)：7-8；陈有，高原肺水肿发病机制研究进展，高原医学杂志，2005，15(2)：62-64；高钰琪，高原肺水肿的发病机制及防治，人民军医，2005；482(2)：108-111】。

由于线粒体是动物细胞内唯一含有DNA和蛋白质合成系统的细胞器，是氧传送链的生理终点站，是细胞氧耗的主要位点，是一个细胞氧易感性和适应的自然选择者，因此关于线粒体适应的研究逐渐成为热点(高文祥，低氧大鼠脑线粒体体外转录活性的研究，《中国应用生理学杂志》2001；17：323-326)。HAPE是一种低氧习服不良的急性高原病，因而线粒体在HAPE的发生中发生着重要的作用。单核苷酸多态性(SNP)，是广泛分布于人类全基因组中稳定的多态位点，代表了不同个体之间最大的遗传差异。随着人类基因组计划的进展，人们愈来愈相信基因组中的这类多态性有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病的易感性、以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。

LDR(连接酶检测反应)是一种经济、快速的检测SNP常用的方法，其检测原理是：利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别，高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行。测序分型原理如下：

(1)本技术方案先通过PCR(聚合酶链反应)获得含有待检测突变位点的基因片断，然后进行LDR，最后通过测序仪电泳读取检测结果；

(2)检测结果表明，左边位点，即突变位点一为A/C杂合子，右边位点，即突变位点二为T纯合子(见图1)。

LDR与传统的SNP分型手段相比，LDR技术有多项优势：

(1)准确度高：与PCR等技术的假阴性假阳性相比，LDR技术可以比较准确的对SNP进行分型；

(2)操作简单：和目前的PCR技术相似，LDR反应操作简单，对技术人员没有特殊的专业要求；

(3)成本低：使用LDR检测系统只需现有的PCR仪等分子实验室仪器即可，无需再投入大量的资金购置设备；

(4)通用性强：成熟的LDR检测系统适用于各种SNP位点的分型；

(5)高通量：LDR检测系统可同时对多达上百个SNP位点进行分型，检测效率高，满足复杂疾病及药物基因组学的诊断需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于线粒体DNA C3970T单核苷酸多态性检测高原肺水肿易感性的试剂盒，能用于高原肺水肿(简称HAPE)易感者的筛选，指导HAPE的预防。

发明人根据LDR的检测原理，对206例汉族HAPE患者和144例汉族健康对照的线粒体DNA(mtDNA)的3970位点SNP进行对比分析，探讨mtDNA C3970T与HAPE的相关性，寻找出了敏感可信的HAPE易感生物遗传标记。步骤是先通过对26例汉族无关个体的mtDNA的全长扩增，测序，初步提示mtDNA的3970位点为汉族人mtDNA的SNP高频位点。然后利用mtDNA的10398位点多态性，通过RFLP(限制性片断长度多态性)将所有标本分为单倍群M和N。再通过PCR-LDR反应(聚合酶链反应-连接酶检测反应)在单倍群M和N中检测mtDNAC3970T单核苷酸多态性频率。在单倍群N中，该位点3970C在HAPE病例组频率为71.6％，在对照组频率为37.5％(P＝0.000)。结论：在单倍群N中，3970C是HAPE发病的危险因素，可以作为HAPE的遗传标志之一。因此，基于该SNP位点，可以设计适当长度的引物与探针，用于PCR-LDR检测高原肺水肿的易感性。

本发明所述的基于线粒体DNA C3970T单核苷酸多态性检测高原肺水肿易感性的试剂盒，其特征是该试剂盒包括以下分离包装的试剂：

试剂一，引物混合液，序列如下：

上游引物HP6-F：5’-ACGTTGCCGAAGGGGAGTCCGAACT-3’；

下游引物HP6-R：5’-GTTCAGGGGAGAGTGCGTCAAATGTTGTTC-3’；

试剂二，PCR反应混合液；

试剂三，线粒体DNA的3970位点单核苷酸多态性C对照DNA，浓度为50ng/μl；

试剂四，线粒体DNA的3970位点单核苷酸多态性T对照DNA，浓度为50ng/μl；

试剂五，探针混合液，三种探针序列如下：

①P6-F：

5’-GGCGAAGGGGCCTGCGGCGTATTCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’，为荧光物FAM标记；

