KR101444155B1 - 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별용 프라이머 세트, 이를 이용한 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별 방법 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents
쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별용 프라이머 세트, 이를 이용한 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별 방법 및 이를 포함하는 키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별용 프라이머 세트, 이를 이용한 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별 방법 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 본 발명에 의하면 1회의 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통하여 양성대조구인 쌀 DNA 밴드의 확인과 밀 성분의 혼입 여부를 동시에 판별할 수 있기 때문에, 판별을 위한 노동력과 시간을 현저하게 절약할 수 있다.
Description
본 발명은 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별용 프라이머 세트, 이를 이용한 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별 방법 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 1회의 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통하여 양성대조구인 쌀 DNA 밴드의 확인과 밀 성분의 혼입 여부를 동시에 판별할 수 있는 프라이머 세트, 방법 및 키트에 관한 것이다.
전통적으로 쌀로 만든 음식에는 밥, 죽, 떡, 한과, 술 등이 있다. 그중에서도 쌀 생산량의 95%는 밥으로 소비되었다. 그러나 생활수준이 높아지고 핵가족화가 이루어지면서 식생활도 변하여, 조리가 편한 가공식품의 수요가 늘고 외식하는 횟수도 늘어났다.
이렇게 쌀의 소비가 줄어들자 정부는 쌀 소비를 촉진하기 위하여 1986년 혼식을 폐지하였다. 또한 1990년 쌀을 막걸리와 가공식품의 원료로 사용하도록 허용하고, 1991년에는 소주의 원료로 쌀을 사용할 수 있도록 허가하였다.
근래에는 건강에 대한 소비자의 높은 관심과 정부의 쌀 가공사업 장려정책에 맞물려, 쌀가공 식품의 생산과 시장규모는 하기 표 1과 같이 꾸준히 증가하고 있다.
이러한 쌀가공 식품의 소비 증가 추세에 편승하여 쌀가공 식품에 비교적 값이 싼 밀가루를 섞어 “쌀 100%”라고 허위표시를 할 개연성이 있다. 하지만, 밀가루 원료의 혼입 여부에 대한 과학적이고 효율적인 판별방법이 없어 이를 확인할 수 없는 문제점이 있다.
한국등록특허 제10-1219763호, 제10-1277798호, 제10-1277799호, 제10-1277800호 및 제10-1277801호에는 쌀과 밀의 성분 유무를 확인할 수 있는 DNA 판별방법이 개시되어 있지만, 쌀과 밀의 프라이머 세트를 각각 중합효소 연쇄반응(PCR)을 하기 때문에 비효율적인 문제점이 있다. 또한, 쌀과 밀의 프라이머 세트들에 대해 다른 곡물들과의 교차 실험 정보가 없어 쌀과 밀 이외의 곡물들이 혼합될 경우, 분석 결과의 판독에 혼돈이 생길 수 있는 문제점이 있다.
일본공개특허 제2011-125306호는 GMO 밀의 정량 분석을 위한 방법으로서, 중합효소 연쇄반응을 이용하여 밀을 검출하고 다른 곡물들과 교차반응이 없는 판별방법을 개시하고 있으나, 쌀의 PCR에 필요한 프라이머 세트가 없기 때문에, 밀 성분이 포함되어 있지 않은 시료에 대해서 PCR 증폭의 오류인지 밀 성분이 없는 것인지를 명확하게 알 수 없는 문제점이 있다.
즉, 쌀가공 식품을 대상으로 할 경우, PCR의 증폭 유무를 확인하기 위한 양성대조군으로 쌀의 프라이머 세트가 필요하고, 밀과 교차 반응이 없어야 하므로, 상기 일본공개특허 제2011-125306호는 쌀가공 식품에서 밀 성분 유무 판별을 위한 분석법으로 적절하지 않은 문제점이 있다.
또한, 쌀과 밀을 각각 중합효소 연쇄반응할 경우 비효율적인 판별방법이 될 수 있는 문제점이 있다.
따라서, 쌀가공 식품중의 밀가루 원료의 혼입 여부를 효율적이면서 과학적으로 확인할 수 있는 분석기술의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 연구를 지속적으로 진행하여, 쌀과 밀에 특이적으로 반응하는 프라이머 세트의 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 통하여, 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부를 판별할 수 있음을 알아내고자 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 쌀과 밀에 특이적으로 반응하는 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부를 판별하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 쌀 검출용 프라이머 세트, 및 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 밀 검출용 프라이머 세트를 포함하는 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 피검 시료인 쌀가공 식품으로부터 추출한 DNA를 주형으로 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계, 및 상기 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별용 키트를 제공한다.
본 발명에 의한 프라이머 세트, 판별 방법 및 키트는 1회의 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해서 양성대조구인 쌀 DNA 밴드의 확인 및 밀의 혼입 여부를 동시에 판별하는 것이 가능하기 때문에, 고 민감도(high sensitivity) 및 고 특이도(high specificity)를 가지면서, 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부를 판별하기 위한 노동력과 시간을 현저하게 절약할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명에 의한 프라이머 세트, 판별 방법 및 키트는 다른 곡물들과의 교차 반응이 없어, 밀 특이 반응에 의한 밀 성분 검출을 정확하게 할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 쌀과 밀의 특이 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 서열번호 3부터 6의 프라이머들을 이용하여 쌀과 밀에 특이적으로 반응하며, 다른 곡물들과의 교차 반응 확인울 위한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 쌀과 밀의 특이 프라이머 세트를 이용한 다양한 비율(%)의 쌀 DNA와 밀 DNA의 혼합 DNA에서 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4d는 시중에 유통중인 쌀가공 식품 및 밀가공 식품을 대상으로 한 PCR 결과를 나타낸 것으로서, 도 4a는 떡꾹떡을 대상으로 한 PCR 결과, 도 4b는 떡볶이떡을 대상으로 한 PCR 결과, 도 4c는 막걸리를 대상으로 한 PCR 결과이고, 도 4d는 쌀가공 식품인 쌀면, 밀가공 식품인 밀면, 쌀과 밀의 혼합 면제품, 스파게티면, 파스타 등과 같은 면 제품을 대상으로 한 PCR 결과이다.
도 2는 서열번호 3부터 6의 프라이머들을 이용하여 쌀과 밀에 특이적으로 반응하며, 다른 곡물들과의 교차 반응 확인울 위한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 쌀과 밀의 특이 프라이머 세트를 이용한 다양한 비율(%)의 쌀 DNA와 밀 DNA의 혼합 DNA에서 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4d는 시중에 유통중인 쌀가공 식품 및 밀가공 식품을 대상으로 한 PCR 결과를 나타낸 것으로서, 도 4a는 떡꾹떡을 대상으로 한 PCR 결과, 도 4b는 떡볶이떡을 대상으로 한 PCR 결과, 도 4c는 막걸리를 대상으로 한 PCR 결과이고, 도 4d는 쌀가공 식품인 쌀면, 밀가공 식품인 밀면, 쌀과 밀의 혼합 면제품, 스파게티면, 파스타 등과 같은 면 제품을 대상으로 한 PCR 결과이다.
본 발명은 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 쌀 검출용 프라이머 세트, 및 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 밀 검출용 프라이머 세트를 포함하는, 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 쌀 검출용 프라이머 세트는 쌀의 뿌리특이(root-specific) GOS9 유전자를 인식할 수 있다.
상기 쌀의 뿌리 특이(root-specific) GOS9 유전자는 GenBank accession number X51909일 수 있는데, 상기 유전자의 일부의 염기서열은 하기의 표 2와 같다.
상기 표 2에서, 정방향 프라이머(5’-CAACGTCGTGACAAACCTTA-3’, 서열번호 3)은 첫번째 밑줄친 염기서열에 결합하고, 역방향 프라이머(5’-ggggtgaatttatcatgagc-3’, 서열번호 4)는 두번째 밑줄친 염기서열에 결합하며, 이때 PCR 증폭 산물의 DNA band 크기는 236bp이다.
본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 밀 검출용 프라이머 세트는 밀의 프롤라인 풍부 단백질(proline rich protein) 유전자를 인식할 수 있다.
상기 밀의 프롤라인 풍부 단백질(proline rich protein) 유전자는GenBank accession number CALP011016564.1일 수 있는데, 상기 유전자의 일부의 염기서열은 하기의 표 3과 같다.
상기 표 3에서 정방향 프라이머 (5’-GCTAACATCTACAGCATGCC-3’, 서열번호 5)는 첫번째 밑줄친 염기서열에 결합하고, 역방향 프라이머(5’-ATCTAGGTAGGGGATCGTGT-3’, 서열번호 6)은 두번째 밑줄친 염기서열에 결합하며, 이때 PCR 증폭 산물의 DNA band 크기는 116 bp이다.
