KR101818775B1 - 벼의 17053 트랜스제닉 사건 및 이의 이용 방법 - Google Patents

벼의 17053 트랜스제닉 사건 및 이의 이용 방법 Download PDF

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시오-와이 호이
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몬산토 테크놀로지 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 벼의 17053 트랜스제닉 사건 및 17053 사건으로부터 유래한 식물, 식물 세포, 종자, 식물의 일부분, 및 상품을 제공한다. 본 발명은 또한 17053 사건에 특이적인 폴리뉴클레오티드 및 17053 사건에 특이적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물, 식물 세포, 종자, 식물의 일부분, 및 상품을 제공한다. 본 발명 또한 17053 사건에 관련된 방법을 제공한다.

Description

벼의 17053 트랜스제닉 사건 및 이의 이용 방법 {RICE TRANSGENIC EVENT 17053 AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2009년 3월 30일에 제출된 미국 가출원 제61/164,899호에 대한 유익을 주장하며, 상기 문헌은 그 전문이 본 거명에 의해 본원에 포함된다.
서열목록의 삽입
본 개시의 일부인 서열목록은 EFS-Web을 통해 제출된 본 발명의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열을 포함하는 "MONS246WO_ST25.txt"라는 파일명의 컴퓨터 판독가능한 15 KB 파일을 포함한다. 이 서열목록의 대상은 본 거명에 의해 그 전체가 본원에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 벼의 17053 트랜스제닉 사건 (event)에 관한 것이다. 상기 사건을 포함하는 식물은 글리포세이트 제초제에 대해 내성을 나타낸다. 본 발명은 또한 17053 사건과 관련된 핵산 분자, 식물, 식물의 일부분, 식물 종자, 식물 세포, 농산물, 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 벼 게놈 내로의 트랜스제닉 DNA의 삽입과 관련하여 생성된 상기 사건 특유의 뉴클레오티드 분자를 제공한다.
쌀은 세계의 많은 지역에서 중요한 작물이다. 개선된 특성을 갖는 쌀을 생산하기 위해 생명공학 방법들이 쌀에 적용되었다. 그러한 개선된 특성 중 한가지는 제초제 내성이다. 식물에서 제초제 내성 전이유전자의 발현은 제초제 내성이라는 바람직한 특성을 갖는 식물을 생산하기 위한 목적에 유용하다. 식물에서 전이유전자의 발현은 염색체 상의 전이유전자의 위치에 의해 영향받을 수 있는데, 이는 아마도 염색질 구조 (예를 들어, 헤테로염색질), 또는 삽입 부위에 근접한 전사 조절 요소 (예를 들어, 인핸서)의 근접도로 인한 것으로 추정된다. 이러한 이유로, 전이유전자가 최적으로 발현되는 사건 및 그에 따른 특정 바람직한 특질을 식별하기 위해 매우 많은 수의 개별 식물 형질전환 사건을 스크리닝하는 것이 종종 필요하다. 예를 들어, 사건들 간에 전이유전자 발현 수준이 넓은 범위로 다양할 수 있다는 것이 식물에서 관찰되었다. 또한, 도입된 유전자 구조체 중에 존재하는 전사 조절 요소로부터 예기되는 패턴과 상응하지 않을 수 있는 공간적 또는 시간적 발현 패턴의 차이, 예를 들어, 다양한 식물 조직에서의 상대적 전이유전자 발현 수준의 차이가 존재할 수도 있다. 이러한 이유로, 수백 내지 수천개의 상이한 트랜스제닉 사건을 일으켜 이들을 스크리닝하여 상업적 목적을 위해 요구되는 전이유전자 발현 수준 및 패턴을 갖는 사건을 찾는 것이 필요할 수 있다. 그런 다음, 그러한 요구되는 전이유전자 발현 수준 또는 패턴을 갖는 사건을 식물 육종 방법을 사용한 교배를 통해 전이유전자를 다른 유전적 배경 내로 침투시키는데 사용할 수 있다. 그러한 교배의 자손은 본래의 형질전환체의 전이유전자 발현 특질을 갖게 될 것이다. 이는 특정 지역의 재배 환경에 적합하게 개조된 수많은 상이한 품종에서 신뢰할 만한 유전자 발현을 보장하기 위해 사용될 수 있다.
발명의 요약
본 발명은 글리포세이트 제초제의 적용에 대해 상업상 허용되는 내성을 나타내는 17053 사건을 포함하는 트랜스제닉 벼를 제공하며, 이의 대표적인 종자는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, ATCC)에 등록 번호 PTA-9843으로 기탁되었다. 본 발명은 또한 17053 사건을 포함하는 벼의 종자, 자손, 식물 일부분, 세포, 및 상품을 제공한다. 본 발명은 또한 17053 사건을 포함하는 벼의 게놈과 관련된 신규한 DNA 분자 및 이 분자를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 벼의 17053 트랜스제닉 사건 및 상기 사건을 포함하는 식물을 사용하는 방법 및 글리포세이트 내성 벼를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 벼의 17053 사건과 관련된 DNA 분자를 제공한다. 이러한 DNA 분자는 이하를 나타내거나 또는 이하로부터 유래된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다: 전이유전자 삽입 및 벼의 17053 사건의 측면에 위치한(flanking) 게놈 DNA 간의 연접부, 및/또는 삽입된 DNA의 측면에 위치한 게놈 DNA의 영역, 및/또는 상기 삽입 부위의 측면에 위치한 통합된 트랜스제닉 DNA의 영역, 및/또는 통합된 트랜스제닉 발현 카세트의 영역, 및/또는 이들 영역 중 임의의 영역의 연속 서열. 본 발명은 또한 벼의 17053 사건에 대한 진단이 되는 프라이머 및 프로브로서 유용한 DNA 분자를 제공한다. 또한, 이들 분자를 포함하는 벼, 벼 세포, 벼의 일부분, 상품, 자손, 및 종자를 개시한다.
본 발명은 벼의 17053 사건으로부터 유래한 DNA의 존재를 검출하는데 유용한 방법, 조성물, 및 키트를 제공한다. 본 발명은 벼의 17053 사건으로부터의 게놈 DNA와 함께 핵산 증폭 반응에서 사용시 벼의 17053 사건에 대한 진단이 되는 증폭된 DNA를 생성하는 프라이머 세트에 DNA를 포함한 샘플을 접촉시켜, 핵산 증폭 반응을 실시하여, 증폭된 DNA를 생성시키고, 이 증폭된 DNA를 검출함으로써 17053 사건을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 벼의 17053 사건으로부터의 게놈 DNA와의 혼성화 반응에서 사용시 벼의 17053 사건에 특이적인 DNA 분자에 혼성화하는 프로브에 DNA를 포함한 샘플을 접촉시켜, 혼성화 반응을 실시하고, 상기 DNA 분자에 대한 상기 프로브의 혼성화를 검출함으로써 17053 사건을 검출하는 방법을 제공한다. 벼의 17053 사건으로부터 유래한 DNA의 존재를 검출하는데 유용한 본 발명의 방법 및 조성물을 포함하는 키트가 또한 제공된다.
본 발명은 17053 사건을 포함하는 벼, 벼 세포, 또는 벼의 종자로부터 유래한 벼, 종자, 벼 세포, 자손 벼, 벼의 일부분, 또는 상품을 제공한다. 본 발명은 또한, 서열 1 내지 6 및 이들의 상보체 및 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자 또는 서열 6에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 DNA 분자를 포함하는 벼, 종자, 벼 세포, 자손 벼, 벼의 일부분, 또는 상품을 제공한다. 본 발명은 또한, 17053 사건을 포함하고 서열 1 및/또는 서열 2를 포함하는 (예를 들어, DNA 증폭 방법에서) 증폭된 DNA 분자를 생성하는 DNA 분자를 포함하는 벼 또는 벼의 종자로부터 유래한 벼, 종자, 벼 세포, 자손 벼, 벼의 일부분, 또는 상품을 제공한다.
본 발명은 17053 사건을 포함하는 벼를 심은 후 17053 사건을 포함하는 식물에는 해를 입히지 않으면서 잡초를 제어할 수 있는 유효 용량의 글리포세이트 제초제를 적용함으로써 경작지에서 잡초를 제어하는 방법을 제공한다.
본 발명은 17053 사건을 포함하거나 또는 서열 1 또는 서열 2를 포함하는 벼를 제2의 벼와 유성 교배시켜, 종자를 생산하고, 상기 종자를 성장시켜 자손 벼를 생산하고, 자손 벼를 글리포세이트로 처리하고, 글리포세이트에 내성이 있는 자손 벼를 선별함으로써 글리포세이트 제초제의 적용을 견뎌내는 벼 및/또는 종자를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 또한, 상기 선별된 자손 벼를 자가수정시켜 복수의 제2 세대 자손 벼를 생산하고, 이들로부터 글리포세이트 내성 벼를 선별하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한, 상기 선별된 자손 벼를 또 다른 벼와 유성 교배시켜 종자를 생산하고, 상기 종자를 성장시켜 제2 세대의 자손 벼를 생산하고, 제2 세대의 자손 벼를 글리포세이트로 처리하고, 글리포세이트에 내성이 있는 제2 세대 자손 벼를 선별하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명은 17053 사건을 포함하고 서열 1 또는 서열 2를 포함하는 글리포세이트 내성 벼를 자가수정시켜, 종자를 생산하고, 상기 종자를 성장시켜 자손 벼를 생산한 후, 이 자손 벼를 글리포세이트로 처리하고; 글리포세이트에 내성이 있는 자손 벼를 선별함으로써, 글리포세이트 제초제의 적용을 견뎌내는 벼 및/또는 종자를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 및 다른 측면은 이하의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.
도 1. 벼의 17053 사건의 개략적인 도식: [A]는 벼 게놈 및 삽입된 트랜스제닉 DNA의 5' 부분 간의 연접부인 5' 연접 영역 (서열 1로 제시되어 있음)의 상대적 위치에 상응하며; [B]는 벼 게놈 및 삽입된 트랜스제닉 DNA의 3' 부분 간의 연접부인 3' 연접 영역 (서열 2로 제시되어 있음)의 상대적 위치에 상응하고; [C]는 17053 사건의 통합된 발현 카세트의 측면에 위치하는 5' 벼 게놈 서열 및 전이유전자 DNA의 5' 말단의 영역을 포함하는, 삽입된 트랜스제닉 DNA (서열 3으로 제시되어 있음)의 5' 측면(flanking) 영역 및 5' 말단의 일부분의 상대적 위치에 상응하고; [D]는 17053 사건의 통합된 발현 카세트의 측면에 위치하는 3' 벼 게놈 서열 및 전이유전자 DNA의 3' 말단의 영역을 포함하는, 삽입된 트랜스제닉 DNA (서열 4로 제시되어 있음)의 3' 측면 영역 및 3' 말단의 일부분의 상대적 위치에 상응하고; [E]는 17053 사건의 게놈 내로 삽입된 전이유전자 발현 카세트 (서열 5로 제시되어 있음)를 나타내고; [F]는 도면에서 좌측에서 우측으로 나타나 있는 바 서열 3, 서열 5 및 서열 4를 포함하는 상기 측면 서열 및 전이유전자 발현 카세트의 연속 서열 (서열 6으로 제시되어 있음)을 나타낸다(여기서 서열 1 및 서열 2는 17053 사건의 연접 서열을 나타내는 바 상기 개시된 바와 같이 편입되어 있음).
서열의 간단한 설명
서열 1 - 벼 게놈 DNA 및 통합된 발현 카세트 간의 5' 연접 서열을 나타내는 20개의 뉴클레오티드 서열. 이 뉴클레오티드 서열은 서열 3의 위치 565 내지 584 ([C], 도 1 참조) 및 서열 6의 위치 565 내지 584에 상응한다.
서열 2 - 통합된 발현 카세트 및 벼 게놈 DNA 간의 3' 연접을 나타내는 20개 뉴클레오티드 서열. 이 뉴클레오티드 서열은 서열 4의 위치 626 내지 645 ([D], 도 1 참조)에 상응하며, 서열 2의 역 상보체는 서열 6의 위치 3707 내지 3726에 상응한다.
서열 3 - 트랜스제닉 DNA의 영역을 포함하며 이 영역까지인 삽입된 17053 사건 DNA의 측면에 위치한 5' 서열. 서열 3의 뉴클레오티드 위치 565 내지 584는 서열 1의 뉴클레오티드 위치 1 내지 20에 상응하며, 서열 3의 뉴클레오티드 위치 575 내지 584는 서열 5의 뉴클레오티드 위치 1 내지 10에 상응한다.
서열 4 - 전이유전자 DNA 삽입 영역을 포함하며 이 영역까지인 삽입된 17053 사건 DNA의 측면에 위치한 3' 서열. 서열 4의 뉴클레오티드 위치 626 내지 645는 서열 2의 뉴클레오티드 위치 1 내지 20에 상응하며, 서열 4의 뉴클레오티드 위치 636 내지 645의 역 상보체 가닥은 서열 5의 뉴클레오티드 위치 3133 내지 3142에 상응한다.
서열 5 - 글리포세이트 제초제 내성을 부여하는 통합된 발현 카세트의 서열. 서열 5는 서열 6의 뉴클레오티드 위치 575 내지 3716에 상응한다.
서열 6 - 삽입된 17053 사건 DNA의 측면에 위치한 5' 서열 (서열 3), 통합된 발현 카세트의 서열 (서열 5), 및 삽입된 17053 사건 DNA의 측면에 위치한 3' 서열 (서열 4의 역 상보체)의 콘티그(contig)를 나타내는 뉴클레오티드 서열.
서열 7 - 17053 사건을 식별하기 위해 사용되는 프라이머 SQ4194. 프라이머 SQ4194는 우측 전이유전자 DNA 삽입 경계면에 근접한, 삽입된 발현 카세트의 5' 영역의 측면에 위치한 게놈 영역에 상보적이다. 프라이머 SQ4194 및 SQ4191 (서열 8)의 조합물을 이용하여 생성한 앰플리콘은 17053 사건의 존재를 나타낸다.
서열 8 - 17053 사건을 식별하는데 사용되는 프라이머 SQ4191. 프라이머 SQ4191은 전이유전자 DNA 삽입 경계면에 근접한, 삽입된 발현 카세트의 5' 영역에 상보적이다. 프라이머 SQ4194 (서열 7) 및 SQ4191의 조합물을 이용하여 생성한 앰플리콘은 17053 사건의 존재를 나타낸다.
서열 9 - 17053 사건을 식별하는데 사용되는 프로브 PB1494이며, 5' 연접 서열의 단편에 상보적이다. 이 프로브는 검출가능한 표지, 예컨대 6FAMTM에 연결될 수 있다. 프라이머, 예컨대 SQ4194 및 SQ4191을 프로브, 예컨대 6FAMTM-표지된 프로브 PB1494와 조합하여 사용하는 택맨(TAQMAN)(등록상표) (피이 어플라이드 바이오시스템즈(PE Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재) 검정에서 형광 신호의 방출은 17053 사건의 존재에 대한 진단이 된다.
