CN1309842C - 用于转基因油菜(籽)实时pcr检测的引物序列和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
用于转基因油菜(籽)SYBRGreen实时PCR检测的引物序列和试剂盒，给出检测转基因油菜(籽)RT73品系外源结构基因、MS8品系外源结构基因和FatA内源基因的引物序列，最大、最小及优选序列，按引物序列制成的试剂盒，用于转基因产品定量检测和定性检测，具有灵敏度高、避免交叉污染造成假阳性的优点。SYBRGreen实时PCR技术采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性。SYBRGreen染料在PCR反应中所要求的极端温度下同样十分稳定，可有效区别特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体，以弥补其特异性差，检测技术快速和敏感，使得本方法具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。
Description
(一)技术领域：
本发明涉及基因的扩增与检测。
(二)背景技术：
随着转基因产品不断商品化，其安全性问题一直被世人关注，并不断发生争议。为了保障人类的身体健康，消除消费者顾虑，有利于国际贸易和商品流通，以欧盟为代表的很多国家，在经历了短暂的争议后，对此类特殊产品都制定出安全管理条例，以便严格管理。欧洲、日本等多国还制定了相应的限量法规。我国农业部也于今年出台了转基因产品的管理办法。然而，要使消费者了解或接受转基因产品，各项法规能得以实施，除了给以相关信息及增加透明度外，关键问题是能够有相应的科学检测方法来分析与鉴别传统产品与转基因产品。尤其面对国内外贸易中对转基因产品的限量要求，更应有相应的、准确地定量方法对转基因产品，尤其是转基因食品进行定性、定量检测。在目前国内外常用的转基因产品的检测方法中，主要是以核酸为基础的PCR检测方法。PCR方法又分为定性PCR和定量PCR方法。定性PCR，即聚合酶链式反应PCR已广泛应用于基于核酸的各个研究和临床诊断等领域，该方法使用两段(约17～20多个核苷酸)寡核苷酸作为反应的引物，这两段寡核苷酸引物的序列应不发生互补作用。但它们可和称为模板的待测DNA两条链上在一定的位点分别发生互补。反应液包括含有镁离子的反应缓冲液、4种单核苷酸dNTP、模板DNA及引物。在DNA聚合酶催化下，通过温度的变化，DNA变性及退火，而合成两个互补位点之间的DNA片断。这样的反应反复进行，使第一个循环产生的DNA片断得以扩增。经25～30个循环，扩增倍数达106。用该方法检测转基因产品整个过程繁杂，操作步骤多，而且需要PCR后处理，如琼脂糖凝胶电脉和溴化乙锭染色，紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或银染检测，不仅需要多种仪器，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程又给污染和假阳性提供了机会，严重影响对结果的正确判断。
(三)发明内容：
本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种用于转基因油菜(籽)实时PCR检测的引物序列和试剂盒，用于转基因产品定量检测的引物也可以对转基因产品进行定性检测，灵敏度高、避免交叉污染造成假阳性，使检测方法操作简单、省时省力、结果可靠。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：用于转基因油菜(籽)实时PCR检测的引物序列，用于检测转基因油菜(籽)RT73品系外源结构基因的上游引物序列是：5’-cca tat tga cca tca tact ca ttg ct-3’，该引物的最小序列是：5’-cca tca tact-3’；下游引物序列是：5’-gct tat acg aag gca agaaaa gga-3’，该引物的最小序列是：5’-aag gca a-3’。
用于检测转基因油菜(籽)MS8品系外源结构基因的上游引物序列是：5’-gac ctt tgc aat ttt ctc ttc agt act-3’，该引物的最小序列是：5’-aat ttt ctc-3’；下游引物序列是：5’-gcc ttt tct tat cga ccatgt act c-3’，该引物的最小序列是：5’-at cga cca-3’。
用于检测油菜(籽)内源基因(FatA)的上游引物序列是：5’-ggt ctc tcagca agt ggg tga t-3’，该引物的最小序列是：5’-gca agt g-3’；下游引物序列是：5’-tcg tcc cga act tca tct gta a-3’，该引物的最小序列是：5’-ga act tc-3’。
按上述引物序列制成的用于转基因油菜(籽)及其加工产品实时PCR检测的SYBR？Green荧光体系。
