KR100938413B1 - 식품검사방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특정물의 유전자의 일부에서 얻어진 정보에 기초한 프라이머를 설계하여 PCR을 행하고, 식품중의 특정물의 유무를 측정하는 방법으로, 식품중에 포함된 미량성분의 검출이나 유해한 특정물의 알레르겐의 식별에 매우 유용하다.

Description

식품검사방법{Method of testing food}

본 발명은 식품의 검사방법에 관한 것으로, 특히 알러지 물질이 식품 중에 포함되어 있는지의 여부를 표시하기 위해서, 식품의 모든 유통단계에서 미량으로 포함될 수 있는 특정물의 존재를 검출하는 방법이다.

최근, 알러지 물질을 포함하는 식품에 기인한 건강위해를 방지하기 위해서, 표시에 의한 정보제공의 요청이 높아지고, 2001년 4월의 식품위생법 관련법령의 개정에 따라, 알러지 물질을 포함하는 식품의 표시가 의무화되었다. 특히 증례수가 많은 계란, 우유, 밀과 증상이 치명적인 메밀, 땅콩의 5품목(특정 원재료)에 대해서는, 식품의 모든 유통 단계에 있어서 적절한 표시를 실시하는 것이 의무화되게 되었다. 알러지 물질로서 어느 식품을 알레르겐(allergen)으로서 인식하는지의 여부는 개체차에 의해 다르기 때문에, 식품에 포함된 특정물이 극히 미량이 있어도 적절하게 표시되어 있으면, 식품을 섭취하는 것은 자신에 있어서 알레르겐이 포함되어 있는지 아닌지를 알 수 있다. 그러나, 극히 미량의 특정물의 유무를 가열 등의 가공이 행하여진 식품에서 검출하는 것은 종래 공지의 식품분석법에서는 곤란하다.

특정물의 생산자가 자기 회사에서 이용하고 있다면 가공 식품에 당연히 표시 할 수 있지만, 말단 제품의 중간원료로서 특정 원재료가 사용된 경우, 특히 구입되는 중간원료에 미량 함유되어 있는지의 여부에 관해서는 확인할 수 없는 경우가 있다. 또한 실제로 의도하지 않은 혼입도 있을 수 있다.

식품 메이커에서는 가공조제나 캐리오버 등 식품첨가물의 극히 미량으로 잔재 또는 제조라인간에 상호 오염의 실태를 정확하게 파악하고, 적절한 대응을 취하는 것과 동시에, 소비자에 대해서는 법률에 기초하여 정확한 정보를 제공하는 것이 중요하고, 그 때문에 알러지 물질의 정확한 분석기술의 제공이 필요하다.

일본에 있어서, 메밀은 일상적인 식품이고, 이 메밀에 대해서 알러지 반응을 갖는 환자가 있다. 반응의 대부분은 아나필락시형이고, 최종 증예로서는 사망에 이른다. 식품위생법의 알러지 물질을 포함하는 식품에 표시에 있어서는, 메밀은 특정원재료의 하나로서 규정되어, 식품중에 혼입된 경우는 그 것을 표시하는 것이 의무화되었다. 그러나 적절한 측정방법은 없었다. 그 때문에 미량성분의 확실한 측정방법이 요구되어 진다.

따라서, 본 발명은 식품중에 메밀의 혼입의 유무를 정확하게 분석하는 방법을 개발을 목적으로 하여, 메밀에 특이적인 프라이머의 구축 및 그 검출한계를 확인 및 가공식품의 응용을 시도하는 것에 의해 식품중의 특정물의 유무를 측정하는 벙법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

[1] 즉, 본 발명은 특정물의 유전자의 일부로부터 얻어진 정보에 기초한 프라이머를 설계하고 PCR을 행하여 식품중의 특정물의 유무를 측정하는 방법을 제공 한다.

[2] 또한 식품중의 미량성분의 유무를 식품에 표시하기 위해서, 특정물의 유전자의 일부로부터 얻어진 정보에 기초한 프라이머를 설계하고 PCR을 행하여 특정물의 유무를 측정하고 식품에 표시하는 방법을 제공한다.

[3] 또한 식품섭취자에 따라 유해한 특정물의 알레르겐을 포함하는 식품을 식별하기 위해서, 특정물의 유전자의 일부로부터 얻어진 정보에 기초한 프라이머를 설계하고 유전자증폭반응 PCR을 행하여 식품중의 특정물의 유무를 측정하는 방법을 제공한다.

[4] 여기서, 상기 특정물은 특정의 곡류인 방법이 바람직하다.

[5, 6] 또한 상기 식품은 가공 처리된 식품인 방법인 것이 바람직하고, 식품원료이어도 바람직하다.

[7] 상기 특정 곡류는 메밀인 방법을 제공한다.

[8] 여기서, 상기 유전자가 서열표의 서열 번호 11에 나타난 메밀 유전자이고, 상기 프라이머는,

① 121번째의 g에서 360번째의 c까지의 서열에서 선택되는 적어도 5∼35개의 연속된 DNA 단편의 정보로부터 선택되는 센스 프라이머 또는 안티센스 프라이머, 또는

② 1381번째의 t에서 1680번째의 c까지의 서열에서 선택되는 적어도 5∼35개의 연속된 DNA 단편의 정보로부터 선택되는 센스 프라이머 또는 안티센스 프라이머인 방법이 바람직하다.

프라이머는 표적 유전자의 상보쇄이며, 표적 유전자의 N-말측의 서열부분과 C-말측의 서열부분이 쌍으로 선택된다. 쌍의 길이는 동일하여도 좋고, 다를 수도 있다.

[9] 특히, 후술하는 표 1에 나타내는 FAG3(서열번호 1)/FAG4(서열번호 2), FAG17(서열번호 5)/FAG18(서열번호 6), FAG19(서열번호 7)/FAG20(서열번호 8), FAG19(서열번호 7)/FAG22(서열번호 9), FAG19(서열번호 7)/FAG24(서열번호 10)의 프라이머 쌍이 특히 바람직하다.

PCR에 이용할 수 있는 프라이머는 주형이 되는 DNA(메밀의 경우를 예시하면, 서열번호 11의 서열을 들 수 있다)의 해당 영역이 같은 영역이라면, 프라이머 개개의 서열의 5'-상류측, 3'-하류측의 염기 위치가, 해당하는 동일 주형상에서, 또는 수 염기 또는 10수 염기 어긋나 있어도 동일 기능을 가지며, 동일한 결과 (PCR산물)을 얻을 수 있음이 알려져 있다.

따라서 바람직한 프라이머 쌍은 상기 표 1의 것에 한정되지 않고, 실질적으로 상기 표 1의 프라이머 쌍과 동일한 기능을 PCR로 달성 할 수 있는 것도, 바람직한 프라이머 쌍에 포함된다.

상기 프라이머에 대해서는, 각 프라이머의 1 또는 수 염기를 결실, 치환, 부가 및/또는 삽입한 프라이머로서, 주형이 되는 DNA의 해당 영역에 하이브리다이즈한 프라이머도 상기 프라이머와 실질적으로 동일하다. 구체적으로는, 예를 들면 서열번호 1∼10의 각 프라이머에 대해서 해당하는 주형 DNA에 대하여 5'-상류측/하류측 및/또는 3'-상류/하류측에 1 또는 수 염기 또는 1O수 염기 어긋나 있는 것으로 서, 서열번호 1∼10의 서열 중, 연속된 적어도 8O%, 더 바람직하게는 90%이상, 더욱 바람직하게는 95%이상의 서열을 포함하는 프라이머 등이, 본 발명의 바람직한 프라이머에 포함된다.

[10] 또한 상기 프라이머를 사용하여 유전자 증폭반응을 행하고 전기영동상에서 명료한 증폭밴드가 닷탄메밀(Fagopyrum tataricum) 및/또는 메밀(Fagopyrum esculentum)을 포함하는(메밀카즈라를 포함하지 않음) 타디과 소바속 피검체에서 확인되고, 메밀카즈라(Fallopia)를 포함하는(닷탄메밀 및/또는 메밀을 포함하지 않음) 피검체에서 확인되지 않는 방법을 제공한다.

[11] 특정물의 유전자의 일부에서 얻어진 정보에 기초하여 설계된 식품중의 특정물의 유무 및/또는 농도를 측정하기 위한 PCR용 프라이머 및 이를 포함하는 식품중의 특정물의 유무 및/또는 농도를 측정하기 위한 키트를 제공한다.

도 1a는 메밀 검출 프라이머; FAG19/22의 메밀 특이성 결과를 표시하는 전기영동상이다. 도 1b은 FAG5/FAG6의 특이성을 표시하는 전기영동상이다.

도 2는 PCR에 의한 메밀 검출계의 검출 한계를 나타내는 전기영동상이다. 도 2a는 DNA레벨의 의사혼입 샘플의 측정 결과이고, 도 2b는 분체 레벨의 의사혼입 샘플의 측정 결과를 나타내는 전기영동상이다.

도 3은 PCR에 의한 가공 식품으로부터의 메밀의 검출 결과를 나타내는 전기영동상이다. 도 3a, 도3b은 각각 측정한 가공 식품이 레인별로 다르다.

이하에, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 특정물의 유전자의 일부로부터 얻어진 정보에 기초한 프라이머를 설계하고 PCR을 행하여 식품중의 특정물의 유무를 측정하는 방법이다.

검체로서 측정되는 식품은 원재료일 수도, 가공단계 중의 어느 하나일수도, 가공 후의 식품일 수도 있다. 본 발명방법은, 식품중의 예를 들면 DNA 레벨의 부피비 또는 특정물의 전체 식품에 대한 질량비로 바람직하게는 0.1%이하, 100ppm이하, 더 바람직하게는 50pm이하, 특히 바람직하게는 10ppm이하의 미량의 특정물의 존재의 유무를 검출하는 방법이다. 특정물의 유전자가 식품중에 함유되는 경우는 생산자가 의도하지 않은 것이, 조미료나 첨가물의 일부로서 미량 존재해도 검출 할 수 있다. 또 DNA는 단백질 등의 생물 유래의 다른 물질에 비해서, 가열 등의 식품가공에 대해서 비교적 안정적이고, 가열, 조리 등, 가공된 식품중의 미량의 존재를 검출할 수 있다.

특정물의 유전자 서열은 미지인 경우에는 공지의 유전자 검출법에 의해 검출할 수 있지만, 요즘에는 많은 기지의 유전자정보를 이용하는 할 수 있다. 예를 들면 국립유전학연구소(DDBJ)등의 데이터베이스로부터 특정물의 유전자 전체 서열의 정보를 얻고, 서열의 일부로부터 PCR에 알맞은 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머의 페어(쌍, 조)를 선택해서 프라이머로 할 수 있다.

프라이머의 설계는 본 발명의 검사 방법을 고려해서 이하의 사항에 유의다. 우선, (i) 프라이머의 GC함량이 40∼60%이다, (ii) 프라이머의 융해 온도(Tm값, 하기참조)가 55∼70℃이다, (iii) 2개의 프라이머 쌍의 Tm값이 가깝다, (iv) 2개의 프라이머의 3'말단간에서 상보적 서열을 보유하지 않고 있다, (v) 프라이머 자신이 헤어핀과 같은 고차구조를 형성하지 않는다, (vi) 프라이머의 전장은 15∼35mer로 한다, (vii) 프라이머의 3'말단측의 GC함량을 낮게 한다, (viii) 프라이머 내에서 동일 뉴클레오티드가 다수 연속하는 서열은 회피한다, (ix) 프라이머는 증폭하고 싶은 주형 DNA의 편측 1개쇄의 서열과 완전하게 일치하고 있을 필요는 없지만, 3' 말단측의 상보성을 높게 한다, (x) 사용하는 주형 DNA에 있어서, 프라이머 부위의 이외에 동일한 서열이 없다 등이다.

본 발명의 프라이머는 원재료의 메밀뿐만 아니라, 가공 단계의 식품이나 가열, 조리 등의 가공 후의 식품에도 사용 가능한 것임을 필요로 한다. 따라서 사용되는 메밀의 주형 DNA는 인택트(intact)한 것이 아니라, 매우 가늘게 절단된 DNA 단편이라고 생각되며, (xi) 2개의 프라이머에 의해서 증폭되는 유전자의 일부는, 비교적 짧은 영역인 것이 바람직하다. 또, 각종 메밀이 공통적으로 가지는 1개의 유전자 영역 중에서, (i)∼(xi)의 모든 조건을 충족시키는 프라이머를 설계해야 한다. 그러나, A, C, G, T, 불과 4개의 뉴클레오티드로 구성되는 DNA서열로 이들 조건을 모두 충족시키는 프라이머를 제작하는 것은 매우 어렵다. 이 때문에 프라이머의 설계는 PCR를 실시하는 데 있어서 곤란한 문제가 되어 있다. 또, 만일, 이들 다수의 조건을 모두 충족시키는 프라이머를 설계할 수 있었다고 하더라도, 그것은 PCR를 실시하는데 있어서의 필요 조건일 뿐, 의도한 PCR를 성공시키는 것은 실제로 PCR을 수행해 보지 않으면 알 수 없다.

PCR법은 특별하게 한정되지 않고, 공지인 여러 개량방법을 포함하지만, 일 예를 들면, 프라이머의 쌍, 주형(피검) DNA 이외에 Tris-HCl, KC1, MgCl₂, 각 dNTP, TaqDNA 폴리머라아제 등의 시약류를 혼합해서 PCR반응액으로 한다. PCR의 1사이클은 열변성, 프라이머의 어닐링, DNA 폴리머라아제에 의한 DNA합성 반응의 3개의 스텝으로 이루어져 있다. 각 스텝은 각각 다른, 경우에 따라서는 동일한 반응 온도와 반응 시간을 필요로 하기 때문에, 증폭하려고 하는 DNA 영역의 염기서열과 그 길이에 의해 적절한 범위로 한다. 이러한 조작을 위한 thermal cycler가 시판되고 있다. GC함량과 서열의 길이로부터 얻을 수 있는 하기식,

T_m(℃)≡4×(G+C) + 2×(A+T)

을, 어닐링 온도의 지표로 한다. PCR증폭 산물이 50∼500bp, 더 바람직하게는 100∼150bp정도가 되도록 한다. 이 범위로 하면, 가공 식품 중에서 단편화하고 있는 DNA의 검출도 가능하기 때문이다.

특정곡류가 메밀인 경우는, 상기 유전자는 서열표의 서열 번호 11에 나타난 메밀 유전자이고, 상기 프라이머는 서열번호 11에 나타난 ① 121번째의 g에서 360번째의 c까지의 서열에서 선택되는 적어도 5∼35개의 연속된 DNA 단편의 정보로부터 선택되는 센스 프라이머 또는 안티센스 프라이머이거나;

② 1381번째의 t에서 1680번째의 c까지의 서열에서 선택되는 적어도 5∼35개의 연속된 DNA 단편의 정보로부터 선택되는 센스 프라이머 또는 안티센스 프라이머인 방법이 바람직하다. 프라이머는 표적 유전자의 상보쇄이며, 표적 유전자의 N-말측의 서열부분과 C-말측의 서열부분이 쌍으로 선택된다. 쌍의 길이는 동일하여도 좋고, 달라도 좋다.

특히, 하기 표 1의 FAG3(서열번호 1)/FAG4(서열번호 2), FAG17(서열번호 5)/FAG18(서열번호 6), FAG19(서열번호 7)/FAG20(서열번호 8), FAG19(서열번호 7)/FAG22(서열번호 9), FAG19(서열번호 7)/FAG24(서열번호 10)의 프라이머 쌍 또는 이들과 실질적으로 동일한 프라이머 쌍이 바람직하다. 후술하는 비교예에서 설명하는 것과 같이, 동일한 Tm값을 취하는 프라이머 쌍(FAG5(서열번호 3)/FAG6(서열번호 4)에서도 검출에 부적당할 경우가 있어, 프라이머의 선택이 중요하다.

표 1

TaqDNA 폴리머라아제, MgCl₂의 농도와 반응 사이클수 등 바람직한 PCR 조건의 검토, 혹은 nestedPCR를 이용하면, 검출 감도가 한층 향상할 가능성이 있다.

PCR 반응물은 면역반응을 이용해서 동정하여도, 어떻게 동정하여도 좋지만, 전기영동시키고, 필요한 경우에는 양성 컨트롤이나, 음성 컨트롤을 이용해서 전기영동상으로 명료한 밴드가 인정되면, 검체 중에 피검 물질이 존재하는 것임을 확인할 수 있다.

본 발명의 검출 방법은 특정물의 유전자 일부에서 얻어진 정보에 의거하여 설계된 프라이머를, 시약으로서 함유한 시약 1식(키트)을 이용해서 수행하면, 용이하게 실시할 수도 있다. 시약 1식(키트)은 PCR에 널리 이용할 수 있는 공지의 시약을 함유하고 있어도, 전기영동장치 등의 다른 장치가 부속되고 있어도 좋다. 구체적으로 시약으로서는, dNTP, MgCl₂, Taq polymerase, Tris-HC1, 글리세롤, DMSO, 포지티브 컨트롤용 DNA, 네거티브 컨트롤용 DNA, 증류수 등을 들 수 있다. 이들 시약은 시약 1식(키트) 중에서, 각각 독립으로 포장되어 제공되어도 좋고, 2종 이상의 시약이 혼합된 형태로 제공되어도 좋다. 시약 1식(키트) 중의 각각의 시약 농도에 특별한 제한은 없고, 본 발명의 PCR를 실시하는데 대해서 가능한 범위라면 좋다. 또한, 시약 1식(키트)에는, 바람직한 PCR 조건 등등의 정보만이 첨부되어도 좋고, 프라이머 시약만일 수도 있다.

본 발명의 방법은 피검물질은 식품이면 한정되지 않지만, 곡류를 예로 하면, 밀, 벼, 옥수수, 좁쌀, 기장, 피, 메밀 및 대두류를 포함한다. DNA는 열에 안정적 이고 가공 식품 중에서 미량에서 검출할 수 있으므로 수득된 결과는 식품에 표시하거나, 식품의 알러지 정보로서 이용 할 수 있는 것 이외에, 식품중의 특정 곡류의 유무를 검출함으로써 가공조제와 캐리오버 등 식품 첨가물의 극히 미량의 잔존, 혹은 제조 라인 간의 상호 오염의 유무 등의 생산자가 의도하지 않은 공정을 검출 할 수가 있다.

이하에 메밀을 1례로 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이것들에 한정되는 것은 아니다.

(1) 메밀 검지를 위한 프라이머의 구축

메밀 유래 DNA를 검지(감지)하기 위한 프라이머를 구축하는데 있어서, 우선, 국립유전학연구소(DDBJ)의 데이타베이스에 접속하여 메밀(Fagopyrum esculentum)의 기지 유전자의 검색을 실시하고, 수득된 메밀에 관한 유전자정보 중에서 Fagopyrum esculentum major allergenic storage protein gene(Accession #AF152003, 전장 1825bp)를 선택하였다. 다음에 DDBJ의 BLAST검색에 의해서 선택한 메밀의 유전자 서열과 유사 서열이 메밀 이외의 식물에는 없다는 것을 확인하였다.

발명자는 프라이머를 설계하기 위해서, 특정물의 유전자 서열에 대해서 소프트웨어 "GENETYX MAC"을 사용하여, 프라이머 후보가 되는 서열의 검색을 실시하였다. GENETYX MAC은 프라이머 설계의 상기 조건 중, 수계산으로는 해석이 곤란한 여러 조건, (i) GC함량, (ii) Tm값의 범위설정을 수행할 수 있는 것부터 사용하였다. 그 결과, 후보가 되는 서열을 67쌍 동정 할 수 있었다. 그 중에서 상기(i)∼(xi)의 프라이머 설계를 위한 조건을 모두 충족시키는 서열을, 발명자가 독자적으로 검색 함으로써, 본 발명의 검사 방법에서 사용 가능한 프라이머 서열을 검출하였다. 이것에 의해 발견된 프라이머 서열을 포함하는 9쌍의 올리고 뉴클레오티드 DNA프라이머(바이오로지카(주)에서 합성)를 제작하였다.

(2) DNA의 추출

메밀 및 그 밖의 식물 종자에 대해서는 표면을 1% TritonX(와코쥰약)에 의해 세정한 후 증류수로 헹구고, 잘 건조시킨 후 멀티비드숏커(Multi beads shocker)(야쓰이기계)로 미분쇄하였다. 다음에, 분쇄 샘플 1∼1.5g을 Dneasy Plant Maxi kit(Qiagen)을 이용하여 DNA를 추출하였다. 또한 가공식품에 대해서는 수분 함량이 높은 것은 24시간동결 건조후 1g을, 수분 함량이 낮은 것에 대해서는 그대로 1g으로부터 Genomic Tip20/G(Qiagen)을 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 흡광도 측정에 의해서 농도를 구한 후, 순수를 이용해서 10ng/㎕로 희석하고, 이것을 PCR의 주형(피검) DNA 시료액으로 사용하였다.

(3) PCR과 전기영동상에 의한 메밀의 검출

PCR 반응액은 아래와 같이 조정하였다. 즉, PCR 완충액(PCR bufferII, Appliedbiosystems사), 200μmol/l; dNTP, 1.5mmol/l; MgCl₂, 0.5μmol/l; 5 및 3’프라이머, 및 0.625 units TaqDNA 폴리머라아제(AmpliTaq Gold, Appliedbiosystems사)을 함유하는 액에 10ng/㎕로 조정한 DNA 시료액 2.5㎕을 첨가하고, 전량을 25㎕로 하였다. 표 3에서 주형 DNA량의 기재의 없는 것은 이 경우의 농도이다. 단, 추출된 DNA의 농도가 10ng/㎕이하의 경우, 또는 첨가물이 많은 가공 식품 등에서, 수 득된 DNA의 흡광도 OD₂₆₀/OD₂₈₀의 값이 1.7이하와 협잡물이 많아 DNA의 순도가 낮은 경우에는, 추출 DNA 원액 또는 10ng/㎕ 희석액을 2.5㎕∼17.8㎕ PCR 반응액에 첨가하고, 그 량에 따라서 전량이 25㎕이 되도록 순수를 사용하여 조정하였다. 표 3에서 주형 DNA량이 부기되어 있는 것은 이 경우의 농도이다.

PCR 증폭 장치에는 GeneAmp PCR System 9600(Appliedbiosystems사)을 사용하고, 반응 조건은 다음과 같이 설정하였다. 우선 95℃에 10분간 유지 반응을 개시시키고, 다음에 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초를 1사이클로 하여, 40 사이클의 PCR의 증폭을 실시하였다. 마지막으로 종료 반응으로 72 ℃ 7분간 유지한 후, 4℃에서 보존하고, 수득된 반응액을 PCR 증폭 반응액으로 하였다.

PCR 증폭 반응액은 브롬화에디튬(ethidium bromide)을 함유하는 2% 아가로스겔(2% E-Ge1, Invitrogen)에 의한 전기영동을 수행하고, 양성 컨트롤(밀 종자에서 추출한 DNA) 및 음성 컨트롤(주형 DNA가 없는 블랭크 반응액)의 증폭 번트(bunt, 흑수병)의 유무에 의해 PCR의 타당성을 판단하는 동시에, 각 프라이머에 의한 최적 사이즈의 DNA 증폭밴드를 확인하는 것에 의해서, 샘플 중의 메밀의 혼입의 유무를 판정하였다.

(4) 실험 1. 메밀 검지 프라이머의 특이성 확인

메밀을 특이적으로 검출하는 프라이머의 선발을 목적으로 하여, 메밀 및 기타 식물의 종자로부터 수득한 DNA를 이용하여 PCR를 실시하였다. 메밀의 샘플로서는 7 종류의 메밀 종자[망칸(미국, 캐나다, 중국), 내몽고(중국), 유림(중국), 키 타와세(북해도), 아이즈재래(후쿠시마)] 및 2종(농림 61호, Canadian Amber Durum), 호밀(캐나다), 대맥(미노리무기), 쌀(코시히카리), 옥수수(사료용 nonGMO), 대두(무라유타카), 좁쌀(쿠마모토), 유채씨(Cano1a), 귀리(경마대상 사료용), 및 소바카즈라(나도닭의 덩굴, 오카야마대락자원생물과학연구실에서 입수)의 종자를 이용하였다.

PCR 후, 전기영동을 실시하여 최적 사이즈의 명료한 증폭 밴드가 메밀 샘플에서만 인정되고, 다른 식물에서는 인정되지 않는 프라이머를, 메밀을 특이적으로 검지하는 프라이머로 선발하였다.

도 1a에 표시한 프라이머: FAG5/FAG6의 특이성을 나타낸 검출 결과의 전기영동상을 나타낸다. 도 1b에서 레인 번호 1: 망칸종(캐나다), 2: 내몽고종(중국), 3: 유림종(중국), 4: 아이즈재래종(일본), 5: 업무용 메밀가루 A, M: 100bp 래더 마커를 나타낸다. 도 1b에서는, 비특이적 밴드의 출현이 확인된 메밀 검지용 프라이머로서 적당하지 않다는 것을 알았다.

표 2. 메밀검지용 프라이머 ; FAG19/22의 특이성

실험 1의 결과, 이하 실험의 프라이머로서, FAG19/22(증폭사이즈 127bp)의 셋트를 선발하였다.

FAG19(센스 프라이머): 5'-AAC GCC ATA ACC AGC CCG ATT-3'

FAG22(안티센스 프라이머): 5'-CCT CCT GCC TCC CAT TCT TC-3'

메밀 이외의 식물 내 메밀카즈라는 메밀과 같은 타데과 식물이지만, 이 프라이머 셋트에 있어서, 교차반응은 확인되지 않았다(도 1a, 표 2).

(5) 실험 2. PCR에 의한 메밀의 검출 한계의 확인

실험 2에서는 FAG19/22 프라이머를 이용한 PCR에 의한 메밀의 검출 한계를 조사하는 것을 목적으로 하여, DNA 레벨 및 분체 레벨에서 메밀의 의사혼입 샘플을 제작하고, 그들의 DNA 시료액을 이용해서 PCR를 실시하여 메밀의 검출 한계를 확인하였다.

DNA 레벨의 의사혼입 샘플은 밀 및 메밀의 종자에서 추출된 DNA를 10ng/㎕로 희석하고, 그것을 연어 정자 DNA 중의 메밀 DNA의 혼입율이 0, 1, 10, 50, 100, 1000ppm 및 1%가 되도록 부피비로 혼합해서 제작하였다. 또, 분체 레벨의 의사혼입 샘플은 밀가루 중의 메일가루의 혼입율이 0, 1, 10, 50, 100, 1000ppm 및 1%가 되도록 질량비로 혼합해서 샘플을 제작하고, 각 혼입 샘플을 미분쇄한 후 DNA를 추출하였다.

도 2a 및 도 2b에 검출 결과의 전기영동상을 나타낸다. 상부의 숫자는 메밀의 혼입율을 나타내며, M: 100bp 래더, NC: No Template Contro1(주형 DNA가 없는 블랭크) 물(水)을 나타낸다. 여기에서 도 2a는 메밀 DNA를 연어 정자 DNA로 희석한, DNA 레벨의 의사혼입 샘플을 피검체로 하였고, 도 2b는 메일가루를 밀가루로 희석한, 분체 레벨의 의사혼입 샘플을 피검체로 하였다.

실험 2에서 FAG19/22를 사용한 PCR에 의한 메밀 검출 한계를 확인한 결과, DNA 레벨 및 분체 레벨의 양쪽 모두 의사혼입 샘플로에서도 메밀 혼입율로서 10ppm 이 검출 한계이었다(도 2). 단, 복수회 실시한 실험의 내, 수회의 검출 한계는 50ppm이었으며, 이 PCR 반응계에서 안정적으로 검출되는 한계는 5Oppm임이 시사되었다. 식물 알러지는 사람에 따라 극히 미량의 알러지 물질에 의해 발증할 수 있기 때문에 식품위생법의 개정에서 「알러지 물질을 포함하는 식품의 표시의 의무화」에 있어서는 지정원재료가 함유된 식품은 함유량에 관계없이 미량으로도 표시해야만 한다. 일본의 후생노동성의 알러지 표시 검토회의 중간보고(2001년 10월 17일)에서 표시의 필요성을 판단하는 기준을 나타내고 있지만, 여기서는 가공식품에 특정원재료의 총 단백량으로서 수 ㎍/ml(g) 이상(1∼9ppm 이상)이 함유된 경우에 표시할 필요가 있다고 보고하고 있다. 메밀 전층 가루의 단백질 함량은 총 12중량%(오정식품성분표에 의함)인 것으로부터 본 PCR의 검출한계 50ppm은 메밀의 단백질의 혼입율로 환산하면 6ppm이 된다. 즉, 여기서 나타낸 PCR에 의한 메밀의 검출법은 표시검토회에서 나타낸 표시를 위해 기준을 검지하기 위해서 충분한 분석방법으로 생각할 수 있다.

(6) 실험 3. PCR에 의한 가공 식품으로부터의 메밀의 검지

메밀 검지 프라이머로서 FAG19/22를 사용하였으며, 원료로서 메밀이 함유되는 가공 식품으로부터의 메밀의 검지를 실시하였다. 사용한 샘플은 레토르트 용기(통조림) 2종(10할 메밀, 3할 메밀), 과자 4종류(메밀 떡 A, B, 메밀 카린도, 메밀호우로, 구운과자) 및 메밀차로서, 각각 미분쇄 후, Dneasy Plant Maxi kit 또는 Genomic Tip20/G(Qiagen)을 이용해서 DNA를 추출하고, PCR을 수행하였다. 메밀 떡 B에 대해서는 수득된 DNA의 순도가 1.2로 낮아서 PCR반응 튜브당 50∼1800ng(흡광 도로부터의 계산값)의 DNA를 첨가하였다.

도 3a, 도3b의 레인번호(샘플명)을 이하의 표 3에 나타낸다.

표 3

FAG19/22를 이용해서 가공 식품으로부터의 메밀의 검지를 PCR에 의해 실시한 결과(실험 3), 메밀 떡 B를 제외하고, 주형 DNA의 첨가량이 PCR 반응당 25ng의 규정량으로 메밀이 검출되었다(도 3a). 한편 메밀 떡 B에서는 주형 DNA의 첨가량을 1800ng까지 증량하는 것에 의해서 메밀의 검출이 가능하였다(도 3b).

현재 식품 알러지의 검사로서 임상현장에서는, 유발시험이나 프릭ㆍ스크래치(prick scratch) 시험, RAST법 등이 실시되고 있지만, 이들 방법은 알러지 환자 자신 혹은 혈액을 대상으로 실시하는 검사로, 식품분석에로의 적용은 곤란하다. 한편, 알레르겐 그 자체를 검출, 정량하기 위한 특정 단백질의 분리 검출법으로서 전 기영동법(SDS-PAGE)이나 웨스턴 블로팅법, 면역화학적 수법(ELISA법)이 사용되고 있지만, 이것들은 기지의 주요 알레르겐의 검출을 위해서는 유효하지만, 미지의 알레르겐의 검출 혹은 가열 공정에 의해서 단백이 변성하고 있을 가능성이 있는 가공 식품에 대해서는 반드시 적당하다고 할 수는 없다.

DNA는 단백질보다도 가열 내성이 높기 때문에 가공 식품 중에서도 잔존하고 있을 경우가 많다. 이 때문에 본 발명에서 나타낸 DNA를 지표로 한 PCR에 의한 특정물의 검출법은, 특히 가공 식품에 있어서 종래부터의 단백질의 검출법을 보완하는 간접적인 식품중의 알러지 물질의 분석 수단으로서 매우 유용하다고 생각된다.