서열 10 - 17053 사건을 식별하는데 사용되는 프라이머 SQ1875. 프라이머 SQ1875는 전이유전자 DNA 삽입 경계면에 근접한, 삽입된 발현 카세트의 3' 영역에 상보적이다. 프라이머 SQ1875 및 SQ3623 (서열 11)의 조합물을 이용하여 생성한 앰플리콘은 17053 사건의 존재를 나타낸다.
서열 11 - 17053 사건을 식별하는데 사용되는 프라이머 SQ3623. 프라이머 SQ3623은 전이유전자 DNA 삽입 경계면에 근접한, 삽입된 발현 카세트의 3' 말단의 측면에 위치한 게놈 영역에 상보적이다. 프라이머 SQ1875 (서열 10) 및 SQ3623의 조합물을 이용하여 생성한 앰플리콘은 17053 사건의 존재를 나타낸다.
서열 12 - 17053 사건의 측면에 위치한 게놈 DNA를 식별하는데 사용되는 프라이머 SQ1871. 프라이머 SQ1871은 전이유전자 DNA 삽입 경계면에 근접한, 삽입된 발현 카세트의 5' 영역에 상보적이다.
서열 13 - 17053 사건의 측면에 위치한 게놈 DNA를 식별하는데 사용되는 프라이머 SQ1869. 프라이머 SQ1869는 전이유전자 DNA 삽입 경계면에 근접한, 삽입된 발현 카세트의 5' 영역에 상보적이다.
서열 14 - 17053 사건의 측면에 위치한 게놈 DNA를 식별하는데 사용되는 프라이머 SQ1880. 프라이머 SQ1880은 전이유전자 DNA 삽입 경계면에 근접한, 삽입된 발현 카세트의 3' 영역에 상보적이다.
서열 15 - 17053 사건의 측면에 위치한 게놈 DNA를 식별하는데 사용되는 프라이머 SQ3626. 프라이머 SQ3626은 전이유전자 DNA 삽입 경계면에 근접한, 삽입된 발현 카세트의 5' 말단의 측면에 위치한 게놈 영역에 상보적이다.
발명의 상세한 설명
이하의 정의 및 방법은 본 발명에 대한 보다 나은 정의를 위해 및 본 발명의 실시에 있어 당업자에게 지침이 되도록 하기 위해 제공되는 것이다. 달리 언급되지 않는 한, 용어들은 관련 업계의 통상의 지식을 가진 자들에 의한 통상적인 용법에 따라 이해되어야 한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "~을 포함하는"이란, "이들로 한정되지는 않지만 ~을 포함하는"을 의미한다.
본 발명은 17053 사건 및 글리포세이트 제초제의 적용에 대해 상업상 허용되는 내성을 나타내는 17053 사건을 포함하는 트랜스제닉 벼를 제공한다. 상기 사건은 벼의 생식질의 염색체/게놈 내로의 트랜스제닉 DNA의 단일 삽입을 포함한다. 어떤 사건을 포함하는 식물은, (i) 관심 전이유전자를 포함하는 핵산 구조체를 이용하여 식물 세포를 형질전환시키고, (ii) 상기 식물의 게놈 내로 전이유전자가 삽입되어 발생된 식물 집단을 재생성하고, (iii) 전이유전자가 해당 식물 게놈 내의 특정 위치 내로 삽입된 것을 특징으로 하는 특정 식물을 선별함에 의해 생산할 수 있다. 용어 "사건"은 게놈 내의 특정 위치로 관심 유전자가 특이적으로 트랜스제닉 삽입되는 것을 지칭한다. 상기 사건을 포함하는 식물은 해당 식물의 게놈 내의 특정 위치 내로 삽입된 전이유전자를 포함하는 최초의 형질전환체를 지칭하는 것일 수 있다. 상기 사건을 포함하는 식물은 또한 해당 식물의 게놈 내의 특정 위치 내로 삽입된 전이유전자를 포함하는 형질전환체의 자손을 지칭하는 것일 수 있다. 그러한 자손은 상기 형질전환체, 또는 그의 자손, 및 또 다른 식물 간의 이종 교배에 의해 생산된 것일 수 있다. 상기 다른 식물은 동일 또는 상이한 전이유전자를 포함하는 트랜스제닉 식물 및/또는 비-트랜스제닉 식물, 예컨대 상이한 품종의 식물일 수 있다. 반복친(recurrent parent)에 대한 여러 번의 여교배(back-crossing) 후에도, 형질전환된 부모로부터의 삽입된 DNA 및 측면에 위치한 DNA는 교배 자손 내에서 동일한 게놈 상의 위치에 존재한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "벼"는 오리자 사티바(Oryza sativa)를 의미하며, 야생 벼 종뿐 아니라 종 간의 생식을 허용하는 오리자 속(屬)에 속하는 벼를 포함한, 벼와 생식할 수 있는 모든 식물 품종을 포함한다.
용어 "사건"은 또한 삽입된 DNA 및 삽입된 DNA의 양측에 바로 인접한 측면에 위치한 벼 게놈 DNA를 포함하는 최초의 형질전환체로부터의 DNA 분자를 지칭한다. 이 DNA 분자는 벼의 게놈 내로 트랜스제닉 DNA를 삽입하는 행위, 즉, 형질전환 행위에 의해 생성된다. 따라서, 이 DNA 분자는, 벼 게놈 DNA의 특정 영역의 서열 및 트랜스제닉 DNA 삽입체의 서열을 모두 함유한다는 점에서 트랜스제닉 DNA가 삽입된 벼의 게놈에 특유한 것이면서도 상기 사건에 특이적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 주위의 벼 게놈 DNA와 비교하여 벼의 17053 사건에서 삽입된 DNA의 배열은 벼의 17053 사건에 특이적이면서도 특유하다. 이 DNA 분자는 또한 17053 사건을 포함하는 벼의 염색체의 불가분한 부분이며, 그렇기 때문에 벼에서 정적인 상태로 존재하며, 자손 벼에게로 전달될 수 있다.
17053 사건은 벼에 가해지는 글리포세이트 제초제에 대한 내성을 부여한다. "글리포세이트"는 N-포스포노메틸-글리신 및 그의 염을 지칭한다. N-포스포노메틸-글리신은 넓은 범위의 식물 종에 대해 활성을 갖는 제초제이다. 글리포세이트가 식물 표면에 가해질 때, 이는 식물 전체에 전신적으로 이동한다. 글리포세이트는 방향족 아미노산의 합성에 대한 전구체를 제공하는 시킴산 경로를 억제함으로 인해 식물독성이다.
본원에서 사용된 바, 용어 "재조합"은 천연에서는 정상적으로 발견되지 않으며, 따라서 인간의 개입에 의해 생성된 것인 DNA 및/또는 단백질 및/또는 유기체의 형태를 지칭한다. 이러한 인간의 개입은 재조합 DNA 분자 및/또는 재조합 식물을 생산할 수 있다. 본원에서 사용된 바, "재조합 DNA 분자"는 천연적으로는 함께 발생하지 않으며 인간의 개입의 결과인 DNA 분자의 조합물을 포함하는 DNA 분자, 예를 들어, 서로에 대해 이종인 2개 이상의 DNA 분자의 조합물로 구성된 DNA 분자, 및/또는 천연에서 정상적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열로부터 벗어난 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 인공적으로 합성된 DNA 분자, 및/또는 숙주 세포의 게놈 DNA 및 상기 숙주 세포의 게놈의 관련된 측면 위치 DNA 내로 인공적으로 편입된 전이유전자를 포함하는 DNA 분자이다. 재조합 DNA 분자의 예는, 벼 게놈 내로의 전이유전자의 삽입으로부터 생성된 본원에 기재된 DNA 분자로서, 이는 궁극적으로는 상기 유기체에서 재조합 RNA 및/또는 단백질 분자의 발현을 일으킬 수 있다. 본원에서 사용된 바, "재조합 식물"은 인간의 개입의 결과로서 그의 게놈 내로 전이유전자 및/또는 이종 DNA 분자가 편입되어 있는, 천연에서 정상적으로는 존재하지 않는 식물이다. 그러한 게놈상의 변화의 결과로서, 재조합 식물은 관련된 야생형 식물과는 명백히 상이하다. 재조합 식물의 예는 17053 사건을 포함한 바의 본원에 기재된 벼이다.
본원에서 사용된 바, 용어 "전이유전자"는 숙주 세포의 게놈 내로 인공적으로 편입된 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭한다. 그러한 전이유전자는 숙주 세포에 대해 이종일 수 있다. 용어 "트랜스제닉 식물"은 상기와 같은 전이유전자를 포함하는 식물을 지칭한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "이종"은 천연에서 정상적으로는 제2의 분자와 조합되어 발견되지 않는 제1 분자를 지칭한다. 예를 들어, 분자는 제1의 종으로부터 유래되어 제2의 종의 게놈 내로 삽입될 수 있다. 즉, 이 분자는 숙주에 대해 이종으로서 숙주 세포의 게놈 내로 인공적으로 편입된 것일 것이다.
본원에서 사용된 바, 용어 "키메라"는 제1 DNA 분자를 제2 DNA 분자에 융합시켜 생성하며, 여기서 제1 DNA 분자나 제2 DNA 분자 어느 것도 정상적으로는 그러한 형태로, 즉, 서로 융합된 형태로 발견되지 않는, 단일 DNA 분자를 지칭한다. 즉, 키메라 DNA 분자는 다른 방식으로는 천연에서 정상적으로 발견되지 않는 신규한 DNA 분자이다.
본 발명은 DNA 분자 및 그의 상응하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 본원에서 사용된 바, 용어 "DNA", "DNA 분자", "폴리뉴클레오티드 분자"는 5' (상류) 말단에서 3' (하류) 말단으로 판독되는, 게놈 또는 합성 기원의 이중-가닥 DNA 분자, 즉, 데옥시리보뉴클레오티드 염기 또는 폴리뉴클레오티드 분자의 중합체를 지칭한다. 본원에서 사용된 바, 용어 "DNA 서열", "뉴클레오티드 서열" 또는 "폴리뉴클레오티드 서열"은 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본원에서 사용된 명명법은 WIPO 표준 ST.25 (1998)에서의 표, 즉 부록 2, 표 1 및 3에 개시되어 있으며 미국 연방규정집 § 1.822의 표제 37에서 요구하고 있는 명명법이다. 본 발명은 17053 트랜스제닉 사건의 게놈 내의 삽입된 트랜스제닉 DNA의 위치에 존재하는 2개의 뉴클레오티드 서열 가닥 중 1개의 가닥만을 참조하여, 특히 서열 1 내지 6을 참조하여 개시되어 있다. 따라서, 함축적으로 및 도출에 의해, 상보 서열 (또한 당업계에서 완전 상보체 또는 역상보 서열로도 지칭됨)도 본 발명의 범주 내에 속하며, 따라서 이 역시 청구되는 대상의 범주 내에 포함시키고자 한다.
삽입된 트랜스제닉 DNA의 완전한 뉴클레오티드 서열 및 삽입된 트랜스제닉 DNA의 양 말단의 측면에 위치한 벼 게놈 DNA의 실질적 절편에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 6으로 제시되어 있다. 이의 하위 부분은 서열 5로 제시된 삽입된 트랜스제닉 DNA이다. 포스포디에스테르 결합에 의해 물리적으로 연결되어, 삽입된 트랜스제닉 DNA (서열 5)의 5' 말단의 측면에 위치하는 벼 게놈 DNA의 뉴클레오티드 서열이 개시되어 있으며 서열 3에 나타나 있다. 포스포디에스테르 결합에 의해 물리적으로 연결되어, 삽입된 트랜스제닉 DNA (서열 5)의 3' 말단의 측면에 위치하는 벼 게놈 DNA의 뉴클레오티드 서열이 개시되어 있으며 서열 4에 나타나 있다.
사건 17053은 2개의 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하는데, 즉, 트랜스제닉 DNA가 삽입된 게놈 DNA의 5' 위치를 확장시키는 서열 및 3' 위치를 확장시키는 서열로서, 본원에서는 연접 서열로 지칭된다. "연접 서열" 또는 "연접 영역"은 삽입된 트랜스제닉 DNA 및 인접한 측면 게놈 DNA를 모두 확장시키는 DNA 서열 및/또는 상응하는 DNA 분자를 지칭한다. 연접 서열은 임의로 2가지의 20개 뉴클레오티드 서열로 표시되어 서열 1 및 서열 2로 제시되어 있으며, 각각 삽입 DNA의 10개 뉴클레오티드에 연결된 바로 인접한 측면 게놈 DNA의 10개의 뉴클레오티드를 나타낸다. 이들 뉴클레오티드는 포스포디에스테르 결합으로 연결되어 있다. 벼에서, 서열 1 및 서열 2는 그의 게놈에서 천연적으로는 나타나지 않는 것으로서, 17053 트랜스제닉 사건에만 특이적이고 특유한 것이며, 벼에서 유래한 임의의 뉴클레오티드 서열에서 이들 서열, 또는 이들 각 서열 중의 약 11개 이상, 약 13개 이상, 또는 약 15개 이상의 연속한 뉴클레오티드가 동정되었다면, 이는 상기 DNA가 벼의 17053 사건으로부터 수득되었다는 것을 확정짓는 것이며, 이는 샘플 내에서 벼의 17053 사건으로부터의 DNA의 존재에 대한 진단이 된다. 서열 1은 벼 게놈 DNA와 삽입된 DNA의 5' 말단 사이의 연접부를 확장시키는 20개 뉴클레오티드 서열이다. 서열 2는 벼 게놈 DNA와 삽입된 DNA의 3' 말단 사이의 연접을 확장시키는 20개 뉴클레오티드 서열이다. 따라서, 본 발명은 적어도 서열 1 및 서열 2 중 하나 또는 둘 모두에 개시된 바의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 분자를 제공한다. 벼의 17053 트랜스제닉 사건으로부터 유래한 DNA의 절편 중에서 서열 1 중의 약 11개 이상, 약 13개 이상, 또는 약 15개 이상의 연속한 뉴클레오티드를 포함하기에 충분한 임의의 절편은 본 발명의 범주 내에 속한다. 벼의 17053 트랜스제닉 사건으로부터 유래한 DNA의 절편 중에서 서열 2 중의 약 11개 이상, 약 13개 이상, 또는 약 15개 이상의 연속한 뉴클레오티드를 포함하기에 충분한 임의의 절편은 본 발명의 범주 내에 속한다. 또한, 본 단락 내에 기재된 서열 중의 임의의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 임의의 폴리뉴클레오티드도 본 발명의 범주 내에 속한다. 도 1은 5'에서 3'으로 정렬된 서열 6에 대한 서열 1 내지 5의 물리적 정렬을 도시한다. 본 발명은 또한 서열 6의 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 샘플에서 17053 사건으로부터 유래한 DNA의 존재를 진단하기 위한 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있는 예시적인 DNA 분자를 제공한다. 그러한 프라이머 또는 프로브는 표적 핵산 서열에 특이적이며, 따라서 본원에 기재된 본 발명의 방법에 의한 벼의 17053 사건의 식별에 유용하다.