SYBRGreen染料能选择性结合双链DNA，并且由此而发出荧光，PCR扩增产物随着扩增循环次数的增加的同时，荧光信号随之也增强，因此，通过实时追踪荧光信号的强度就能精确计算出由单链寡核甘酸引物扩增的双链产物的数量，对于靶基因鉴定或少量反应时，SYBRGreen染料是一种理想的化学试剂。更重要的是SYBRGreen染料在PCR反应中所要求的极端温度下同样十分稳定，通过分析目的产物的熔解曲线，使用SYBRGreen染料可有效区别特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体，以弥补其特异性差的缺点。SYBR Green荧光体系不仅简单实用，而且其特异性随着所采用PCR引物的精心设计和筛选而得以保证，完全可以和荧光探针PCR媲美，具有较高的实用价值。
按上述引物序列制成的用于转基因油菜(籽)及其加工产品实时PCR检测的试剂盒。
本发明的有益效果是：本发明通过检测作物本身所具有的内源参照基因(Endogenous Reference Gene)，如：油菜(籽)FatA内源基因，一方面可以测定检查模板DNA的质量，另一方面可以测定样品中转基因作物和非转基因作物的总DNA模板量；通过检测转基因作物中转入的外源基因，如：RT73品系外源结构基因、MS8品系外源结构基因，一方面可以测定是否有转基因成分存在，另一方面可以测定样品中转基因作物的DNA模板量，通过建立转基因作物标准参照样品的内源参照基因与外源基因Ct值之差(ΔCt)与转基因成分百分含量的标准曲线，可以计算出样品及其加工产品中转基因成分的百分含量。用于转基因产品定量检测的引物也可以对转基因产品进行定性检测，具有灵敏度高、避免交叉污染造成假阳性的优点。本发明实时PCR技术采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性。该技术巧妙地运用了PCR技术的DNA高效扩增的缺点，更重要的是SYBRGreen染料在PCR反应中所要求的极端温度下同样十分稳定，通过分析目的产物的熔解曲线，使用SYBRGreen染料可有效区别特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体，以弥补其特异性差，检测技术快速和敏感，使得本方法具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。
(四)附图说明：
图1为本发明SYBRGreen实时PCR检测原理示意图。
图2转基因产品和非转基因产品SYBRGreen实时PCR检测溶解曲线图。
(五)具体实施方式：
以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但不限于实施例。
实施例1
用于转基因油菜(籽)RT73品系的SYBRGreen实时PCR检测的引物序列和试剂盒，按常规引物制备合成方法制造，检测转基因油菜(籽)RT73品系外源结构基因(转基因成分)。
检测基因：RT73品系的外源结构基因。
引物：5’-cca tat tga cca tca tact ca ttg ct-3’、5’-gct tat acg aag gca agaaaa gga-3’。
试剂盒：应用该引物序列采用常规制法制成的用于检测转基因油菜(籽)RT73品系的外源结构基因的试剂盒。
实施例2
用于转基因油菜(籽)MS8品系的SYBRGreen实时PCR检测的引物序列和试剂盒，按常规引物制备合成方法制造，检测转基因油菜(籽)MS8品系外源结构基因(转基因成分)。
检测基因：MS8品系外源结构基因。
引物：5’-gac ctt tgc aat ttt ctc ttc agt act-3’、5’-gcc ttt tct tat cga cca tgtact c-3’。
试剂盒：应用该引物序列制成的用于检测转基因油菜(籽)MS8品系外源结构基因的试剂盒。
实施例3
用于油菜(籽)SYBRGreen实时PCR检测的引物序列和试剂盒，按常规引物制备合成方法制造，检测转基因油菜(籽)内源基因。
检测基因：FatA基因。
引物：5’-ggt ctc tca gca agt ggg tga t-3’、5’-tcg tcc cga act tca tct gta a-3’。
试剂盒：应用该引物序列制成的用于检测油菜(籽)内源FatA基因的试剂盒。
检测用主要仪器：实时PCR仪、超净工作台、消毒灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机、低温冰箱，冷藏冷冻冰箱、纯水器、双蒸水器、旋涡震荡器、微量进样器(0.5μL，2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL)等。
检测用主要试剂：10×PCR缓冲液、MgCl2、dNTP(dATP、dUTP、dCTP、dGTP)、UNG酶(Uracil N-glycosylase)、Taq酶、SYBRGreen、引物(按引物序列制成试剂盒)等。