한편, 본 발명의 상기 서열번호 3 내지 6의 프라이머들의 염기서열에 대해서는 하기의 표 4와 같다.
본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 쌀가공 식품은 쌀을 이용하여 먹기 편하고 저장성이 좋게 만든 식품을 일컫는 것으로서, 밥을 가공한 제품으로는 레토르트밥, 무균포장밥, 냉동밥, 칠드밥, 통조림밥, 건조밥, 즉석 고기덮밥, 즉석 쌀죽 등을 들 수 있고, 면 종류로는 쌀국수, 쌀냉면, 쌀쫄면, 쌀라면, 증숙면, 비빔국수 등을 들 수 있으며, 음료로는 즉석 식혜, 쌀 요구르트, 즉석 미숫가루 등을 들 수 있고, 그밖에 현미 후레이크, 청결미, 파미분, 쌀고기 등을 들 수 있다.
또한, 상기 쌀가공 식품은 떡국떡, 떡볶이떡, 면류(쌀국수, 쌀냉면, 쌀쫄면, 쌀라면, 증숙면, 비빔국수 등), 음료류(식혜, 쌀 요구르트, 즉석 미숫가루 등), 쌀가루, 쌀과자, 쌀빵, 쌀죽, 쌀스프, 쌀베이글, 쌀케이크, 미숫가루, 막걸리 등을 예로 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 피검 시료인 쌀가공 식품으로부터 추출한 DNA를 주형으로 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계, 및 상기 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 판별 방법에서, 상기 쌀가공 식품은 쌀을 이용하여 먹기 편하고 저장성이 좋게 만든 식품을 일컫는 것으로서, 밥을 가공한 제품으로는 즉석 쌀죽 등을 들 수 있고, 면 종류로는 쌀국수, 쌀냉면, 쌀쫄면, 쌀라면, 증숙면, 비빔국수 등을 들 수 있으며, 음료로는 즉석 식혜, 쌀 요구르트, 즉석 미숫가루 등을 들 수 있고, 그밖에 현미 후레이크, 쌀고기 등을 들 수 있다.
또한, 상기 쌀가공 식품은 떡국떡, 떡볶이떡, 면류(쌀국수, 쌀냉면, 쌀쫄면, 쌀라면, 증숙면, 비빔국수 등), 음료류(식혜, 쌀 요구르트, 즉석 미숫가루 등), 쌀가루, 쌀과자, 쌀빵, 쌀죽, 쌀스프, 쌀베이글, 쌀케이크, 미숫가루, 막걸리 등을 예로 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 판별 방법에서, 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계는 증폭된 산물을 전기영동한 후, 쌀 236 bp 및 밀 116 bp의 DNA 밴드가 생성되는지 여부를 검출하는 단계일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 키트에서, 상기 쌀가공 식품은 쌀을 이용하여 먹기 편하고 저장성이 좋게 만든 식품을 일컫는 것으로서, 밥을 가공한 제품으로는 즉석 쌀죽 등을 들 수 있고, 면 종류로는 쌀국수, 쌀냉면, 쌀쫄면, 쌀라면, 증숙면, 비빔국수 등을 들 수 있으며, 음료로는 즉석 식혜, 쌀 요구르트, 즉석 미숫가루 등을 들 수 있고, 그밖에 현미 후레이크, 쌀고기 등을 들 수 있다.
또한, 상기 쌀가공 식품은 떡국떡, 떡볶이떡, 면류(쌀국수, 쌀냉면, 쌀쫄면, 쌀라면, 증숙면, 비빔국수 등), 음료류(식혜, 쌀 요구르트, 즉석 미숫가루 등), 쌀가루, 쌀과자, 쌀빵, 쌀죽, 쌀스프, 쌀베이글, 쌀케이크, 미숫가루, 막걸리 등을 예로 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
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실시예
1>
DNA
의 준비
쌀, 밀, 떡국떡, 떡볶이떡, 면류, 막걸리에서 DNA를 추출하였다.
또한, 다른 곡물들과의 교차반응을 확인하기 위하여 보리, 옥수수, 조, 콩, 수수, 율무 및 기장의 곡물류에서 DNA를 추출하여 같은 조건에서 실험하였다.