"프라이머"는 전형적으로 열적 증폭을 수반한 특정 어닐링 또는 혼성화 방법에서의 사용을 위해 디자인된 고도로 정제된, 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 열적 증폭, 예컨대 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에서, 프라이머쌍을 주형 DNA, 예컨대 벼 게놈 DNA의 샘플과 함께 사용하여 앰플리콘을 생성할 수 있으며, 여기서 상기 반응으로부터 생성된 앰플리콘은 프라이머가 주형에 혼성화된 두 부위 사이에 위치한 주형 DNA의 서열에 상응하는 DNA 서열을 가질 것이다. 본원에서 사용된 바, "앰플리콘"은 증폭 기술을 사용하여 합성된 DNA의 조각 또는 단편이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 17053 사건에 대한 진단이 되는 앰플리콘은 벼 게놈에서 천연적으로는 발견되지 않는 서열을 포함한다. 본 발명의 앰플리콘은 서열 1, 서열 2 및/또는 이들의 상보체의 약 11개 이상의 연속한 뉴클레오티드, 약 13개 이상의 연속한 뉴클레오티드, 또는 약 11개 이상, 약 13개 이상, 또는 약 15개 이상의 연속한 뉴클레오티드를 포함한다. 프라이머는 전형적으로 상보적인 표적 DNA 가닥에 혼성화하여 상기 프라이머와 표적 DNA 가닥 간의 혼성체를 형성하도록 디자인되며, 프라이머의 존재는 중합효소가 상기 표적 DNA 가닥을 주형으로서 사용하여 프라이머의 확장 (즉, 확장 중인 폴리뉴클레오티드 분자 내로의 추가 뉴클레오티드의 중합)을 시작하는, 중합효소의 인식 지점이다. 본 발명에서 사용되는 프라이머쌍은, 전형적으로 열적 증폭 반응 또는 다른 통상의 핵산 증폭 방법에서, 프라이머쌍의 개별 구성원의 결합 표적이 되는 위치 사이의 폴리뉴클레오티드 절편을 선형적으로 증폭시키기 위해 사용되는, 이중 가닥 뉴클레오티드 절편의 반대 가닥에 결합하는 2개의 프라이머를 지칭하는 것으로 의도되었다. 프라이머로서 유용한 예시적인 DNA 분자는 서열 7 내지 8 및 10 내지 11로 제시되어 있다. 서열 7 및 서열 8로서 제시된 프라이머쌍은 제1 DNA 분자 및 상기 제1 DNA 분자와 상이한 제2 DNA 분자로 제시되어 있으며, 두 분자 모두 각각 열적 증폭 반응에서 벼의 17053 사건으로부터 유래한 주형 DNA와 함께 사용될 때, 서열 1의 약 11개 이상의 연속한 뉴클레오티드, 약 13개 이상의 연속한 뉴클레오티드, 또는 약 11개 이상, 약 13개 이상, 또는 약 15개 이상의 연속한 뉴클레오티드를 포함하는 앰플리콘을 생성하는 DNA 프라이머로 기능하기에 충분한 길이의 서열 3, 서열 5, 또는 서열 6 또는 이들의 상보체의 연속한 뉴클레오티드로 이루어져 있다. 제1 DNA 분자 및 상기 제1 DNA 분자와 상이한 제2 DNA 분자로서의 예시적인 DNA 분자쌍이 제시되어 있는데, 즉, 서열 10 및 서열 11이며, 두 분자 모두 각각 열적 증폭 반응에서 벼의 17053 사건으로부터 유래한 주형 DNA와 함께 사용될 때, 서열 2의 약 11개 이상의 연속한 뉴클레오티드, 약 13개 이상의 연속한 뉴클레오티드, 또는 약 11개 이상, 약 13개 이상, 또는 약 15개 이상의 연속한 뉴클레오티드를 포함하는 앰플리콘을 생성하는 DNA 프라이머로 기능하기에 충분한 길이의 서열 4, 서열 5 또는 서열 6 또는 이들의 상보체의 연속한 뉴클레오티드로 이루어져 있다.
"프로브"는 표적 핵산의 가닥에 상보적인 단리된 핵산이다. 본 발명에 따른 프로브는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산뿐 아니라, 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하는 폴리아미드 및 기타 프로브 물질을 포함하며, 그러한 결합의 검출은 특정 샘플에서 상기 표적 DNA 서열의 존재를 진단, 식별, 결정 또는 확인하는데 유용할 수 있다. 프로브는 통상의 검출가능한 표지 또는 리포터 분자, 예를 들어, 방사성 동위원소, 리간드, 화학발광 시약, 또는 효소에 부착될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 17053 사건에 대한 진단이 되는 프로브는 벼 게놈에서 천연적으로는 발견되지 않는 서열을 포함한다. 프로브로서 유용한 예시적인 DNA 분자는 서열 9로서 제시되어 있다.
본 발명에 따른 프로브 및 프라이머는 표적 서열에 대해 완전한 서열 동일성을 갖는 것일 수 있으나, 표적 서열과 상이하지만 표적 서열에 우선적으로 혼성화하는 능력을 보유한 프라이머 및 프로브도 통상의 방법으로 디자인할 수 있다. 핵산 분자가 프라이머 또는 프로브로 기능하기 위해서 유일하게 요구되는 것은, 서열이 충분히 상보적이어서 이용되는 특정 용매 및 염 농도 하에서 안정적인 이중-가닥 구조를 형성할 수 있어야 한다는 것이다. 샘플에서 벼의 17053 사건으로부터의 트랜스제닉 DNA의 존재를 식별하기 위해서는 통상의 임의의 핵산 혼성화 또는 증폭 방법을 이용할 수 있다. 프로브 및 프라이머는 일반적으로 길이가 약 11개 이상의 뉴클레오티드, 약 18개 이상의 뉴클레오티드, 약 24개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 30개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 이상이다. 그러한 프로브 및 프라이머는 엄격한 혼성화 조건 하에서 표적 DNA 서열에 특이적으로 혼성화한다. 통상의 엄격도 조건은 문헌 [Sambrook et al., 1989], 및 [Haymes et al., In: Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)]에 기재되어 있다. 본원에서 사용된 바, 2개의 핵산 분자는 역평행의 이중-가닥 핵산 구조를 형성할 수 있다면 서로 특이적으로 혼성화할 수 있는 것으로 지칭된다. 핵산 분자 및 또 다른 핵산 분자가 완전한 상보성을 나타내는 경우 상기 핵산 분자는 또다른 핵산 분자의 "상보체"로 지칭된다. 본원에서 사용된 바, 분자 중 하나의 모든 뉴클레오티드가 다른 분자의 뉴클레오티드에 상보적인 경우 이들 분자는 "완전한 상보성"을 나타내는 것으로 지칭된다. 2개의 분자가 적어도 통상의 "저-엄격도" 조건 하에서 충분한 안정성으로 서로에 혼성화하여 서로에 어닐링(annealing)한 상태를 유지할 수 있는 경우 이들은 "최소한도로 상보적"인 것으로 지칭된다. 유사하게, 분자들이 통상의 "고-엄격도" 조건 하에서 충분한 안정성으로 서로에 혼성화하여 서로에 어닐링(annealing)한 상태를 유지할 수 있는 경우 이들은 "상보적"인 것으로 지칭된다. 따라서, 이중-가닥 구조를 형성하는 분자의 능력을 완전히 제한하는 것이 아닌 한, 완전한 상보성에서 벗어나는 것은 허용된다.
본원에서 사용된 바, 용어 "단리됨"이란 어떤 분자가 그의 본래적 상태 또는 천연 상태에서 정상적으로는 결합되어 있는 다른 분자로부터 적어도 부분적으로 분리되는 것을 지칭한다. 한 실시양태에서, 용어 "단리됨"은 DNA 분자가 그의 본래적 상태 또는 천연 상태에서 정상적으로는 그의 측면에 위치해 있는 핵산으로부터 적어도 부분적으로 분리되는 것을 지칭한다. 따라서, 정상적으로는 결합되어 있지 않은 조절 서열 또는 코딩 서열에 (예를 들어 재조합 기술의 결과로서) 융합된 DNA 분자는 본원에서 단리된 것으로 간주된다. 그러한 분자는 숙주 세포의 염색체 내로 통합되거나 또는 다른 DNA 분자를 함유한 핵산 용액 중에 존재할 때도 단리된 것으로 간주된다.
본 발명에 개시된 DNA 분자, 또는 그의 단편을 단리 및 조작하기 위해서 당업자에 익히 공지된 임의 수의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, PCR (중합효소 쇄 반응) 기술을 사용하여, 특정 출발 DNA 분자를 증폭하고/하거나 본래의 분자의 변이체를 생성할 수 있다. DNA 분자, 또는 그의 단편은 또한 다른 기술에 의해, 예컨대 화학적 수단에 의한 단편의 직접 합성으로 수득할 수 있으며, 이는 통상은 자동화 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 실시된다.
따라서, 본원에 제시된 DNA 분자 및 상응하는 뉴클레오티드 서열은 무엇보다도 벼의 17053 사건의 식별, 벼의 17053 사건을 포함하는 식물 품종 또는 혼성체의 선별, 샘플에서 벼의 17053 사건으로부터 유래한 DNA의 존재의 검출, 및 벼의 17053 사건 또는 벼의 17053 사건을 포함하는 식물 및 식물의 일부분의 존재 및/또는 부재를 판별하기 위한 샘플의 모니터링에 유용하다.
본 발명은 벼, 자손, 종자, 식물 세포, 식물의 일부분 (예컨대, 화분, 배주, 꼬투리, 꽃, 뿌리 또는 줄기 조직, 섬유, 및 잎), 및 상품을 제공한다. 이들 벼, 자손, 종자, 식물 세포, 식물의 일부분, 및 상품은 검출가능한 양의 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 즉, 예컨대 서열 1 및 서열 2로 제시된 서열 중 하나 이상을 갖는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 본 발명의 식물, 자손, 종자, 식물 세포, 및 식물의 일부분은 또한 하나 이상의 추가적인 전이유전자를 함유할 수도 있다. 그러한 전이유전자는, 이들로 한정되지는 않지만 내충성의 증가, 용수 효율 증가, 수확량 증가, 내건성 증가, 종자 품질 증가, 영양 품질 향상, 및/또는 제초제 내성 증가를 비롯한 바람직한 속성을 부여하는 단백질 또는 RNA 분자를 코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 여기서 상기 바람직한 속성은 그러한 추가의 전이유전자를 결여한 벼와 비교하여 측정된다.
본 발명은 17053 사건을 포함하는 트랜스제닉 벼로부터 유래한 벼, 자손, 종자, 식물 세포, 및 식물의 일부분, 예컨대 화분, 배주, 꼬투리, 꽃, 뿌리 또는 줄기 조직, 및 잎을 제공한다. 본 발명을 유효하게 하기 위해 17053 사건을 포함하는 종자의 대표적인 샘플을 부다페스트 조약에 따라 기탁하였다. 상기 기탁물의 수령을 위해 선택된 기탁기관은 우편번호 20110 미국 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 주소를 가진 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)이다. 상기 ATCC 기탁기관은 17053 사건 종자에 대해 등록 번호 PTA-9843을 배정하였다.
본 발명은 그의 게놈 내에 서열 1 및 서열 2를 가진 DNA 분자를 포함하는 미생물을 제공한다. 그러한 미생물의 예는 트랜스제닉 식물 세포이다. 미생물, 예컨대 본 발명의 식물 세포는 다수의 산업적 용처에서 유용한데, 그것으로서는 이들로 한정되지는 않지만, (i) 과학적 조사 또는 산업 연구를 위한 연구 도구로서 사용하는 것; (ii) 후속 과학적 연구에 또는 산업 제품으로서 사용될 수 있는 내인성 또는 재조합 탄수화물, 지질, 핵산, 또는 단백질 생성물 또는 소분자를 생산하기 위한 배양에서 사용하는 것; 및 (iii) 이후에 농업적 연구 또는 생산에 사용될 수 있는 트랜스제닉 식물 또는 식물 조직 배양물을 생산하기 위해 현대의 식물 조직 배양 기술과 함께 사용하는 것이 있다. 인공적인 독특한 미생물을 생산하기 위해 미생물, 예컨대 트랜스제닉 식물 세포를 생산 및 사용하는 것은 현대의 미생물학 기술 및 인간의 개입을 이용한다. 이 방법에서는, 재조합 DNA를 식물 세포의 게놈 내로 삽입하여 천연 식물 세포로부터 분리된 독특한 트랜스제닉 식물 세포를 생성한다. 이어서, 이 트랜스제닉 식물 세포를 현대의 미생물학 기술을 이용하여 박테리아 및 효모 세포처럼 다량으로 배양할 수 있으며, 이는 미분화의 단세포 상태로 존재할 수도 있다. 상기 신규한 식물 세포의 유전적 조성 및 표현형은 상기 세포의 게놈 내로 이종 DNA를 통합함으로써 생성된 기술적 효과이다. 본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 미생물을 사용하는 방법이다. 본 발명의 미생물, 예컨대 트랜스제닉 식물 세포를 사용하는 방법은, (i) 재조합 DNA를 상기 세포의 게놈 내로 통합시킨 후 이 세포를 사용하여 동일한 이종 DNA를 지닌 추가의 세포를 유도해 냄으로써 트랜스제닉 세포를 생산하는 방법; (ii) 현대의 미생물학 기술을 사용하여 재조합 DNA를 함유한 세포를 배양하는 방법; (iii) 배양된 세포로부터 내인성 또는 재조합 탄수화물, 지질, 핵산, 또는 단백질 생성물을 생산 및 정제하는 방법; 및 (iv) 현대의 식물 조직 배양 기술을 트랜스제닉 식물 세포와 함께 사용하여 트랜스제닉 식물 또는 트랜스제닉 식물 조직 배양물을 생산하는 방법을 포함한다.
본 발명의 식물은 전이유전자를 비롯한 상기 사건 DNA를 자손에 전달할 수 있다. 본원에서 사용된 바, "자손"에는, 선조 식물로부터 유래한 상기 사건 DNA 및/또는 서열 1 및 서열 2로 제시된 서열 중 하나 이상을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 임의의 식물, 종자, 식물 세포, 및/또는 재생가능한 식물의 일부분이 포함된다. 식물, 자손, 및 종자는 전이유전자에 대해 동형접합이거나 또는 이형접합일 수 있다. 자손은 17053 사건을 포함하는 벼에 의해 생산된 종자로부터 및/또는 17053 사건을 포함하는 벼의 화분과 수정된 식물에 의해 생산된 종자로부터 성장한 것일 수 있다.
자손 식물을 자가수분 (또한 "자가수정"으로도 공지됨)시켜, 순계의 식물, 즉, 전이유전자에 대해 동형접합인 식물을 생성할 수도 있다. 적절한 자손의 자가수정은 첨가된 두 외인성 유전자에 대해 동형접합인 식물을 생산할 수 있다.
별법으로, 자손 식물을 이종교배, 예를 들어, 관련없는 또 다른 식물과 생식시켜, 변종 또는 혼성체 종자 또는 식물을 생산할 수 있다. 관련없는 다른 식물은 트랜스제닉이거나 또는 트랜스제닉이 아닐 수 있다. 즉, 본 발명의 변종 또는 혼성체 종자 또는 식물은 벼의 17053 사건의 특이적이고도 특유한 DNA를 결여한 제1 부모를 벼의 17053 사건을 포함한 제2 부모와 교배하여 벼의 17053 사건의 특이적이고도 특유한 DNA를 포함하는 혼성체를 산출함으로써 도출할 수 있다. 교배 또는 생식에 의해 본 발명의 식물 또는 종자, 즉, 서열 1 및 서열 2를 포함하는 벼의 17053 사건의 특이적이고도 특유한 DNA를 함유한 하나 이상의 대립유전자를 가진 종자가 산출되는 한, 각각의 부모는 혼성체이거나 순계교배/변종일 수 있다. 따라서, 2가지의 상이한 트랜스제닉 식물을 교배하여 독립적으로 구분되는 2가지의 부가된 외인성 유전자를 함유한 혼성체 자손을 생산할 수 있다. 예를 들어, 글리포세이트 내성의 17053 사건을 포함하는 벼를 다른 트랜스제닉 벼와 교배하여, 상기 트랜스제닉 부모 둘 모두의 특징을 갖는 식물을 생산할 수 있다. 이의 한 가지 예는 글리포세이트 내성의 17053 사건을 포함하는 벼를 하나 이상의 추가적인 속성을 가진 벼와 교배하여 글리포세이트에 대해 내성이 있으며 하나 이상의 추가적인 속성을 갖는 자손 식물 또는 종자를 산출하는 것이다. 예를 들어, 포스피노트리신 또는 글루포시네이트 제초제에 대해 내성을 나타내는 벼를 17053 사건을 포함하는 벼와 교배하여 글리포세이트 및 포스피노트리신 또는 글루포시네이트 제초제에 대해 내성이 있는 자손 식물 또는 종자를 생산할 수 있을 것이다. 따라서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 식물 및 종자는 또한 하나 이상의 추가의 전이유전자를 함유할 수도 있다. 그러한 전이유전자는 이들로 한정되지는 않지만 내충성 증가, 용수 효율 증가, 수확량 증가, 내건성 증가, 종자 품질 증가, 영양 품질 향상, 스트레스 저항성 향상, 및/또는 제초제 저항성 증가를 비롯한 바람직한 속성을 부여하는 단백질 또는 RNA 분자를 코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 여기서 상기 바람직한 속성은 그러한 추가의 전이유전자를 결여한 벼와 비교하여 측정된다.
트랜스제닉 식물 내성이 입증되어 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 제초제로는, 이들로 한정되지는 않지만, 글리포세이트, 글루포시네이트, 술포닐우레아, 이미다졸리논, 브로목시닐, 델라폰, 시클로헥산디온, 프로토포르피리노겐 옥시다제 억제제, 및 이속사플루톨 제초제가 있다. 제초제 내성에 관여하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는 당업계에 공지되어 있으며, 이들로 한정되지는 않지만, 이하를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자가 포함된다: 글리포세이트-내성 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS) (예를 들어, 미국 특허 제5,627,061호; 제5,633,435호; 제6,040,497호; 제5,094,945호; 제5,804,425호; 제6,248,876호; 제7,183,110호; 제RE39,247호 참조); 글리포세이트 옥시도리덕타제 (GOX) (예를 들어, 미국 특허 제5,776,760호 참조); 글리포세이트-n-아세틸트랜스퍼라제 (GAT); 술포닐우레아, 이미다졸리논, 트리아졸로피리미딘, 피리미디닐 옥시벤조에이트, 술포닐아미노 카르보닐 트리아졸리논, 및/또는 헤테로아릴 에테르에 대한 내성의 경우, 제초제-내성 아세토락테이트 신타제 (ALS, 또한 아세토히드록시산 신타제 (AHAS)로도 공지되어 있음); 아릴옥시페녹시프로피오네이트 (AOPP) (예컨대 할록시포프, 퀴잘로포프, 디클로로포프, 및 디클로포프)에 대한 내성의 경우, 제초제-내성 아세틸 조효소 A 카르복실라제 (ACCase) 또는 R-2,4-디클로로페녹시프로피오네이트 디옥시게나제 (rdpA); 합성 옥신 제초제에 대한 내성의 경우, 해독 단백질, 예컨대 2,4-D 디옥시게나제 (tfdA), R-2,4-디클로로페녹시프로피오네이트 디옥시게나제 (rdpA), 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제 (AAD), 및/또는 S-2,4-디클로르프로프 디옥시게나제 (sdpA); 브로목시닐 내성의 경우, 브로목시닐 니트릴라제 (Bxn) (예를 들어, 미국 특허 제4,810,648호 참조); 노르플루라존에 대한 내성의 경우, 피토엔 탈포화효소 (phytoene desaturase, crtI); 글루포시네이트 및 비알라포스에 대한 내성의 경우, 비알라포스 저항성 (bar) 또는 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (PAT) 단백질 (예를 들어, 미국 특허 제5,646,024호 및 제5,276,268호 참조); 및 트리케톤 (메조트리온, 템보트리온, 토프로메존, 이속사졸) 제초제-내성에 대한 단백질, 예컨대 내성 4-히드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 (HPPD), 해독 시토크롬 P450, 또는 HPPD 경로 우회, 예컨대 아트로박터 글로비포르미스 HPP 옥시다제 (HPPO) 및 슈도모나스 애시도보란스 4-HPA 1-히드록실라제 (HPAH) 및 NADH 옥시도리덕타제 (HPAC).
트랜스제닉 식물에 유용한 다른 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는 당업계에 공지되어 있으며, 이들로 한정되지는 않지만, 이. 콜라이(E. coli) cspA (PCT 공보 제WO2005/033318호); 비. 서브틸리스(B. subtilis) cspB (PCT 공보 제WO2005/033318호); 지 메이스(Zea mays) Mg 수송체 (미국 공보 제20040034888호; 제20070011783호; 제20070294782호); 지 메이스 nfb2 (a.k.a hap3) (미국 공보 제20050022266호 및 제20080104730호; PCT 공보 제WO2008/002480호); 목화 csp-유사 (미국 일련번호 제11/980,758호; 미국 공보 제20050097640호; PCT 공보 제WO 2005/033318호); 밀 csp-유사 (미국 특허 제7,214,786호; 미국 공보 제20050097640호); G1988 (미국 일련번호 제09/474,435호; PCT 공보 제WO04/031349호); G1073 (미국 특허 제6,717,034호 및 미국 공보 제20050097631호); G1274 (미국 공보 제20090265813호); 및 CGPG 2117 (미국 공보 제20080090998호)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 트랜스제닉 식물에 유용한 단백질을 코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드 분자는 당업계에 공지되어 있으며, 해충 방제, 예컨대 살선충제, 살진균제 및 살곤충제에 유용한 것을 포함한다. 살곤충제는, 이들로 한정되지는 않지만, Bt 독소 및/또는 제노라브두스(Xenhorabdus), 포토라브두스(Photorhabdus), 바실루스(Bacillus) (예컨대 바실루스 라테로스포로우스(Bacillus laterosporous)), 세라티아(Serratia), 클레브시엘라(Klebsiella), 에르위니아(Erwinia) 등으로부터의 독소를 포함한다. Bt 독소는, 이들로 한정되지는 않지만, VIP 독소, Cry1, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry7, Cry8, Cry9, 및 이원 살곤충 독소, 예컨대 Bt로부터 유도된 것 등을 포함한다.
모 식물에 대한 여교배 및 비-트랜스제닉 식물과의 이종-교배 또한 고려되며, 영양 번식도 마찬가지로 고려된다. 상이한 속성 및 작물에 통상적으로 사용되는 다른 육종 방법에 대한 설명은 여러 참조문헌 중 하나, 예를 들어 문헌 [Fehr, in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987)]에서 찾을 수 있다.
본 발명은 17053 사건을 포함하는 벼로부터 유래된 식물의 일부분을 제공한다. 본원에 사용된 "식물의 일부분"은 17053 사건을 포함하는 벼로부터 유래된 물질로 이루어진 식물의 임의의 부분을 지칭한다. 식물의 일부분은, 이들로 한정되지는 않지만, 화분, 배주, 꼬투리, 꽃, 뿌리 또는 줄기 조직, 섬유, 및 잎을 포함한다. 식물의 일부분은 생육가능하고/거나, 생육가능하지 않고/거나, 재생가능하고/거나, 재생가능하지 않을 수 있다.
본 발명은 17053 사건을 포함하는 벼로부터 유래된 상품을 제공한다. 본원에 사용된 "상품"은 17053 사건을 포함하는 벼, 종자, 식물 세포 또는 식물의 일부분으로부터 유래된 물질로 이루어진 임의의 조성물 또는 생성물을 지칭한다. 상품은 소비자에게 판매될 수 있고, 생육가능하거나 생육가능하지 않을 수 있다. 생육가능하지 않은 상품은, 이들로 한정되지는 않지만, 생육불능 종자 및 낟알; 가공된 종자, 종자의 일부분 및 식물의 일부분; 탈수화 식물 조직, 냉동 식물 조직 및 가공된 식물 조직; 지상 및/또는 수중 동물 소비를 위한 동물 사료, 인간 소비를 위한 오일, 박, 가루, 박편, 겨, 섬유, 밀크, 치즈, 종이, 크림, 와인 및 임의의 다른 식품용으로 가공된 종자 및 식물의 일부분; 및 바이오매스 및 연료 제품을 포함한다. 생육가능한 상품은, 이들로 한정되지는 않지만, 종자 및 식물 세포를 포함한다. 따라서, 17053 사건을 포함하는 벼는 벼로부터 전형적으로 획득되는 임의의 상품을 제조하는데 사용될 수 있다. 17053 사건을 포함하는 식물로부터 유래된 상기와 같은 임의의 상품은 벼의 17053 사건에 상응하는 하나 이상의 검출가능한 양의 특이적이고도 특유한 DNA를 함유할 수 있으며, 특히 서열 1 또는 서열 2의 15개 이상의 연속한 뉴클레오티드를 함유하는 검출가능한 양의 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분자에 대한 임의의 표준 검출 방법 (본원에 개시된 검출 방법 포함)이 사용될 수 있다. 상품은 그 안에 임의의 검출가능한 양의 서열 1 또는 서열 2가 존재한다면 본 발명의 범주 내에 속한다.
따라서, 본 발명의 식물, 자손, 종자, 식물 세포, 식물의 일부분 (예컨대 화분, 배주, 꼬투리, 꽃, 뿌리 또는 줄기 조직, 및 잎), 및 상품은 특히 농업용으로 17053 사건을 포함하는 종자 및/또는 식물의 일부분을 생산하기 위해 식물을 성장시키고, 식물 육종 및 조사 목적을 위해 17053 사건을 포함하는 자손을 생산하고, 산업 및 조사 용도를 위해 미생물학 기술과 함께 사용하고, 소비자에게 판매하는데 유용하다.
본 발명은 글리포세이트 제초제 및 17053 사건을 포함하는 식물을 사용하여 잡초를 제어하는 방법 및 식물을 생산하는 방법을 제공한다. 경작지에서 잡초를 제어하는 방법이 제공되며, 본 방법은 경작지에서 17053 사건을 포함하는 변이 또는 혼성 식물을 심고, 17053 사건을 포함하는 식물에는 해를 입히지 않으면서 경작지에 있는 잡초를 제어할 목적으로 경작지에 제초 유효 용량의 글리포세이트를 적용하는 것으로 이루어진다. 이러한 글리포세이트 제초제의 적용은 발아-전, 즉 17053 사건을 포함하는 종자를 심은 후 및 17053 사건을 포함하는 식물이 발아하기 전의 임의의 시간에 이루어질 수 있거나, 또는 발아-후, 즉 17053 사건을 포함하는 식물이 발아한 후의 임의의 시간에 이루어질 수 있다. 경작지에서 잡초를 제어하는 또다른 방법이 또한 제공되며, 본 방법은 경작지에서 잡초를 제어하기 위해 유효 용량의 글리포세이트 제초제를 적용한 다음 경작지에 17053 사건을 포함하는 벼를 심는 것으로 이루어진다. 이러한 글리포세이트 제초제의 적용은 심기-전, 즉 17053 사건을 포함하는 종자를 심기-전에 이루어질 것이며, 심기-전 약 14일 내지 심기-전 약 1일을 포함하는 (이로 한정되지 않음) 심기-전의 임의의 시간에 행해질 수 있다. 경작지에서 사용하기 위한 글리포세이트의 제초 유효 용량은 성장 시즌에 걸쳐서 1 에이커 당 글리포세이트 약 0.5 파운드 내지 1 에이커 당 글리포세이트 약 4.5 파운드 만큼의 범위로 이루어져야 한다. 글리포세이트의 다중 적용, 예를 들어 2회 적용 (예컨대 심기-전 적용 및 발아-후 적용 또는 발아-전 적용 및 발아-후 적용) 또는 3회 적용 (예컨대 심기-전 적용, 발아-전 적용 및 발아-후 적용)이 성장 시즌에 걸쳐서 사용될 수 있다.
본 발명의 17053 트랜스제닉 사건에 특이적이며 특유한 DNA 서열을 포함하는 제초제 내성 벼를 생산하는 방법이 제공된다. 이들 방법에 사용된 트랜스제닉 식물은 전이유전자에 대해 동형접합 또는 이형접합일 수 있다. 이들 방법에 의해 생산된 자손 식물은 변이 또는 혼성 식물일 수 있고; 식물에 의해 생산된 종자, 및/또는 17053 사건을 포함하는 벼의 화분으로 수정된 식물에 의해 생산된 벼의 17053 사건을 포함하는 종자로부터 성장한 것일 수 있고; 전이유전자에 대해 동형접합 또는 이형접합일 수 있다. 자손 식물은 이후 자가-수분하여 순계의 식물, 즉 전이유전자에 대해 동형접합인 식물을 생성할 수 있거나, 또는 별법으로 이종교배, 예를 들어 관련없는 또다른 식물과 생식되어 변이 또는 혼성 종자 또는 식물을 생산할 수 있다.
글리포세이트 제초체의 적용에 대해 내성이 있는 벼는 서열 1 및 서열 2의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 17053 사건을 포함하는 식물을 또다른 벼와 유성 교배시키고, 이에 의해 종자를 생산한 다음, 자손 식물로 성장시킴으로써 생산할 수 있다. 이어서, 이들 자손 식물을 글리포세이트 제초제로 처리하여 글리포세이트 제초제에 내성이 있는 자손 식물을 선별할 수 있다. 별법으로, 이들 자손 식물을 진단학적 방법을 사용하여 분석함으로써 17053 사건 DNA를 함유하는 자손 식물을 선별할 수 있다. 교배에 사용된 다른 식물은 글리포세이트 제초제에 대해 내성이 있거나 없을 수 있으며, 트랜스제닉될 수 있거나 안될 수 있다. 생산된 자손 식물 및/또는 종자는 변이 또는 혼성 종자일 수 있다.
본 방법을 실시하는데 있어서, 한 식물을 또다른 식물과 유성 교배하는 단계, 즉 타화-수분은 인간 개입에 의해, 예를 들어 한 식물의 화분을 인간 손으로 수집하고 이 화분을 제2의 식물의 암술대 또는 암술머리와 접촉시키커고/거나; 인간 손 및/또는 작용으로 식물의 수술 또는 꽃밥을 제거, 파괴 또는 회수하여 (예를 들어, 수술제거(detasseling) 또는 화학적 생식자소멸제의 적용에 의함) 천연 자가-수분을 방지하고 수정되려면 타화-수분이 일어나야만 하도록 하고/거나; 인간이 "방향성 수분(directed pollination)"을 위한 위치에 수분 곤충을 배치하고/거나 (예를 들어, 과수원 또는 경작지에 벌집을 배치하거나 식물을 수분 곤충과 함께 보관함에 의함); 인간이 꽃의 일부분을 개방 또는 제거하여 암술대 또는 암술머리 상에 외래 화분의 배치 또는 접촉을 가능하게 하고/거나 (예를 들어, 본래 타화-수분을 방해 또는 방지하므로 자연적으로 인간 개입없이 의무적인 자가-수분자가 되는 꽃을 갖는 벼에서); 식물의 선택적인 배치에 의해 (예를 들어, 의도적으로 수분 근접지에 식물을 심음); 및/또는 개화를 촉진시키거나 (화분에 대한 암술머리의) 수용성을 증진시키는 화학물질의 적용에 의해 달성 또는 용이해질 수 있다.
글리포세이트 제초제의 적용에 내성이 있는 벼는 서열 1 및 서열 2의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 17053 사건을 포함하는 식물을 자가수정하고, 이에 의해 종자를 생산한 다음, 이를 자손 식물로 성장시켜 생산할 수 있다. 이어서, 이들 자손 식물을 글리포세이트 제초제로 처리하여 글리포세이트 제초제에 내성이 있는 자손 식물을 선별할 수 있다. 별법으로, 이들 자손 식물을 진단학적 방법을 사용하여 분석함으로써 17053 사건 DNA를 함유하는 자손 식물을 선별할 수 있다. 본 방법을 실시하는데 있어서, 한 식물을 그 자체와 유성 교배하는 단계, 즉 자가-수분 또는 자가수정은 인간 개입에 의해, 예를 들어 인간 손으로 식물의 화분을 수집하고 이 화분을 같은 식물의 암술대 또는 암술머리와 접촉시킨 다음 임의로 식물의 추가 수정을 방지하고/거나; 인간 손 및/또는 작용으로 다른 근처 식물의 수술 또는 꽃밥을 제거, 파괴 또는 회수하여 (예를 들어 수술제거 또는 화학적 생식자소멸제의 적용에 의함) 천연 타화-수분을 방지하고 수정되려면 자가-수분이 일어나야만 하도록 하고/거나; 인간이 "방향성 수분"을 위한 위치에 수분 곤충을 배치하고/거나 (예를 들어, 식물 단독을 수분 곤충과 함께 보관함에 의함); 인간이 자가-수분되도록 꽃 또는 그의 일부분을 조작하고/거나; 식물의 선택적인 배치에 의해 (예를 들어, 의도적으로 수분 근접지 너머에 식물을 심음); 및/또는 개화를 촉진시키거나 (화분에 대한 암술머리의) 수용성을 증진시키는 화학물질의 적용에 의해 달성 또는 용이해질 수 있다.
이들 방법에 포함되며 이들 방법을 사용하여 생산되는 자손 벼 및 종자는 다른 벼와 상이할 것인데, 이는 예를 들어 자손 벼 및 종자가 재조합되어 인간 개입에 의해 생성되고/거나; 글리포세이트 제초제 내성이고/거나; 본 발명의 전이유전자 DNA로 이루어진 하나 이상의 대립유전자를 함유하고/거나; 서열 1 및 서열 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출가능한 양의 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하기 때문이다. 종자는 개별 자손 식물로부터 선택될 수 있으며, 종자가 서열 1 및 서열 2를 포함하는 한, 이는 본 발명의 범위 안에 속할 것이다.
본 발명을 실시하는데 있어서, 2개의 상이한 트랜스제닉 식물은 2개의 독립적으로 분리된 이형접합 유전자를 함유하는 혼성체 자손을 생산하도록 교배될 수 있다. 적절한 자손의 자가수정은 두 유전자에 대해 동형접합인 식물을 생산할 수 있다. 모 식물에 대한 역-교배 및 비-트랜스제닉 식물과의 이종-교배 또한 고려되며, 영양 번식도 마찬가지로 고려된다. 상이한 속성 및 작물에 통상적으로 사용되는 다른 방법에 대한 설명은 여러 참조문헌 중 하나, 예를 들어 문헌 [Fehr, in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987)]에서 찾을 수 있다.
본원에 개시된 방법에 사용된 식물 및 종자는 또한 하나 이상의 추가 전이유전자를 함유할 수 있다. 이러한 전이유전자는 내충성 증가, 용수 효율 증가, 수확량 증가, 내건성 증가, 종자 품질 증가, 영양 품질 향상, 및/또는 제초제 내성 증가를 포함하는 (이들로 한정되지는 않음) 바람직한 속성을 부여하는 단백질 또는 RNA 분자를 코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 바람직한 속성은 상기 추가의 전이유전자가 결핍된 벼와 비교하여 측정된다.
따라서, 본 발명의 방법은 특히, 농업 또는 조사 목적으로 17053 사건을 포함하는 종자 및/또는 식물의 일부분을 생산하기 위해 식물을 성장시키고, 식물 육종 또는 조사 목적으로 17053 사건을 포함하는 자손을 선별하고, 17053 사건을 포함하는 자손 식물 및 종자를 생산하는 동안 경작지에서 잡초를 제어하는데 유용하다.
본 발병의 식물, 자손, 종자, 식물 세포, 식물의 일부분 (예컨대 화분, 배주, 꼬투리, 꽃, 뿌리 또는 줄기 조직, 및 잎), 및 상품은 DNA 조성, 유전자 발현, 및/또는 단백질 발현에 대해 평가될 수 있다. 이러한 평가는 표준 방법, 예컨대 PCR, 노던 블롯팅, 서던 분석, 웨스턴 블롯팅, 면역-침전, 및 ELISA를 사용하거나 본원에 제공된 검출 방법 및/또는 검출 키트를 사용하여 수행될 수 있다.
샘플에서 벼의 17053 사건에 특이적인 물질의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 하나의 방법은 17053 사건을 포함하는 벼 세포, 조직 또는 식물에 특이적이고 이로부터 유래된 DNA의 존재를 검출하는 것으로 이루어진다. 상기 방법은 열적 증폭에 적절한 조건 하에 놓일 때 17053 사건 DNA로부터의 앰플리콘, 특히 서열 1 또는 서열 2의 15개 이상의 연속한 뉴클레오티드 또는 이들의 상보체를 함유하는 앰플리콘을 생산할 수 있는 프라이머 쌍과 접촉될 주형 DNA 샘플을 제공한다. 앰플리콘은, 주형 DNA 분자가 서열 1 및 서열 2에 기재된 바와 같은 특이적이고 특유한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 한, 벼의 17053 사건으로부터 유래된 주형 DNA 분자로부터 생산된다. 앰플리콘은, 앰플리콘의 생산에 사용하기 위해 선택된 중합효소에 따라, 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA일 수 있다. 상기 방법은 임의의 상기 열적 증폭 반응에서 생산된 앰플리콘 분자를 검출하고, 앰플리콘 서열 내에서 서열 1 또는 서열 2에 상응하는 뉴클레오티드 또는 이들의 상보체의 존재를 확인한는 것을 제공한다. 앰플리콘에서 서열 1 또는 서열 2에 상응하는 뉴클레오티드 또는 이들의 상보체의 검출은, 샘플에서 17053 사건 특이적 DNA의 존재 및 이에 따른 17053 사건을 포함하는 생물학적 물질의 존재를 결정 및/또는 진단해준다.
벼 또는 벼 조직으로부터 유래된 물질로 이루어진 샘플에서 서열 3 및 서열 4에 상응하는 DNA 분자의 존재를 검출하는 또다른 방법이 제공된다. 상기 방법은 (i) 벼 또는 상이한 벼 군으로부터 DNA 샘플을 추출하고, (ii) 상기 DNA 샘플을, 서열 1 또는 서열 2에 기재된 바와 같은 15개 이상의 연속한 뉴클레오티드를 나타내는 DNA 프로브 분자와 접촉시키고, (iii) 상기 프로브 및 DNA 샘플을 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화시키고, 이어서 (iv) 프로브와 표적 DNA 샘플 사이의 혼성화 사건을 검출하는 것으로 이루어진다. 혼성체 조성물의 검출은 서열 3 또는 서열 4의 존재를 진단해주며, 이는 DNA 샘플에서도 같을 수 있다. 별법으로, 혼성화의 부재는 샘플에서 트랜스제닉 사건의 부재를 진단해준다. 별법으로, 특정 벼가 서열 1 또는 서열 2에 상응하는 서열 또는 이들의 상보체 중 어느 하나 또는 모두를 함유하는지 결정하는 것은, 상기 벼가 17053 사건에 상응하는 하나 이상의 대립유전자를 함유하는지를 결정해준다.
따라서, 임의의 널리 공지된 핵산 검출 방법, 예컨대 핵산 프로브를 사용하는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 DNA 혼성화에 의해 본 발명의 핵산 분자의 존재를 검출하는 것이 가능하다. 사건-특이적 PCR 검정은 예를 들어 문헌 [Taverniers et al., J. Agric. Food Chem., 53: 3041-3052, 2005]에서 논의되는데, 이 문헌에서 트랜스제닉 옥수수 계통 Bt11, Bt176, 및 GA21 및 카놀라 사건 RT73에 대한 사건-특이적 추적 시스템이 입증되었다. 이 연구에서, 사건-특이적 프라이머 및 프로브는 각각의 사건에 대해 게놈/전이유전자 연접부의 서열을 기초로 디자인되었다. 트랜스제닉 식물 사건 특이적 DNA 검출 방법은 또한 미국 특허 제6,893,826호; 제6,825,400호; 제6,740,488호; 제6,733,974호; 제6,689,880호; 제6,900,014호 및 제6,818,807호에 기재되어 있다.
DNA 검출 키트가 제공된다. 한 유형의 키트는 샘플에서 트랜스제닉 벼의 17053 사건으로부터 유래된 DNA의 존재를 검출하는데 특이적인 DNA 프라이머 또는 프로브로서 기능하는, 서열 3, 서열 5, 또는 서열 6에 유사하거나 상보적인 충분한 길이의 연속한 뉴클레오티드로 이루어진 하나 이상의 DNA 분자를 함유한다. 이 키트로 검출되는 DNA 분자는 서열 1에 기재된 바와 같은 15개 이상의 연속한 뉴클레오티드, 또는 이의 상보체를 함유한다. 별법으로, 키트는 생물학적 샘플에서 트랜스제닉 벼의 17053 사건으로부터 유래된 DNA의 존재를 검출하는데 특이적인 DNA 프라이머 또는 프로브로서 기능하는, 서열 4, 서열 5, 또는 서열 6에 유사하거나 상보적인 충분한 길이의 연속한 뉴클레오티드로 이루어진 하나 이상의 DNA 분자를 함유할 수 있다. 이 키트로 검출되는 DNA 분자는 서열 2에 기재된 바와 같은 15개 이상의 연속한 뉴클레오티드, 또는 이의 상보체를 함유한다.
또다른 키트는, 표적 DNA 샘플이 상기 기재된 바와 같은 프라이머 쌍과 접촉한 다음, 서열 2의 15개 이상의 연속한 뉴클레오티드 또는 이의 상보체를 포함하는 앰플리콘을 생산하기에 충분한 핵산 증폭 반응을 수행하는 방법을 이용한다. 앰플리콘의 검출 및 앰플리콘 서열 내 서열 1 또는 서열 2의 15개 이상의 연속한 뉴클레오티드 또는 이들의 상보체의 존재의 결정은 표적 DNA 샘플에서 17053 사건 특이적 DNA의 존재를 결정해주거나 또는 상기 또다른 방식으로 진단해준다.
DNA 프로브로서 사용하기에 충분한 DNA 분자는, 샘플에서 17053 사건 DNA에 특이적이며 특유한 DNA의 존재 또는 심지어 부재를 결정, 검출 또는 진단하는데 유용하다. 이 DNA 분자는 서열 1의 15개 이상의 연속한 뉴클레오티드, 또는 이의 상보체, 또는 서열 2의 15개 이상의 연속한 뉴클레오티드, 또는 이의 상보체를 함유한다.
핵산 증폭은 열적 증폭 방법을 비롯한, 당업계에 공지된 다양한 핵산 증폭 방법 중 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 벼의 17053 사건으로부터의 이종 DNA 삽입 서열, 연접 서열, 또는 측면 서열 (17053 사건을 포함하는 대표적인 종자 샘플은 ATCC PTA-9843으로 기탁됨)은 본원에 제공된 서열로부터 유래된 프라이머를 사용하여 상기 사건으로부터의 상기 서열을 증폭시킨 후 앰플리콘 또는 클로닝된 DNA에 대해 표준 DNA 서열분석을 수행함으로써 증명될 수 있다 (또한, 필요한 경우 보정될 수 있다).
이들 방법에 의해 생산된 앰플리콘은 여러 기법에 의해 검출될 수 있다. 이러한 한가지 방법은 제네틱 비트 분석(Genetic Bit Analysis) (문헌 [Nikiforov, et al. Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994])인데, 여기서 인접한 측면 게놈 DNA 서열 및 삽입된 DNA 서열 둘 다에 겹쳐지는 DNA 올리고뉴클레오티드가 디자인된다. 올리고뉴클레오티드는 마이크로웰 플레이트의 웰에 고정된다. 관심 영역의 열적 증폭 후 (삽입된 서열에서 하나의 프라이머 및 인접한 측면 게놈 서열에서 하나의 프라이머를 사용함), 단일 가닥 앰플리콘 (열적 증폭 생성물)을 고정된 올리고뉴클레오티드에 혼성화시키고, DNA 중합효소 및 예상되는 다음 염기에 특이적인 표지된 ddNTP를 사용하여 단일 염기 연장 반응에 대한 주형으로서 이용할 수 있다. 판독(Readout)은 형광 또는 ELISA-기반일 수 있다. 형광 또는 다른 신호의 검출은 성공적인 증폭, 혼성화 및 단일 염기 연장으로 인한 삽입/측면 서열의 존재를 나타낸다.
또다른 방법은 문헌 [Winge, Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000]에 기재된 바와 같은 파이로시퀀싱(Pyrosequencing) 기법이다. 본 방법에서는, 인접한 게놈 DNA 및 삽입 DNA 연접부에 겹쳐지는 올리고뉴클레오티드가 디자인된다. 올리고뉴클레오티드는 관심 영역으로부터의 단일 가닥 열적 증폭 생성물 (단일 가닥 앰플리콘)에 혼성화되고 (삽입된 서열에서 하나의 프라이머 및 측면 게놈 서열에서 하나의 프라이머 사용), DNA 중합효소, ATP, 술푸릴라제, 루시페라제, 아피라제, 아데노신 5' 포스포술페이트 및 루시페린의 존재 하에 인큐베이션된다. ddNTP는 개별적으로 첨가되고, 이러한 혼입으로 인해 광 신호가 생성되며, 이를 측정한다. 광 신호는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 또는 다중-염기 연장으로 인한 전이유전자 삽입/측면 서열의 존재를 나타낸다.
문헌 [Chen, et al., Genome Res. 9:492-498, 1999]에 기재된 바와 같은 형광 편광은 앰플리콘을 검출하는데 사용될 수 있는 방법이다. 이러한 방법을 사용하여, 게놈 측면 및 삽입 DNA 연접부에 겹쳐지는 올리고뉴클레오티드가 디자인된다. 올리고뉴클레오티드는 관심 영역으로부터의 단일 가닥 증폭 생성물에 혼성화되고 (삽입된 DNA에서 하나의 프라이머 및 측면 게놈 DNA 서열에서 하나의 프라이머 사용), DNA 중합효소 및 형광-표지된 ddNTP의 존재 하에 인큐베이션된다. 단일 염기 연장은 ddNTP의 혼입을 초래한다. 이러한 혼입은 플루오로미터를 사용하여 편광의 변화로서 측정될 수 있다. 편광의 변화는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 염기 연장으로 인한 전이유전자 삽입/측면 서열의 존재를 나타낸다.
택맨(등록상표) (피이 어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)는 또한 제조업체에 의해 제공된 설명서를 사용하여 DNA 서열의 존재를 검출 및/또는 정량화하는데 사용될 수 있다. 간략히, 게놈 측면 및 삽입 DNA 연접부에 겹쳐지는 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 디자인된다. FRET 프로브 및 증폭 프라이머 (삽입 DNA 서열에서 하나의 프라이머 및 측면 게놈 서열에서 하나의 프라이머)는 열안정적 중합효소 및 dNTP의 존재 하에 사이클링된다. FRET 프로브의 혼성화는 FRET 프로브 상의 켄칭 잔기로부터 형광 잔기의 절단 및 방출을 초래한다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화로 인한 측면/전이유전자 삽입 서열의 존재를 나타낸다.
몰레큘라 비콘스(Molecular Beacons)는 문헌 [Tyangi, et al., Nature Biotech.14:303-308, 1996]에 기재된 바와 같이 서열 검출에 사용되는 것으로 기재되어 있다. 간략히, 측면 게놈 및 삽입 DNA 연접부에 겹쳐지는 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 디자인된다. FRET 프로브의 독특한 구조는 근접부에서 형광 및 켄칭 잔기를 유지하는 2차 구조를 함유하는 구조를 초래한다. FRET 프로브 및 증폭 프라이머 (삽입 DNA 서열에서 하나의 프라이머 및 측면 게놈 서열에서 하나의 프라이머)는 열안정적 중합효소 및 dNTP의 존재 하에 사이클링된다. 성공적인 증폭 후, 표적 서열에 대한 FRET 프로브르의 혼성화는 프로브 2차 구조의 제거 및 형광 및 켄칭 잔기의 공간 분리를 초래하여 형광 신호를 생성한다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화로 인한 측면/전이유전자 삽입 서열의 존재를 나타낸다. 본 발명의 방법을 실시하는데 있어서 당업계에 공지된 다른 방법, 예컨대 DNA 샘플을 분리 및 증폭하기 위한 방법 및 장치를 제공하는 미세유체학 (예를 들어, 미국 특허 공보 2006068398 및 미국 특허 제6,544,734호 참조); 특정 DNA 분자를 검출 및 측정하기 위한 광학 염료 (예를 들어, WO/05017181 참조); DNA 분자의 검출을 위한 전자 센서를 포함하는 나노튜브 장치 (예를 들어, WO/06024023 참조); 및/또는 특정 DNA 분자에 결합한 다음 검출될 수 있는 나노 비드가 사용될 수 있다.
DNA 검출 키트는 본원에 개시된 조성물 및 DNA 검출 분야에 공지된 방법을 사용하여 개발될 수 있다. 상기 키트는 샘플에서 17053 사건의 확인에 유용하며, 적절한 사건 DNA를 함유하는 벼를 육종하는 방법에 적용될 수 있다. 상기 키트는 서열 1 내지 6 또는 이들의 단편에 유사하거나 상보적인 DNA 프라이머 또는 프로브를 함유할 수 있다. 따라서, 본 발명의 키트 및 검출 방법은 특히 벼의 17053 사건을 확인하고, 17053 사건을 포함하는 식물 변이체 또는 혼성체를 선별하고, 샘플에서 벼의 17053 사건으로부터 유래된 DNA의 존재를 검출하고, 벼의 17053 사건 또는 벼의 17053 사건을 포함하는 식물, 식물의 일부분 또는 상품의 존재 및/또는 부재에 대해 샘플을 모니터링하는데 유용하다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 바람직한 실시양태의 예를 입증하기 위해 포함된다. 당업자는 하기 실시예에 개시된 기법들이, 본 발명자들에 의해 본 발명의 실시에서 잘 기능하는 것으로 발견된 접근법을 나타내고, 따라서 그의 실시를 위해 바람직한 방식의 예를 구성하는 것으로 고려될 수 있음을 이해할 것이다. 그러나, 당업자는 본 개시에 비추어, 개시된 특정 실시양태에서 많은 변화가 이루어질 수 있으며, 본 발명의 취지 및 범위에 벗어남 없이 비슷하거나 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있음을 이해할 것이다.
실시예
실시예 1: 벼의 형질전환 및 사건 선별
본 실시예는 트랜스제닉 벼 사건을 생성하는 방법 및 17053 사건을 선별하는 방법을 기재한다. 글리포세이트에 내성있는 트랜스제닉 17053 사건을 도 1에 예시된 전이유전자 DNA 단편 (이의 서열은 서열 5에 기재됨)을 갖는 벼 세포의 입자 총-매개 형질전환에 의해 생성하였다. 전이유전자 DNA 단편은, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 노팔린 신타제 유전자로부터 유래된 3' 전사 종결 영역 DAN 분자 (T-AGRtu.nos), 그에 작동가능하게 연결된 글리포세이트 내성 EPSPS를 코딩하는 DNA 분자 (AGRtu.EPSPS:CP4), 그에 작동가능하게 연결된 엽록체 운반 펩티드 (CTP2, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) EPSPS)를 코딩하는 DNA 분자, 그에 작동가능하게 연결된 벼 액틴 1 유전자로부터 유래된 인트론 분자 (I-Os.Act1), 그에 작동가능하게 연결된 이중의 인핸서를 포함하는 꽃양배추 모자이크 바이러스(Cauliflower Mosaic Virus)로부터 유래된 프로모터 (P-CaMV.e35S) 분자를 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
먼저, 벼 변이체 M-202로부터의 외식체를 입자 총 방법을 사용하여 4개의 발현 카세트 중 1개로 형질전환하였다. 이어서, 형질전환된 세포를 글리포세이트를 함유하는 배지 상에서 선별하고, 생존하는 세포를 식물로 재생시켰다. 형질전환 과정은 928개의 R0 식물을 생성하였으며, 이때 각각의 R0 식물은 별도의 개별 사건이다. 이들 928개의 사건을 PCR 및 서던 분석에 의해 R0 단계에서 스크리닝하여 복수-카피 및/또는 분자수준의 복합 사건을 제거하였다. PCR 분석을 위해, 먼저 종말점 택맨(등록상표) 검정을 추출된 DNA와 함께 사용하였다. PCR 스크리닝에 기초하여, 565개의 R0 사건을 선별하였다. 이어서, 이들 565개의 R0 사건을 서던 분석에 의해 스크리닝하였다. 서던 분석을 위해, DNA를 벼 조직으로부터 추출하고, NcoI 및 EcoRI 또는 SspI로 소화시키고, 서던 블롯 혼성화 분석 기법 및 CaMV 35S 프로모터 및 EPSPS 코딩 서열에 상보적인 방사성 DNA 프로브를 사용하여 혼성화하였다. 이들 데이타를 사용하여, 벼 게놈에 삽입된 전이유전자 카세트의 카피 수를 결정하고, 단일 삽입을 갖는 240개의 R0 사건을 선별하였다.
이어서, 이들 240개의 선별된 사건을 표현형 및 수정률 분석을 위한 성장 챔버에 진출시켜 오프-타입(off-type) 식물을 확인하였다. 성장 챔버 표현형 및 수정률 스크리닝으로부터, 다음 진행을 위한 170개의 사건을 선별하였다. 이어서, 이들 170개의 R1 사건을 성장 챔버 내에서 글리포세이트 내성에 대해 스크리닝하였다. 또한, 이들 식물을 무손상 전이유전자 삽입에 대해 2차 서던 분석에 의해 분석하였다. 이들 분석으로부터 수집된 데이타를 사용하여, 다음 진행을 위한 19개의 사건을 선별하였다. 이후, 이들 사건 중 13개에 대한 R2 식물을 경작지 시험을 위해 진행시켰다. 여러 특징에 대한 경작지 시험 데이타를 한 성장 시즌에 걸쳐 13개 사건 각각에 대해, 그리고 두 성장 시즌에 걸쳐 5개 사건에 대해 식물로부터 수집하였다. 첫해 경작지 시험에서, 13개의 사건을 다수 복제 경작지 시험 디자인에서의 최소 3개의 위치에서 글리포세이트 내성 및 작물학적 동등성에 대해 시험하였다. 결과를 하기 표 1에 제시한다.
제1 시즌 경작지 시험 프로그램으로부터의 경작지 시험 결과
파라미터 사건
A 17053 B C D E F G H I J K L
효능
생장기
내성		 있음 있음 있음 있음 있음 있음 있음 있음 있음 있음 있음 있음 있음
수율 있음 있음 있음 있음 없음 있음 있음 있음 있음 있음 없음 있음 있음
수정률,
표현형,
성숙도		 없음 있음 있음 있음 있음 있음 없음 있음 있음 있음 있음 있음 있음
작물학
수율 있음 있음 있음 있음 있음 있음 있음 있음 있음 있음 있음 있음 있음
수정률,
표현형,
성숙도		 있음 있음 있음 있음 있음 있음 있음 있음 있음 있음 있음 있음 있음
경작지
시험
통과		 미통과 통과 통과 통과 미통과 통과 미통과 통과 통과 통과 미통과 통과 통과
이어서, 이들 데이타를 사용하여 5개의 주도적 사건을 선별하여 두번째해 경작지 시험으로 진출시켰다. 이들 두번째해 경작지 시험에서, 5개의 주도적 사건을 6 위치의 다수 복제 경작지 디자인에서 글리포세이트 내성 및 작물학적 동등성에 대해 시험하였다. 결과를 하기 표 2에 제시한다.
제2 시즌 경작지 시험 프로그램으로부터의 경작지 시험 결과
파라미터 사건
17053 B C E G
효능
생장기 내성 있음 있음 있음 있음 있음
수율 있음 있음 있음 있음 있음
수정률, 표현형, 성숙도 있음 있음 있음 있음 있음
작물학
수율 있음 있음 있음 있음 있음
수정률, 표현형, 성숙도 있음 있음 있음 있음 있음
경작지 시험 통과? 통과 통과 통과 통과 통과
두 시즌에서의 효능 시험에서, 식물을 성장 중의 4-6 잎 단계에서 3 파운드 산 당량/에이커 (lb ae/ac) 양의 글리포세이트 (이는 전형적인 상업용 비율의 2배임), 또는 4.5 lb ae/ac 양의 글리포세이트 (이는 전형적인 상업용 비율의 3배임)로 처리하였다. 생장기 글리포세이트 내성을 생장기 손상으로서 측정하고, 생식기 글리포세이트 내성을 수율 및 ％ 수정률로서 측정하였다. 이들 시험으로부터의 데이타를 사용하여, 17053 사건을 선별하였다. 17053 사건은 3 lb ae/ac 또는 4.5 lb ae/ac에서 생장기 손상을 나타내지 않았으며, 글리포세이트로의 처리 후 수율 손실을 나타내지 않았다 (벼 낟알의 톤/에이커 (T/ac)로서 측정됨).
실시예 2: 삽입된 DNA에 인접한 벼 염색체 서열의 단리
모든 PCR 반응을 위한 벼 게놈 DNA를 신속한 고pH/고염 용해 프로토콜을 사용하여 단리하였다. 이 프로토콜에서, 대략 0.1 g의 동결건조된 분쇄 잎 조직을 600 μl (마이크로리터)의 용해 완충액 (100 mM Tris, 1 M KCl, 10 mM EDTA, pH 9.5)과 함께 볼텍싱하여 혼합한 다음, 65℃에서 45 내지 60분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 튜브를 다시 볼텍싱하고, 200 μl의 침전 완충액 (5 M 칼륨 아세테이트, pH 7.0)을 첨가하고, 다시 볼텍싱하고, 원심분리하였다. DNA 용액의 600 μl 분취액을 깨끗한 튜브에 옮기고, 500 μl의 빙냉 이소프로판올을 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 원심분리 후, DNA 펠렛을 70％ 에탄올로 세척하고, 공기 건조시키고, DNA를 250 μl의 물에 재현탁시켰다.
본질적으로 문헌 [Liu et al., Plant Journal 8: 457-463, 1995]에 기재된 바와 같은 TAIL-PCR 프로토콜을 사용하여 17053 사건에 대해 전이유전자 삽입에 인접한 벼 게놈 DNA를 연장시켰다. 측면 게놈 DNA를 확인하기 위하여, 2개의 내포된(nested) 게놈-워킹 프라이머 두 세트를 측면 연접부 근처로 디자인하였다. 한 세트는 통합된 발현 카세트의 5' 말단에서 나오도록 디자인하고, 다른 세트는 통합된 발현 카세트의 3' 말단에서 나오도록 디자인하였다. 5' TAIL-PCR에 대한 프라이머는 1 라운드에서는 프라이머 SQ1871 (서열 12)이고 2 라운드에서는 프라이머 SQ1869 (서열 13)이다. 3' TAIL-PCR에 대한 프라이머는 1 라운드에서는 프라이머 SQ1875 (서열 10)이고 2 라운드에서는 프라이머 SQ1880 (서열 14)이다.
각각의 측면 영역의 확인을 위해, 2개의 내포된 프라이머를 문헌 [Liu et al., Plant Journal 8: 457-463, 1995]에 기재된 바와 같은 보다 짧은 임의 퇴화 (arbitrary degenerate, AD) 프라이머와 함께 연속적인 PCR 반응에 사용하였다. PCR의 제1 라운드에서, 5' 및 3' 측면 서열 모두에 대해, 각각의 PCR 반응을 하기 표 3에 상세하게 기재한 바와 같이 설정하였다. 이들 반응은 초기 경사 속도 설정을 갖는 하기 표 4에 기재된 사이클링 파라미터를 이용하여 MJ 엔진 써모사이클러(MJ Engine thermocycler)에서 수행하였다.
벼의 17053 사건 1 라운드 TAIL-PCR 반응
단계 시약 양 설명
1 18 메그옴 물 50 μl의 최종 부피로 첨가됨 -
2 10X 반응 완충액
(MgCl2 함유)		 5.0 μl 완충액의 1X 최농 농도,
MgCl2의 1.5 mM 최종 농도
3 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP의 10 mM 용액 1.0 μl 각 dNTP의 200 μM 최종 농도
4 프라이머 SQ1871 (5' 측면) 또는 프라이머 SQ1875 (3' 측면)
(10 μM의 농도로 1X TE 완충액 또는 18 메그옴 물에 재현탁됨) 		1.0 μl 0.2 μM 최종 농도
5 임의 퇴화 프라이머 AD1, AD2 또는 AD3 (100 μM의 농도로 1X TE 완충액 또는 18 메그옴 물에 재현탁됨) 1.5 μl 3.0 μM 최종 농도
최대 성공률을 위해 3개의 임의 퇴화 프라이머 모두를 사용할 것을 권장함
6 REDTaq DNA 중합효소 (1 유닛/μl) 2.5 μl
(다음 단계 전에 피펫을 교체할 것을 권장함)		 2.5 유닛/반응
7 추출된 DNA
(주형):
표적 DNA
양성 대조군 DNA
비트랜스제닉 DNA		 50 내지 200 ng의 게놈 DNA 1) 성공률을 증가시키기 위해 주형으로서 고품질 DNA를 사용할 것을 권장함
2) 이 접근법을 사용하여 측면 서열이 성공적으로 단리된 트랜스제닉 사건으로부터의 양성 대조군 DNA를 사용할 것을 권장함
1 라운드 TAIL-PCR 써모사이클링 조건
사이클 번호 설정
1 94℃ 2분
5 94℃ 30초
62℃ 1분
72℃ 2분 30초
1 94℃ 30초
25℃ 3분
3분에 걸쳐 72℃로 올라감 (0.2℃/초)
72℃ 2분 30초
15 94℃ 10초
68℃ 1분
72℃ 2분 30초
94℃ 10초
68℃ 1분
72℃ 2분 30초
94℃ 10초
44℃ 1분
72℃ 2분 30초
1 72℃ 5분
TAIL-PCR 제1 라운드의 분취액을 하기 표 5에 상세하게 기재된 바와 같은 TAIL-PCR 제2 라운드에 사용하였다. 이들 반응은 초기 경사 속도 설정을 갖는 하기 표 6에 기재된 사이클링 파라미터를 이용하여 MJ 엔진 써모사이클러에서 수행하였다.
2 라운드 TAIL-PCR 반응
단계 시약 양 설명
1 18 메그옴 물 50 μl의 최종 부피로 첨가됨 -
2 10X 반응 완충액
(MgCl2 함유)		 5.0 μl 완충액의 1X 최농 농도,
MgCl2의 1.5 mM 최종 농도
3 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP의 10 mM 용액 1.0 μl 각 dNTP의 200 μM 최종 농도
4 프라이머 SQ1869 (5' 측면) 또는 프라이머 SQ1880 (3' 측면)
(10 μM의 농도로 1X TE 완충액 또는 18 메그옴 물에 재현탁됨) 		1.0 μl 0.2 μM 최종 농도
5 임의 퇴화 프라이머 (100 μM의 농도로 1X TE 완충액 또는 18 메그옴 물에 재현탁됨) 1.0 μl 2.0 μM 최종 농도
6 REDTaq DNA 중합효소 (1 유닛/μl) 2.5 μl
 2.5 유닛/반응
(다음 단계 전에 피펫을 교체할 것을 권장함)
7 1 라운드 TAIL-PCR 반응의 1:100 희석액 5.0 μl
2 라운드 TAIL-PCR 써모사이클링 조건
사이클 번호 설정
1 94℃ 2분
12 94℃ 10초
64℃ 1분
72℃ 2분 30초
94℃ 10초
64℃ 1분
72℃ 2분 30초
94℃ 10초
44℃ 1분
72℃ 2분 30초
10 94℃ 15초
44℃ 1분
72℃ 2분 30초
1 72℃ 5분
TAIL-PCR 앰플리콘을 가시화하기 위해, 2 라운드 반응의 분취액을 2.0％ 아가로스 겔 상에서 전개시키고, 에티듐 브로마이드로 염색하였다. 추가로, TAIL-PCR 제2 라운드의 분취액을 서열분석하기 위해 몬산토(Monsanto) 게놈 서열분석 센터에 제출하였다. 몬산토 소유의 플랭킹 시퀀스 어플리케이션(Flanking Sequence Application) 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 서열 분석을 수행하였다.
PCR 프라이머는 제2 라운드 TAIL-PCR 반응의 서열분석 결과에서 관찰된 게놈 측면 서열을 확인하도록 디자인하였다. 17053 사건에서, 5' 게놈 측면 서열은 프라이머 쌍 SQ3626 (서열 15)과 SQ1869 (서열 13)를 이용한 PCR 반응에 의해 확인하였다. 17053 사건에서, 3' 게놈 측면 서열은 프라이머 쌍 SQ3623 (서열 11)과 SQ1875 (서열 10)를 이용한 PCR 반응에 의해 확인하였다.
실시예 3: 사건 특이적 종말점 택맨(등록상표) 검정.
본 실시예는 샘플에서 17053 사건을 확인하기 위해 개발된 사건 특이적 종말점 택맨(등록상표) 열적 증폭 방법을 기재한다. 본 방법에 유용한 조건의 예는 하기 표 7 및 표 8에 기재되어 있다. 본 방법에 유용한 DNA 분자는 예를 들어, 프라이머 SQ4194 (서열 7) 및 SQ4191 (서열 8) 및 6FAMTM-표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 PB1494 (서열 9)이다. 다른 프로브 및 프라이머는 본원에 제공된 전이유전자 삽입 서열 및/또는 측면 서열을 기초로 디자인될 수 있다. SQ4194 (서열 7) 및 SQ4191 (서열 8)은 PB1494 (서열 9)와 함께 이들 반응 방법에 사용될 때 17053 사건 DNA에 대한 진단이 되는 DNA 앰플리콘을 생성한다. 이러한 분석을 위한 대조군은 17053 사건 DNA를 함유하는 벼로부터의 양성 대조군, 비-트랜스제닉 벼로부터의 음성 대조군, 및 주형 DNA를 함유하지 않는 음성 대조군을 포함한다.
이들 검정은 어플라이드 바이오시스템즈 진앰프 PCR 시스템(Applied Biosystems GeneAmp PCR System) 9700 또는 스트래타진 로보사이클러(Stratagene Robocycler), MJ 엔진, 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer) 9700, 또는 에펜도르프 마스터사이클러 그래디언트(Eppendorf Mastercycler Gradient) 써모사이클러에서 사용하는데 최적화되어 있다. 생물학적 샘플에서 17053 사건 DNA를 확인하기 위한 앰플리콘을 생성하는데 유용할 다른 방법 및 장치가 당업자에게 공지되어 있다. 하기 표 7 및 표 8에 기재된 사이클링 파라미터는 샘플을 분석할 때 사용될 수 있다. 에펜도르프 마스터사이클러 그래디언트 또는 MJ 엔진에서 열적 증폭을 수행하는 경우, 써모사이클러는 계산된 방식으로 진행되어야 한다. 퍼킨-엘머 9700에서 열적 증폭을 수행하는 경우, 써모사이클러는 최대의 경사 속도로 설정되어야 한다.
벼의 17053 사건 특이적 종말점 택맨(등록상표)
단계 시약 부피 설명
1 18 메그옴 물 10 μl의 최종 부피로 조정함
2 2X 유니버설 마스터 믹스(Universal Master Mix) (dNTP, 효소, 완충액) 5.0 μl 1X 최종 농도
3 프라이머-1과 프라이머-2의 믹스 (각각의 프라이머에 대해 20 μM의 농도가 되도록 18 메그옴 물 중에 재현탁됨) 예: 마이크로원심분리 튜브에서, 20 μM의 최종 농도의 500 μl를 달성하도록 하기 물질이 첨가되어야 함: 100 μM의 농도의 프라이머 SQ4194 (서열 7) 100 μl; 100 μM의 농도의 프라이머 SQ4191 (서열 8) 100 μl; 18 메그옴 물 300 μl 0.5 μl 1.0 μM 최종 농도
4 사건 6-FAMTM MGB 프로브 PB1494 (서열 9) (10 μM의 농도로 18 메그옴 물에 재현탁됨) 0.2 μl 0.2 μM 최종 농도
5 추출된 DNA (주형):
1. 분석될 잎 샘플
2. 음성 대조군 (비-트랜스제닉 DNA)
3. 음성 물 대조군 (비 주형)
4. 양성 대조군 17053 DNA		 3.0 μl
종말점 택맨(등록상표) 써모사이클러 조건
사이클 번호 설정
1 50℃ 2분
1 95℃ 10분
10 95℃ 15초
64℃ 1분
-1℃/사이클
30 95℃ 15초
54℃ 1분
1 10℃ 영구히
실시예 4: 육종 활동에 있어서의 17053 사건의 확인
본 실시예는 17053 사건을 포함하는 벼를 사용한 임의의 육종 활동의 자손 내에서 17053 사건을 확인할 수 있는 방법을 기재한다. DNA 사건 프라이머 쌍을 사용하여 17053 사건에 대한 진단이 되는 앰플리콘을 생성한다. 17053 사건에 대한 진단이 되는 앰플리콘은 서열 1 또는 서열 2로서 본원에 제공된 하나 이상의 연접 서열 ([A] 및 [B], 각각 도 1에 예시됨)을 포함한다. 서열 1 (도 1의 [A])은 전이유전자 삽입의 5' 말단과 측면 서열의 연접부 (서열 3 [C]의 위치 565 내지 584, 도 1 참조)에 상응하는 뉴클레오티드 서열이다. 서열 2 ([B], 도 1 참조)는 전이유전자 삽입의 3' 말단과 측면 서열의 연접부 (서열 4 [D]의 위치 626 내지 645, 도 1 참조)에 상응하는 뉴클레오티드 서열이다.
17053 사건에 대한 진단학적 앰플리콘을 생성할 사건 프라이머 쌍은 측면 서열 (서열 3 및 서열 4) 및 삽입된 트랜스제닉 DNA 서열 (서열 5)을 사용하여 디자인된 프라이머 쌍을 포함한다. 서열 1의 11개 이상의 뉴클레오티드가 발견되는 진단학적 앰플리콘을 얻기 위해, 서열 3의 염기 1에서 564까지를 기초로 정방향 프라이머 분자를 디자인하고, 삽입된 발현 카세트 DNA 서열인 서열 5의 위치 1에서 3142까지를 기초로 역방향 프라이머 분자를 디자인할 것이며, 여기서 프라이머 분자는 서열 3 및 서열 5에 특이적으로 혼성화되는 충분한 길이의 연속한 뉴클레오티드이다. 서열 2의 11개 이상의 뉴클레오티드가 발견되는 진단학적 앰플리콘을 얻기 위해, 삽입된 발현 카세트인 서열 5의 위치 1에서부터 3142까지를 기초로 정방향 프라이머 분자를 디자인하고, 3' 측면 서열인 서열 4의 염기 1에서 645까지를 기초로 역방향 프라이머 분자를 디자인할 것이며, 여기서 프라이머 분자는 서열 4 및 서열 5에 특이적으로 혼성화되는 충분한 길이의 연속한 뉴클레오티드이다. 실시를 위해, 제한된 크기 범위, 예를 들어 100 내지 1000개의 염기의 앰플리콘을 생성하는 프라이머를 디자인하여야 한다. 보다 작은 크기 (보다 짧은 폴리뉴클레오티드 길이)의 앰플리콘은 일반적으로 PCR 반응에서 보다 신뢰할 만하게 생성될 수 있고, 보다 짧은 사이클 시간을 허용하며, 아가로스 겔 상에서 용이하게 분리 및 가시화되거나 종말점 택맨(등록상표)-유사 검정에서의 사용에 용이하게 적용될 수 있다. 보다 작은 앰플리콘은 DNA 앰플리콘 검출 분야에 공지된 방법에 의해 생성 및 검출될 수 있다. 또한, 프라이머 쌍을 사용하여 생성된 앰플리콘은 백터 내로 클로닝, 증식, 단리 및 서열분석될 수 있거나, 당업계에 널리 확립된 방법으로 직접 서열분석될 수 있다. 17053 사건에 대한 진단이 되는 앰플리콘 또는 그의 자손을 생성하기 위한 DNA 증폭 방법에 유용한 서열 3과 서열 5의 조합 또는 서열 4와 서열 5의 조합으로부터 유래된 임의의 프라이머 쌍은 본 발명의 한 측면이다. 17053 사건을 포함하는 식물 또는 그의 자손에 대한 진단이 되는 앰플리콘을 생성하기 위한 DNA 증폭 방법에 유용한, 서열 3의 11개 이상의 연속한 뉴클레오티드를 포함하는 임의의 한 단리된 DNA 폴리뉴클레오티드 프라이머 분자 또는 그의 상보체는 본 발명의 한 측면이다. 17053 사건을 포함하는 식물 또는 그의 자손에 대한 진단이 되는 앰플리콘을 생성하기 위한 DNA 증폭 방법에 유용한, 서열 4의 11개 이상의 연속한 뉴클레오티드를 포함하는 임의의 한 단리된 DNA 폴리뉴클레오티드 프라이머 분자 또는 그의 상보체는 본 발명의 한 측면이다. 17053 사건을 포함하는 식물 또는 그의 자손에 대한 진단이 되는 앰플리콘을 생성하기 위한 DNA 증폭 방법에 유용한, 서열 5의 11개 이상의 연속한 뉴클레오티드를 포함하는 임의의 한 단리된 DNA 폴리뉴클레오티드 프라이머 분자 또는 그의 상보체는 본 발명의 한 측면이다.
이러한 분석을 위한 증폭 조건의 예는 표 7 및 표 8에 예시되어 있다. 그러나, 이들 방법의 임의의 변형 또는 17053 사건에 대한 진단이 되는 앰플리콘을 생성하는 17053 사건의 서열 3 또는 서열 4 또는 전이유전자 삽입 DNA 서열 (서열 5)에 상동성이거나 상보적인 DNA 프라이머의 사용은 본 개시의 범주 내에 속한다. 진단학적 앰플리콘은 1개 이상의 전이유전자/게놈 연접 DNA (서열 1 또는 서열 2) 또는 이의 실질적인 부분에 상동성이거나 상보적인 DNA 분자를 포함한다.
샘플에서 17053 사건에 대한 분석은 17053 사건으로부터의 양성 대조군, 17053 사건이 아닌 벼로부터의 음성 대조군 (예를 들어, M-202 (이로 한정되지는 않음)), 및/또는 벼 게놈 DNA를 함유하지 않는 음성 대조군을 포함할 수 있다. 내인성 벼 DNA 분자를 증폭시킬 프라이머 쌍은 DNA 증폭 조건에 대한 내부 대조군으로서의 역할을 할 수 있다. 서열 3, 서열 4 또는 서열 5에 기재된 서열로부터 선택된 서열의 임의의 단편은 표 7 및 표 8에 나타낸 방법으로 앰플리콘을 생성하기 위한 DNA 증폭 프라이머로서 사용될 수 있고, 이러한 앰플리콘은 상기 진단학적 증폭 반응을 위한 주형으로서 17053 사건을 사용할 경우에 17053 사건에 대한 진단이 될 수 있다. 표 7 및 표 8의 방법을 변형하여 이들 DNA 프라이머 서열을 사용하는 것은 본 발명의 범주 내에 속한다. 17053 사건에 대한 진단이 되는 서열 3, 서열 4, 또는 서열 5로부터 유래된 1개 이상의 DNA 프라이머 서열에 의해 생성된 앰플리콘은 본 발명의 한 측면이다.
따라서, 서열 3, 서열 4, 또는 서열 5로부터 유래된 충분한 길이의 연속한 뉴클레오티드의 1개 이상의 DNA 프라이머를 함유하며, DNA 증폭 방법에 사용될 때 17053 사건을 포함하는 식물 또는 그의 자손에 대한 진단학적 앰플리콘을 생성하는 DNA 검출 키트가 디자인될 수 있으며, 이는 본 발명의 한 측면이다. DNA 증폭 방법으로 시험시 17053 사건에 대한 진단이 되는 앰플리콘을 생성할 벼의 일부분 또는 종자 또는 상품은 본 발명의 한 측면이다. 17053 사건 앰플리콘에 대한 검정은, 어플라이드 바이오시스템즈 진앰프(등록상표) PCR 시스템 9700 또는 스트래타진 로보사이클러(등록상표), 또는 MJ 엔진, 또는 퍼킨-엘머 9700, 또는 에펜도르프 마스터사이클러(등록상표) 그래디언트 써모사이클러, 또는 표 8에 나타낸 17053 사건에 대한 진단이 되는 앰플리콘을 생성하는데 사용될 수 있는 임의의 다른 증폭 시스템을 사용하여 수행될 수 있다.
상기 개시되고 하기 특허청구범위에 기재된 벼의 17053 사건을 포함하는 대표적인 종자 샘플이 부다페스트 조약 하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) (미국 20110 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801)에 기탁되었다. 기탁일은 2009년 2월 18일이었다. 이 기탁물에 대한 ATCC 등록 번호는 PTA-9843이다. 기탁물은 30년 또는 마지막 요청일 후 5년의 기간, 또는 특허 유효일 중 보다 긴 기간 동안 기탁기관에 유지될 것이며, 상기 기간 동안 필요에 따라 대체될 것이다.
본 발명의 원리가 예시 및 기재되어 있으므로, 본 발명이 상기 원리에 벗어나지 않으면서 배열 및 세부사항에서 변형될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명자들은 첨부된 특허청구범위의 취지 및 범주 내에 있는 모든 변형을 청구한다.
ATCC PTA-9843 20090218 ATCC PTA-9844 20090218
SEQUENCE LISTING <110> Chen, Yun-Chia Sophia Duong, Can Hoi, Sio-Wai Hubmeier, Christopher S Qi, Youlin <120> RICE TRANSGENIC EVENT 17053 AND METHODS OF USE THEREOF <130> MONS:246WO <140> unknown <141> 2010-03-29 <150> US 61/164,899 <151> 2009-03-30 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized Oligonucleotide; chimeric DNA molecule of rice genomic DNA and transgene DNA <400> 1 aaaggataca accaagcttg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized Oligonucleotide; chimeric DNA molecule of rice genomic DNA and transgene DNA <400> 2 tagtctatgt taagcttggt 20 <210> 3 <211> 584 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric DNA molecule of rice genomic DNA and transgene DNA <400> 3 ttgtagaagt taagcaaaag tcaatggcat attgtagaac atgataaagt cagtggcaaa 60 tcgtagacgt gtgacaaaat cagtggtata taatggattc tctctattat tttagaccta 120 tgattgtctt gcagtaagat agtgtagaag tcttggtcat 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Claims (44)

  1. (a) 서열 1, 서열 2, 서열 3 및 서열 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자; 또는
    (b) (a)에 상보적인 서열
    을 포함하는 DNA 분자.
  2. 제1항에 있어서, 서열 6에 대해 90％ 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 DNA 분자가 17053 사건 (event)으로부터 유래된 것이고, 17053 사건을 포함하는 종자의 대표적인 샘플이 ATCC 등록 번호 PTA-9843으로 기탁된 것인 DNA 분자.
  4. 제1항에 있어서, 벼, 벼 세포, 종자, 자손 벼, 벼의 일부분, 또는 쌀 상품에 포함되는 DNA 분자.
  5. 제1항에 있어서, 17053 사건으로부터의 주형 분자로부터 생성된 앰플리콘인 DNA 분자.
  6. 서열 1 및 서열 2, 및 이들의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중의 11개 이상의 연속한 뉴클레오티드로 이루어진 서열에 결합하기에 충분한 길이를 가지며, 17053 사건의 존재에 대한 진단이 되는 폴리뉴클레오티드 프로브.
  7. 제1 DNA 분자 및 상기 제1 DNA 분자와 상이한 제2 DNA 분자로 이루어지며, 상기 DNA 분자는 서열 6, 또는 이의 상보체의 연속한 뉴클레오티드로 이루어진 충분한 길이의 뉴클레오티드 서열을 가져, 벼의 17053 사건으로부터의 주형을 이용한 증폭 반응에서 함께 사용될 때 DNA 프라이머로 기능하여 샘플에서 벼의 17053 사건에 대한 진단이 되는 앰플리콘을 생성하는 것인, DNA 분자쌍.
  8. 제7항에 있어서, 상기 앰플리콘이 서열 1 및 서열 2, 및 이들의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 DNA 분자쌍.
  9. (a) DNA 샘플을 제7항의 DNA 분자쌍과 접촉시키는 단계;
    (b) 서열 1 및 서열 2, 및 이들의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중의 11개 이상의 연속한 뉴클레오티드를 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 앰플리콘을 생성하기에 충분한 증폭 반응을 실시하는 단계; 및
    (c) 상기 DNA 앰플리콘을 검출하는 단계
    를 포함하며, 여기서 상기 DNA 앰플리콘의 검출이 상기 DNA 샘플에서 상기 벼의 17053 사건으로부터의 DNA 분자의 존재에 대한 진단이 되는 것인, 벼의 17053 사건으로부터의 DNA 분자의 존재를 검출하는 방법.
  10. (a) 서열 1 및 서열 2, 및 이들의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 엄격한 혼성화 조건 하에서 서열 3 또는 서열 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자와 혼성화하며, 상기 엄격한 혼성화 조건 하에서 서열 3 또는 서열 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는 DNA 분자와는 혼성화하지 않는 DNA 프로브를 샘플과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 샘플 및 상기 DNA 프로브를 엄격한 혼성화 조건에 적용하는 단계; 및
    (c) 서열 3 또는 서열 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상기 DNA 분자에 대한 상기 DNA 프로브의 혼성화를 검출하는 단계
    를 포함하는, 샘플에서 서열 3 또는 서열 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자의 존재를 검출하는 방법.
  11. 벼의 17053 사건으로부터의 DNA의 존재를 검출함에 있어 특이적인 DNA 프라이머 또는 프로브로 기능하기에 충분한 길이의 서열 6 및 이의 상보체 중의 연속한 뉴클레오티드 서열로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA 분자를 포함하며, 여기서 상기 DNA의 검출이 샘플에서 상기 벼의 17053 사건의 존재에 대한 진단이 되는 것인, DNA 검출 키트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 DNA 분자가 서열 1 또는 서열 2, 또는 이들의 상보체 중의 15개 이상의 연속한 뉴클레오티드를 포함하는 것인 DNA 검출 키트.
  13. 제11항에 있어서,
    (a) 제7항의 DNA 분자쌍과 샘플을 접촉시키는 단계;
    (b) 서열 1 또는 서열 2, 또는 이들의 상보체 중의 15개 이상의 연속한 뉴클레오티드를 포함하는 앰플리콘을 생성하기에 충분한 핵산 증폭 반응을 실시하는 단계; 및
    (c) 상기 앰플리콘을 검출하는 단계
    를 포함하는 방법을 이용하는 DNA 검출 키트.
  14. 서열 1, 서열 2, 및 이들의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는, 벼, 종자, 세포, 또는 이들 식물의 일부분.
  15. 제14항에 있어서, 글리포세이트 제초제 처리에 내성이 있는 벼, 종자, 세포, 또는 이들 식물의 일부분.
  16. 제14항에 있어서, 상기 벼, 종자, 세포, 또는 이들 식물의 일부분의 게놈이 DNA 증폭 방법으로 테스트시 17053 사건에 대한 진단이 되는 앰플리콘을 생성하는 것인 벼, 종자, 세포, 또는 이들 식물의 일부분.
  17. 17053 사건을 포함하며, 17053 사건을 포함하는 종자의 대표적인 샘플이 ATCC 등록 번호 PTA-9843으로 기탁된 것인, 벼, 종자, 세포, 또는 이들 식물의 일부분.
  18. 제17항에 있어서, 상기 식물 또는 이의 일부분이 글리포세이트 제초제 처리에 내성이 있는 것인, 벼, 종자, 세포, 또는 이들 식물의 일부분.
  19. 제17항에 있어서, 상기 벼 또는 종자가 17053 사건으로부터 유래하거나 이를 포함하는 하나 이상의 부모를 갖는 혼성체이며, 여기서 17053 사건을 포함하는 종자의 대표적인 샘플은 ATCC 등록 번호 PTA-9843으로 기탁된 것인, 벼, 종자, 세포, 또는 이들 식물의 일부분.
  20. 제17항에 있어서, 세포, 화분, 배주, 꼬투리, 꽃, 뿌리 조직, 줄기 조직, 또는 잎 조직으로 한정되는 벼, 종자, 세포, 또는 이들 식물의 일부분.
  21. 제17항에 있어서, 상기 17053 사건을 포함하는 벼의 임의의 세대의 자손 식물로 추가 한정되는 벼, 종자, 세포, 또는 이들 식물의 일부분.
  22. 서열 1 및 서열 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 DNA 분자를 포함하는 쌀 상품.
  23. 제22항에 있어서, 통곡 또는 가공된 벼 종자, 동물 사료, 오일, 박 (meal), 가루, 박편, 겨, 팽화 쌀, 밀크, 치즈, 종이, 크림, 와인, 알콜, 바이오매스, 및 연료 제품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상품으로 추가 한정되는 쌀 상품.
  24. 제22항에 있어서, 상기 상품이 17053 사건을 포함하며, 여기서 상기 17053 사건을 포함하는 대표적인 종자가 ATCC 등록 번호 PTA-9843으로 기탁된 것인, 쌀 상품.
  25. 제22항에 있어서, DNA 증폭 방법으로 테스트시 17053 사건에 대한 진단이 되는 앰플리콘을 생성하는 핵산을 포함하는 것으로 추가 한정되는 쌀 상품.
  26. DNA 증폭 방법으로 테스트시 17053 사건 진단성 앰플리콘을 생성할 수 있으며, 여기서 상기 17053 사건을 포함하는 대표적인 종자가 ATCC 등록 번호 PTA-9843으로 기탁된 것인, 벼 또는 이의 일부분.
  27. 제26항에 있어서, 앰플리콘이 서열 1 또는 서열 2를 포함하는 것인 벼.
  28. DNA 증폭 방법으로 테스트시 17053 사건 진단성 앰플리콘을 생성할 수 있으며, 상기 17053 사건을 포함하는 대표적인 종자가 ATCC 등록 번호 PTA-9843으로 기탁된 것인, 벼 종자.
  29. 제28항에 있어서, 앰플리콘이 서열 1 또는 서열 2를 포함하는 것인 벼 종자.
  30. 벼 게놈 내로 17053 사건을 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 17053 사건을 포함하는 대표적인 종자가 ATCC 등록 번호 PTA-9843으로 기탁된 것인, 글리포세이트 제초제에 내성이 있는 벼를 생산하는 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    (a) 17053 사건을 포함하는 제1의 벼를 17053 사건이 결여된 제2의 벼와 교배시켜 자손 벼를 생산하는 단계; 및
    (b) 상기 17053 사건을 포함하며 글리포세이트에 내성이 있는 하나 이상의 제1 자손 벼를 선별하는 단계
    를 포함하는 것으로 한정되는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 제1 자손 벼를 자가수정시켜, 제2 세대 자손 벼를 생산하고, 상기 17053 사건에 대해 동형접합인 하나 이상의 제1 벼를 선별하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  33. (a) 제17항의 벼 또는 이의 일부분을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 벼 또는 이의 일부분으로부터 쌀 상품을 생산하는 단계
    를 포함하는, 쌀 상품을 생산하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상품이 통곡 또는 가공된 벼 종자, 동물 사료, 오일, 박, 가루, 박편, 겨, 팽화 쌀, 밀크, 치즈, 종이, 크림, 와인, 알콜, 바이오매스, 및 연료 제품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  35. 잡초의 성장을 제어하기에 유효한 양의 글리포세이트로 경작지를 처리하는 것을 포함하며, 여기서 17053 사건을 포함하는 벼가 글리포세이트에 내성을 나타내는 것인, 17053 사건을 포함하는 벼를 포함하는 경작지에서 잡초의 성장을 제어하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 글리포세이트의 유효한 양이 1 에이커(acre)당 0.5 파운드 내지 4.5 파운드인 방법.
  37. 서열 1, 서열 2 및 이들의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 DNA 분자를 포함하는 살아있지 않은 식물 물질.
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 분자가 서열 1의 서열을 갖는 것인 DNA 분자.
  41. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 분자가 서열 2의 서열을 갖는 것인 DNA 분자.
  42. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 분자가 서열 3의 서열을 갖는 것인 DNA 분자.
  43. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 분자가 서열 4의 서열을 갖는 것인 DNA 분자.
  44. 제1항에 있어서, 서열 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자.
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