②P6-D1：线粒体DNA的3970位点为单核苷酸多态性C：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGTATTCGGCTATGAAGAATAG-3’；

③P6-D2：线粒体DNA的3970位点为单核苷酸多态性T：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGTATTCGGCTATGAAGAATAA-3’；

试剂六，连接反应混合液；

试剂七，电泳混合液。

所述的基于线粒体DNA C3970T单核苷酸多态性检测高原肺水肿易感性的试剂盒，其特征是：

试剂一，引物混合液100μl；上游引物和下游引物各50μl混合，浓度均为10pmol/μl；

试剂二，PCR反应混合液1000μl；成分有1×PCR buffer，2.0mMMgCl2，200mM dNTPs，1U Taq酶，余量为蒸馏水；

试剂三，线粒体DNA的3970位点单核苷酸多态性C对照DNA 50μl，浓度为50ng/μl；

试剂四，线粒体DNA的3970位点单核苷酸多态性T对照DNA 50μl，浓度为50ng/μl；

试剂五，探针混合液120μl，三种探针各40μl混合，该三种探针浓度均为12.5pmol/ul；

试剂六，连接反应混合液100μl；成分有pH 7.6的20mM Tris-HCl，25mM醋酸钾，10mM醋酸镁，10mM二硫苏糖醇，lmM氧化型辅酶I，0.1％TritonX-100，0.5μl Taq DNA连接酶，余量为蒸馏水；

试剂七，电泳混合液100μl；荧光物质l×ROX和上样缓冲液6×loadingbuffer各为50μl。

本发明能用于平原人进入高原前对高原肺水肿易感者的筛选，指导HAPE的预防和治疗，减轻急性重症高原病的威胁，有利于进入高原人群健康；该试剂盒使用简单，操作方便，检测快速。

附图说明

图1LDR分型原理。

图2线粒体DNA3970位点为单核苷酸多态性C。

图3线粒体DNA3970位点为单核苷酸多态性T。

具体实施方式

本发明所述的基于线粒体DNA C3970T单核苷酸多态性检测高原肺水肿易感性的试剂盒，包括以下分离包装的试剂：

试剂一，引物混合液100μl；上游引物和下游引物各50μl混合，浓度均为10pmol/μl，序列如下：

上游引物HP6-F：5’-ACGTTGCCGAAGGGGAGTCCGAACT-3’；

下游引物HP6-R：5’-GTTCAGGGGAGAGTGCGTCAAATGTTGTTC-3’；

试剂二，PCR反应混合液1000μl；成分有1×PCR buffer，2.0mMMgCl₂，200mM dNTPs，1U Taq酶，余量为蒸馏水；

试剂三，3970位点单核苷酸多态性C对照DNA50μl，浓度为50ng/μl；

试剂四，3970位点单核苷酸多态性T对照DNA50μl，浓度为50ng/μl；

试剂五，探针混合液120μl；三种探针各40μl混合，该三种探针浓度均为12.5pmol/ul，探针序列如下：

①P6-F：

5’-GGCGAAGGGGCCTGCGGCGTATTCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’，为荧光物FAM标记；

②P6-D1：线粒体DNA的3970位点为单核苷酸多态性C：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGTATTCGGCTATGAAGAATAG-3’；

③P6-D2：线粒体DNA的3970位点为单核苷酸多态性T：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGTATTCGGCTATGAAGAATAA-3’；

试剂六，连接反应混合液100μl；成分有pH 7.6的20mM Tris-HCl，25mM醋酸钾，10mM醋酸镁，10mM二硫苏糖醇，1mM氧化型辅酶I，0.1％TritonX-100，0.5μl Taq DNA连接酶，余量为蒸馏水；

试剂七，电泳混合液100μl；荧光物质1×ROX和上样缓冲液6×loadingbuffer各为50μl。

该试剂盒的所有试剂和耗材均能在上海生工生物技术服务有限公司，宝生物工程(大连)有限公司等国内试剂公司购买到，引物与探针也可按照以上序列在上述生物公司合成。

该试剂盒的使用说明：

第一步，采用上海生工生物技术服务有限公司UNIQ-10柱式临床样品基因组抽提试剂盒(货号SK1342)提取待测个体静脉血液中白细胞基因组总DNA，然后用紫外分光光度仪对DNA进行定量；

