CN106636414A - 一种定性检测棉花材料中mon531转化体的pcr检测试剂盒及方法 - Google Patents

一种定性检测棉花材料中mon531转化体的pcr检测试剂盒及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106636414A
CN106636414A CN201611241299.5A CN201611241299A CN106636414A CN 106636414 A CN106636414 A CN 106636414A CN 201611241299 A CN201611241299 A CN 201611241299A CN 106636414 A CN106636414 A CN 106636414A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mon531
transformant
cotton
pcr
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201611241299.5A
Other languages
English (en)
Inventor
谢家建
彭于发
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201611241299.5A priority Critical patent/CN106636414A/zh
Publication of CN106636414A publication Critical patent/CN106636414A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明“一种定性检测棉花材料中MON531转化体的PCR检测试剂盒及方法”，属于生物技术领域,试剂盒包括粉剂或溶液状的以下三条引物531‑GF：5‘‑GAAAGAACTAAACAATTAGTACCC‑3’，531‑TR：5‘‑CTCGCACACGGCTTCGAC‑3’，531‑GR：5‘‑AAACCAATGCCACCCCACTG‑3’。可检测待测棉花个体材料中是否含有MON531转化体，并鉴别出该品种中特定个体的纯杂合状态，适合于纯合度检测和育种选种。

Description

一种定性检测棉花材料中MON531转化体的PCR检测试剂盒及 方法
技术领域
本发明属于生物技术领域。特别是涉及一种定性检测棉花材料中MON531转化体的PCR检测试剂盒及方法。
背景技术
转基因棉花是全球种植的主要转基因作物之一，也是我国种植面积最大的转基因作物。2015年，我国转基因棉花种植面积达到370万公顷，占棉花总种植面积96％，高于2014年93％的比例。目前我国批准商业化种植的转基因棉花主要有国内研发的转crylAb/Ac融合基因的抗虫棉和转基因crylAc基因的抗虫棉MON531转化体(http://www.moa.gov.cn/ztzl/zjyqwgz/spxx/)。转基因棉花MON531转化体是由孟山都公司研发的抗虫棉品种，已在美国、中国、加拿大、澳大利亚等20多个国家和地区批准种植或允许用作食品饲料原料(http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/event/default.asp？EventID＝54)。
转基因性状与其他生物性状一样，可以根据其自交或杂交产生后代中的分离情况来判定其是纯合或杂合。在育种过程中，获得纯合体是一个非常关键的步骤，也是保证种子质量的重要的因素。传统的区分转基因植株纯杂合方法是通过检测自交产生的子一代是否发生分离以及计算分离比进行的，不仅耗时费力，而且浪费了子一代的宝贵资源。而快速高效地筛选纯合植株，可显著加快转基因植株的育种进程，因此鉴别转基因植株纯杂合方法具有重要的应用价值。
在分子水平上鉴别转基因植株纯杂合可以通过PCR方法扩增转基因插入位点序列和两端的基因组序列来鉴别单个植株或单粒种子的纯杂合状态。目前种植的棉花绝大部分属于陆地棉品种，陆地棉的基因组是异源四倍体，也就是由具有高度相似的两个二倍体组成。因此在鉴别转基因棉花的纯杂合时，插入位点基因组的扩增会受到其同源染色体上序列的干扰，鉴别比较困难。
发明内容
本发明比较了转基因棉花MON531插入位点的棉花基因组序列与其同源染色体序列差异，设计和验证了特异性的引物组合，建立了快速鉴定转基因棉花MON531纯杂合方法，可检测待待测棉花材料是MON531转化体，并鉴别出特定个体的纯杂合状态。
本发明提供的技术方案如下：
一种定性检测棉花材料中MON531转化体的PCR检测试剂盒，其特征在于，包括粉剂或溶液状的以下三条引物
531-GF：5‘-GAAAGAACTAAACAATTAGTACCC-3’，
531-TR：5‘-CTCGCACACGGCTTCGAC-3’，
531-GR：5‘-AAACCAATGCCACCCCACTG-3’。
优选地，所述试剂盒还包括进行PCR反应的通用试剂。
一种鉴定转基因抗虫棉MON531转化体纯杂合状态的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备待测棉花材料的DNA作为模板，
(2)在PCR反应体系中加入以下序列所示的三条引物，进行PCR扩增：
