CN1706969A - 用于转基因棉花(籽)实时pcr检测的引物序列和试剂盒 - Google Patents
用于转基因棉花(籽)实时pcr检测的引物序列和试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1706969A CN1706969A CN 200510046407 CN200510046407A CN1706969A CN 1706969 A CN1706969 A CN 1706969A CN 200510046407 CN200510046407 CN 200510046407 CN 200510046407 A CN200510046407 A CN 200510046407A CN 1706969 A CN1706969 A CN 1706969A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seed
- sequence
- pcr
- primer
- transgene cotton
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
用于转基因棉花(籽)实时PCR检测的引物序列和试剂盒，给出检测转基因棉花(籽)MON531品系外源结构基因、MON1445品系外源结构基因、MON15985品系外源结构基因和acp1内源基因的引物序列，最大、最小及优选序列，按引物序列制成的试剂盒，用于转基因产品定量检测和定性检测，具有灵敏度高、避免交叉污染造成假阳性的优点。SYBRGreen实时PCR技术采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性。SYBRGreen染料在PCR反应中所要求的极端温度下同样十分稳定，可有效区别特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体，以弥补其特异性差，检测技术快速和敏感，使得本方法具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。
Description
(一)技术领域：
本发明涉及基因的扩增与检测。
(二)背景技术：
随着转基因产品不断商品化，其安全性问题一直被世人关注，并不断发生争议。为了保障人类的身体健康，消除消费者顾虑，有利于国际贸易和商品流通，以欧盟为代表的很多国家，在经历了短暂的争议后，对此类特殊产品都制定出安全管理条例，以便严格管理。欧洲、日本等多国还制定了相应的限量法规。我国农业部也于今年出台了转基因产品的管理办法。然而，要使消费者了解或接受转基因产品，各项法规能得以实施，除了给以相关信息及增加透明度外，关键问题是能够有相应的科学检测方法来分析与鉴别传统产品与转基因产品。尤其面对国内外贸易中对转基因产品的限量要求，更应有相应的、准确地定量方法对转基因产品，尤其是转基因食品进行定性、定量检测。在目前国内外常用的转基因产品的检测方法中，主要是以核酸为基础的PCR检测方法。PCR方法又分为定性PCR和定量PCR方法。定性PCR，即聚合酶链式反应PCR已广泛应用于基于核酸的各个研究和临床诊断等领域，该方法使用两段(约17～20多个核苷酸)寡核苷酸作为反应的引物，这两段寡核苷酸引物的序列应不发生互补作用。但它们可和称为模板的待测DNA两条链上在一定的位点分别发生互补。反应液包括含有镁离子的反应缓冲液、4种单核苷酸dNTP、模板DNA及引物。在DNA聚合酶催化下，通过温度的变化，DNA变性及退火，而合成两个互补位点之间的DNA片断。这样的反应反复进行，使第一个循环产生的DNA片断得以扩增。经25～30个循环，扩增倍数达106。用该方法检测转基因产品整个过程繁杂，操作步骤多，而且需要PCR后处理，如琼脂糖凝胶电脉和溴化乙锭染色，紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或银染检测，不仅需要多种仪器，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程又给污染和假阳性提供了机会，严重影响对结果的正确判断。
(三)发明内容：
本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种用于转基因棉花实时PCR检测的引物序列和试剂盒，用于转基因产品定量检测的引物也可以对转基因产品进行定性检测，操作简单、省时省方、具有灵敏度高、避免交叉污染造成假阳性的特点。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：用于转基因棉花(籽)实时PCR检测的引物序列，用于检测转基因棉花(籽)MON531品系外源结构基因的上游引物序列是：5’-tcc cat tcg agt ttc tca cgt-3’，该引物的最小序列是：5’-cg agt ttc-3’；下游引物序列是：5’-aac caa tgc cac ccc act ga-3’，该引物的最小序列是：5’-tgc cac c-3’；
用于检测转基因棉花(籽)MON1445品系外源结构基因的上游引物序列是：5’-gga gta aga cga ttc aga tca aac ac-3’，该引物的最小序列是：5’-cgattc aga-3’；下游引物序列是：5’-atc gac ctg cag ccc aag ct-3’，该引物的最小序列是：5’-ctg cag ccc-3’。