상기 쌀은 분쇄과정을 거친 후 사용하였고, 상기 밀은 분말 상태의 일반 밀가루를 사용하였다. 떡국떡, 떡볶이떡, 면류는 완제품에서 조각을 얻은 후 건조한 후 분쇄하였다.
상기 막걸리는 원심분리 한 후 아랫부분의 고형물을 모아 건조하였다. 또한, 상기 보리, 옥수수, 조, 콩, 수수, 율무 및 기장의 곡물류 역시 건조와 분쇄과정을 수행하였다.
상기의 과정을 처리한 시료들은 ExiPrep Rice Genomic DNA kit(바이오니아, K-3200-CR)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 구체적으로는 건조 후 분쇄된 30 mg 분말상태에 lysis buffer 200 ㎕, proteinase K(20㎎/㎖) 20㎕, α-amylase(10㎎/㎖) 20㎕를 첨가하고, 진탕배양기(BIOER)를 이용하여 60℃에서 30분간 흔들면서 반응시켰다.
이 후, 200㎕의 rice binding buffer를 넣고 충분히 섞은 후, 상기 혼합용액을 15,000 rpm에서 10분간 원심분리 한 다음, 상층액 200㎕를 buffer cartridge 에 넣고, Exiprep16 DNA 자동추출 장비에 넣어 DNA를 추출하였다.
추출된 DNA는 스펙트로포토메타(SD-2000, BioPrince)를 이용하여 농도를 측정하였으며, 최종농도는 멸균 증류수를 이용하여 50ng/㎕로 희석하였다.
<
실시예
2> 쌀과 밀의 유전자 증폭을 위한
PCR
수행후
결과 확인
상기 실시예 1에서 얻은 쌀, 밀, 쌀과 밀의 혼합 시료(쌀+밀)에 대해 쌀과 밀의 유전자를 인식하는 서열번호 3 내지 6의 전체 염기서열을 포함하는 프라이머를 합성하였다.
이때, 쌀 DNA 증폭용 프라이머로는 상기 표 4 기재의 서열번호 3(정방향 프라이머) 및 서열번호 4(역방향 프라이머)를 사용하였다.
또한, 밀 DNA 증폭용 프라이머로는 상기 표 4 기재의 서열번호 5(정방향 프라이머) 및 서열번호 6(역방향 프라이머)을 사용하였다.
이 후, 각 프라이머들이 해당 종에 대한 DNA만을 특이적으로 증폭할 수 있는지를 확인하기 위하여 PCR을 수행하였다.
PCR을 위한 반응액은, 각 시료당 DNA 2㎕(50ng/㎕), 서열번호 3 내지 6의 프라이머(10pM)들 각각 1.5㎕, Taq DNA polymerase 프리믹스(HS Prime Taq Premix 2X, 제넷바이오) 12.5㎕첨가하고, 멸균 증류수 4.5㎕를 첨가하여 총 25 ㎕로 부피를 조정하였다.
즉, 표 5과 같은 조성과 표 6과 같은 조건으로 PCR을 수행한 결과를 도 1 및 도 2에 나타나 있다.
도 1은 쌀과 밀의 특이 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과로서, 레인 1은 쌀, 레인 2는 밀, 레인 3은 쌀+밀, 레인 4는 100bp DNA 마커이다.
본 발명의 프라이머 세트들이 쌀(236bp)과 밀(116bp)의 DNA 시료에 대해 각각 특이적으로 중합효소 연쇄반응(PCR) 하는 것을 보여주며, 쌀과 밀이 혼합된 시료에서는 2개의 반응(236bp와 116bp)이 모두 일어난 것을 확인할 수 있다.
도 2는 쌀과 밀의 특이 프라이머 세트를 이용하여 다른 곡물들과의 교차 반응 확인을 위한 PCR 결과로서, 레인 1은 100bp DNA 마커, 레인 2는 보리, 레인 3은 옥수수, 레인 4는, 레인 5는 콩, 레인 6은 수수, 레인 7은 율무, 레인 8은 기장, 레인 9는 밀, 레인 10은 쌀, 레인 11은 밀+쌀이다.
즉, 도 2는 쌀과 밀의 프라이머세트들이 다른 곡물들을 대상으로 중합효소 연쇄반응을 했을 때 교차반응의 유무를 확인하기 위하여 실시한 결과로서, 밀의 프라이머세트가 보리, 옥수수, 조, 콩, 수수, 율무 및 기장의 다른 곡물들에서 중합효소 연쇄반응이 일어나지 않아, 본 발명의 밀 프라이머가 밀에 특이적으로 반응한다는 것을 확인할 수 있다.