531-GF：5‘-GAAAGAACTAAACAATTAGTACCC-3’，
531-TR：5‘-CTCGCACACGGCTTCGAC-3’，
531-GR：5‘-AAACCAATGCCACCCCACTG-3’。
(3)对PCR扩增产物进行检测，
扩增出一条529bp条带的样品为纯合的MON531转化体，
同时扩增出613bp和529bp两条条带的样品为杂合MON531转化体；
仅扩增出613bp条带的样品不是或不含有MON531转化体。
所述PCR扩增的反应体系：
总体积20μL中GoGreenMaster Mix 10μL，10μmol/L的531-GF、531-GR和531-TR各1μL，DNA模板2μL，其余为超纯水至20μL。
PCR反应程序为：95℃预变性4min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，扩增反应进行35个循环，72℃保温10min。
对于检测有限群体中MON531转化体的比例，也可以采用上述定性方法，具体如下：一种检测棉花材料群体中转基因抗虫棉MON531转化体含量的方法，包括如下步骤：
(1)随机选取待测棉花材料群体中的多个材料，分别提取每种所选材料的DNA，
(2)采用以下三条引物组成的引物组对每种所选材料的DNA进行PCR扩增：
531-GF：5‘-GAAAGAACTAAACAATTAGTACCC-3’，
531-TR：5‘-CTCGCACACGGCTTCGAC-3’，
531-GR：5‘-AAACCAATGCCACCCCACTG-3’。
(3)对PCR扩增产物进行检测，
扩增出一条529bp条带的样品为纯合的MON531转化体，
同时扩增出613bp和529bp两条条带的样品为杂合MON531转化体；
仅扩增出613bp条带的样品不是或不含有MON531转化体；
所述PCR扩增的反应体系：
总体积20μL中GoGreenMaster Mix 10μL，10μmol/L的757-GF、757-GR和757-TR各1μL，DNA模板2μL，其余为超纯水至。
PCR反应程序为：95℃预变性4min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，扩增反应进行35个循环，72℃保温10min。
本发明在MON531转化体插入位点两侧基因组上设计引物，以及插入序列上设计引物，三条引物分别扩增插入位点的棉花基因组序列和5’连接区序列，在MON531转化体纯合样品中，仅能获得5’连接区序列的529bp的扩增产物，而在含有转化体的基因组中，插入位点的引物之间的片段为包括完整插入片段的区域，预期超过10kb，这么长的片段在普通PCR条件下则不能获得扩增；而不含MON531转化体的样品中，仅能获得棉花基因组序列的613bp的扩增产物。
实验数据证明，纯合MON531转化体植株仅扩增得到一条529bp的片段，杂合植株得到529bp和613bp两条条带，不含MON531转化体的植株只得到一条613bp的条带，这与预期结果完全一致。因此，建立的MON531转化体定性PCR方法能有效地鉴别MON531转化体及其存在状态。
综上，因此本发明为特异性鉴定转基因抗虫棉MON531转化体提供了便利，这些方法的优点在于快速、灵敏度高、特异性好、所需实验条件不高，鉴于转基因抗虫棉MON531转化体在我国已经批准商业化种植，因此有非常高的实用价值。
附图说明
图1.转基因棉花MON531转化体PCR检测的引物位置示意图
图2.鉴定引物531-GF和531-GR的设计示意图
A：531-GF；B：531-GR；
其中1：MON531转化体基因组序列；
2：棉花Dt_chr8染色体序列；
3：棉花At_chr3染色体序列；
4：棉花Dt_chr4染色体序列
图3.转基因棉花MON531转化体单株鉴定图谱
1,2,4-6：非MON531单株；3,8：MON531纯合单株；7：MON531杂合单株；
图4.MON531杂合单株自交后代种子鉴定图谱
1-30：30粒源自杂合单株的自交种子；31：非MON531种子；32：空白对照；M：DL2000
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。
实施例1.引物设计
本发明的关键点在于MON531转化体棉花基因组上的正向引物和反向引物的设计。
通过序列比对发现，MON531转化体(http://gmdd.shgmo.org/sequence/view/30)插入位点位于棉花D亚基因组8号染色体(简写为Dt_chr8)染色体上，同时发现其插入位点的基因组序列还与棉花A亚基因组3号染色体(简写为At_chr3)和棉花D亚基因组4号染色体(简写为Dt_chr4)染色体上的序列有较高的相似性。
通过将MON531转化体插入位点上游棉花基因组序列与At_chr3和Dt_chr4染色体序列进行逐一比对，检索到序列531-GF：5‘-GAAAGAACTAAACAATTAGTACCC-3’与At_chr3相差一个碱基，与Dt_chr4有较大差异(图2A)，因此将其作为正向基因组引物。
同样的方法，将MON531转化体插入位点下游棉花基因组序列与At_chr3和Dt_chr4染色体序列进行逐一比对，检索到序列531-GR：5‘-AAACCAATGCCACCCCACTG-3’与At_chr3相差一个碱基，与Dt_chr4也相差一个碱基(图2B)，因此将其作为反向基因组引物。