SYBRGreen实时PCR检验所用引物序列如实施例1～3所述。
SYBRGreen实时PCR反应体系：
| 试剂名称 | 试剂成分 | 加入量(μL) |
| 总反应体积 | 20 | |
| DNA模板(50-200ng) | 提取的样品DNA | 2 |
| SYBR Premix Ex TaqTM(注1) | Taq DNA聚合酶 | 10 |
| dNTP Mixture | ||
| 反应缓冲液 | ||
| SYBRGreen I | ||
| 引物(正向和反向) | 0.8 | |
| ddH2O | 7.2 | |
| 注1：SYBR Premix Ex TaqTM是由TaKaRa公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不代表对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 | ||
SYBRGreen实时PCR的反应参数为：
| 阶段 | 分析模式 | 循环次数 | 温度(℃) | 时间(s) | 升温速率(℃/s) | 荧光检测模式 |
| 预变性 | 无 | 1 | 95 | 10 | 20 | 不检测 |
| PCR反应 | 定量分析 | 40 | 95 | 5 | 20 | 不检测 |
| 60 | 20 | 20 | 温度段结束后检测 | |||
| 融解曲线分析 | 融解曲线 | 1 | 95 | 0 | 20 | 不检测 |
| 65 | 15 | 20 | 不检测 | |||
| 95 | 0 | 0.1 | 连续检测 | |||
| 注2：罗氏LightCycler仪器的反应程序。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不代表对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 | ||||||
上机运行：按预先设定的样品摆放顺序将PCR反应管依次摆放，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免物质泄漏污染仪器，开始运行进行实时PCR反应。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。
结果分析与计算：
定性分析：
基线的设置：实时PCR反应结束并分析后，应设置无效基线范围。无论采用任何荧光通道基线范围选择在3-20个循环；阈值设置原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且Ct值＝40为准。
结果判断：待测样品外源基因检测Ct值≥40，内参照基因检测Ct值23-30者，表明未检出×××基因；待测样品外源基因检测Ct值28-34，内参照基因检测Ct值23-30者。表明检出×××基因。
定量分析：
用EXCEL或其它方法计算数据，可以创建以DNA浓度(x)对应循环数Ct值(Y)的标准曲线。对于样品DNA的浓度，可以根据回归方程logX＝Y-b/m计算(b为交叉点值，m为斜率)。ΔCt值＝外源基因Ct值-内源基因Ct值。将ΔCt值代入方程，即可得出样品中某一外源基因的相对含量。
如图2所示，外源基因出现PCR扩增，表明该样品检测出了外源转基因成分，即为转基因产品。未出现外源基因PCR扩增，表明该样品未检测出外源转基因成分。
Claims (5)
1、用于转基因油菜或油菜籽实时PCR检测的引物序列，其特征是：用于检测转基因油菜或油菜籽RT73品系外源结构基因的上游引物序列是：5’-cca tat tga cca tca tact ca ttg ct-3’，下游引物序列是：5’-gct tat acg aag gca agaaaa gga-3’。
2、用于转基因油菜或油菜籽实时PCR检测的引物序列，其特征是：用于检测转基因油菜或油菜籽MS8品系外源结构基因的上游引物序列是：5’-gac ctt tgc aat ttt ctc ttc agt act-3’，下游引物序列是：5’-gcc ttt tct tat cga ccatgt act c-3’。
3、用于转基因油菜或油菜籽实时PCR检测的引物序列，其特征是：用于检测油菜或油菜籽内源基因(FatA)的上游引物序列是：5’-ggt ctc tca gcaagt ggg tga t-3’，下游引物序列是：5’-tcg tcc cga act tca tct gta a-3’。
4、根据权利要求1-3任一所述的用于转基因油菜或油菜籽实时PCR检测的引物序列制成的用于转基因油菜或油菜籽SYBR Green实时PCR检测的SYBR Green荧光体系。
5、根据权利要求1-3任一所述的用于转基因油菜或油菜籽实时PCR检测的引物序列制成的用于转基因油菜或油菜籽SYBR Green实时PCR检测的试剂盒。
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