用于检测转基因棉花(籽)MON15985品系外源结构基因的上游引物序列是：5’-gtt act aga tcg ggg ata tcc-3’，该引物的最小序列是：5’-aga tcgggg-3’；下游引物序列是：5’-aag gtt gct aaa tgg atg gga-3’，该引物的最小序列是：5’-gct aaa tgg-3’。
用于检测棉花(籽)内源基因(acpl)的上游引物序列是：5’-att gtg atggga ctt gag gaa ga-3’，该引物的最小序列是：5’-atg gga ctt-3’；下游引物序列是：5’-ctt gaa cag ttg tga tgg att gtg-3’，该引物的最小序列是：5’-g ttg tgatg-3’。
按上述的引物序列制成的用于转基因棉花(籽)及其加工产品实时PCR检测SYBRGreen荧光体系。
SYBRGreen染料能选择性结合双链DNA，并且由此而发出荧光，PCR扩增产物随着扩增循环次数的增加的同时，荧光信号随之也增强，因此，通过实时追踪荧光信号的强度就能精确计算出由单链寡核甘酸引物扩增的双链产物的数量，对于靶基因鉴定或少量反应时，SYBRGreen染料是一种理想的化学试剂。更重要的是SYBR Green染料在PCR反应中所要求的极端温度下同样十分稳定，通过分析目的产物的熔解曲线，使用SYBRGreen染料可有效区别特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体，以弥补其特异性差的缺点。SYBR Green荧光体系不仪简单实用，而且其特异性随着所采用PCR引物的精心设计和筛选而得以保证，完全可以和荧光探针PCR媲美，具有较高的实用价值。
按上述引物序列制成的用于转基因棉花(籽)及其加工产品实时PCR检测的试剂盒。
本发明的有益效果是：本发明用于转基因样花(籽)实时PCR检测的引物序列和试剂盒，通过检测作物本身所具有的内源参照基因(EndogenousReference Gene)，如：棉花(籽)acpl内源基因，一方面可以测定检查模板DNA的质量，另一方面可以测定样品中转基因作物和非转基因作物的总DNA模板量；通过检测转基因作物中转入的外源基因，如：MON531品系外源结构基因、MON1445品系外源结构基因和MON15985品系外源结构基因，一方面可以测定是否有转基因成分存在，另一方面可以测定样品中转基因作物的DNA模板量，通过建立转基因作物标准参照样品的内源参照基因与外源基因Ct值之差(ΔCt)与转基因成分百分含量的标准曲线，可以计算出样品及其加工产品中转基因成分的百分含量。用于转基因产品定量检测的引物也可以对转基因产品进行定性检测，具有灵敏度高、避免交叉污染造成假阳性的优点。本发明实时PCR技术采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性。该技术巧妙地运用了PCR技术的DNA高效扩增的缺点，更重要的是SYBRGreen染料在PCR反应中所要求的极端温度下同样十分稳定，通过分析目的产物的熔解曲线，使用SYBRGreen染料可有效区别特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体，以弥补其特异性差，检测技术快速和敏感，本发明使得检测方法具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。
(四)附图说明：
图1为SYBRGreen实时PCR检测原理示意图。
图2转基因产品和非转基因产品SYBRGreen实时PCR检测溶解曲线图。
(五)具体实施方式：
以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但不限于实施例。
实施例1
用于转基因棉花(籽)MON531品系的SYBRGreen实时PCR检测的引物序列和试剂盒，按常规引物制备合成方法制造，检测转基因棉花(籽)MON531品系外源结构基因(转基因成分)。
检测基因：MON531品系的外源结构基因。
引物：5’-tcc cat tcg agt ttc tca cgt-3’、5’-aac caa tgc cac ccc act ga-3’。
试剂盒：应用该引物序列采用常规制法制成的用于检测转基因棉花(籽)MON531品系的外源结构基因的试剂盒。
实施例2
用于转基因棉花(籽)MON1445品系的SYBRGreen实时PCR检测的引物序列和试剂盒，检测转基因棉花(籽)MON1445品系外源结构基因(转基因成分)。
检测基因：MON1445品系外源结构基因。
引物：5’-gga gta aga cga ttc aga tca aac ac-3’、5’-atc gac ctg cag ccc aagct-3’。
试剂盒：应用该引物序列制成的用于检测转基因棉花(籽)MON1445品系外源结构基因的试剂盒。
实施例3
用于转基因棉花(籽)MON15985品系的SYBRGreen实时PCR检测的引物序列和试剂盒，检测转基因棉花(籽)MON15985品系外源结构基因(转基因成分)。
检测基因：MON15985品系外源结构基因。
引物：5’-gtt act aga tcg ggg ata tcc-3’、5’-aag gtt gct aaa tgg atg gga-3’。
试剂盒：应用该引物序列制成的用于检测转基因棉花(籽)MON15985品系外源结构基因的试剂盒。
实施例4
用于棉花(籽)SYBRGreen实时PCR检测的引物序列和试剂盒，检测转基因棉花(籽)内源基因。
检测基因：acpl基因。
引物：5’-att gtg atg gga ctt gag gaa ga-3’、5’-ctt gaa cag ttg tga tgg attgtg-3’。