<110> H . YAMAKAWA et. al. <120> Method of food analysis <130> PCT-178 <160> 11 <210> SEQ ID No:1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAG3, disigned sense primer based on SEQ ID No:11 between 149 a nd 169 <400> 1 ccagcaattc cagcatcagt g 　　　　　　　 21 <210> SEQ ID No:2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAG4, disigned anti-sense primer based on SEQ ID No:11 between 3 34 and 313 <400> 2 ttggagtagg aaggaagcaa ga　　　　　　　22 <210> SEQ ID No:3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAG5, disigned sense primer based on SEQ ID No:11 between 278 a nd 297 <400> 3 tgtcgccgtc cgtgtcgtaa 　　　　　　　　20 <210> SEQ ID No:4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAG6, disigned anti-sense primer based on SEQ ID No:11 between 5 30 and 510 <400> 4 ggattcttcg ctctcactct g 　　　　　　　21 <210> SEQ ID No:5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAG17,disigned sense primer based on SEQ ID No:11 between 1435 and 145 5 <400> 5 tggagtgggt ggagttgaag a 　　　　　　　21 <210> SEQ ID No:6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAG18, disigned anti-sense primer based on SEQ ID No:11 between 1624 a nd 1604 <400> 6 tcatctcggg actggaatgg t 　　　　　　　21 <210> SEQ ID No:7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAG19, disigned sense primer based on SEQ ID No:11 between 1464 and 14 84 <400> 7 aacgccataa ccagcccgat t 　　　　　　　21 <210> SEQ ID No:8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAG20,disigned anti-sense primer based on SEQ ID No:11 between 1 626 an d 1606 <400> 8 tctcatctcg ggactggaat g 　　　　　　　21 <210> SEQ ID No:9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAG22, disigned anti-sense primer based on SEQ ID No:11 between 1590 a nd 1571 <400> 9 cctcctgcct cccattcttc 　　　　　　　　20 <210> SEQ ID No:10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAG24, disigned anti-sense primer based on SEQ ID No:11 between 1592 a nd 1572 <400> 10 aacctcctgc ctcccattct t 　　　　　　　21 <210> SEQ ID No:11 <211> 1825 <212> DNA <213> Fagopyrum esculentum <220> <221> CDS <222> (39)..(1655) <223> major allergenic storage protein (FAGAG1) mRNA, complete cds. <400> 11 gatcaccacc tcgacaacac aacttcaaac attccaccat gtcaactaaa ctcatactct 60 ccttctcact gtgccttatg gtactaagct gctctgcgca gctattgcca tggcagaagg 120 gacaacgcag ccgcccccac catggacacc agcaattcca gcatcagtgt gatatccaga 180 ggctcaccgc ctctgagccc tctcgtagag tccggtccga ggccggagtt actgagattt 24 0 gggaccatga cacccctgag ttccgatgtg ccggatttgt cgccgtccgt gtcgtaattc 300 agcctggagg cctcttgctt ccttcctact ccaacgcccc ttacatcacc tttgtcgagc 360 aagggagggg agtgcaggga gtggtcgtgc caggatgccc ggagacgttc cagtcagggt 420 cggaatttga gtaccctcgg tctcagagag accaacgctc caggcagagt gagagcggag 480 aatccagccg tggagaccaa cgctccaggc agagtgagag cgaagaatcc agccgtggag 　 　 540 accaacgctc caggcagagt gagagcgaag aattcagccg tggagaccag caccagaaga 　 　 600 ttttcaggat cagagacggc gacgtcatcc catctcccgc cggtgtcgtg cagtggaccc 　　 66 0 acaacaacgg tgacaacgat ctcatcagta tcactcttta cgatgccaac agcttccaga 　　 72 0 accagctcga tgagaacgtt aggaacttct tcctagctgg tcagagcaag cagagcaggg 　　 7 80 aggaccgccg cagccagcga cagactaggg aggaaggcag tgaccgccaa tcccgtgaga 　 　 840 gccaagacga cgaagcactt ctcgaagcaa acatcttgag tggattcgag gacgagatcc 　　 9 00 tccaagaaat cttccgaaat gttgaccagg agaccatcag caagctcaga ggtgagaacg 　　 9 60 accagagagg attcatcgtc caggctcggg acctcaaact ccgggtccca gaggagtatg 　　1 020 aagaagaact ccagagggaa agaggtgaca ggaaaagagg tggaagcggg aggagcaatg 　 　1080 gattggagca agcgttctgc aacctgaaat tcaggcaaaa tgttaacagg ccttctcgcg 　　114 0 ccgacgtctt caacccacgc gccggtcgta tcaacaccgt agacagcaac aatctcccga 　　1 200 tcctcgaatt catccaactt agcgcccagc acgtcgtcct ctacaagaat gcgatcctcg 　　1260 gaccgagatg gaacttgaac gcgcacagcg cactgtacgt gacgagagga gaaggaagag 　 　1320 tccaggttgt cggagatgaa ggaagaagtg tgttcgacga caacgtgcag cgaggacaga 　　1 380 tccttgtggt cccacaggga ttcgcagtgg tgttgaaggc aggaagagaa ggactggagt 　　14 40 gggtggagtt gaagaacgac gacaacgcca taaccagccc gattgccggg aagacttcgg 　　 1500 tgttgagggc gatccctgtg gaggttcttg ccaactccta cgatatctcg acgaaggaag 　　1560 cgttcagatt gaagaatggg aggcaggagg ttgaggtctt ccgaccattc cagtcccgag 　　162 0 atgagaagga gagggagcgt ttctccatag tttaagagag acaaagggtc tatcgtatgc 　　168 0 aaaataaaac agaaggagaa ggataaggga gtcttgtcta tcgtttagct agtcaagtcc 　　174 0 ctcttccact tctgggttat gttctatgtt tttactttag tgtcaataaa agagtgaatt 　　1800 ctcgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　182 5

Claims (11)

1. FAG19(서열번호 7) 및 FAG22(서열번호 9)로 이루어지는 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR을 행하여 식품 중의 메밀의 유무를 측정하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 알레르겐으로서 메밀을 포함하는 식품을 식별하기 위해서, 또는 식품 중의 미량성분으로서 메밀의 유무를 식품에 표시하기 위해서 행하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 식품이 식품원료 또는 가공식품인 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용되고, FAG19(서열번호 7) 및 FAG22(서열번호 9)로 이루어지는 한 쌍의 프라이머로 이루어지는, 식품 중의 메밀의 유무 또는 농도를 측정하기 위한 PCR용 프라이머.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용되는 FAG19(서열번호 7) 및 FAG22(서열번호 9)로 이루어지는 한 쌍의 프라이머를 포함하는, 식품 중의 메밀의 유무 또는 농도를 측정하기 위한 키트.
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