第二步，PCR反应体系配制，共配制三管；

第一管为待测样本，取待测个体的DNA 0.5μl，试剂一1μl，试剂二18.5μl，混匀；

第二管为3970位点单核苷酸多态性C对照，取试剂三0.5μl，试剂一1μl，试剂二18.5μl，混匀；

第三管为3970位点单核苷酸多态性T对照，取试剂四0.5μl，试剂一1μl，试剂二18.5μl，混匀；

第三步，将第二步的三管已经混匀的物质分别放入PCR仪中，均按以下条件进行PCR反应：94℃变性15分钟→94℃变性30秒→65℃退火1分钟→64℃延伸1分钟→94℃变性30秒→65℃退火1分钟→64℃延伸1分钟→94℃变性30秒→65℃退火1分钟→64℃延伸1分钟......，其中94℃变性30秒→65℃退火1分钟→64℃延伸1分钟循环35次，最后64℃终末延伸10min，得到三管PCR产物；

第四步，用3％琼脂糖凝胶电泳(电压80V，电泳时间40分钟)检查第三步所得的三管PCR产物，片断长度均为165bp；

第五步，又取三只PCR管，每管均加入试剂五1μl，试剂六1.15μl，然后每管分别加入第三步所得的三管PCR产物各7.85μl，混匀；当mtDNA为3970C时，探针长度47bp，为3970T时，探针长度50bp；

第六步，将第五步三管混匀物分别放入PCR仪，进行LDR连接反应，LDR反应程序均为，95℃2分钟→94℃30秒→60℃2分钟→94℃30秒→60℃2分钟→94℃30秒→60℃2分钟......，其中94℃30秒→60℃2分钟共循环15次，得到3管连接产物；

第七步，分别从第六步所得3管连接产物中各取2μl，均各与试剂七的2μl混匀；在3730测序仪上进行测序电泳，电泳时电压为3KV，电泳时间1.5小时；

第八步，结果通过Genemapper软件进行数据分析，连接产物长度为94bp时为单核苷酸多态性C，参见图2；连接产物长度为97bp时为单核苷酸多态性T，参见图3。当结果如图2所示时，为HAPE易感个体。

Claims (1)

1.基于线粒体DNA C3970T单核苷酸多态性检测高原肺水肿易感性的试剂盒，其特征是该试剂盒包括以下分离包装的试剂：

试剂一，引物混合液，序列如下：

上游引物HP6-F：5’-ACGTTGCCGAAGGGGAGTCCGAACT-3’；

下游引物HP6-R：5’-GTTCAGGGGAGAGTGCGTCAAATGTTGTTC-3’；

引物混合液100μl；HP6-F上游引物和HP6-R下游引物各50μl混合，浓度均为10pmol/μl；

试剂二，PCR反应混合液，体积1000μl；成分有1×PCR buffer，2.0mM MgCl₂，200mM dNTPs，1U Taq酶，余量为蒸馏水；

试剂三，线粒体DNA的3970位点单核苷酸多态性C对照DNA 50μl，浓度为50ng/μl；

试剂四，线粒体DNA的3970位点单核苷酸多态性T对照DNA 50μl，浓度为50ng/μl；

试剂五，探针混合液，体积120μl，三种探针各40μl混合，该三种探针浓度均为12.5pmol/ul；三种探针序列如下：

①P6-F：

5’-GGCGAAGGGGCCTGCGGCGTATTCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’，为荧光物RAM标记；

②P6-D1：线粒体DNA的3970位点为单核苷酸多态性C：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGTATTCGGCTATGAAGAATAG-3’；

③P6-D2：线粒体DNA的3970位点为单核苷酸多态性T：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGTATTCGGCTATGAAGAATAA-3’；

试剂六，连接反应混合液，体积100μl；成分有pH 7.6的20mM Tris-HCl，25mM醋酸钾，10mM醋酸镁，10mM二硫苏糖醇，1mM氧化型辅酶I，0.1％Triton X-100，0.5μl Taq DNA连接酶，余量为蒸馏水；

试剂七，电泳混合液，体积100μl；荧光物质1×ROX和上样缓冲液6×loading buffer各为50μl。

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