试剂盒：应用该引物序列制成的用于检测棉花(籽)内源acpl基因的试剂盒。
检测主要仪器：实时PCR仪、超净工作台、消毒灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机、低温冰箱，冷藏冷冻冰箱、纯水器、双蒸水器、旋涡震荡器、微量进样器(0.5μL，2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL)等。
检测主要试剂：10×PCR缓冲液、MgCl2、dNTP(dATP、dUTP、dCTP、dGTP)、UNG酶(Uracil N-glycosylase)、Taq酶、SYBRGreen、引物(按引物序列制成试剂盒)等。
SYBRGreen实时PCR检验所用引物序列如实施例1～4所述。
SYBRGreen实时PCR反应体系：
| 试剂名称 | 试剂成分 | 加入量(μL) |
| 总反应体积 | 20 | |
| DNA模板(50-200ng) | 提取的样品DNA | 2 |
| SYBR Premix Ex TaqTM(注1) | Taq DNA聚合酶 | 10 |
| dNTP Mixture | ||
| 反应缓冲液 | ||
| SYBR Green I | ||
| 引物(正向和反向) | 0.8 | |
| ddH2O | 7.2 | |
| 注1：SYBR Premix Ex TaqTM是由TaKaRa公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不代表对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 | ||
SYBRGreen实时PCR的反应参数为：
| 阶段 | 分析模式 | 循环次数 | 温度(℃) | 时间(s) | 升温速率(℃/s) | 荧光检测模式 |
| 预变性 | 无 | 1 | 95 | 10 | 20 | 不检测 |
| PCR反应 | 定量分析 | 40 | 95 | 5 | 20 | 不检测 |
| 60 | 20 | 20 | 温度段结束后检测 | |||
| 融解曲线分析 | 融解曲线 | 1 | 95 | 0 | 20 | 不检测 |
| 65 | 15 | 20 | 不检测 | |||
| 95 | 0 | 0.1 | 连续检测 | |||
| 注2：罗氏LightCycler仪器的反应程序。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不代表对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 | ||||||
上机运行：按预先设定的样品摆放顺序将PCR反应管依次摆放，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免物质泄漏污染仪器，开始运行进行实时PCR反应。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。
结果分析与计算：
定性分析：
基线的设置：实时PCR反应结束并分析后，应设置无效基线范围。无论采用任何荧光通道基线范围选择在3-20个循环；阈值设置原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且Ct值＝40为准。
结果判断：待测样品外源基因检测Ct值≥40，内参照基因检测Ct值23-30者，表明未检出×××基因；待测样品外源基因检测Ct值28-34，内参照基因检测Ct值23-30者。表明检出×××基因。
定量分析：
用EXCEL或其它方法计算数据，可以创建以DNA浓度(x)对应循环数Ct值(Y)的标准曲线。对于样品DNA的浓度，可以根据回归方程logX＝Y-b/m计算(b为交叉点值，m为斜率)。ΔCt值＝外源基因Ct值-内源基因Ct值。将ΔCt值代入方程，即可得出样品中某一外源基因的相对含量。
如图2所示，外源基因出现PCR扩增，表明该样品检测出了外源转基因成分，即为转基因产品。未出现外源基因PCR扩增，表明该样品未检测出外源转基因成分。
Claims (10)
1、用于转基因棉花(籽)实时PCR检测的引物序列，其特征是：用于检测转基因棉花(籽)MON531品系外源结构基因的上游引物的最大序列是：5’-tcc cat tcg agt ttc tca cgt-3’，最小序列是：5’-cg agt ttc-3’；下游引物的最大序列是：5’-aac caa tgc cac ccc act ga-3’，最小序列是：5’-tgc cac c-3’。
2、根据权利要求1所述的用于转基因棉花(籽)实时PCR检测的引物序列，其特征是：用于检测转基因棉花(籽)MON531品系外源结构基因的上游引物序列是：5’-tcc cat tcg agt ttc tca cgt-3’，下游引物序列是：5’-aaccaa tgc cac ccc act ga-3’。
3、用于转基因棉花(籽)实时PCR检测的引物序列，其特征是：用于检测转基因棉花(籽)MON1445品系外源结构基因的上游引物的最大序列是：5’-gga gta aga cga ttc aga tca aac ac-3’，最小序列是：5’-cga ttc aga-3’；下游引物的最大序列是：5’-atc gac ctg cag ccc aag ct-3’，最小序列是：5’-ctgcag ccc-3’。
4、根据权利要求3所述的用于转基因棉花(籽)实时PCR检测的引物序列，其特征是：用于检测转基因棉花(籽)MON1445品系外源结构基因的上游引物序列是：5’-gga gta aga cga ttc aga tca aac ac-3’，下游引物序列是：5’-atc gac ctg cag ccc aag ct-3’。