<
실시예
3> 본 발명
프라이머
세트를 이용하여 다양한 비율의 쌀
DNA
와 밀 DNA의 혼합
DNA
에서
PCR
수행 후 전기 영동에 의한 결과 확인
주형으로 쌀과 밀의 DNA를 10:0부터 0:10 까지 11개의 쌀과 밀의 DNA가 혼합된 시료를 이용한 것 이외에는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 PCR을 수행한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 쌀과 밀의 특이 프라이머 세트를 이용한 다양한 비율(%)의 쌀 DNA와 밀 DNA의 혼합 DNA에서 PCR 결과(단위 : %)를 나타낸 것으로서, 레인 1은 100bp DNA 마커, 레인 2는 쌀 100, 레인 3은 쌀(90)+밀(10), 레인 4는 쌀(80)+밀(20), 레인 5는 쌀(70)+밀(30), 레인 6은 쌀(60)+밀(40), 레인 7은 쌀(50)+밀(50), 레인 8은 쌀(40)+밀(60), 레인 9 는 쌀(30)+밀(70), 레인 10은 쌀(20)+밀(80), 레인 11은 쌀(10)+밀(90), 레인 12는 밀(100)이다.
도 3을 참조하면, 쌀 236bp 및 밀 116bp의 DNA 밴드가 생성되는 것을 통하여, 쌀과 밀의 DNA(100 ng) 혼합비율이 9:1부터 1:9까지인 시료에 대해서도 판별이 가능한 것을 확인할 수 있다.
<
실시예
4> 본 발명의
프라이머
세트를 이용한 쌀가공 식품 및 밀 가공 식품에서의 쌀과 밀 혼입 유무 판별을 위한
PCR
수행 후 전기 영동에 의한 결과 확인>
쌀가공 식품으로 떡꾹떡, 떡볶이떡, 막걸리, 쌀면, 밀면, 쌀과 밀이 혼합된 면, 스파게티면, 파스타의 DNA를 주형으로 하고, 상기 실시예 2와 동일한 조건으로 PCR을 수행한 결과를 도 4a 내지 도 4d에 나타내었다.
도 4a는 서열번호 3 내지 6의 프라이머세트를 이용한 떡국떡 가공품에서의 적용사례로서, 레인 1은 제작한 표준마커(쌀 236bp, 밀 116bp), 레인 2-4, 5-7, 8-10은 하나의 제품에서 떡국떡 3조각을 채취하고 DNA를 추출하여 PCR을 수행한 결과이다.
도 4a를 참조하면, 쌀의 DNA밴드는 선명하고, 밀에서 DNA밴드가 없는 것을 확인할 수 있으며, 또한 표시사항에 밀이 없는 것과 일치하는 것을 확인할 수 있다.
도 4b는 서열번호 3 내지 6의 프라이머세트를 이용한 떡볶이떡 가공식품에서의 적용사례로서, 레인 1, 14, 27은 제작한 표준마커(쌀 236bp, 밀 116bp), 레인 2-4, 5-7, 8-10, 11-13, 15-17, 18-20, 21-23, 24-26, 28-39는 하나의 제품에서 떡볶이떡 3조각을 채취하고, DNA를 추출하여 PCR을 수행한 결과이다.
도 4b를 참조하면, 2번부터 30까지 제품의 포장지에는 밀에 대한 표시가 없었고, 실험 결과 밀 성분이 검출되지 않았음을 알 수 있다. 또한, 31번부터 36까지의 제품에는 밀 또는 소맥분이 표시되어 있었으며, 실험결과에서도 밀 성분이 검출된 것을 확인할 수 있다.
그러나, 37부터 39까지의 제품에는 밀 성분이 표시되어 있지 않았지만, 밀성 분이 검출된 것을 확인할 수 있다.
도 4c는 서열번호 3 내지 6의 프라이머세트를 이용한 막걸리 제품에서의 적용사례로서, 레인 1은 제작한 표준마커(쌀 236bp, 밀 116bp), 레인 2-9는 하나의 막걸리 제품에서 원심분리를 통해 아래층의 고형물을 채취하고, DNA를 추출하여 PCR을 수행한 결과이다.
도 4c를 참조하면, 시료 7번을 제외한 나머지 시료에서 표시사항에 맞게 쌀과 밀 성분이 검출되었고, 7번 시료의 경우 쌀 100%라고 제품에 표시되어 있었지만, 밀 성분이 혼합 되어 있는 것을 확인할 수 있다.
도 4d는 서열번호 3 내지 6의 프라이머세트를 이용한 면 가공품의 적용사례로서, 레인 1, 17, 30은 제작한 표준마커(쌀 236bp, 밀 116bp), 레인 2-4, 5-7, 8-10, 11-13, 14-16, 18-20, 21-23, 24-26, 27-29, 31-33, 34-36, 37-39은 하나의 제품에서 면 3조각을 채취하고, DNA를 추출하여 PCR을 수행한 결과이다.
도 4d를 참조하면, 시료 2-4, 11-13, 18-20, 27-29는 표시사항에 밀 성분이 없었으며, 실험결과에서도 밀 성분이 검출되지 않았음을 알 수 있다.
또한, 시료 14-16, 21-23, 31-33, 34-36, 37-39는 표시사항에 쌀 성분이 없었으며, 실험결과에서도 쌀 성분이 검출되지 않았음을 알 수 있다.
한편, 시료 5-7, 8-10, 24-26는 표시사항에 쌀과 밀 성분이 혼합되어 표기되어 있었고, 실험결과에서도 두 개의 성분이 모두 검출되었음을 알 수 있는 바, 면 제품에서 표시사항과 실험결과가 일치하였음을 알 수 있다.
본 발명에 의한 프라이머 세트, 판별 방법 및 키트는 1회의 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해서 양성대조구인 쌀 DNA 밴드의 확인 및 밀의 혼입 여부를 동시에 판별하는 것이 가능하기 때문에, 고 민감도(high sensitivity) 및 고 특이도(high specificity)를 가지면서, 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부를 판별하기 위한 노동력과 시간을 현저하게 절약할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명에 의한 프라이머 세트, 판별 방법 및 키트는 다른 곡물들과의 교차 반응이 없어, 밀 특이 반응에 의한 밀 성분 검출을 정확하게 할 수 있는 장점이 있기 때문에, 쌀가공 식품 관리와 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있다.
<110> Republic of Korea
<120> Primer set for determining incorporation of wheat in
rice-processing foods, method of determining incorporation of
wheat in rice-processing foods using the same, and kit comprising
the same
<130> 9596
<160> 6
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1171
<212> DNA
<213> rice root-specific GOS9 gene of O. sativa
<400> 1
acattgctta gtgttaaaac taataagcat catatataaa gaaaataagg gagtgttatt 60
caagttgatt cactggtgga aatcaattaa tgatgatatt tccgcacgtc cttgcataca 120
gattacactt ggatctcagg aattcgtgaa gggaatctcc ggaactttta ccaacgtcgt 180
gacaaacctt aaaattgtca ccaatgtcac cacttataat tttggacaag gtggtggaac 240
tgcttttagc ctcccgctgc agagcggcag tgtggttggt ttcttcggac gcgcgggagc 300
acttgtggac tctatcggag tttatgtcca catatgatat atattatcta catatgaata 360
tatccttgga tatatggttg gatcagtgct catgataaat tcacccctag gtctattcgt 420
ttagtccctc aacaagaagt taagtgagat ttgtaggaga ataattcaca tttattgagg 480
tgtggaatta atcccctcaa ttctctctaa tctctctttt gggaatgaac cgaacaagac 540
ctaagggtga tatttctttc aatcactata taactataca tatatagtgt gcatgtgtat 600
gtgcttggac taggtccaag ggtttaccac actagtgccc cgttatacct ctgtcagtgt 660
cgtatacatt tatttgtgtt gtattacatt cgctatatat gtacgtggtt tatatatgat 720
tatatatgaa taaaagactt atgtgatgta ttgagcttaa atgtgcgcaa gcctattttt 780
aatgtaccta aattttgaga agctgagttg ctactacaat aagttgcttc gacgtacagg 840
aaacactatg gttggatctt attgtgggtg aacccttgtg tcaaatccac ggatatcatc 900
aacaacataa gggaaaacca cacacataaa gccacaaata ccggtaaaat atgtgtaaaa 960
gaagatttct ttgtagagac atcactgaaa ggggggaaat gccttttgat tgaccgatgc 1020
gagagaatcc ctcggacaac ggacgctcgt agaccctacc catcttgccc gcttctccct 1080
ctcgctcatt tctctctact ctatcctcgt caccgtcatc taggatgttt cccccattgt 1140
tctcctctct acccgctccc tctcctctcc c 1171
<210> 2
<211> 1013
<212> DNA
<213> proline rich protein gene of Triticum aestivum
<400> 2
