CN1490609A - 实时荧光pcr检测牛羊源性成分探针序列及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于检测牛、羊源性成分的实时荧光PCR探针序列和试剂盒，给出检测牛、羊线粒体DNA基因的探针序列(包括最大、最小及优选序列)，按探针序列生产制成的试剂盒，用于牛、羊源性成分的定性和定量检测。本发明采用的实时荧光PCR技术采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性。该技术巧妙地运用了PCR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，使得本方法具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。
Description
所属技术领域
本发明涉及基因的扩增与检测，特别涉及牛、羊源性成份的实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检测探针序列及试剂盒。
背景技术
欧洲自1996年发生和传播疯牛病(Bovine SpongiformEncephalopathy，BSE)后，在国际上引起了广泛的重视。由于该病的发展与人类健康密切相关，科学界对此进行了大量和深入地研究。现已证实，疯牛病的病原体是一种“朊蛋白”，它导致绵羊患上一种被称“痒病”的慢性神经机能病，痒病传播到牛身上即导致了疯牛病。由于疯牛病至今尚无有效的治疗方法，免疫接种也不能预防这类疾病，因此许多国家陆续制定政策和法规，采取紧急措施，开展对疯牛病的普查和监测，加强对疯牛病的预防控制和管理，禁止从疯牛病疫区的国家或地区进口含牛、羊成份的制品(如饲料、血液制品、化妆品等)，以防范疯牛病的传入或控制其蔓延。
目前，动物源性成份的检测鉴别方法有物理、化学、免疫学和分子生物学方法(即聚合酶链式反应，PCR法)。其中尤其以分子生物学方法最为快速、灵敏。PCR方法又分为定性PCR和定量PCR方法。定性PCR已广泛应用于基于核酸的研究和临床诊断等领域，但这种检测方法依赖于不同程度的PCR后处理，容易因污染而产生假阳性，凝胶电泳使用的染色剂溴化乙锭(EB)为强烈的致癌物质，若操作不当，会危害实验人员的健康。
发明内容
本发明的目的旨在克服现有定性PCR技术的不足而提供一种高特异性、高灵敏性和高精确性、闭管检测、操作快速重现性好、抗污染且进一步降低假阳性率的牛、羊源性成份的实时荧光PCR检测探针序列和试剂盒。
本发明的原理是在定量PCR体系中，不仅有两条普通的引物，而且还加有一条荧光标记探针。这条探针的5’端和3’端分别标记了荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)。当这条探针保持完整时，R基团的荧光信号被Q基团所淬灭；一旦探针被切断，淬灭作用消失，R基团的荧光信号就可以被检测到。荧光的强度与PCR成正相关，收集荧光信号，从而可以检测出待测样品的初始拷贝数，判定待测样品中是否含有牛、羊源性成份。还可通过加入一系列已知浓度梯度的标准样品，建立标准曲线，还可对待测样品中的牛、羊成份进行定量检测。
本发明的目的是这样实现的：
所有探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团，两者可构成能量传递结构。
用于检测牛源性成份的荧光PCR检测探针的优选序列是：5’-caatccagaactgacaccaac-3’，该探针的最大序列是：5’-cttttatcacaatccagaactgacaccaacaaaaatat-3’，该探针最小序列是：5’-ccagaactgacacc-3’。按上述探针序列生产制成的用于检测牛源性成份的实时荧光PCR检测试剂盒。
用于检测羊源性成份的荧光PCR检测探针的优选序列是：5’-tgtcctttggtgttatgaat-3’，该探针的最小序列是：5’-ctttggtgttat-3’，该探针用于检测山羊成份的最大序列是：5’-gttcatgtttgtcctttggtgttatgaatacttattatt-3’，用于检测绵羊成份的最大序列是：5’-ctcatgtctgtcctttggtgttatgaatgctcattatt-3’。按上述探针序列生产制成的用于检测羊源性成份的实时荧光PCR检测试剂盒。
本发明的优点是：实时荧光PCR采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性。该技术巧妙地运用了PCR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，使得本方法具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。
用于检测牛、羊成份的实时荧光PCR探针序列即可用于定性检测，又可用于定量检测。当作定性检测时，以阳性对照物为准，判定结果为阴性(未检出)或阳性(检出)；当作定量检测时，通过已知含量的标准样品，建立标准曲线，即可定量检测。
具体实施方式
实施例1
用于检测牛源性成份的实时荧光PCR检测的探针序列和试剂盒，检测牛源性成份。
检测基因：牛线粒体DNA。
引物序列：上游5’-gccatatactctccttggtgaca-3’，下游5’-gtaggcttgggaatagtacga-3’。
探针序列：5’-caatccagaactgacaccaac-3’。
试剂盒：应用该探针序列制成的用于检测牛源性成份的试剂盒。
实施例2
用于检测羊源性成份的实时荧光PCR检测的探针序列和试剂盒，检测羊源性成份。
检测基因：羊线粒体DNA。
引物序列：上游 5’-tattaggcctcccccttgtt-3’，下游5’-ccctgctcataagggaatagcc-3’。
探针序列：5’-tgtcctttggtgttatgaat-3’。
试剂盒：应用该探针序列制成的用于检测牛源性成份的试剂盒。
检测主要仪器：超净工作台、消毒灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机、低温冰箱，冷藏冷冻冰箱、纯水器、双蒸水器、旋涡震荡器、微量进样器(0.5μL，2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL)等。
检测主要试剂：10×PCR缓冲液、MgCl2、dNTP(dATP、dUTP、dCTP、dGTP)、UNG酶(Uracil N-glycosylase)、Taq酶、引物和探针(按探针序列制成试剂盒)等。
提取DNA：
(1)试剂盒法：按说明书操作步骤进行。
(2)SDS法：称2g样品于10ml离心管中，加入8m110％SDS和10ul/ml蛋白酶K提取液，56℃振荡消化1hr。2000rpm离心5min；取离心上清液，加等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混匀，静置5min；8000rpm离心5min；小心取离心上清液，加等体积氯仿/异戊醇(24∶1)混匀，静置5min；8000rpm离心理5min；取离心上清液加0.65倍体积的异丙醇，混匀，12000rpm4℃离心10min；弃去上清液，加500ul70％冰乙醇；12000rpm4℃离心5min；取沉淀，吹干(37℃约10 min)。加50ulddH2O溶解白色沉淀，此即为总DNA抽提物。4℃过夜，或37℃保温1hr后直接用于PCR或电泳测试。
实时荧光PCR检验所用引物和探针序列如实施例1、2所述。
实时荧光PCR反应体系：
| 试剂名称 | 终浓度 |
| 10×PCR反应缓冲液 | 1× |
| MgCl2 | 2.5mmol/L |
| dNTPs(含dUTP) | 0.2mmol/L |
| UNG酶 | 0.075U |
| 引物(上游) | 0.2μmol/L |
| 引物(下游) | 0.2μmol/L |
| 探针 | 0.1μmol/L |
| Taq酶 | 2.5U |
| DNA模板(20ng～30ng/μL) | 5μL |
| 补水至 | 50μL |
| 注：表中DNA模板为原料的模板量，加工产品可视加工程度适当增加模板量。 | |
实时荧光定量PCR的反应参数为：50℃/2min，预变性95℃/10min；95℃/15s，60℃/1min，40个循环(注：不同仪器应将反应参数作适当调整)。
Claims (4)
1、用于牛源性成份检测的荧光PCR检测探针序列，其特征是：该探针的优选序列是：5’-caatccagaactgacaccaac-3’，探针的最大序列是：5’-cttttatcacaatccagaactgacaccaacaaaaatat-3’，探针的最小序列是：5’-ccagaactgacacc-3’。
2、用于羊源性成份检测的荧光PCR检测探针序列，其特征是：该探针的优选序列是：5’-tgtcctttggtgttatgaat-3’，最小序列是：5’-ctttggtgttat-3’；用于检测山羊源性成份的荧光PCR探针的最大序列是：5’-gttcatgtttgtcctttggtgttatgaatacttattatt-3’，用于检测绵羊源性成份的荧光PCR探针的最大序列是：5’-ctcatgtctgtcctttggtgttatgaatgctcattatt-3’。
3、根据权利要求1、2、所述的用于牛、羊源性成份实时荧光PCR检测的探针序列，其特征是：荧光报告基团标记在探针的5′端，荧光淬灭基团标记在探针的3′端，两者可构成能量传递结构。
4、根据权利要求1、2和3所述的探针序列，其特征是：可以制成用于牛、羊源性成份实时荧光PCR检测的试剂盒。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA021349541A CN1490609A (zh) | 2002-10-15 | 2002-10-15 | 实时荧光pcr检测牛羊源性成分探针序列及试剂盒 |
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN1490609A true CN1490609A (zh) | 2004-04-21 |
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ID=34146026
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|---|---|---|---|
| CNA021349541A Pending CN1490609A (zh) | 2002-10-15 | 2002-10-15 | 实时荧光pcr检测牛羊源性成分探针序列及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1490609A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101135666B (zh) * | 2007-10-01 | 2010-04-21 | 中国人民解放军第三军医大学 | 基于线粒体dna c3970t单核苷酸多态性检测高原肺水肿易感性的试剂盒 |
| CN106520914A (zh) * | 2015-09-11 | 2017-03-22 | 中国检验检疫科学研究院 | 用于羊源性成分精准定量检测的引物探针、试剂盒及方法 |
| CN108456736A (zh) * | 2018-05-11 | 2018-08-28 | 北华大学 | 牛脊髓dna鉴定试剂盒及鉴定方法 |
| CN108531618A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-09-14 | 贵州省产品质量监督检验院 | 检测畜类源性成分的三重荧光pcr引物探针组、试剂盒及检测方法 |
-
2002
- 2002-10-15 CN CNA021349541A patent/CN1490609A/zh active Pending
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