5、用于转基因棉花(籽)实时PCR检测的引物序列，其特征是：用于检测转基因棉花(籽)MON15985品系外源结构基因的上游引物的最大序列是：5’-gtt act aga tcg ggg ata tcc-3’，最小序列是：5’-aga tcg ggg-3’；下游引物的最大序列是：5’-aag gtt gct aaa tgg atg gga-3’，最小序列是：5’-gctaaa tgg-3’。
6、根据权利要求5所述的用于转基因棉花(籽)实时PCR检测的引物序列，其特征是：用于检测转基因棉花(籽)MON15985品系外源结构基因的上游引物序列是：5’-gtt act aga tcg ggg ata tcc-3’，下游引物序列是：5’-aag gtt gct aaa tgg atg gga-3’。
7、用于转基因棉花(籽)实时PCR检测的引物序列，其特征是：用于检测棉花(籽)内源基因(acp1)的上游引物的最大序列是：5’-att gtg atg ggactt gag gaa ga-3’，最小序列是：5’-atg gga ctt-3’；下游引物的最大序列是：5’-ctt gaa cag ttg tga tgg att gtg-3’，最小序列是：5’-g ttg tga tg-3’。
8、根据权利要求7所述的用于转基因棉花(籽)实时PCR检测的引物序列，其特征是：用于检测棉花(籽)内源基因(acp1)的上游引物序列是：5’-att gtg atg gga ctt gag gaa ga-3’，下游引物序列是：5’-ctt gaa cag ttg tgatgg att gtg-3’。
9、根据权利要求1-8任一所述的用于转基因棉花(籽)实时PCR检测的引物序列制成的用于转基因棉花(籽)及其加工产品实时PCR检测SYBRGreen荧光体系。
10、根据权利要求1-8任一所述的用于转基因棉花(籽)实时PCR检测的引物序列制成的用于转基因棉花(籽)及其加工产品实时PCR检测的试剂盒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200510046407 CN1706969A (zh) | 2005-05-09 | 2005-05-09 | 用于转基因棉花(籽)实时pcr检测的引物序列和试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200510046407 CN1706969A (zh) | 2005-05-09 | 2005-05-09 | 用于转基因棉花(籽)实时pcr检测的引物序列和试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1706969A true CN1706969A (zh) | 2005-12-14 |
Family
ID=35581077
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 200510046407 Pending CN1706969A (zh) | 2005-05-09 | 2005-05-09 | 用于转基因棉花(籽)实时pcr检测的引物序列和试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1706969A (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101831499A (zh) * | 2010-05-24 | 2010-09-15 | 东北农业大学 | 一种检测粪便中产甲酸草酸杆菌定殖数量的实时pcr方法 |
| CN102952863A (zh) * | 2011-08-26 | 2013-03-06 | 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 | 转基因棉花多重pcr-dhplc检测引物及检测方法 |
| CN103352085A (zh) * | 2013-07-26 | 2013-10-16 | 山东省农业科学院植物保护研究所 | 抗虫转基因棉花mon531转化体pcr检测的引物和探针及其应用 |
| CN103361436A (zh) * | 2013-07-25 | 2013-10-23 | 山东省农业科学院植物保护研究所 | 耐除草剂转基因棉花mon1445的转化体特异性引物、探针及在实时荧光pcr检测中的应用 |
| CN106636414A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-05-10 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种定性检测棉花材料中mon531转化体的pcr检测试剂盒及方法 |
| CN106755557A (zh) * | 2017-03-23 | 2017-05-31 | 青岛捷安信检验技术服务有限公司 | 一种转基因小麦和棉花的检测方法 |
-
2005
- 2005-05-09 CN CN 200510046407 patent/CN1706969A/zh active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101831499A (zh) * | 2010-05-24 | 2010-09-15 | 东北农业大学 | 一种检测粪便中产甲酸草酸杆菌定殖数量的实时pcr方法 |