accgatgact gacaattgat gtgatactca catatgacag ctgaaggagg agatcgaccc 60
gtccggagcc acgatgtgct atttctagaa taagtggcat agtatccggt tagcgagata 120
gtgatgatgc atctttttgt attccttgta ttccaccatt ccttttagtt tctgttgttc 180
catgcaccca tgatgagtac tactattctg taattatcat ttgcgtgttg gtatatgttc 240
atctgtgcac atgactcggt tgttctttcg tgtagataca catgctttta ttcgtttgca 300
tgaaagacac attttgtcca gcagactgca gtctatgttg ttttcctttt gatttatttc 360
gcctcgtggg tgcaccctgg acatgcccct attcctccac tggaccgtct cgagcgtgtg 420
tttttcaaac acgagcccgt aaatgcttgt gtggtttcta gttaaattca ccacccagca 480
acaggtgatg gcaaaaaatg tgcaaaattt acctataaaa atagagatgt gcagaattcc 540
cctagaatcc tctctttgtc ctcagtaagc actgtatttt caggattcta atgtgcgtac 600
ccaccagcaa acctcccact cccagctaac atctacagca tgcccaacgc catactaaat 660
cccgctttcc acacaaatta tcttcttttt tctcaaatac taaaatatat ctgcagttcc 720
acacgatccc ctacctagat gacacttctt ttttgccttt tatccttttt tttctagcca 780
gtatagtact gcttagattt caccatgaca agcgcatttt tcagagtgat tcacgcacac 840
gatatataac cacaatggtt cacggagacg acatataacc acaatgtaca gatagccatg 900
tttacacggt ctacaatata gcacatgaga tcagtactct tggacggttc aacacaaaac 960
agagtcttaa gcaacgaaac agagtctcag tctctccaga gaataacagg cat 1013
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for GOS9 gene
<400> 3
caacgtcgtg acaaacctta 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for GOS9 gene
<400> 4
ggggtgaatt tatcatgagc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for PRP gene
<400> 5
gctaacatct acagcatgcc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for PRP gene
<400> 6
atctaggtag gggatcgtgt 20
Claims (8)
- 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 쌀 검출용 프라이머 세트, 및
서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 밀 검출용 프라이머 세트를 포함하는, 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별용 프라이머 세트. - 제1항에 있어서, 상기 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 쌀 검출용 프라이머 세트는 쌀의 뿌리특이(root-specific) GOS9 유전자를 인식하고,
상기 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 밀 검출용 프라이머 세트는 밀의 프롤라인 풍부 단백질(proline rich protein) 유전자를 인식하는 것을 특징으로 하는 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별용 프라이머 세트. - 제1항에 있어서, 상기 쌀가공 식품은 떡국떡, 떡볶이떡, 면, 파스타, 쌀가루, 쌀과자, 쌀빵, 쌀죽, 쌀스프, 쌀베이글, 쌀케이크, 미숫가루 및 막걸리로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별용 프라이머 세트.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 피검 시료인 쌀가공 식품으로부터 추출한 DNA를 주형으로 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계, 및
상기 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별 방법. - 제4항에 있어서, 상기 쌀가공 식품은 떡국떡, 떡볶이떡, 면, 파스타, 쌀가루, 쌀과자, 쌀빵, 쌀죽, 쌀스프, 쌀베이글, 쌀케이크, 미숫가루 및 막걸리로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계는 증폭된 산물을 전기영동한 후, 쌀 236 bp 및 밀 116 bp의 DNA 밴드가 생성되는지 여부를 검출하는 것을 특징으로 하는 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 쌀가공 식품중 밀의 혼입여부 판별용 키트.
- 제7항에 있어서, 상기 쌀가공 식품은 떡국떡, 떡볶이떡, 면, 파스타, 쌀가루, 쌀과자, 쌀빵, 쌀죽, 쌀스프, 쌀베이글, 쌀케이크, 미숫가루 및 막걸리로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 가공 식품중 밀의 혼입여부 판별용 키트.
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