本发明在MON531转化体插入位点两侧基因组上设计引物，以及插入序列上设计引物，三条引物如下：
531-GF：5‘-GAAAGAACTAAACAATTAGTACCC-3’，
531-TR：5‘-CTCGCACACGGCTTCGAC-3’，
531-GR：5‘-AAACCAATGCCACCCCACTG-3’(Seq ID No.3)，如图1所示。
其中531-GF/531-TR扩增区域为MON531转化体的5‘端棉花基因组与转基因序列的连接区，531-GF/531-TR对MON531转化体的扩增序列，529bp，如Seq ID No.4所示；
531-GF/531-GR扩增片段为棉花基因组序列，位于棉花基因组(陆地棉)的Dt_chr8染色体的37518889-37519501位，扩增序列为613bp。而在含有转化体的基因组中，插入位点的引物之间的片段为包括完整插入片段的区域，预期超过10kb，这么长的片段在普通PCR条件下则不能获得扩增；因此即仅能在不含MON531转化体的样品中，获得棉花基因组序列的613bp的扩增产物，如Seq ID No.5.所示；
三条引物联合使用，在杂合体可以扩增出两条条带。
可用于常规PCR方法快速准确鉴定田间棉花单株或单粒棉花种子中的MON531转化体的纯杂合状态。
实施例2.转基因抗虫棉MON531转化体的定性PCR检测方法
1实验材料
1.1转基因抗虫棉材料
鄂杂棉1号(润富棉839)(生厂商：湖北中香米业有限责任公司，生产批号：2009-10，审定编号：鄂审棉001-2000)，2010年购自湖北省棉花种子市场。在中国农业科学院植物保护研究所温室种植，经单株筛选鉴定、自交繁殖等获得MON531转化体的纯合材料和杂合材料。
1.2试剂
分子生物学试剂，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、DL2000 Marker等购自大连宝生物工程有限公司。
其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京三博生物技术有限责任公司合成。
1.3实验仪器
PCR扩增仪：型号S1000(Bio-Rad公司)
核酸电泳仪：DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)
凝胶成像系统：BiospectrumAC(UVP公司)
其它仪器包括：离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。
2实验方法和过程
2.1样品前处理
温室种植的棉花材料，分别取单株叶片。
2.2棉花基因组DNA提取
依照植物DNA提取试剂盒(TIANGEN生物技术有限公司)的操作手册，进行棉花材料总DNA的提取。取5μl提取的DNA溶液，以0.8％的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提取的DNA的浓度和纯度。
2.3温室种植单株棉花材料的检测
采用建立的由3条引物531-GF(基因组正向引物)、531-GR(基因组反向引物)和531-TR(插入片段反向引物)组成的MON531转化体定性PCR检测方法，选择纯合、杂合和不含MON531转化体的温室棉花材料单株进行验证。
PCR反应体系：GoGreenMaster Mix 10μL，引物757-GF、757-GR和757-TR(10μmol/L)各1μL，DNA模板2μL，补超纯水至总体积20μL。反应程序：95℃预变性4min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，扩增反应进行35个循环，72℃保温10min。
在MON531转化体杂合样品中，三条引物分别扩增插入位点之间的棉花基因组序列和插入序列的5’连接区序列，从而获得613和529bp的两种扩增产物；
在MON531转化体纯合样品中，仅能获得插入序列5’连接区序列的529bp的扩增产物即531-GF(基因组正向引物)和531-TR(插入片段反向引物)扩增所得扩增所得；而基因组正反向引物之间由于包括的插入片段(MON531转化体)完整区域预期超过10kb，在普通PCR条件下不可能获得扩增；
而不含MON531转化体的样品中，仅能获得棉花基因组序列的613bp的扩增产物，即531-GF(基因组正向引物)和531-GR(基因组反向引物)扩增所得。
验证结果表明，如图3所示，纯合MON531转化体植株(泳道3,8)仅扩增得到一条529bp的片段，杂合植株(泳道7)得到529bp和613bp两条条带，不含MON531转化体的植株(泳道1,2,4-6)只得到一条613bp的条带，这与预期结果完全一致。
因此，本发明建立的MON531转化体定性PCR方法及引物组能有效地鉴别MON531转化体及其存在状态。
2.4棉花种子样品中MON531转化体的定性PCR检测
随机抽取鉴定为鄂杂棉1号MON531杂合植株的自交种子30粒，采用建立的MON531转化体特异性定性PCR方法进行鉴定(图4)。结果表明30粒种子中MON531转化体纯合、杂合和不含有的分别为9、12和9粒。
说明，本发明的方法及试剂盒能够准确鉴定单个棉花材料是否含有MON531转化体，且鉴定MON531转化体的杂纯合状态，而且还可以用来鉴定一个群体中杂合或纯合个体所占的比例。
<110>中国农业科学院植物保护研究所
<120>一种定性检测棉花材料中mon531转化体的pcr检测试剂盒及方法
<130> P160826-ZWB
<160>3
<210>1
<211>24
<212>dna
<213> 人工序列
<220> 基因组正向引物
<400>1
gaaagaacta aacaattagt accc 24
<210>2
<211>18
<212>dna
<213> 人工序列
<220> 插入序列反向引物
<400> 2
ctcgcacacg gcttcgac 18
<210>3
<211>20
<212>dna
<213> 人工序列
<220> 基因组反向引物
<400>3
aaaccaatgc caccccactg 20
<210>4
<211>529
<212>dna
<213> 人工序列
<220> 阳性扩增序列
<400>4
gaaagaacta aacaattagt acccactgtt cccacctaac tcatcatctc cttccctgtc 60
tatccctcct gagctaccat gtcacaataa aaaaactaga atattattta ccttacaaaa 120
atggcaatgg catcatgcag tcaaaggagc ttcatgggtt ttagttttac ttccatttta 180
gtgaaatgat tgttgggcta taagcagtca tttcagaaaa aaaaaccatt gaattctagt 240
ttgtattctt atgtatgtgc ctgcaggaaa aaaaatattg aaactcatgc aggagctgtc 300
agactgtttg acattttgtt tatcattaaa tgagattttt ttttgatttt tcaccattga 360
aaggtcacta atattcttct ttttctttct ttcttttctc tatcagatca aatttttttt 420
aaaaaaatgg aggggccaat gcctcgtgat tgttctctgc aagaatatac agtgataaat 480
tatatatgtg tatattataa ccagaaacgc cgtcgaagcc gtgtgcgag 529
<210>5
<211>613
<212>dna
<213> 人工序列
<220> 阴性扩增序列
<400>5
gaaagaacta aacaattagt acccactgtt cccacctaac tcatcatctc cttccctgtc 60
tatccctcct gagctaccat gtcacaataa aaaaactaga atattattta ccttacaaaa 120
atggcaatgg catcatgcag tcaaaggagc ttcatgggtt ttagttttac ttccatttta 180
gtgaaatgat tgttgggcta taagcagtca tttcagaaaa aaaaaccatt gaattctagt 240
ttgtattctt atgtatgtgc ctgcaggaaa aaaaatattg aaactcatgc aggagctgtc 300
agactgtttg acattttgtt tatcattaaa tgagattttt ttttgatttt tcaccattga 360
aaggtcacta atattcttct ttttctttct ttcttttctc tatcagatca aatttttttt 420
aaaaaaatgg aggggccaat gcctcgtgat tgttctctgc aagaatatac agtgataaat 480
tatatatgtg tatattataa ccaaaatgta taattgatga tgttgtcgtg tcgtgtgacc 540
ttttaccaac acatataaat ttattgttgg taaaaaagaa gagctaagtg ggtcagtggg 600
gtggcattgg ttt 613

Claims (8)

1.一种检测棉花材料中转基因抗虫棉MON531转化体状态的定性PCR检测试剂盒，其特征在于，包括粉剂或溶液状的以下三条引物：
531-GF：5‘-GAAAGAACTAAACAATTAGTACCC-3’，
531-TR：5‘-CTCGCACACGGCTTCGAC-3’，
531-GR：5‘-AAACCAATGCCACCCCACTG-3’。
2.根据权利要求1所述的定性PCR检测试剂盒，还包括进行PCR反应的通用试剂。
3.一种鉴定棉花材料中转基因抗虫棉MON531转化体状态的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备待测棉花材料的DNA作为模板，
(2)在PCR反应体系中加入以下序列所示的三条引物，进行PCR扩增：
531-GF：5‘-GAAAGAACTAAACAATTAGTACCC-3’，
531-TR：5‘-CTCGCACACGGCTTCGAC-3’，
531-GR：5‘-AAACCAATGCCACCCCACTG-3’；
(3)对PCR扩增产物进行检测，
扩增出一条529bp条带的样品为纯合的MON531转化体，
同时扩增出529bp和613bp两条条带的样品为杂合MON531转化体；
仅扩增出613bp条带的样品不是或不含有MON531转化体。
4.根据权利要求3所述的方法，所述PCR扩增的反应体系：
总体积20μL中GreenMaster Mix 10μL，10μmol/L的531-GF、531-GR和531-TR各1μL，DNA模板2μL，其余为超纯水。
5.根据权利要求3或4所述的方法，PCR反应程序为：95℃预变性4min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，扩增反应进行35个循环，72℃保温10min。
6.一种检测棉花材料群体中转基因抗虫棉MON531转化体含量的方法，包括如下步骤：
(1)随机选取待测棉花材料群体中的多个材料，分别提取每种所选材料的DNA，
(2)采用以下三条引物组成的引物组对每种所选材料的DNA进行PCR扩增：
531-GF：5‘-GAAAGAACTAAACAATTAGTACCC-3’，
531-TR：5‘-CTCGCACACGGCTTCGAC-3’，
531-GR：5‘-AAACCAATGCCACCCCACTG-3’；
(3)对PCR扩增产物进行检测，
扩增出一条529bp条带的样品为纯合的MON531转化体，
同时扩增出613bp和529bp两条条带的样品为杂合MON531转化体；
仅扩增出613bp条带的样品不是或不含有MON531转化体；
(4)转基因抗虫棉MON531转化体含量＝(纯合的MON531转化体的材料数+1/2*杂合的MON531转化体的材料数)/所选材料的总数。
7.根据权利要求6所述的方法，所述PCR扩增的反应体系：
总体积20μL中GreenMaster Mix 10μL，10μmol/L的531-GF、531-GR和531-TR各1μL，DNA模板2μL，其余为超纯水。
8.根据权利要求6或7所述的方法，所述PCR扩增的反应体系：
PCR反应程序为：95℃预变性4min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，扩增反应进行35个循环，72℃保温10min。
CN201611241299.5A 2016-12-29 2016-12-29 一种定性检测棉花材料中mon531转化体的pcr检测试剂盒及方法 Pending CN106636414A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611241299.5A CN106636414A (zh) 2016-12-29 2016-12-29 一种定性检测棉花材料中mon531转化体的pcr检测试剂盒及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611241299.5A CN106636414A (zh) 2016-12-29 2016-12-29 一种定性检测棉花材料中mon531转化体的pcr检测试剂盒及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106636414A true CN106636414A (zh) 2017-05-10

Family

ID=58835482

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611241299.5A Pending CN106636414A (zh) 2016-12-29 2016-12-29 一种定性检测棉花材料中mon531转化体的pcr检测试剂盒及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106636414A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107022646A (zh) * 2017-06-16 2017-08-08 中国农业科学院植物保护研究所 用于检测棉花mon1445转化体的引物组、试剂盒及方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1706969A (zh) * 2005-05-09 2005-12-14 曹际娟 用于转基因棉花(籽)实时pcr检测的引物序列和试剂盒
CN101413028A (zh) * 2001-06-11 2009-04-22 孟山都技术有限公司 棉花事件mon15985以及检测它的组合物和方法
CN102108399A (zh) * 2010-12-06 2011-06-29 中国检验检疫科学研究院 转基因棉花检测芯片、试剂盒及应用
CN103352085A (zh) * 2013-07-26 2013-10-16 山东省农业科学院植物保护研究所 抗虫转基因棉花mon531转化体pcr检测的引物和探针及其应用
US20140255922A1 (en) * 2007-06-14 2014-09-11 Monsanto Technology Llc Cotton polymorphisms and methods of genotyping
CN105755110A (zh) * 2015-12-24 2016-07-13 中国农业科学院植物保护研究所 一种检测棉花材料中转基因抗虫棉mon757转化体状态的定性pcr检测试剂盒及方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101413028A (zh) * 2001-06-11 2009-04-22 孟山都技术有限公司 棉花事件mon15985以及检测它的组合物和方法
CN1706969A (zh) * 2005-05-09 2005-12-14 曹际娟 用于转基因棉花(籽)实时pcr检测的引物序列和试剂盒
US20140255922A1 (en) * 2007-06-14 2014-09-11 Monsanto Technology Llc Cotton polymorphisms and methods of genotyping
CN102108399A (zh) * 2010-12-06 2011-06-29 中国检验检疫科学研究院 转基因棉花检测芯片、试剂盒及应用
CN103352085A (zh) * 2013-07-26 2013-10-16 山东省农业科学院植物保护研究所 抗虫转基因棉花mon531转化体pcr检测的引物和探针及其应用
CN105755110A (zh) * 2015-12-24 2016-07-13 中国农业科学院植物保护研究所 一种检测棉花材料中转基因抗虫棉mon757转化体状态的定性pcr检测试剂盒及方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨阳: ""转基因棉花MON757转化体特异性PCR检测方法及应用"", 《农业生物技术学报》 *
杨阳: ""转基因棉花MON757转化体的检测和外源基因表达的初步分析"", 《中国学位论文全文数据库》 *
黄春蒙: ""转基因棉花MON531R756省略_短cry1Ac基因表达的初步分析"", 《中国学位论文全文数据库》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107022646A (zh) * 2017-06-16 2017-08-08 中国农业科学院植物保护研究所 用于检测棉花mon1445转化体的引物组、试剂盒及方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105695478B (zh) 调节植物株型和产量的基因及其应用
EP3561079A1 (en) Soybean anti-pod-shattering major qtlqpd08-1, and mapping method and application thereof
CN106282394A (zh) 高通量检测玉米南方锈病抗性基因分型的方法及其试剂盒
CN107227373B (zh) 一种粳稻抗倒伏基因的snp功能分子标记及应用
CN106755434B (zh) 一种水稻粒长基因qGL3的分子标记及其应用
CN110747288A (zh) 水稻大粒基因功能标记及应用
CN111926104B (zh) 一种鉴定甘蔗与斑茅杂交后代真实性的ssr分子标记及其方法
CN103589805B (zh) 赋予玉米斐济病毒抗性的主要qtls
CN107022646A (zh) 用于检测棉花mon1445转化体的引物组、试剂盒及方法
CN112609017A (zh) 检测水稻籽粒小粒形的分子标记及对应的基因和应用
US20190241981A1 (en) Plant breeding using next generation sequencing
CN111593135A (zh) 一种鉴别转基因材料及其自交、杂交、回交后代中内、外源基因的检测引物和方法
CN114480718B (zh) 一种基于kasp技术用于水稻耐高温基因分型的引物组、检测试剂盒及其应用
CN110468229A (zh) 水稻广谱高抗白叶枯病基因Xa45(t)的共分离分子标记Hxjy-1
CN107988418B (zh) 用于转基因番木瓜yk16-0-1转化体纯杂合鉴定的引物组、试剂盒及方法
CN106636414A (zh) 一种定性检测棉花材料中mon531转化体的pcr检测试剂盒及方法
CN110358861A (zh) 与水稻广谱高抗白叶枯病基因Xa45(t)紧密连锁分子标记R13I14
CN105755110B (zh) 一种检测棉花材料中转基因抗虫棉mon757转化体状态的定性pcr检测试剂盒及方法
CN112176082A (zh) 小麦粒重相关基因的snp分子标记及其应用
CN108588273A (zh) 玉米隐性核雄性不育突变基因ms30的功能标记及其应用
CN110358862A (zh) 与水稻广谱高抗白叶枯病基因Xa45(t)紧密连锁的分子标记Hxjy-14
CN108060258B (zh) 用于棉花mon15985转化体纯杂合鉴定的引物组、试剂盒及方法
CN112575101A (zh) 与西葫芦prsv-w病毒病抗性相关的分子标记及其应用
CN111485031A (zh) 水稻分子标记dof8及其应用、一种利用水稻分子标记dof8鉴别粳稻和籼稻的方法
CN107099590A (zh) 水稻抗稻瘟病Pi9基因的共显性功能分子标记Pi9InDel2及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170510

RJ01 Rejection of invention patent application after publication