| CN101831499B (zh) * | 2010-05-24 | 2012-07-04 | 东北农业大学 | 一种检测粪便中产甲酸草酸杆菌定殖数量的实时pcr方法 |
| CN102952863A (zh) * | 2011-08-26 | 2013-03-06 | 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 | 转基因棉花多重pcr-dhplc检测引物及检测方法 |
| CN102952863B (zh) * | 2011-08-26 | 2014-12-31 | 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 | 转基因棉花多重pcr-dhplc检测引物及检测方法 |
| CN103361436A (zh) * | 2013-07-25 | 2013-10-23 | 山东省农业科学院植物保护研究所 | 耐除草剂转基因棉花mon1445的转化体特异性引物、探针及在实时荧光pcr检测中的应用 |
| CN103352085A (zh) * | 2013-07-26 | 2013-10-16 | 山东省农业科学院植物保护研究所 | 抗虫转基因棉花mon531转化体pcr检测的引物和探针及其应用 |
| CN106636414A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-05-10 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种定性检测棉花材料中mon531转化体的pcr检测试剂盒及方法 |
| CN106755557A (zh) * | 2017-03-23 | 2017-05-31 | 青岛捷安信检验技术服务有限公司 | 一种转基因小麦和棉花的检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1706969A (zh) | 用于转基因棉花(籽)实时pcr检测的引物序列和试剂盒 | |
| CN103045755B (zh) | 一种检测埃博拉病毒的荧光定量pcr检测方法及其引物和试剂盒 | |
| CN102586473B (zh) | 一种乙型肝炎病毒基因分型pcr检测试剂盒 | |
| CN102277441B (zh) | 一种快速检测IL28B SNP rs12979860多态性的试剂盒 | |
| CN101104867A (zh) | 检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法 | |
| CN108251510A (zh) | 一种叶酸代谢能力基因分型的试剂盒、检测方法及其应用 | |
| CN101158634A (zh) | 乙型肝炎病毒(hbv)荧光定量pcr检测试剂盒 | |
| CN1309842C (zh) | 用于转基因油菜(籽)实时pcr检测的引物序列和试剂盒 | |
| CN101899521A (zh) | 一种广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法 | |
| CN102719540A (zh) | 利用荧光定量PCR技术检测PML-RARα融合基因相对表达量的检测试剂盒 | |
| CN102925562A (zh) | 氨基糖苷类药物性耳聋易感基因检测试剂盒及方法 | |
| CN103045754A (zh) | 一步法检测z/s亚型埃博拉病毒的实时荧光定量rt-pcr方法及其试剂盒 | |
| CN104293932A (zh) | 一种基于实时荧光pcr检测hla-b*5801等位基因的方法 | |
| CN1420182A (zh) | 用于转基因马铃薯实时荧光pcr检测的探针序列和试剂盒 | |
| CN103555842A (zh) | 动物衣原体Taqman-MGB探针多重实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和方法 | |
| CN1420181A (zh) | 用于转基因油菜籽实时荧光pcr检测的探针序列和试剂盒 | |
| CN101451162B (zh) | 用于检测烟草根黑腐病菌的引物、探针及实时荧光pcr试剂盒 | |
| CN102732618B (zh) | 用于检测aml1-eto融合基因相对表达量的试剂盒 | |
| CN107604069A (zh) | 基于Taqman‑MGB探针的人JAK2 V617F突变检测试剂盒和方法 | |
| CN104195255A (zh) | 一种检测融合基因AML1-ETO mRNA表达的试剂盒及其检测方法 | |
| CN1203187C (zh) | 用于转基因玉米实时荧光pcr检测的探针序列和试剂盒 | |
| CN101440400B (zh) | 含89k毒力岛猪链球菌2型核酸的荧光检测试剂盒及方法 | |
| CN103014164B (zh) | 贝类包拉米虫和派琴虫的二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒 | |
| CN100386443C (zh) | 一种用于检测o139群霍乱弧菌核苷酸片段的引物和探针序列 | |
| CN102382890B (zh) | 油棕猝倒病菌荧光定量pcr检测试剂及检测试剂盒和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |