CN101413028A - 棉花事件mon15985以及检测它的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及棉花事件MON15985以及检测它的组合物和方法。具体地，本发明提供了包括能产生对鳞翅目昆虫危害有抗性的MON15985事件的棉花植物、棉花组织和棉花种子。还提供了根据插入棉花基因组中导致MON15985事件的重组结构的DNA序列和/或插入位点旁侧的基因组序列检测MON15985事件存在的测定方法。
Description
本申请是申请日为2002年6月5日的中国专利申请02802047.2“棉花事件MON15985以及检测它的组合物和方法”的分案申请。
本申请要求申请日为2001年6月11日的美国临时申请号60/297406的优先权。
技术领域
本发明属于植物分子生物学领域，特别是植物昆虫保护和植物育种领域，并且涉及棉花植物——陆地棉的新的转化事件，包括插入棉花细胞基因组中的特定位点上的多核苷酸序列，所述序列编码Cry2Ab鳞翅目昆虫抑制蛋白。另外，本发明涉及由所述转化事件产生的棉花植物，并且涉及检测所述事件在样品中的存在的测定方法。
背景技术
本发明涉及以前业已商业化的能表达嵌合形式的Cry1A昆虫抑制蛋白的，用于抗鳞翅目昆虫的被称为MON531的棉花植物事件。在世界上栽培植物的所有地方，棉花植物都容易受到昆虫的采食。重组DNA技术在棉花植物细胞上的应用已有大约10年时间，自从大约1990s初期，业已通过重组DNA技术生产出了具有改善了的特征的棉花植物，这是因为插入了异源DNA序列。由重组棉花植物所表现出来的某些改良包括除草剂耐受性，改善了的纤维特征，和对昆虫采食的抗性。
生产出了能防止鳞翅目昆虫采食的第一种重组棉花植物，并且得到了商业销售管理机构的批准，并且随后于1996年商业化。这种棉花植物含有编码嵌合Cry1 α鳞翅目昆虫抑制蛋白的、主要来自MON531事件的DNA序列。业已通过常规育种将这种特殊性状和与它相邻连接的编码选择标记的DNA序列转移到多种棉花品种中，每一种品种都特别适合于在世界上的各种地理位置上高产生产棉花。由于多种原因，所述重组品种业已获得了巨大的商业成功。一个原因是，由于在这种棉花植物的每一个细胞中都存在昆虫抑制蛋白，导致了昆虫采食的减少，因而大大改善了棉花生产的每英亩的平均产量。所述商业化成功的另一个主要原因是，由于减少了保护棉花作物免受昆虫损害的化学除草剂的应用，因而减少了劳动力和费用。另外，化学杀虫剂应用的减少改善了环境的整体健康状况，因为避免了对存在于威胁大田中的作物的材料上的昆虫或蛛形纲昆虫和其他物种的灭绝，减少了应用于环境中的化学杀虫剂毒素的负荷，并且使得农民能避免与接触化学杀虫剂的潜在有害作用相关的风险。
很快就会明白，具有较宽的抗昆虫效力的产品是理想的。尽管从化学角度来看，提供用于这一目的的昆虫抑制蛋白的组合可以被认为是简单的，并且可以推迟或避免由目标昆虫群体所产生的毒素抗性，但实际上培育满足上述特征的植物是存在问题的，并且需要大量的资源、技术能力，以及尝试和误差实验，以便获得单一的重组植物转化事件，该事件会产生具有理想的昆虫抑制蛋白组合的形态学上正常的植物，这种蛋白能够在植物生长期的适当时间，并且在目标害虫物种采食的组织中以足够的水平产生。
因此，有必要培育并鉴定具有增强了的昆虫抗性特征的棉花植物，这种增强的昆虫抗性是由于整合到植物细胞的基因组中的DNA序列所产生的两种或两种以上昆虫抑制蛋白的存在而导致的。另外，对于所述昆虫抑制特征来说，还希望(i)能彼此独立地分离，(ii)不会对所述植物的生理学和代谢产生任何负面影响，和(iii)对由所述植物所产生的纤维的产量或质量只有很小的负面影响(如果有的话)。
为了确定有性杂交的后代是否含有感兴趣的转基因，如果能够检测一种特定事件的存在将是有利的。另外，用于检测特定事件的方法将有助于符合要求种子销售在上市前得到批准的规定，以便生产转基因作物类植物，以及由所述作物所制成的食品，例如，或者用于环境监测，监测作物在大田中的性状，或监测由作物收获物所产生的产品，以及用于确保符合有关管理或条约的规定。
可以通过本领域公知的任何核酸检测方法检测转基因的存在，包括，但不限于热扩增(PCRTM)或用核酸DNA探针及其DNA杂交(通常，为了简便起见，用统一的试剂和方法检测业已被用于转化各种植物品种的特定DNA结构，所述检测方法通常集中在经常使用的遗传因子，例如启动子，终止子，标记基因等，因为对于很多DNA结构来说，编码序列区是可以交换的。结果是，所述方法不能用于区分由相同的DNA结构或非常相似的结构所产生的独立的事件。不过，如果靠近插入的DNA的染色体DNA序列(旁侧DNA)，就可以使用上述方法。例如，Windels等披露了一种事件专一性热扩增(PCRTM)测定方法(Med.Fac.Landbouww，Univ.Gent64/5b：459-462，1999)，该作者利用跨越插入片段和旁侧DNA之间的接头的热扩增引物组鉴定了草甘膦抗性大豆事件40-3-2。具体地讲，一种包括引物的序列来自插入片段内部，而第二种包括引物的序列包括旁侧DNA。还开发了用于事件MON531的所述方法，并且它是一份独立专利申请的主题，需要一种能够检测本发明的新的事件的存在，即使是在存在事件MON531的条件下检测的方法。业已通过本发明实现了上述和其他有利的进步。
发明内容
用包括编码Cry2Ab——一种昆虫抑制蛋白的编码序列的被命名为PV-GHBK11的遗传结构——再次转化上述棉花事件MON531，并且业已选择了该转化工作的一种事件用于潜在的商业化推广。将其命名为MON15985。因为它是一种新的插入事件，在自交时它会从MON531的Cry1Ac基因中分离。仅含有MON15985插入片段的棉花品系被命名为MON15985X。根据本发明的一个方面，提供了用于所述棉花品系的组合物。业已在2000年9月29日将包括棉花事件MON15985的棉花种子交给美国典型培养物保藏中心保藏，并且所确定的ATCC保藏号为PTA-2516，微生物分类命名是棉花(Cotton，Gossypium hirsutum)：15985。
在本发明的另一方面，提供了用于检测MON15985事件存在的方法。提供了用于鉴定插入的DNA序列和MON15985的天然棉花旁侧序列的DNA序列。根据所述DNA序列可以设计出用于PCR诊断测定的引物。提供了典型的引物，如在存在MON15985DNA的条件下进行扩增时使用所述引物所产生的扩增子。
应当指出的是，对于棉花事件MON15985插入的序列诊断的检测，可能不足以回答有关种子样品的所有问题。被命名为MON15985的所述种子体系含有所述插入片段以及以前被鉴定的MON531。因此，在本发明的另一方面，提供了用于区分MON15985和MON15985X，一种缺乏MON531事件的品系的方法。该方法使用一种或多种以前已知的诊断MON531的序列。
这里的一种连接序列跨越DNA插入所述基因组连接在位于插入点旁侧的棉花天然基因组DNA上的位点，植物遗传材料中一种或其他连接序列的鉴定或检测就足以诊断所述事件。其中包括跨越棉花事件MON15985的插入点并具有旁侧DNA的类似长度的DNA序列。所述诊断序列的例子是SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的二十聚体结合序列。不过，与所述插入点或连接点的结合部分重叠的小到15个碱基对的其他序列和基因组序列同样是诊断性的，并且可以使用。使用本文所提供的引物或由本领域普通技术人员所设计的引物对来自所述事件的基因组DNA进行的核酸扩增，生产出了含有所述诊断DNA序列的扩增子。另外，检测能专一性结合本文所披露的诊断序列的寡核苷酸的结合也可以诊断所述事件。
根据本发明的另一方面，提供了用于区别棉花事件MON15985和天然的、未转化过的和未受到破坏的序列的寡核苷酸序列引物对。具体地讲，所述旁侧序列引物对包括选自SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的两种分离核酸分子，所述序列的扩增子与插入的DNA的一个或多个连接序列重叠，在图1中用编号2、4、6、9和11表示。例如，人们还可以选择来自SEQ ID NO：11所示的大约1-361号碱基对位置的含有至少15个连续的核苷酸的分离的核酸，所述核酸来自位于插入的DNA5’末端旁侧的棉花基因组DNA序列，在图1中用编号1表示，以及来自SEQ IDNO：11的674-1361号碱基对位置的含有至少15个连续核苷酸的至少1个分离的核酸，该序列位于插入的DNA内，在图1中用编号3和5的部分表示。本领域普通技术人员可以方便地设计出可用于分析棉花事件MON15985的其他引物对，该引物对包括来自SEQ ID NO：11的1-1885号核苷酸的具有至少15个连续的核苷酸的至少一种分离的核酸，该核酸与来自SEQ ID NO：11的362-2267号核苷酸的具有至少15个连续的核苷酸的至少一种分离的核酸配对。类似地，引物对可以来自SEQ IDNO：12的1-673号核苷酸，以及来自SEQ ID NO：12的350-1361号核苷酸的核苷酸，每一种引物的长度至少为15个核苷酸。
根据本发明的另一方面，提供了可用于核酸扩增的特殊引物组。具体地讲，SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27就是这样的引物组，并且可用于生产能诊断棉花事件MON15985DNA存在的扩增子。SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29是另一种这样的引物组。相反，SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27能够用从除了棉花事件MON15985之外的来源获得的以及从包括位于MON15985序列整合到基因组上的位点上的野生型序列和MON15985整合序列的半纯合基因组获得的DNA样品生产扩增子，并且所述扩增子似乎可以诊断一种样品中来自棉花事件MON15985的插入DNA的缺乏，并且在含有所述事件的DNA的样品中不能生产扩增子。不过，在在理解所述结果时应当注意，并且本领域技术人员应当理解的是，当作为染色体对的半纯合成员存在时，用SEQ ID NO：26和SEQ IDNO：29作为诊断工具来证实阴性或阳性结果可能是错误的。
根据本发明的另一方面，提供了检测样品中相应于棉花事件MON15985的DNA存在的方法。所述方法包括：(a)让含有DNA的样品与一种引物组接触，所述引物组在用于棉花事件MON15985的基因组DNA的核酸扩增反应中时，能产生可以诊断棉花事件MON15985的扩增子；(b)实施核酸扩增反应，从而产生所述扩增子；和(c)检测所述扩增子。
根据本发明的另一方面，提供了检测相应于样品中棉花事件MON15985的DNA存在的方法，该方法包括：(a)让含有DNA的样品与一种探针接触，所述探针能在严格条件下与来自棉花事件MON15985的基因组DNA杂交，但是，在严格杂交条件下不能与来自对照棉花植物的DNA杂交；(b)让所述样品和探针经历严格杂交条件；和(c)检测所述探针与所述DNA的杂交。
本发明的另一方面是用于检测靶位点，即至少一个结合点存在的方法和组合物，所述结合点的鉴定和检测，可以诊断源于棉花事件MON15985或从棉花事件MON15985的基因组获得的核酸样品中与棉花事件MON15985中的棉花植物基因组整合的DNA的存在，使用多种检测方法，包括TAQMAN(Perkin Elmer)或相关的荧光团/淬火方法，热扩增，连接酶链式反应，Southern杂交，ELISA方法，和比色和荧光检测方法。具体地讲，本发明提供了用于检测靶序列存在的试剂盒，即含有来自棉花事件MON15985的基因组核酸的样品中棉花事件MON15985上的至少一个结合序列。所述试剂盒包括至少一种能够结合所述靶位点或基本上靠近所述靶位点的多核苷酸，以及至少一种用于检测所述多核苷酸与所述靶位点结合的方法。所述检测方法可以选自荧光、化学发光、比色或同位素方法，并且可以与用于检测结合的至少一种免疫学方法组合。还设计了一种可以检测靶位点在一种样品中的存在的一种试剂盒，即插入的DNA与MON15985事件中的棉花植物的基因组DNA的至少一个结合点，利用了两种或两种以上多核苷酸序列，这些序列组合在一起之后能够与靠近靶序列的或位于大约100个碱基对之内的核苷酸序列结合，或位于大约200个碱基对内，或位于大约500个碱基对内或位于大约1000个碱基对内，并且可以彼此相互延伸形成至少含有所述靶位点的扩增子。
通过以下详细说明和附图，可以更好地理解本发明的上述方面和其他方面。
附图说明
图1是位于插入序列旁侧的DNA和插入序列本身的序列比较的曲线图，包括棉花事件MON15985中的Cry2Ab基因。插入的DNA以单链形式表示，从左侧的5’到右侧的3’。本文所鉴定的单一的DNA序列按以下方法标记：编号1是5’末端旁侧基因组序列(SEQ ID NO：19)，编号2是与编号1和3的序列重叠的结合序列，它是一种如SEQ ID NO：14所示的诊断序列；编号3是核外DNA的与叶绿体相关的序列(SEQ IDNO：20)；编号4是与编号3和5的序列重叠的结合序列，它是SEQ IDNO：15所示的诊断序列；编号5是棉花基因组序列的残迹(SEQ ID NO：21)；编号6是与编号5和7重叠的结合序列，它是SEQ ID NO：16所示的诊断序列；编号7是有意插入的序列的5’末端的一部分(SEQ ID NO：22)；编号8是有意插入的序列的3’末端的一部分(SEQ ID NO：23)；编号9是与编号8和10的序列重叠的结合序列，它是SEQ ID NO：17所示的诊断序列；编号10是另一种非故意插入的棉花基因组序列的残迹(SEQ ID NO：24)；SEQ ID NO：11是与编号10和12的序列重叠的结合序列，它是SEQ ID NO：18所示的诊断序列；而编号12是SEQ IDNO：25所示的3’旁侧棉花基因组序列。
具体实施方式
业已通过遗传学方法将陆地棉(棉花)修饰成抗鳞翅目害虫，这种修饰会对棉花产量产生负面影响。这一目的是通过插入源于苏云金芽孢杆菌的编码杀昆虫Cry1Ac蛋白的第一种DNA盒和源于苏云金芽孢杆菌的编码杀昆虫Cry1Ab蛋白的第二种DNA盒而实现的。本发明优选涉及至少包括含右所述第二种DNA盒的序列的植物、植物部分、植物后代，并且涉及用于检测所述序列在样品中的存在的方法和组合物。
通过农杆菌属转化利用源于质粒PV-GHBK04(在US5500365中是pMON10518)将所述第一种DNA盒插入棉花栽培品种Coker312的基因组中，以便产生棉花事件MON531，业已利用该事件培育了很多不同的棉花品种，并且成功地进入了世界上的棉花市场。业已通过粒子加速技术用凝胶纯化的线性DNA片段，即质粒PV-GHBK11(或者被称为pB1579)的上文所披露的第二种盒，重新转化了棉花事件MON531，所述DNA片段含有Cry2Ab和β-葡糖醛酸酶(uidA)编码区(John，M.E.，1997，Cotton crop improvement through genetic engineering.CriticalReviews in Biotechnology，17，3：185-208)。用uidA基因作为选择标记，帮助鉴定含有Cry2Ab编码区的细胞。源于质粒pvGHBK11的Cry2Ab编码区包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，具有重复的增强子区(US5530196；5424200；和359142)可操作地连接在矮牵牛热激蛋白非翻译前导序列(pEThsp70-前导序列)上，可操作地连接或结合在源于拟南芥EPSPS基因的N-末端叶绿体转运肽上(AEPSPS/CTP2)(Van denBroeck等，1985，通过与源于核糖1，5-二磷酸羧化酶的小亚基的转运肽融合，将外源蛋白导向叶绿体，Nature313，358-61)，可操作地连接或结合在编码Cry2Ab蛋白的合成序列上(Widner，W.R.和Whiteley，H.R.1990，在来自苏云金芽孢杆菌的鳞翅目-双翅目结晶蛋白上的定位双翅目专一性区，J.Bacteriol，172，2826-32)，它可操作地连接或结合在源于根瘤农杆菌的胭脂氨酸合成酶(NOS)基因的3’非翻译区上，它能终止转录并指导聚腺苷酸化(Fraley，R.T.等，1983，细菌基因在植物细胞中的表达，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80，15，4803-07)。β-葡糖醛酸酶编码区同样是由强化的CaMV35S启动子和NOS3’聚腺苷酸化序列操纵的。将含有Cry2Ab和uidA编码序列的所述盒或基本上所述盒的全部插入棉花事件MON531，产生了一种MON15985的事件，该事件包括Cry1A编码序列以及编码Cry2Ab编码序列的盒。对MON15985事件进行的遗传学分析业已证实，这两种插入的盒位于不同的染色体上，因此可以在育种过程中分离，这种分离产生了原始的MON531事件基因型，以及被称为MON15985X的第二种基因型，第二种基因型是包括单一的插入盒，该插入盒包括决定编码Cry2Ab蛋白的基因。能产生棉花基因型MON15985和MON15985X基因型的转化事件被认为是本发明的主题。
提供以下定义和方法是为了更好地定义本发明，并且指导本领域普通技术人员实施本发明。除非另有说明，术语是按照相关领域的普通技术人员的常规使用方法理解的。分子生物学领域的常用术语的定义还可以参见Riger等，Glossary of Genetics：Classical and Molecular，5th edition，Springer-Verlag，New York，1991；和Lewin，Genes V，Oxford UniversityPress：New York，1994。采用在37CFR§1.822中所规定的对DNA碱基的命名。
含有
在本文中，术语“含有”表示“包括但不限于”。
事件
在本文中，转基因“事件”表示通过以下方法生产的重组植物：用异源DNA，即包括感兴趣的转基因的核酸结构转化植物细胞，再生通过将所述转基因插入所述植物基因组所产生的植物群体，以及筛选以插入特定基因组位点为特征的特定植物。术语“事件”表示包括所述异源DNA的原始转化体和该转化体的后代。术语“事件”还表示通过所述转化体和含有所述异源DNA的另一种品种之间的有性远交所产生的后代。即使在与轮回群体重复回交之后，来自转化亲本的插入的DNA和旁侧DNA仍然存在于杂交后代的相同染色体位点上。术语“事件”还表示来自所述原始转化体的DNA，它含有插入的DNA和紧靠插入的DNA的旁侧序列，预计该DNA能转移到接受了包括感兴趣的转基因的插入DNA的后代，所述后代是通过一个包括所述插入DNA的亲本系(例如，原始转化体和通过自交产生的后代)和不含有所述插入DNA的亲本系有性杂交而产生的。
探针和引物
“探针”是在它上面连接了常规的可检测标记或报导分子的分离的核酸，例如，放射性同位素、配体、化学发光试剂或酶。所述探针与靶核酸的一股链互补，对本发明来说，即与来自棉花事件MON15985的基因组DNA的一股链互补(来自棉花植物或来自包括源于所述事件的DNA的样品)。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且还包括聚酰胺和其他探针材料，这种材料能专一性地结合靶DNA序列，并且可用于检测靶DNA序列的存在。
“引物”是能够通过核酸杂交与互补的靶DNA链退火形成引物和靶DNA链之间的杂合体的分离的核酸，然后通过诸如DNA聚合酶的聚合酶沿靶DNA链延伸。可以用引物对或组扩增核酸序列，例如，通过聚合酶链式反应PCRTM(又被称为热扩增方法，或其他常规核酸扩增方法)。
所述探针和引物可以小到10个核苷酸，不过其长度通常为15个核苷酸或更长，优选20个核苷酸或更长，更优选25个核苷酸，最优选30个核苷酸或更长。所述探针和引物能在高严格条件下专一性地与靶序列杂交。本发明的探针和引物优选具有与所述靶序列的完整的序列互补性，不过，通过常规方法可以设计出与靶序列不同并且保留了与靶序列杂交的能力的探针。探针或引物或其他DNA序列的所有专一性序列都包括它的互补性序列。
例如，制备和使用探针和引物的方法披露于以下文献中：MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd.vol.1-3，ed.Sambrook等，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989(以下称之为“Sambrook et al.1989”)；Current Protocols in Molecular Biology，ed.S.Ausubel et al.，Greene Publishing andWiley Interscience，New York，1992(定期更新)(以下称之为“Ausubel et al.，1992”)；和Innis et al.，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，Academic Press：SanDiego，1990。PCRTM-引物对可以来自已知序列，例如通过使用用于引物设计的计算机程序(Version0.5，1991，Whitehead Institute for BiomedicalResearch，Cambridge，MA)。
可以利用基于本文所披露的旁侧DNA和插入序列的引物和探针通过常规方法来证实(如果需要的话，校正)所披露的序列，例如通过对所述序列进行再克隆和测序。
核酸杂交；严格的条件；专一性
本发明的核酸探针和引物能在严格条件下与靶DNA序列杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可用于鉴定来自转基因事件的DNA在一种样品中的存在。
术语“严格条件”是通过披露于Sambrook et al.1989，9.52-9.55中的专一性杂交方法对核酸探针与靶核酸(即与感兴趣的特定核酸序列)的杂交进行的功能性定义。还可以参见Sambrook et al.1989，9.47-9.52，9.56-9.58；Kanehisa，Nucl.Acids Res.12：203-213，1984；和Wetmur和Davidson，J.Biol.31：349-370，1968。
对于用特定的扩增引物对进行的靶核酸序列的扩增(例如PCRTM)来说，“严格条件”是使得所述引物对只能与靶核酸序列杂交的条件，引物与它具有相应的野生型序列(或补体)的靶核酸序列能够结合，并且优选产生特殊的扩增产物。
术语“对(靶序列)专一”表示一种探针或引物在严格条件下只能与含有靶序列的样品中的靶序列杂交。
核酸扩增
在本文中，“扩增的DNA”或“扩增子”表示作为核酸模板一部分的靶核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了确定通过有性杂交所产生的棉花植物是否含有来自棉花植物的转基因事件基因组DNA，可以用一种引物对扩增核酸，所述引物对包括源于所述植物基因组的靠近插入的异源DNA的插入位点的旁侧序列的引物，和源于插入的异源DNA的第二种引物，以便产生用于诊断所述事件存在的扩增子(例如所述扩增子具有用于诊断所述事件的长度和序列)。另外，引物对可以源于所述插入的DNA两侧的旁侧序列，以便产生包括整个插入片段的扩增子。
核酸扩增可以通过本领域已知的多种核酸扩增方法中的任一种进行，包括聚合酶链式反应(PCRTM)。有多种扩增方法为本领域所公知，并且特别批露于以下文献中:US4683195和4683202，以及PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，ed.Innis et al.，Academic Press：SanDiego，1990。用于核酸扩增的任何已知方法都可用于实施本发明。
可以通过以下方法证实(并且校正，如果需要的话)源于棉花事件MON15985的异源DNA插入片段或旁侧序列的序列：用源于本发明所提供的序列的引物扩增源于所述事件的所述序列，然后进行标准DNA测序。
检测试剂盒
在本文中，“检测试剂盒”表示用于检测样品中源于MON15985事件的DNA的存在或缺乏的试剂盒，该试剂盒包括能在严格条件下与靶DNA序列杂交的本发明的核酸探针和引物，以及实施核酸杂交或扩增方法所需要的其他材料。另外，检测试剂盒可以包括使得本领域技术人员能够实施类似于在被收作本文参考的PCT国际申请号WO97/22719中所批露的方法所需要的材料，以便检测样品中源于MON15985事件的DNA的存在或缺乏。
例1
业已将棉花(陆地棉)通过遗传学方法修饰成抗鳞翅目害虫，这种修饰对棉花产量有负面影响。这一目的是通过本文所批露的方法实现的，通过农杆菌转化，利用源于质粒PV-GHBK04(在US5500365中被称为pMON10518)的DNA片段插入源于苏云金芽孢杆菌的编码杀昆虫Cry1Ac蛋白的DNA盒。这种转化导致在棉花基因组上插入了三个独立的片段，决定在棉花事件531中表达Cry1Ac蛋白的主要的、功能性插入片段包括上文所批露的强化35S启动子、Cry1Ac编码区和与编码抗生素选择标记的序列连接的终止序列。靠近所述第一个插入片段并位于该序列上游的第二个插入片段包括部分Cry1Ac编码区和终止序列。第二个插入片段仅包括部分终止序列，并且业已证实与上文所述的前两种序列独立地分离。第一种和第二种插入序列是紧密连锁的，因此不会彼此分离。棉花基因组序列位于所有三个插入片段的5’和3’末端。因此，通过所述转化方法产生了六种独特的棉花基因组/插入片段结合。可以对以上六种结合中的任一种进行分析，以便确定MON531事件是否存在于棉花种子样品中。
对棉花事件MON531进行分子分析，以便确定所述转基因DNA插入片段之一的末端，并且鉴定所述转基因DNA插入片段的旁侧棉花基因组DNA。基因组步移研究与核苷酸测序组合进行得到了所述主要插入片段的两种棉花基因组/插入片段结合的DNA序列，SEQ ID NO：1和SEQID NO：2及其互补体。然后按照以下方法鉴定可用于诊断MON531的旁侧序列和插入片段序列：SEQ ID NO：3，所述主要插入片段的5’末端序列；SEQ ID NO：4，5’末端的旁侧棉花基因组序列；SEQ ID NO：5，位于3’的所述插入片段序列；和SEQ ID NO：6，3’末端旁侧的基因组序列。如上文所述，引物可源于用于DNA扩增方法的序列，例如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。SEQ ID NO：9是一部分DNA的序列，它与棉花基因DNA和插入的DNA的一端重叠；SEQ ID NO：10是一部分DNA的序列，它与棉花基因组DNA和所述插入的DNA的另一个末端重叠。
下面提供了如何利用所述新的核酸序列检测样品中的棉花事件MON531的非限定性例子，包括被命名为MON15985的种子品系，以及检验其在被命名为MON15985X的种子品系中的缺乏。
分离用于PCRTM分析的DNA
从种子组织中提取棉花事件MON531的DNA。从对照物质(非转基因棉花种子和叶片组织)的种子和叶片组织中提取DNA，通过用可以从商业渠道获得的搅拌器将种子加工成细粉，以便从种子中提取DNA。将大约2克加工过的种子转移到50毫升锥形试管中，并且将大约16毫升CTAB提取缓冲液[1.5％(w/w)CTAB，75mM Tris-HCl，pH8.0，100mMEDTA，pH8.0，1.05M氯化钠和0.75％(w/w)PVP(MW40000)]添加到所述处理过的种子中。在65℃下培养所述样品大约30分钟，进行间歇性地混合，然后冷却到室温。将等体积的(大约16毫升)室温下的氯仿：异戊醇(24：1v/v)或氯仿添加到所述样品中。通过倒转混合该悬浮液，并通过以大约16000×g的速度离心5分钟分离两种相。用移液管取出含水层(上层)，并且放入一只干净的50毫升的锥形试管中。将大约1/10倍体积(大约1.6毫升)的大约10％CTAB缓冲液[10％(w：w)CTAB，0.7M氯化钠]添加到所述水相中，然后通过倒转混合。以大约16000×g的速度将所述样品离心5分钟，以便分离各相。取出水相(上部)与等体积的(大约15毫升)CTAB沉淀缓冲液[1％(w：w)CTAB，50mMTris，pH8.0和10mMEDTA，pH8.0]混合，并且在室温下放置大约1小时。以大约10000×g的速度对样品进行离心，以便使DNA沉淀，倒出上清液，并且将沉淀溶解在大约2毫升的高盐TE[10mM Tris-HCl，pH8.0，10mMEDTA，pH8.0，和1M氯化钠]中，在37℃下培养大约2小时，同时轻柔地搅拌。以大约23000×g的速度离心，使所有残余的杂质沉淀。取出上清液，放入一只干净的15毫升试管中，并且添加大约1/10体积的(大约150微升)3M乙酸钠，pH5.2，和2体积的(相对上清液，大约4毫升)冰镇100％乙醇，使DNA沉淀。将沉淀的DNA卷绕到装有大约1毫升70％乙醇的微型离心机试管中。在微型离心机上以最大速度(14000rpm)离心5分钟使DNA沉淀，干燥，并且重新溶解在TE，pH8.0中，在4℃的冰箱中过夜。
被用作对照的非转基因棉花基因组DNA是从在液氮中冷冻并且用研钵和研棒研磨成细粉的叶片组织中分离的。将大约1克研磨的叶片组织转移到13毫升的离心管中，并且添加6毫升提取缓冲液[2.5毫升DNA提取缓冲液(350mM山梨醇，100mM Tris，pH7.5，5mM EDTA，0.38％(w/v)硫酸氢钠)，2.5毫升细胞核裂解缓冲液(200mM Tris，pH7.5，50mM EDTA，2M氯化钠，2％(w/v)CTAB)，和1毫升十二烷基肌氨酸钠(5％(w/v)溶液)]。在65℃下将所述样品培养大约30分钟，进行间歇性混合。将室温下的4.5毫升氯仿：异戊醇(24：1(v/v))添加到所述样品中。将所述悬浮液混合2-3分钟，并通过在4℃下以大约2000×g的速度离心分离两种相。用移液管取出含水层(上部)，并且放入13毫升的离心管中。添加5毫升100％的异丙醇，并通过倒转混合所述试管，使DNA沉淀。将DNA的沉淀卷绕到装有500微升70％乙醇的微型离心管中，在微型离心机上以最大速度(14000rpm)离心2分钟使DNA沉淀。干燥所述DNA，并且溶解在TE缓冲液中，在4℃的冰箱中过夜。
PCRTM证实棉花事件MON531中的特殊插入片段-棉花基因组结合。
使用基于PCRTM的通用基因组步移试剂盒TM，按照生产商的方法鉴定四种基因组/插入片段结合的DNA序列，然后对PCRTM产物进行核苷酸测序。然后，使用一种互补于棉花基因组DNA的引物和互补于插入的转基因DNA的另一种引物进行PCR测定。例如，将一种引物设计成互补于基因组旁侧序列的主要的功能性插入片段的3’末端(例如，SEQ IDNO：6)，该引物与位于互补于插入的转基因序列的所述主要的功能性插入片段的3’末端的第二种引物(例如，SEQ ID NO：5)配对。使用10-100纳克的棉花事件MON531基因组DNA模板在50微升反应体积中进行PCRTM测定，所述反应体积中含有终浓度为1.1mM镁离子，0.4μM每一种引物，200μM每一种dNTP，和2.5单位的TaqDNA聚合酶。PCRTM测定的反应是在以下循环条件下进行的：1轮94℃3分钟；30轮94℃30秒，60℃30秒，72℃90秒；1轮72℃1分钟；通过琼脂糖凝胶电泳分离PCRTM产物。通过溴化乙锭染色观察，从凝胶上切除，并且用染料终止子化学方法对DNA进行测序证实所述序列。
在上述实施例中，正如所预料的，没有模板DNA和Coker312非转基因负对照DNA的对照反应不能产生PCRTM产物。所述棉花事件MON531样品产生了3’旁侧序列的264bp的预期大小的PCRTM产物。因此，将位于棉花事件MON531中的插入的DNA和棉花基因组DNA的结合部分的新的核酸序列用于检测样品中的源于棉花事件MON531的DNA。
将品种Coker312背景中的MON531杂交转移到品种DP50(Delta&Pine Land Company)中，以便产生含有编码Cry1Ac蛋白的MON531事件的品种，该品种被命名为DP50B。
例2
本实施例披露了被命名为MON15985的源于DP50B的含有编码Cry2Ab昆虫抑制蛋白的额外插入事件的转化过的棉花植物的生产，以及位于MON159855’和3’末端旁侧的5’和3’DNA序列的分离和鉴定。
通过粒子加速技术，使用源于质粒PV-GHBK11的线性DNA片段转化靶DP50B植物细胞。通过用限制性酶KpnI消化质粒PV-GHBK11制备线性DNA片段。通过琼脂糖凝胶电泳分离质粒片段，并且提取包括含有Cry2Ab编码序列和uidA编码序列(GUS)的盒的DNA片段。在分离和纯化和制备用于棉花组织轰击的片段和序列内不包括质粒主链。所述表达盒包括受强化CaMV35S植物表达启动子和根瘤农杆菌NOS3’转录终止序列和聚腺苷酸化序列调控的Cry2Ab编码区。将Cry2Ab设计成针对作为叶绿体输入植物细胞的前体蛋白的表达产物(披露于WO0026371和美国专利申请流水号09/186002中，申请日为1998年11月4日，所述专利的完整内容被收作本文参考)。
通过用静电放电方法轰击用DNA包衣的金颗粒，利用上述DNA盒转化棉花品种DP50B(John，M.E.，通过遗传工程技术对棉花作物进行改良。Critical Reviews in Biotechnology，17：185-208，1997)。筛选不同事件的抗昆虫害虫的效力、表现型、以及Cry2Ab蛋白的表达的遗传学分离。根据以上标准，选择了6个品系对所述插入事件作进一步的鉴定。将Southern印迹作为评估一个或多个拷贝数的插入事件的插入和互补性的存在的主要方法。选择其中的一个品系15985对插入DP50B基因组的插入事件进行充分的分子鉴定。分离并鉴定所述插入事件周围的DNA。
分离插入事件旁侧的DNA：通过购自Amersham的改进的Phyto-Pure
从幼小的棉花叶片中提取DNA，该方法被设计成从具有大量污染性碳水化合物的植物中提取DNA。为了界定插入的Cry2Ab编码序列周围的DNA的序列，使用了Clone Tech，Inc.的基因组步移方法。采用生产商推荐的条件，只进行了一种改进：在用内切核酸酶裂解之后，不是用苯酚提取来纯化DNA，而是用Qiagen QIAquick螺旋柱按照生产商的指导手册纯化DNA。
在接头连接之前，用于裂解基因组DNA的酶是DraI、PvuII、ScaI和StuI。按照Qiagen提供的方法在5倍体积的PB缓冲液中提取DNA，结合到所述柱上，用0.75毫升的PE洗涤，然后从所述柱上洗脱到20毫升的10mM Tris pH8.5中。然后将该DNA用作接头文库的来源。精心选择引物位点，使其远离将DNA线性化的末端，以便在每一个末端可以有一定量的缺失。将第一种引物(SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31)设计成与Cry2Ab编码序列的特有序列退火，因为在棉花基因组中存在重复的DNA因子。使用直接靠近用于第一种反应的嵌套引物(SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33)对所得到的PCRTM产物进行第二种PCRTM反应。所使用的PCRTM参数是由CloneTech推荐的。主要扩增参数如下：7轮94℃2秒，72℃3分钟，32轮94℃2秒，68℃3分钟，第二种扩增参数如下：5轮94℃2秒，72℃3分钟，20轮94℃2秒，68℃3分钟，以及在最后1轮中为68℃40分钟。所有PCRTM反应是在Perkin-Elmer9700仪器上进行的。
将来自第二次扩增的PCRTM产物克隆到购自Stratagene的pBS(SK+)载体上，所述载体业已用SmaI裂解过，以便产生平端，并且用碱性磷酸酶处理，以便抑制自我连接。在第二种PCR反应中产生的DNA片段用T4DNA激酶，以便添加5’磷酸，然后在标准连接条件下连接到所述平端载体上。
基因组步移方法：用嵌套引物对进行的二级PCRTM反应，产生了从5’和3’末端合成的多种片段。克隆5’末端的三个独立的片段，并且用本领域众所周知的方法测序，同时对来自3’末端的两个片段进行克隆和测序。对每一个独立的片段来说，获得了至少两个独立的克隆。
将来自每一种引物的克隆的序列与另一种进行比较。确定相应克隆之间的所述序列是相同的，并且含有相同的植物反式基因结合。
例3
本实施例说明了如何利用MON15985插入事件旁侧的DNA序列测定接合性。
基于PCRTM的测定方法的设计和开发，用于检测MON15985插入事件的纯合性：将位于MON15985插入事件旁侧的两个部分的DNA序列用于设计基于PCRTM的纯合性测定。如果这种测定能够检测专一性MON15985插入事件和野生型染色体，就认为这种测定是有用的。为了检验开发一种同样能够检测野生型染色体的测定方法的可行性，根据直接与所述插入事件相邻的序列设计引物，并且检验它是否能用于在非转基因棉花以及在15985品系中合成DNA片段。所选择的引物能够合成完整的MON15985插入事件，但是在非转基因对照中没有出现产物。以上结果表明，所述插入事件不是简单地破坏了所述DNA以及所述DNA序列的插入以及编码Cry2Ab蛋白的盒。不过，这一结果确定了所述两个末端确实与含有Cry2Ab的完整的基因盒连接并且位于该基因旁侧。
设计插入片段3’末端旁侧的氨基酸序列的引物，以便通过基因组步移方法在用非转基因棉花DNA制备的接头文库中扩增片段。由非转基因棉花克隆一个620bp的片段，并且测序。然后利用该序列设计用于野生型染色体的引物，所述野生型染色体存在于杂合型个体中。制备了若干组引物，并且在一起检测，以便发现能在单一反应中起作用并且不会产生背景带的一组引物。发现包括SEQ ID NO：34(3’棉花植物旁侧序列)和SEQ ID NO：35(5’棉花植物旁侧序列)的引物组能够由野生型或非转基因棉花DNA产生800bp的扩增子。不过，如果存在至少一个插入片段的话，包括SEQ ID NO：36的引物将会与Cry2Ab专一性序列退火，并且产生1.5kb的扩增子，其中的一个引物与3’棉花植物旁侧序列(SEQ ID NO：34)退火。因此，用包括SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35的PCRTM引物获得的测定结果如下：如果一种个体的MON15985插入事件是纯合的话，就仅存在1.5kb的一条带；但是，如果它是杂合的话，就还会存在另一个0.8kb的带。
对这两条带(1.5kb和0.8kb)进行克隆和测序，以便证实其身份。在杂合性个体中产生的800bp片段的DNA序列与用来自3’末端和非转基因DNA的引物产生的基因组步移片段的序列相同。
证实基于PCRTM的接合测定：为了验证接合测定的精确性，用MON15985的已知的纯合型、杂合型和阴性转基因后代进行了一系列实验。
R2
表现型：对来自三种推测的R1基因型的15个R2个体植物进行鉴定，通过ELISA确定Cry2Ab蛋白的存在或缺乏，在该研究中呈阳性的感兴趣的植物含有MON15985-2和MON15985-34。业已确定植物MON15985-71对于Cry2Ab蛋白来说是阴性的。
R3
表现型：将来自所选择的每一个R2植物的15个单个R3种子种植在4英寸的花盆中，然后通过定性ELISA筛选Cry2Ab蛋白的存在。该ELISA结果表明，MON15985-2的所有R3植物都是阳性的，因此可以确定R2亲本的Cry2Ab基因是纯合的。MON15985-34的R3后代是阳性和阴性植物的混合，R2亲本被确定为Cry2Ab基因杂合的。MON15985-71的所有R3植物是阴性的，并且证实了R2亲本也是阴性的。
基因型：对MON15985-2和MON15985-71的5个R3植物进行基于PCRTM的结合测定。使用上文所述的引物和技术。该测定的结果提供了预期的带型。MON15985-2的所有后代只产生了支持上述ELISA结果的单一的1.5kb的带，这表明MON15985-2品系的Cry2Ab基因是纯合型阳性的。MON15985-71的所有后代仅产生存在于野生型中的单一的0.8kb的带，因此支持了证实该品系的Cry2Ab基因是纯合阴性的ELISA结果。同样对MON15985-34的14个单个R2家族的每一个家族的每一个后代进行筛选，得到纯合型、杂合型和阴性植物的组合。
R4
让来自所有三个R3群体的5个单株进行自花授粉，并且生长到收获。将来自每一个R3植物的15个R4后代种植到4英寸的花盆中，通过PCRTM进行检测，以便证实R3植物的结果。因此，如果R3PCRTM的结果是纯合的话，所有的R4后代都应当是纯合的，而如果R3PCR结果是杂合的话，R4后代就会是纯合型、杂合型和阴性植物的混合。所有R4后代家族都产生了基于R3PCRTM测定的预期结果。因此，基于PCRTM的测定方法提供了用于对植物的接合性进行分型的可靠方法。
例4
本实施例说明了位于棉花事件MON15985中的插入片段的5’和3’末端的旁侧DNA序列。
来自MON15985的DNA是从在液氮中冷冻并且用研钵和研棒研磨成细粉的叶片组织中分离的。将大约1克研磨的叶片组织转移到13毫升的离心管中，并且添加6毫升提取缓冲液[2.5毫升DNA提取缓冲液(350mM山梨醇，100mM Tris，pH7.5，5mM EDTA，0.38％(w/v)硫酸氢钠)，2.5毫升细胞核裂解缓冲液(200mM Tris，pH7.5，50mM EDTA，2M氯化钠，2％(w/v)CTAB)，和1毫升十二烷基肌氨酸钠(5％(w/v)溶液)]。在65℃下将所述样品培养大约35分钟，进行间歇性混合。将室温下的4.5毫升氯仿：异戊醇(24：1(v/v))添加到所述样品中。将所述悬浮液混合2-3分钟，并通过在4℃下以大约2000×g的速度离心分离两种相。用移液管取出含水层(上部)，并且放入13毫升的离心管中。添加5毫升100％的异丙醇，并通过倒转混合所述试管，使DNA沉淀。将DNA的沉淀卷绕到装有500微升70％乙醇的微型离心管中，在微型离心机上以最大速度(14000rpm)离心2分钟使DNA沉淀。干燥所述DNA，并且溶解在TE缓冲液中，在4℃的冰箱中过夜。
从种子组织中提取棉花事件DP50对照的DNA。通过用可以从商业渠道获得的搅拌器将种子加工成细粉，以便从种子中提取DNA。将大约2克加工过的种子转移到50毫升锥形试管中，并且将大约16毫升CTAB提取缓冲液[1.5％(w/w)CTAB，75mM Tris-HCl，pH8.0，100mM EDTA，pH8.0，1.05M氯化钠和0.75％(w/w)PVP(MW40000)]添加到所述处理过的种子中。在65℃下培养所述样品大约30分钟，进行间歇性地混合，然后冷却到室温。将等体积的(大约15毫升)室温下的氯仿：异戊醇(24：1v/v)或氯仿添加到所述样品中。通过倒转混合该悬浮液，并通过以大约16000×g的速度离心5分钟分离两种相。用移液管取出含水层(上层)，并且放入一只干净的50毫升的锥形试管中。将大约1/10倍体积(大约1.5毫升)的10％CTAB缓冲液[10％(w：w)CTAB，0.7M氯化钠]添加到所述水相中，然后通过倒转混合。以大约16000×g的速度将所述样品离心5分钟，以便分离各相。取出水相(上部)与等体积的(大约15毫升)CTAB沉淀缓冲液[1％(w：w)CTAB，50mM Tris，pH8.0和10mMEDTA，pH8.0]混合，并且在室温下放置大约1小时。以大约10000×g的速度对样品进行离心，以便使DNA沉淀，倒出上清液，并且将沉淀溶解在大约2毫升的高盐TE[10mM Tris-HCl，pH8.0，10mM EDTA，pH8.0，和1M氯化钠]中，在37℃下培养大约2小时，同时轻柔地搅拌。以大约23000×g的速度离心，使所有残余的杂质沉淀。取出上清液，放入一只干净的15毫升试管中，并且添加大约1/10体积的(大约150微升)3M乙酸钠，pH5.2，和2体积的(相对上清液，大约4毫升)冰镇100％乙醇，使DNA沉淀。将沉淀的DNA卷绕到装有大约1毫升70％乙醇的微型离心机试管中。在微型离心机上以最大速度(14000rpm)离心5分钟使DNA沉淀，干燥，并且重新溶解在TE，pH8.0中，在4℃的冰箱中过夜。
在产生所述DNA的研究中，在开始研究之前对分别来自DP50和MON15985的DNA进行定量。DNA定量是使用Hoefer DyNA Qua nt200荧光计，用Boehringer Mannheim分子大小标记IX作为DNA校正标准物进行的。
位于棉花事件MON15985中的编码Cry2Ab蛋白的插入片段5’末端旁侧的基因组序列的PCR分析是用源于5’基因组旁侧序列的引物进行的，该引物与位于插入的DNA上的靠近强化CaMV35S启动子序列的跨越1894bp区的第二种引物配对(SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27)。对编码Cry2Ab蛋白的棉花、事件MON15985种的插入片段3’末端的旁侧基因组序列的PCR分析是用MON3’聚腺苷酸化序列上的靠近插入片段3’末端的引物进行的，该引物与源于3’基因组旁侧序列的跨越763bp片段的第二种引物配对(SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29)。
用源于棉花事件MON15985或非转基因对照品系DP50的基因组DNA进行PCR分析。PCR分析是使用35-50纳克棉花事件MON15985或非转基因品系DP50基因组DNA模板在50微升反应体积中进行的，反应混合物中含有终浓度为1.5mM的镁离子，0.2μM每一种引物，200μM dNTP，和2.5单位Platinum TaqDNA聚合酶(Gibco BRL)。插入片段5’末端的反应是在以下循环条件下进行的：1轮94℃3分钟；35轮94℃1分钟，56℃1分钟，72℃2分钟；1轮72℃10分钟。插入片段3’末端的反应是在以下循环条件下进行的：1轮94℃3分钟；35轮94℃1分钟，5℃1分钟，72℃45秒；1轮72℃10分钟。在1.0％琼脂糖凝胶上分离PCR产物。在100V电压下进行电泳大约1.5-2小时，通过溴化乙锭染色进行观察。
通过在1.0％琼脂糖凝胶上对20微升的PCR产物进行凝胶电泳分离用两种引物对制备的含有棉花事件MON15985中的编码Cry2Ab蛋白的插入片段的5’和3’末端的旁侧序列的预期大小的PCR产物。从凝胶中切除代表5’或3’旁侧序列的PCR产物，并且用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)按照生产商提供的方法进行纯化。对两种分析来说，用PCR引物通过染料终止子化学方法对纯化的PCR产物进行测序。由于PCR产物的长度，利用用于制备产物的引物以及被设计成扩增序列的内部序列的引物进行测序。
对从棉花事件MON15985和非转基因品系DP50提取的基因组DNA进行PCR分析，以便证实位于棉花事件MON15985中的插入片段的5’和3’末端的旁侧DNA序列。正如所预料的，不含模板DNA的对照反应以及含有DP50非转基因棉花DNA的反应不能产生PCR产物。对棉花事件MON15985DNA进行PCR分析产生了1894bp的预期大小的产物，它代表编码Cry2Ab蛋白的插入片段的旁侧序列和5’末端的一部分。正如所预料的，不含模板DNA的对照反应和含有DP50非转基因棉花DNA的反应不能产生PCR产物。对棉花事件MON15985DNA进行PCR分析产生了763bp的预期大小的产物，它表示所述插入片段的旁侧序列和3’末端的一部分。以上结果表明，从棉花事件MON15985中的编码Cry2Ab的插入片段的两端产生了推测大小的PCR产物。
代表插入片段5’末端的旁侧棉花基因组DNA序列和插入片段5’末端的DNA的共有序列如SEQ ID NO：11所示。所述5’共有序列资料包括所述插入片段旁侧的1877bp的DNA，随后是390bp的含有强化CaMV35S启动子的序列。362-750碱基对表现出与叶绿体DNA具有同源性。代表插入片段3’末端的旁侧棉花基因组DNA序列和插入片段3’末端的DNA的共有序列如SEQ ID NO：12所示。3’共有序列数据包括349bp的插入序列，该序列含有NOS3’聚腺苷酸化序列的3’末端和多接头序列，随后是插入片段旁侧的1012bp的棉花基因组DNA。本文所提供的5’和3’共有序列是多次测序反应的组合，并且比用于制备该序列的PCR产物的长度短。以上数据描绘了棉花事件MON15985中的插入片段的5’和3’末端，并且示出了仅靠插入片段两个末端旁侧的DNA。
以上数据表明，棉花事件MON15985含有单一的DNA插入片段，该插入片段包括(1)受强化35S CaMV启动子(在5’末端缺乏大约260bp)和NOS3’聚腺苷酸化序列调控的编码UidA的序列(GUS)；和(2)受强化35S CaMV启动子(在5’末端缺乏大约260bp)和NOS3’聚腺苷酸化序列调控的编码Cry2Ab的编码序列(图1)。在本实施例中进行的PCR和序列分析证实了棉花事件MON15985中编码Cry2Ab的插入片段的5’和3’末端序列，并且证实了插入片段5’和3’末端旁侧的基因组DNA序列。
例5
本实施例说明了棉花事件MON15985旁侧序列的物理学特征，并且鉴定了棉花事件MON15985中插入的DNA的5’和3’末端旁侧的其他DNA序列的性质和物理学定位。通过Southern印迹分析基因组DNA，以便确定插入事件的数量，插入的DNA的拷贝数量，插入的启动子的完整性，编码区，以及聚腺苷酸化序列，和质粒主链序列的存在和缺乏。所有分析都是用棉花品系DP50B(对照)和新生产的MON15985事件进行的，以便鉴定新插入的DNA。另外，通过PCR证实了5’和3’“插入片段-至-植物”结合的旁侧序列(以前是通过基因组步移测定的)。
质粒PV-GHBK11-来源质粒，在以上分析中被用作主要参考物质。将与来自DP50对照物质的质粒用作大小标记以及用作Southern印迹分析中的阳性杂交对照。另外，将购自Boehringer Mannheim[分子量标记II(23.1kb-0.6kb)和IX(1.4kb-0.072kb)，产品目录号分别为#236250和#1449460]和Gibco BRL[大分子量DNA标记(48.5kb-8.3kb)和100bp的序列梯(2.1kb-0.1kb)，产品目录号分别为#15618-010和#15628-019]的分子大小标记用于大小估计。
用多种限制酶消化来自抗昆虫型棉花事件MON15985的基因组DNA，并且进行Southern印迹杂交分析，以便鉴定整合到DP50B基因组中的编码Cry2Ab和GUS的DNA。
将从叶片组织中提取的DNA用于本实施例的所有分析中，只有用NOS3’聚腺苷酸化序列探针检测的用于检测uidA基因盒完整性的非转基因样品例外，该样品是按照Rogers和Bendich的方法分离的(1985)。将大约1克研磨的叶片组织转移到13毫升的离心管中，离心管中装有6毫升提取缓冲液[2.5毫升DNA提取缓冲液(350mM山梨醇，100mM Tris，pH7.5，5mM EDTA，0.38％(w/v)硫酸氢钠)，2.5毫升细胞核裂解缓冲液(200mM Tris，pH7.5，50mM EDTA，2M氯化钠，2％(w/v)CTAB)，和1毫升十二烷基肌氨酸钠(5％(w/v)溶液)]。在65℃下将所述样品培养大约30分钟，进行间歇性混合。将室温下的4.5毫升氯仿：异戊醇(24：1)添加到所述样品中。将所述悬浮液混合2-3分钟，并通过在4℃下以大约1000×g的速度离心15分钟分离两种相。用移液管取出含水层(上部)，并且放入13毫升的离心管中。添加5毫升100％的异丙醇，并通过倒转混合所述试管，使DNA沉淀。通过在4℃下以大约1000×g的速度离心5分钟使DNA沉淀。用大约1毫升70％乙醇洗涤沉淀，通过在4℃下以大约1000×g的速度离心5分钟。在室温下干燥所述DNA，并且溶解在TE缓冲液中，在4℃的冰箱中过夜。
DNA定量是使用Hoefer DyNA QunatTM200荧光计San Francisco，CA，用Boehringer Mannheim分子大小标记IX作为DNA校正标准物进行的。
将来自测试和对照品系的大约10微克基因组DNA用于限制酶消化。按照生产商的方法用100个单位的限制酶，在500微升的总体积中，在37℃下进行消化过夜。用5或10pg PV-GHBK11强化某些对照消化。所有限制酶都是从Boehringer Mannheim购买的。在消化之后，通过添加1/10体积(大约50微升)的3M乙酸钠和2倍体积的(相对原始消化体积而言为大约1毫升)100％的乙醇使样品沉淀，然后在-20℃下培养至少1小时。通过离心使消化的DNA沉淀，用70％的乙醇洗涤，真空干燥10-20分钟，在室温下重新溶解在水或TE中。
在1×TBE缓冲液中，在0.8％的琼脂糖凝胶上分离消化过的DNA。进行‘长时间电泳’和‘短时间电泳’以便分别进行Southern印迹分析。长时间电泳有利于更好地分辨高分子量DNA，而短时间电泳能确保所有较小分子量的DNA都留在凝胶上。长时间电泳/短时间电泳包括在80-85V的电压下电泳4-6小时，或者在35-38V的电压下电泳一夜(9-15小时)。在电泳之后，用0.5微克/毫升的溴化乙锭对凝胶进行20-30分钟的染色，并且照相。
从过夜的大肠杆菌培养物中分离质粒PV-GHBK11DNA。用PV-GHBK11作模板通过PCR制备与Cry2Ab编码区、uidA编码区、强化CaMV35S启动子、NOS3’聚腺苷酸化序列和完整的主链片段同源的探针模板。
通过随机启动方法(RadPrime DNA Labeling System，LifeTechnologies)，用32P-dCTP标记大约25纳克的每一种探针模板，NOS3’聚腺苷酸化序列除外。NOS3’聚腺苷酸化序列是在20微升的最终体积中通过PCR用NOS3’模板(15纳克)、NOS3’专一性引物(各0.5μM)、1.5mM氯化镁、3μM dATP、dGTP和dTTP、100μCi的32P-dCTP和2.5单位的Taq DNA聚合酶标记的。循环条件如下：1轮94℃3分钟；5轮94℃45秒，55℃30秒，和72℃1分钟；1轮72℃10分钟。用Sephadex G-50柱(Boehringer Mannheim)纯化放射性标记过的探针。
用业已完善的方法进行Southern印迹分析(Southern，1975)，一般参见Maniatis Fritsch Sambrook(冷泉港)。在电泳之后，在脱嘌呤溶液(0.125N盐酸)中培养凝胶大约10分钟，然后在变性溶液(0.5M氢氧化钠，1.5M氯化钠)中培养大约30分钟，然后在中和溶液(0.5MTris-HCl，pH7，1.5M氯化钠)中培养大约30分钟。用TurboblotterTM(Schleicher&Schull)将凝胶中的DNA转移到Hybond-NTM尼龙膜(Amersham)上。让DNA转移4小时至一夜(在20×SSC)中，并且通过可以调整到自动交联的UV SratalinkerTM1800(Stratagene)与所述膜共价交联。在含有0.5M磷酸钠，7％SDS(w/v)和0.1毫克/毫升大肠杆菌tRNA的水溶液中让所述印迹进行平均2小时的预杂交。与放射性标记过的探针的杂交是在新的预杂交溶液中在大约65℃下进行大约14-21小时。用0.1％(w/v)SDS和0.1×SSC的水溶液在65℃下洗涤膜至少4次，间隔15分钟。用Koda Biomax MSTM胶片与Koda Biomax增感屏制备产生所述印迹的多次曝光。通过在煮沸的0.1％(w/v)SDS中培养剥离印迹，并且让它冷却到室温。
评估插入片段的数量(棉花基因组中新导入的转基因DNA的整合位点的数量)。用限制酶ScaI消化测试和对照DNA，这种酶不会裂解用于转化的DNA片段的内部。这种酶能释放出含有插入的DNA和相邻的植物基因组DNA的片段。同样用XbaI消化质粒强化的DP50‘短时间电泳’的样品，以便将质粒线性化。用参考质粒PV-GHBK11检测印迹。
通过用限制酶SphI——一种只能在用于产生所述事件的线性DNA片段上裂解一次的酶——消化测试基因组DNA。用参考质粒PV-GHBK11检测印迹。
通过用限制酶NcoI——能裂解Cry2Ab编码区的5’和3’末端——消化，确定Cry2Ab编码区的完整性。用完整长度的Cry2Ab编码区检测印迹。
通过用限制酶BamHI——它能裂解基因Cry2Ab盒的5’和3’末端——消化，评估Cry2Ab编码盒(强化CaMV35S启动子、Cry2Ab编码区和NOS3’聚腺苷酸化序列)的完整性。依次用所述盒的每一种因子检测印迹。
通过用限制酶EcoRI和BglII——它们分别能裂解uidA编码区的5’和3’末端——消化，确定uidA编码区的完整性。用完整长度的uidA编码区检测印迹。
通过用限制酶BamHI和DphI——它们能裂解uidA盒的5’和3’末端——消化，评估uidA盒(强化CaMV35S启动子、Cry2Ab编码区和NOS3’聚腺苷酸化序列)的完整性。依次用所述盒的每一种因子检测印迹。
没有将被确定为PV-GHBK11的KpnI限制片段的质粒的主链区用于转化质粒。它包括受细菌启动子控制的细菌复制起点，ori-pUC和nptII基因。为了证实主链的缺乏，用限制酶KpnI消化基因组DNA，并且用完整长度的主链区检测。按上述方法，用Clonetech’s Universal Genome
WalkerTM试剂盒测定5’和3’插入片段-至-植物基因组DNA结合的序列。将引物设计成能通过PCR证实所述结合。用被设计成5’基因组旁侧序列的引物证实5’结合，该引物与uidA基因的强化CaMV35S启动子中的第二种引物配对。用被设计成3’基因组旁侧序列的引物和位于Cry2Ab基因的第二种引物验证3’结合。在25微升的反应体积中，使用作为模板的100纳克叶片基因组DNA(1-2微升)、10皮摩尔每一种引物(各1微升)和PCR Supermix(Gibco BRL产品目录号10572-514)进行PCR。所述反应的扩增是在以下循环条件下进行的：1轮94℃3分钟；3轮94℃30秒，55℃1分钟，72℃2分钟；2轮72℃4分钟。在1×TAE中在1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，并且通过用溴化乙锭染色进行观察。
用ScaI消化测试和对照DNA样品，同样用ScaI消化用PV-GHBK强化的DP50对照DNA。由于ScaI不能裂解所述质粒的内部，添加第二种酶XbaI，以便使该质粒线性化。将所述质粒线性化，以便其通过凝胶迁移，起着精确的大小估测物的作用。用放射性标记的PV-GHBK11(图1)检测印迹，它是用于转化的线性DNA片段的来源质粒。对DP50进行长时间电泳没有产生任何可检测的背景带。对与DP50混合的质粒PV-GHBK11进行短时间电泳，产生了大约8.7kb的预期大小的带，它是完整质粒的大小，没有其他的带。对DP50B进行长时间和短时间电泳，产生了大约为22kb和15kb(非常弱)的两条带。由于这两条带存在于事件MON15985和DP50B(MON531)对照中，它们被认为是与MON531事件相关的背景带。MON15985长时间和短时间电泳各自产生了一条在DP50或DP50B泳道中不存在的大约为9.3kb的带。这一结果表明棉花事件MON15985包括位于9.3ScaI限制片段上的一个整合的DNA片段。
用SphI消化与质粒PV-GHBK11DNA混合的从MON15985、DP50B、DP50(非转基因对照)和DP50中提取的基因组DNA。用PV-GHBK11检测印迹，它是用于转化的线性DNA片段的来源质粒。对DP50进行长时间电泳，没有产生可检测的背景带，在短时间电泳中，与DP50混合的质粒PV-GHBK11产生了3.9kb和4.8kb的预期大小的带；泳道5中的另一条弱的8.7kb的带有可能是由于未消化的质粒DNA产生的。对DP50B进行长时间和短时间电泳产生了6.4kb、8.3kb和8.6kb的三条带。由于这三条带出现在MON15985和DP50对照中，它们被认为是与MON531事件相关的背景带。对MON15985进行长时间和短时间电泳，分别产生了不存在于DP50或DP50B泳道中的大约为2.3kb和3.5kb的两条带。由于酶SphI只能在转化盒内裂解一次，这一结果表明MON15985含有一个拷贝的整合DNA，它能产生这两个限制片段。
用NcoI消化来自测试、对照、以及与质粒PV-GHBK11DNA混合的对照的DNA，以便释放出Cry2Ab编码区，并且评估其完整性。用完整长度的Cry2Ab编码区检测印迹。正如所预料的，对DP50非转基因对照进行长时间电泳和对DP50B对照进行长时间和短时间电泳，没有出现可检测的杂交带。在短时间电泳中，与DP50混合的质粒PV-GHBK11产生了预期大小的大约1.9kb的带，它相关完整的Cry2Ab编码区。对MON15985进行长时间和短时间电泳，还产生了一个1.9kb的带，它相当于完整Cry2Ab编码区的预期大小。这一结果证实了事件MON15985包括完整的Cry2Ab编码区，没有其他可检测的片段。
用BamHI消化来自测试、对照、以及与质粒PV-GHBK11DNA混合的对照的DNA，它能释放出编码Cry2Ab的完整的盒(即，Cry2Ab编码区、强化CaMV35S启动子、和NOS3’聚腺苷酸化序列)。
用完整长度Cry2Ab编码区检测印迹。对DP50非转基因对照进行长时间电泳和对DP50B对照进行长时间和短时间电泳，没有出现可检测的杂交带。在短时间电泳中，与DP50混合的质粒PV-GHBK11产生了预期的3.2kb的带，它相当于编码Cry2Ab的完整的盒，对MON15985进行长时间和短时间电泳，都产生了大约4.0kb的带。这一结果表明转化盒的3’末端在整合到棉花基因组期间丢失了BamHI限制位点。通过PCR分析证实了以前通过基因组步移测定的插入-至-植物结合的3’序列。业已证实缺失转化盒3’末端的66个碱基对，包括BamHI位点。缺失的核苷酸不包括与编码Cry2Ab的盒相关的任何NOS3’聚腺苷酸化序列，而仅包括接头DNA。以上结果证实，编码Cry2Ab的盒是完整的。没有检测到源于编码Cry2Ab的部分盒。
剥离上面所使用的印迹，并且用完整长度的强化CaMV35S启动子进行再次检测。对DP50进行长时间电泳，没有产生任何可检测的背景带。在短时间电泳中，与DP50混合的质粒PV-GHBK11产生了预期大小的5.5和3.2kb的带，没有其他的可检测带。对DP50B进行长时间和短时间电泳，产生了大约为4.4、5.3、7.5、9.4和22kb的五条带。由于这些带出现在事件MON15985和DP50B对照中，它们被认为是与MON531事件相关的背景带。对MON15985进行长时间和短时间电泳，都产生了一条大约为4.0kb的带，这条带不存在于DP50或DP50B泳道中。这一大小相当于推测的编码Cry2Ab的盒的片段，得到了用Cry2Ab编码区获得的结果。推测在MON15985泳道上存在由于与和编码UidA的盒(GUS)相关的强化CaMV35S启动子杂交所产生的第二条带，但是在测试泳道中没有出现。下面披露的NOS3’聚腺苷酸化序列探针的结果证实了存在与UidA编码盒相关的强化CaMV35S启动子序列，但是没有出现与4.4kb背景带共同迁移的4.4kb的带。没有检测到外部启动子。
再次剥离上面所使用的印迹，并且用完整长度NOS3’聚腺苷酸化序列再次检测。对DP50进行长时间电泳没有产生任何可检测的背景带。对与DP50混合的质粒PV-GHBK11进行短时间电泳，产生了5.5和3.2kb的预期大小的带，没有其他可检测的带。对DP50B进行长时间和短时间电泳，产生了一条大约为1.2kb的带。由于这条带存在于事件MON15985和DP50B对照中，它被认为是与MON531事件相关的背景带。对MON15985进行长时间和短时间电泳，分别产生了大约为4.0和4.4kb的两条带，它们不存在于DP50或DP50B泳道中。4.0kb的带相当于预测的编码Cry2Ab的盒的片段，这一结果是根据上文所述推测的。在用强化CaMV35S启动子检测的印迹上没有出现4.4kb的带，因为它与出现在印迹上的4.4kb的背景带共同迁移。该片段与uidA盒相关。
以上结果证实，Cry2Ab编码盒是完整的，并且在BamHI位点和转化盒的3’末端之间缺失了66bp。其中不包括位于编码Cry2Ab的盒的3’末端的任何的NOS3’聚腺苷酸化序列。没有检测到源于编码Cry2Ab的盒的部分盒。
用EcoRI和BglII消化从MON15985、DP50B、DP50(非转基因对照)和与质粒PV-GHBK11DNA混合的DP50中分离的基因组DNA，以便释放出完整的uidA编码区。用完整长度的uidA编码区检测印迹。对DP50非转基因对照进行长时间电泳和对DP50B对照进行长时间和短时间电泳，没有发现可检测的杂交带。对与DP50混合的质粒PV-GHBK11进行短时间电泳，产生了预期的大约1.9kb的带，它相当于完整的uidA编码区。对事件MON15985DNA进行长时间和短时间电泳，还产生了1.9kb的带，它相当于完整的uidA编码区的预期大小。这一事件证实MON15985包括完整的uidA编码区，没有其他可检测的片段。
用BamHI和SphI消化来自测试和对照物质的DNA以便释放出完整的uidA盒(即uidA编码区、强化CaMV35S启动子、和NOS3’聚腺苷酸化序列)。用PstI消化质粒PV-GHBK11之后掺入DP50短时间电泳的样品中(NOS3’聚腺苷酸化序列的检测印迹除外，其中，所述质粒是用BamHI和SphI消化的)。这样做是为了证实完整长度的uidA盒的大小。
用完整长度的uidA编码区检测印迹。正如所预料的，对DP50非转基因对照进行长时间电泳和对DP50B对照进行长时间和短时间电泳，没有发现可检测的杂交带。对与DP50混合的PV-GHBK11进行短时间电泳，产生了预期的2.8kb的带，它相当于完整的uidA盒。对MON15985进行长时间和短时间电泳，都产生了大约2.5kb的带。这一结果表明uidA盒的一部分是不存在的。通过PCR分析证实了以前通过基因组步移测定的5’插入片段-至-植物结合。以前业已证实，缺失了转化盒的5’部分的284bp。以上结果证实，uidA盒缺少了5’启动子序列的大约260bp和源于所述质粒的多克隆位点的多接头DNA的24bp。Odell等(1985)证实这种缺失不应当影响精确的转录启动。用uidA编码区探针没有检测到其他部分uidA盒。剥离上面所使用的印迹，并且用完整长度的强化CaMV35S启动子再次检测。对DP50进行长时间电泳，没有产生任何背景带。对与DP50混合的质粒PV-GHBK11进行短时间电泳，产生了预期大小的1.5和2.8kb的带，没有检测到其他带。对DP50B进行长时间和短时间电泳，产生了大约为4.3、4.6、5.0、6.6和8.5kb的五条带。由于这些带存在于MON15985和DP50B对照中，它们被认为是与MON531事件相关的背景带。对MON15985进行长时间和短时间电泳，分别产生了两条大约2.5和1.0kb的带，这两条带不存在于DP50或DP50B泳道中。2.5kb的带相当于推测的uidA盒的片段。1.0kb的带由与编码Cry2Ab的盒相关的强化CaMV35S启动子所产生。没有检测到外部启动子。
用完整长度的NOS3’聚腺苷酸化序列检测印迹，对DP50进行长时间电泳没有产生任何可检测的电泳带。对与DP50混合的质粒PV-GHBK11进行短时间电泳，产生了预期大小的3.2和2.8kb的带，没有检测到其他带。对DP50B进行长时间和短时间电泳，产生了一条大约为1.2kb的带。由于这条带存在于事件MON15985和DP50B对照中，它们被认为是与MON531事件相关的背景带。对MON15985进行长时间和短时间电泳，分别产生了两条不存在于DP50或DP50B泳道中的大约为2.5和2.3kb的。2.5kb的带相当于推测的uidA盒的片段。2.3kb的带来自与编码Cry2Ab的盒相关的NOS3’聚腺苷酸化序列。
以上结果证实uidA盒缺少了强化CaMV35S启动子5’末端的大约260bp，但是其他部分是完整的。用KpnI消化从事件MON15985、DP50B、DP50(非转基因对照)和与质粒PV-GHBK11 DNA混合的DP50中分离的基因组DNA。用完整的主链序列检测印迹。对DP50进行长时间电泳，没有发现可检测的杂交带。与DP50 DNA混合的质粒PV-GHBK11产生了一条2.6kb的完整主链的预期大小的带。对DP50B进行长时间和短时间电泳，产生了一条大约为22kb的带。由于这条带存在于事件MON15985和DP50B对照中，它被认为是与MON531事件相关的背景。对MON15985进行长时间和短时间电泳包括22kb的背景带，没有其他的杂交。这一结果证实事件MON15985不包括任何可检测的质粒主链序列。
对基因组DNA进行PCR，以便证实位于MON15985插入片段5’和3’末端的插入片段-至-植物结合序列。正如所预料的，在使用5’或3’引物组时，非转基因样品没有产生PCR产物。正如所预料的，被用作对照的DP50B样品在使用另一种引物对时都没有产生产物。在使用任一种引物组时，使用相同的结构制备的并且选择用于表达Cry2Ab、MON15813的不同事件都没有产生产物。在使用5’末端引物对和3’末端引物对时，产生了正确大小的MON15985基因组DNA。这种PCR分析证实了MON15985的5’和3’边界序列。
通过粒子加速技术使用含有编码Cry2Ab和UidA的盒的KpnI DNA片段生产出了抗昆虫的棉花事件MON15985。MON15985事件包括位于9.3kb的ScaI片段上的单一的DNA插入片段。该插入片段包括一个完整拷贝的插入的盒，该盒缺少了启动UidA编码序列表达的强化CaMV35S启动子的5’末端的大约260bp。通过PCR证实该插入片段和植物基因组的5’和3’结合序列，以及该插入片段的5’和3’末端的完整性。事件MON15985不包括任何可检测的来自转化事件的质粒主链序列。基于用于本研究中的酶，插入包括Cry2Ab编码序列的DNA插入片段不会改变Cry1Ac插入片段的限制形式。
因此，SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17和SEQ ID NO：18以及包括这些序列的序列可用于诊断能产生棉花事件MON15985的插入。参见图1，以上序列被分别编号为2、4、6、9和11。
本说明书中所提到的所有文献和专利申请，可以作为本发明所属技术领域的技术人员的技术水平的指标。所有文献和专利申请在本文中以相同的程度收作本文参考，就如同每一份文献或专利申请被专门和分别指明收作本文参考一样。
尽管业已通过为了理解清楚的目的而提供了说明和实施例的方式对上述发明进行了某种程度的详细说明，显而易见的是，在所附权利要求书的范围内可以进行某些改变或改进。
序列表
<110>孟山都技术有限公司(Monsanto Technology LLC)
S.A. 胡伯(Huber，Scott A.)
S. 多赫尔蒂(Sean，Doherty C.)
J.K. 罗伯茨(Roberts，James K.)
Z.W.沙普利(Shappley，Zacchary W.)
<120>棉花事件MON15985以及检测它的组合物和方法
<130>38-21(52211)WOMOBT：232P
<140>US60/297406
<141>2001-06-11
<160>36
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(20)
<223>包含插入DNA和染色体之间的接头的序列
<400>1
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(20)
<223>包含插入DNA和染色体之间的接头的序列
<400>2
<210>3
<211>1104
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(1104)
<223>全合成序列
<400>3
<210>4
<211>309
<212>DNA
<213>陆地棉(Gossypium hirsutum)
<400>4
<210>5
<211>378
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(378)
<223>全合成序列
<400>5
<210>6
<211>211
<212>DNA
<213>陆地棉(Gossypium hirsutum)
<400>6
<210>7
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(26)
<223>全合成序列
<400>7
<210>8
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(26)
<223>全合成序列
<400>8
<210>9
<211>589
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(378)
<223>MON531 3’插入序列，全合成
<220>
<221>misc_特征
<222>(379)..(589)
<223>MON5313’末端陆地棉旁侧序列
<400>9
<210>10
<211>1411
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(1104)
<223>全合成插入序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1105)..(1141)
<223>MON5315’末端陆地棉旁侧序列
<400>10
<210>11
<211>2267
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(361)
<223>陆地棉5’末端基因组DNA序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(362)..(750)
<223>5’末端叶绿体相关DNA序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(751)..(1885)
<223>5’末端陆地棉残余DNA序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1886)..(2267)
<223>5’末端插入DNA序列
<400>11
<210>12
<211>1360
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(349)
<223>3’末端插入序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(350)..(673)
<223>3’末端陆地棉残余DNA序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(674)..(1360)
<223>3’末端陆地棉染色体序列
<400>12
<210>13
<211>1050
<212>DNA
<213>陆地棉(Gossypiumhirsutum)
<400>13
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(20)
<223>叶绿体相关序列旁侧5’事件末端棉花基因组序列
<400>14
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(20)
<223>5’末端棉花基因组序列相邻5’末端叶绿体相关序列
<400>15
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(20)
<223>5’末端插入序列相邻5’末端棉花基因组残余序列
<400>16
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(20)
<223>与3’棉花基因组序列相邻的3’末端NOS3’插入序列
<400>17
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(20)
<223>与3’棉花基因组序列相邻的3’末端棉花基因组残余序列
<400>18
<210>19
<211>361
<212>DNA
<213>陆地棉(Gossypium hirsutum)
<400>19
<210>20
<211>389
<212>DNA
<213>未鉴定的植物
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(389)
<223>与5’端棉花序列相邻的叶绿体相关DNA序列
<400>20
<210>21
<211>1135
<212>DNA
<213>陆地棉(Gossypium hirsutum)
<400>21
<210>22
<211>382
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(382)
<223>相当于强化35S启动子序列的全合成5’末端插入序列
<400>22
<210>23
<211>349
<212>DNA
<213>根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)
<400>23
<210>24
<211>323
<212>DNA
<213>陆地棉(Gossypium hirsutum)
<400>24
<210>25
<211>688
<212>DNA
<213>陆地棉(Gossypium hirsutum)
<400>25
<210>26
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(19)
<223>全合成
<400>26
<210>27
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(27)
<223>全合成
<400>27
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(24)
<223>全合成
<400>28
<210>29
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(24)
<223>全合成
<400>29
<210>30
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(27)
<223>全合成
<400>30
<210>31
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(26)
<223>全合成
<400>31
<210>32
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(31)
<223>全合成
<400>32
<210>33
<211>31
<212>DNA
<213>Artifical
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(31)
<223>全合成
<400>33
<210>34
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(19)
<223>全合成
<400>34
<210>35
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(24)
<223>全合成
<400>35
<210>36
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(24)
<223>全合成
<400>36
Claims (29)
1.DNA分子对，包含：第一DNA分子和第二DNA分子，其中所述DNA分子具有SEQ ID NO：11或其互补序列的足够长度的连续核苷酸，以用作诊断提取自棉花植物MON15985或其后代的DNA的DNA引物或探针。
2.权利要求1的DNA分子对，其中所述第一和第二DNA分子各自包含SEQ ID NO：11或其互补序列的至少15个连续核苷酸，当其一起用于与棉花事件MON15985 DNA的核酸扩增反应中时，产生包含SEQ IDNO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16及其互补序列中的至少一种的扩增子。
3.权利要求2的DNA分子对，其中所述第一DNA分子包含SEQ IDNO：11的至少15个连续核苷酸，其来自位于插入的DNA 5’末端旁侧的棉花基因组DNA序列，并且所述第二DNA分子包含SEQ ID NO：11的至少15个连续核苷酸，其位于插入的DNA之内。
4.权利要求3的DNA分子对，其中所述第一DNA分子包含来自SEQ IDNO：11的1-361号位置的至少15个连续核苷酸，并且所述第二DNA分子包含来自SEQ ID NO：11的674-1361号位置的至少15个连续核苷酸。
5.权利要求2的DNA分子对，其中所述第一DNA分子包含来自SEQ IDNO：11的1-1885号位置的至少15个连续核苷酸，并且所述第二DNA分子包含来自SEQ ID NO：11的362-2267号位置的至少15个连续核苷酸。
6.DNA分子对，包含：第一DNA分子和第二DNA分子，其中所述DNA分子具有SEQ ID NO：12或其互补序列的足够长度的连续核苷酸，以用作诊断提取自棉花植物MON15985或其后代的DNA的DNA引物或探针。
7.权利要求6的DNA分子对，其中所述第一和第二DNA分子各自包含SEQ ID NO：12或其互补序列的至少15个连续核苷酸，当其一起用于与棉花事件MON15985 DNA的核酸扩增反应中时，产生包含SEQ IDNO：17，SEQ ID NO：18及其互补序列中的至少一种的扩增子。
8.权利要求7的DNA分子对，其中所述第一DNA分子包含来自SEQ IDNO：12的1-673号位置的至少15个连续核苷酸，并且所述第二DNA分子包含来自SEQ ID NO：12的350-1361号位置的至少15个连续核苷酸。
9.权利要求1的DNA分子对，选自：SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31，SEQ IDNO：32和SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，以及SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：36。
10.检测棉花样品中选自SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的DNA分子的存在的方法，所述方法包含：
(a)使所述样品与权利要求1到9任一项所述的DNA分子对接触；
(b)提供核酸扩增反应条件；
(c)实施所述核酸扩增反应，从而产生DNA扩增子分子；并且
(d)检测所述DNA扩增子分子，其中包含SEQ ID NO：14，SEQ IDNO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18及其互补序列中的至少一种的扩增子的检测表明所述样品中存在所述DNA分子。
11.权利要求10的方法，其中所述样品是提取自棉花植物的DNA样品。
12.检测棉花样品中选自SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的DNA分子的存在的方法，所述方法包含：
(a)使所述样品与DNA探针接触，所述DNA探针在严格条件下与所述DNA分子杂交，并且在严格条件下不与不包含所述DNA分子的样品杂交；
(b)使所述样品和DNA探针经历严格杂交条件；并且
(c)检测所述DNA探针与所述样品的杂交，其中杂交的检测表明在所述样品中存在所述DNA分子。
13.权利要求12的方法，其中所述样品是提取自棉花植物的DNA样品。
14.权利要求12或13的方法，其中所述DNA探针包含SEQ IDNO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18或其互补序列。
15.DNA检测试剂盒，包含：至少一种DNA分子，该DNA分子具有同源于或互补于SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的足够长度的连续核苷酸，以用作特异于棉花事件MON15985和/或其后代的DNA引物或探针。
16.权利要求15的DNA检测试剂盒，其中所述至少一种DNA分子包含SEQ ID NO：11或其互补序列的至少15个连续核苷酸，当其用于与棉花事件MON15985DNA的核酸扩增反应时，产生包含SEQ ID NO：14，SEQ IDNO：15，SEQ ID NO：16及其互补序列中的至少一种的扩增子。
17.权利要求16的DNA检测试剂盒，其中第一引物包含SEQ ID NO：11的至少15个连续核苷酸，其来自位于插入的DNA 5’末端旁侧的棉花基因组DNA序列，并且第二引物包含SEQ ID NO：11的至少15个连续核苷酸，其位于插入的DNA之内。
18.权利要求17的DNA检测试剂盒，其中所述第一引物包含来自SEQID NO：11的1-361号位置的至少15个连续核苷酸，并且所述第二引物包含来自SEQ ID NO：11的674-1361号位置的至少15个连续核苷酸。
19.权利要求16的DNA检测试剂盒，包含引物对，其中第一引物包含来自SEQ ID NO：11的1-1885号位置的至少15个连续核苷酸，并且第二引物包含来自SEQ ID NO：11的362-2267号位置的至少15个连续核苷酸。
20.权利要求15的DNA检测试剂盒，其中所述至少一种DNA分子包含SEQ ID NO：12或其互补序列的至少15个连续核苷酸，当其用于与棉花事件MON15985DNA的核酸扩增反应时，产生包含SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18及其互补序列中的至少一种的扩增子。
21.权利要求20的DNA检测试剂盒，包含引物对，其中第一引物包含来自SEQ ID NO：12的1-673号位置的至少15个连续核苷酸，并且第二引物包含来自SEQ ID NO：12的350-1361号位置的至少15个连续核苷酸。
22.权利要求15的DNA检测试剂盒，其中所述至少一种DNA分子包含SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，或其互补序列。
23.权利要求22的DNA检测试剂盒，其中所述至少一种DNA分子是SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，或其互补序列。
24.生产棉花事件MON15985的方法，包含：
(a)用编码CrylAc的第一DNA盒转化棉花植物细胞，从而产生包含MON531插入的转基因棉花植物细胞；
(b)用编码Cry2Ab的第二DNA盒转化所述包含MON531插入的棉花植物细胞，从而产生包含MON531和MON15985插入的转基因棉花植物细胞；
(c)从所述包含MON531和MON15985插入的转基因棉花植物细胞再生转基因棉花植物，其中所述转基因棉花植物是棉花事件MON15985。
25.权利要求24的方法，其中所述包含MON531插入的转基因棉花植物细胞包含掺入植物细胞基因组的、具有SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的核苷酸序列的DNA。
26.权利要求25的方法，其中所述包含MON531和MON15985插入的转基因棉花植物细胞还包含掺入植物细胞基因组的、具有SEQ IDNO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的核苷酸序列的DNA。
27.区分棉花样品中棉花事件MON15985和棉花事件MON15985X的方法，包含：
(a)选择引物对，其具有互补于棉花基因组DNA的一种引物和互补于插入的转基因DNA的另一引物，其中所述引物对的每种成员源于选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的一种或多种序列；
(b)使所述棉花样品与所述引物对接触；并且
(c)实施DNA扩增并检测扩增子，所述扩增子包含选自SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的至少一种序列；
其中所述扩增子的检测表明在所述棉花样品中MON531插入的存在，并且进一步表明所述棉花样品中的棉花事件MON15985，并且其中所述扩增子检测的缺乏表明在所述棉花样品中不存在MON531插入，并且进一步表明所述棉花样品中的棉花事件MON15985X。
28.权利要求27的方法，其中所述引物对的每种成员选自：SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
29.权利要求27的方法，其中所述引物对的每种成员选自：SEQ IDNO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。
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