CN100506987C

CN100506987C - 食物或食物原材料中特定属的植物的定量pcr检测方法

Info

Publication number: CN100506987C
Application number: CNB200480020503XA
Authority: CN
Inventors: 平尾宜司; 平元雅之; 渡边聪; 正野仁慈
Original assignee: House Foods Corp
Current assignee: House Foods Corp
Priority date: 2003-05-16
Filing date: 2004-05-14
Publication date: 2009-07-01
Anticipated expiration: 2024-05-14
Also published as: CA2525916C; JP4399417B2; JPWO2004101794A1; EP1642976A1; KR20060014052A; US20080064028A1; CA2525916A1; CN1823165A; KR100841128B1; EP1642976A4; WO2004101794A1

Abstract

一种根据PCR技术测定食物或食物原材料中的特定属的植物量的方法，包括：(i)提供修正样品，其中来自作为检测靶的特定属的植物样品和标准植物样品的混合比率预先确定，并从该样品中提取基因组DNA；(ii)通过向作为试验受试者的食物或食物原材料中添加已知量的标准植物样品来制成测试样品，并从该样品提取基因组DNA；(iii)用引物和这些基因组DNA实施定量PCR；和(iv)在用从修正样品测得的标准修正值进行修正时，计算测试样品中所含的特定植物原材料的量。

Description

食物或食物原材料中特定属的植物的定量PCR检测方法

技术领域

本发明涉及一种定量检测食物或食物成分中所含的特定植物属的方法。

背景技术

自2002年4月日本已经开始实施了在产品上的变应原性特定成分标记系统。由此，对于食物，根据下述条件，小麦、荞麦、花生、乳和蛋这五项作为特定成分必须强制性标记[卫生、劳动和福利部(theMinistry of Health，Labour and Welfare)网址：“Labeling of FoodsContaining Allergens”(http://www.mhlw.go.jp/topics/0103/tp0329-2b.html)；和“Journal of the Food Hygienics Society of Japan(日语为SHOKUHIN EISEIGAKU ZASSHI)(日本)，The Food HygienicsSociety of Japan，2002，第43卷，第4期，第j-269-j-271页”]。此后，卫生、劳动和福利部提供了通过定量ELISA法进行初筛的特定成分测试公告，该方法利用多克隆抗体和定性PCR法(小麦、荞麦和花生)以及蛋白印迹(乳和蛋)进行验证测试。在这一初筛ELISA法中，把经两个ELISA试剂盒中的任意一个检测确定其定量数值为10ppm或更高(根据来自特定成分的总蛋白量/产品最终重量)的样品评估为阳性，并且除调查其生产记录外，还进一步经PCR法(小麦、荞麦和花生)或蛋白印迹(乳和蛋)进行证实[卫生、劳动和福利部网址：“Inspection Method of Foods Containing Allergens”(SHOKU-HATSU No.1106001(卫生、劳动和福利部，药物和食物安全局，食物安全部门(Department of Food Safety，Pharmaceuticaland Food Safety Bureau of the Ministry of Health，Labour andWelfare)公告No.001(2002年11月6日)))(http://wwwhourei.mhlw.go.jP/～hourei/cgi-bin/t_docframe.cgi？MODE＝tsuchi&DMODE＝CONTENTS&SMODE＝NORMAL&KEYWORD＝&EFSNO＝4642)]。

总的来说，ELISA法是一种高灵敏度的蛋白检测方法，也是本领域的常规技术。然而，利用多克隆抗体的ELISA法具有相对高的交叉反应性，有可能检测到非特异性蛋白(Enzyme Immunoassay，EijiIshikawa指导翻译(1989))，并可能由此产生假阳性。对假阳性的检查需要通过其它方法来再次验证。

虽然ELISA法的灵敏度高，但该方法仅有有限的测量动力学范围。有限的测量动力学范围意味着，对浓度未知的样品的准确测量可能涉及通过数次连续稀释来制备测试溶液和选择落入标准曲线范围内的测试溶液的测量结果。用ELISA进行测量时，通常都不考虑对比如各待检样品的提取效率和对ELISA反应的抑制这样的影响进行修正。因此，当通过对预计将会进行受到各种加工和污染的样品，尤其是食物等，进行测量来测定定量值时，应当谨慎。

例如，用于检测商业购买的荞麦蛋白的ELISA法对于试剂盒所附的用于绘制标准曲线的荞麦蛋白标准测试液的检测灵敏度高达1ng/ml(0.02至0.1ppm，根据来自特定成分的总蛋白量/稀释20至400倍并用于进行ELISA的产品最终重量)[“Journal of the FoodHygienics Society of Japan(日语为SHOKUHIN EISEIGAKUZASSHI)(日本)，The Food Hygienics Society of Japan，2002，第43卷，第4期，第j-275-j-277页”；Journal ofthe Food HygienicsSociety of Japan(日语为SHOKUHIN EISEIGAKU ZASSHI)(日本)，The Food Hygienics Society of Japan，2002，第43卷，第4期，第j-277-j.279页”；FAST KIT(Food Allergen Screening Test)series-ELISA荞麦-<<Instruction Manual>>，Nippon MeatPackers，Inc.；and instruction manual of Morinaga buckwheatmeasurement kit，Morinaga Institute of Biological Science]。然而，例如，当从含有达到根据来自荞麦的总蛋白量/样品重量的该浓度水平的荞麦粉样品取样2-g等分试样时，除非待检特定成分具有非常细的颗粒大小，否则可能无法从样品中取样荞麦粉颗粒。

另一方面，目前已知的一种检测污染荞麦的PCR方法的灵敏度约为5pg荞麦DNA的量，且能够检测添加了荞麦了的小麦样品中约10ppm的荞麦。然而，本领域已知的这一方法不能作定量分析[“Journal of the Food Hygienics Society of Japan(日语为SHOKUHIN EISEIGAKU ZASSHI)(日本)，The Food HygienicsSociety of Japan，2002，第43卷，第4期，第j-280-j-282页”；和“Outline for 84th Academic Lecture Meeting of the Food HygienicsSociety of Japan”(日本)，The Food Hygienics Society of Japan，2002，第104页]。

本发明人开发了一种靶向ITS序列的定性PCR法作为探测是否存在特定植物属的方法，该法的检测灵敏度为1ppm或更高(DNA/DNA)，并于2002年9月27日递交了日本专利申请(日本专利申请第2002-284222号)。然而，该方法不能进行定量分析。

一种利用PCR对基因改造作物进行定量的方法，通过测量基因改造玉米特异性基因序列的拷贝数以及用分开测量的玉米固有内源基因序列的拷贝数进行修正，来测量玉米成分中基因改造玉米成分的量。[“Journal of AOAC INTERNATIONAL”(US)，AOACINTERNATIONAL，2002，第85卷，第5期，第1077-1089页]。

更确切地说，用纯基因改造玉米的一个一般栽培种来测定从其种子提取的DNA中的“重组DNA序列的拷贝数/内源基因序列的拷贝数”值(与内部标准的比率)。接着，测定未知样品的“重组DNA序列的拷贝数/内源基因序列的拷贝数”值，并乘以与内部标准之比率的倒数和100，从而测量基因改造玉米的含量。该法适于对由相同植物物种组成的样品(比如仅由玉米物种组成的样品)中的重组体含量进行定量，因为许多玉米栽培种的拷贝数是相同的，而且使用了具有这些栽培种通用核苷酸序列的内源基因作为内部标准。

然而，考虑到测量存在于由各种有生命物种成分及无生命成分组成的混合物中的变应原特定成分的量，难以从各种不同的活物种DNA中找到一种能够获得的内源序列作为内部标准。此外，也不可能从比如无生命物质那样的无DNA物质中找到内源序列。

发明内容

因此，本发明人已经尝试开发了一种缺点更少的定量检测污染食物或食物成分的特定成分的方法。也即，本发明人为开发一种具有足够定量检测污染食物或食物成分的特定成分的特异性和灵敏度的定量方法的目的，已经做了本发明的研究，该方法使得能够修正由比如各待检样品的提取效率和对检测反应的抑制带来的影响，且该方法比ELISA法具有更宽的动力学范围。

更确切地说，本发明人经过坚持不懈地研究一种定量PCR检测法的建立已经完成了本发明，其特征在于：计划利用来自标准植物的样品(标准植物样品)来修正比如各待检样品的提取效率和对检测反应的抑制这样的影响；具有比本领域已知的ELISA法更宽的动力学检测范围；以及具有足够的特异性和灵敏度。

也即，本发明涉及：

1.一种用PCR法对食物或食物成分中属于某一特定植物属的植物进行定量的方法，其包括：

将来自待检特定植物属的样品和标准植物样品以预定比率混合制成修正样品，并从该修正样品中提取基因组DNA；

将已知量的标准植物样品添加到待检食物或食物成分中制成测试样品，并从该测试样品中提取基因组DNA；

用检测来自待检特定植物属的样品的引物组和检测标准植物样品的引物组对提取自修正样品和测试样品的作为模板的基因组DNA进行定量PCR；

用定量PCR法对修正样品确定来自标准植物的DNA拷贝数/来自特定植物属的DNA拷贝数的值，作为标准修正值；和

用定量PCR法对测试样品确定来自特定植物属的DNA拷贝数/来自标准植物的DNA拷贝数的值，和用标准修正值来修正该值从而计算出食物或食物成分中所含的属于特定植物属的植物的量；

2.根据上述1的方法，其中所述定量PCR法是实时PCR法；

3.根据上述2的方法，其特征在于该实时PCR法根据通过使用在5’末端带有荧光染料和在3’末端带有猝灭剂的、能与基因组DNA部位的内部区域杂交的探针所放射出的光量对DNA进行定量，该内部区域与PCR引物组的各寡核苷酸杂交，其中从探针5’末端的荧光染料发射出的光受到3’末端的猝灭剂抑制，在PCR反应中从引物开始的Taq聚合酶-催化的DNA延伸过程中，该探针被Taq聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性降解从而使荧光染料与猝灭剂解离，随之导致发光；

4.根据上述1至3之中任一项的方法，其中所述标准植物属于除高地杂草和食物作物之外的植物物种；

5.根据上述4的方法，其中所述标准植物是补血草；

6.根据上述1至5之中任一项的方法，其中所述待检特定植物属是荞麦属(Fagopyrum)、落花生属(Arachis)、小麦属(Triticum)或大豆属(Glycine)；

7.根据上述2或3的方法，其中所述标准植物是补血草，用于检测补血草的引物组是由具有SEQ ID NO：57所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：58所示序列的寡核苷酸组成的组，且用于检测补血草的探针是具有SEQ ID NO：59所示序列的寡核苷酸；

8.根据上述2或3的方法，其中所述待检特定植物属是荞麦属，用于检测荞麦属的引物组是由具有SEQ ID NO：14所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：15所示序列的寡核苷酸组成的组，且用于检测荞麦属的探针是具有SEQ ID NO：64所示序列的寡核苷酸；

9.根据上述2或3的方法，其中所述待检特定植物属是落花生属，用于检测落花生属的引物组是由具有SEQ ID NO：21所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：26、65或66所示序列的寡核苷酸组成的组，且用于检测落花生属的探针是具有SEQ ID NO：34所示序列的寡核苷酸；

10.用于检测补血草的引物组，其由具有SEQ ID NO：57所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：58所示序列的寡核苷酸组成；

11.用于检测荞麦属的引物组，其由具有SEQ ID NO：14所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：15所示序列的寡核苷酸组成；

12.用于检测落花生属的引物组，其由具有SEQ ID NO：21所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：26、65或66所示序列的寡核苷酸组成；

13.用于检测食物或食物成分中属于特定植物属的植物的方法的试剂盒，其包含用于检测标准植物样品的引物组；

14.根据上述13的试剂盒，还含有用于检测标准植物样品的探针；

15.根据上述13或14的试剂盒，其中所述标准植物是补血草，且用于检测补血草的引物组是由具有SEQ ID NO：57所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：58所示序列的寡核苷酸组成的组；

16.根据上述15的试剂盒，还含有具有SEQ ID NO：59所示序列的用于检测补血草的探针；

17.根据以上13至16之中任一项的试剂盒，还含有用于检测待检特定植物属的引物组；

18.根据上述13至16之中任一项的试剂盒，其中所述待检特定植物属是荞麦属，且用于检测荞麦属的引物组是由具有SEQ ID NO：14所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：15所示序列的寡核苷酸组成的组；

19.根据上述18的试剂盒，还含有具有SEQ ID NO：64所示序列的用于检测荞麦属的探针；

20.根据上述13至16之中任一项的试剂盒，其中所述待检特定植物属是落花生属，且用于检测落花生属的引物组是由具有SEQ IDNO：21所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：26、65或66所示序列的寡核苷酸组成的组；

21.根据上述20的试剂盒，还含有具有SEQ ID NO：34所示序列的用于检测落花生属的探针；

22.根据上述15的试剂盒，还含有作为标准植物样品的补血草样品；

23.根据上述13的试剂盒，其中所述标准植物是补血草且待检特定植物属是荞麦属，该试剂盒还含有用于绘制补血草和荞麦属标准曲线的质粒，该质粒含有相连的具有补血草扩增靶序列的DNA和具有荞麦属扩增靶序列的DNA；

24.根据上述13的试剂盒，其中所述标准植物是补血草且待检特定植物属是落花生属，该试剂盒还含有用于绘制补血草和落花生属标准曲线的质粒，该质粒含有相连的具有补血草扩增靶序列的DNA和具有落花生属扩增靶序列的DNA；

25.用于检测食物或食物成分中属于荞麦属的植物的方法的试剂盒，其包含由具有SEQ ID NO：14所示序列的寡核苷酸和具有SEQID NO：15所示序列的寡核苷酸组成的用于检测荞麦属的引物组；

26.根据上述25的试剂盒，还含有具有SEQ ID NO：64所示序列的用于检测荞麦属的探针；

27.用于检测食物或食物成分中属于落花生属的植物的方法的试剂盒，其包含由具有SEQ ID NO：21所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：26、65或66所示序列的寡核苷酸组成的用于检测落花生属的引物组；和

28.根据上述27的试剂盒，还含有具有SEQ ID NO：34所示序列的用于检测落花生属的探针。

由此首次公开了本发明的方法，也即，不是通过外在添加DNA作为标准来修正比如反应液中对PCR反应的抑制这样的影响，而是通过从外在补加了标准植物样品的样品中同时提取待检特定植物属的DNA(本文中所使用的“待检特定植物属”甚至还包括待定量的特定植物属)和标准植物的DNA而非纯化的DNA进行定量PCR法，来修正比如各待检样品的DNA提取效率和对PCR反应的抑制这样的影响的方法。该法可以进行高度可靠的定量，因为它能够在标准植物样品和来自待检特定植物属的样品间的比如DNA提取效率和对PCR反应的抑制这样的影响是一致的条件下进行测量。本发明的方法具有该方法能够修正比如DNA提取效率和对PCR反应的抑制以及甚至待检样品间的DNA含量差异这样的影响的优点。此外，即便存在假阳性的话，通过将其PCR扩增产物进行DNA序列分析，该利用PCR法的定量分析也能可靠地将所述假阳性排除，并且由此，该方法可以说具有优越的工业实用性。因此，本发明可用于定量检测食物或食物成分中所含的属于变应原性特定植物属的植物。

因此，在本发明的方法中，本发明也包括用于检测作为标准植物样品的补血草的引物组和用于检测作为特定植物属的荞麦属或落花生属的引物组。除此之外，在实时PCR法检测中与这些引物组结合使用的探针也包括在本发明内。本发明的方法中所使用的含有用于检测标准植物样品的引物组或(和)用于检测属于待检特定植物属的植物的引物组中的任一或其二者的试剂盒也包括在本发明范围内。该试剂盒可以包含上述探针。该试剂盒还可以包含标准植物样品。优选的标准植物是补血草，其优选样品是补血草植物的干粉，尤其优选其种子干粉。此外，该试剂盒可以含有用于绘制标准植物样品和特定植物属的标准曲线的质粒，该质粒含有相连的具有标准植物样品序列的DNA和具有待检特定植物属序列的DNA，该质粒能够被该试剂盒中所包含的引物组扩增。

本说明书中，“用于检测”给定植物或植物属(包括属于，也即，包括在该属中的植物)或来自它们之中任一的样品的“的引物”是指，由在PCR法中特异性扩增给定植物或属于给定植物属的植物的基因组DNA的寡核苷酸组成的引物。由两个寡核苷酸组成的用于PCR法的引物对，即正向和反向引物，在本文中可以称作“引物组”。

尽管本发明的引物可以在定量PCR法中用于定量各植物属，但显然，这些引物还可以用于对各植物属的非定量(也即定性)检测。本发明引物的使用使得能够检测属于待检植物属的各植物物种。本发明的引物和引物组有利于在定量和非-定量PCR法中使用。

本文中所使用的术语“检测”同时包括定性和定量检测。

本发明中，设计了用于特异性扩增来自待检特定植物属的DNA的引物。也即，设计了一种在严格条件下能够与具有45S rRNA前体基因序列中的特定植物属的通用核苷酸序列的核酸分子杂交的引物，其中该引物是具有当该引物与核酸分子杂交时能够与特定植物属的ITS-1序列中的核苷酸互补结合的3’末端的引物(A)或具有当该引物与核酸分子杂交时能够与特定植物属的ITS-2序列中的核苷酸互补结合的3’末端的引物(B)。在完成了使用一或多个引物(A)和(B)的PCR后，根据作为指示剂的含有特定植物属的至少一部分ITS-1或ITS-2序列的PCR扩增产物的存在，可以检测到特定植物属的存在。

本文中所使用的短语“在严格条件下杂交”意指，在Sambrook J.等人所述的标准杂交条件下两个DNA片段彼此杂交(Expression ofcloned genes in E.coli(Molecular Cloning：A laboratory manual(1989))Cold Spring harbor Laboratory Press，New York，USA，9.47-9.62和11.45-11.61)。更确切地说，该短语意指，根据，例如，按照以下方程确定的Tm值实施的杂交(例如约3.0×SSC或2.0×SSC，30℃或37℃)，之后在比杂交条件更严格的条件下洗涤(例如，约2.0×SSC，30℃、37℃、40℃、44℃或48℃或更高；或1.0×SSC或0.5×SSC，37℃或更高)。基于，例如，彼此杂交的核苷酸序列对适于杂交和洗涤的“严格条件”的选择是本领域熟知的。本文中仅述及术语“杂交”时，该术语意指除另行说明的条件外在严格条件下的杂交。

Tm＝81.5+16.6(log₁₀[Na⁺])+0.41(G+C分数)-(600/N)

本文中所使用的术语“属”意指一个包括了属于该属的全部植物或包括了选自属于该属植物的若干个物种的组。

本发明中所使用的引物组是能够在严格条件下与具有45S rRNA前体基因序列中的特定植物属的通用核苷酸序列的核酸分子杂交的引物组。重要的是，引物对中至少一个引物是具有当该引物与核酸分子杂交时能够与特定植物属的ITS-1序列中的核苷酸互补结合的3’末端的引物(A)或具有当该引物与核酸分子杂交时能够与特定植物属的ITS-2序列中的核苷酸互补结合的3’末端的引物(B)。本文中，引物(A)还包括与ITS-1序列和5.8S rRNA基因序列间的桥连区域杂交的引物和与ITS-1序列和SSU rRNA基因序列间的桥连区域杂交的引物。同样地，引物B还还包括与ITS-2序列和5.8S rRNA基因序列间的桥连区域杂交的引物和与ITS-2序列和LSU rRNA基因序列间的桥连区域杂交的引物。引物(A)和(B)各自优选由至少15个碱基组成，更优选由15至30个碱基组成。由于ITS-1和ITS-2序列包含对物种特异的可变序列，所以通用或特异于特定植物属的引物(A)或(B)优选可通过选择具有ITS-1或ITS-2序列中通用和特异于特定植物属的核苷酸序列的核酸分子来获得，这是因为该核酸分子具有45S rRNA前体基因序列中的特定植物属的通用核苷酸序列。此外，可以使用引物(A)和(B)中的一或两个或更多个。使用两个或更多个引物(A)和(B)可进一步提高对特定植物属的特异性。

另一方面，引物(A)与能够在严格条件下与核酸分子杂交的引物(C)结合使用，所述核酸分子具有一段连续连接了特定植物属的ITS-1、5.8S rRNA基因、ITS-2和LSU rRNA基因的序列中的部分核苷酸序列。或者，引物(A)与能够在严格条件下与核酸分子杂交的引物(E)结合使用，所述核酸分子具有一段连续连接了特定植物属的SSU rRNA基因和ITS-1的序列中的部分核苷酸序列。再一方面，引物(B)与能够在严格条件下与核酸分子杂交的引物(D)结合使用，所述核酸分子具有一段连续连接了特定植物属的SSU rRNA基因、ITS-1、5.8S rRNA基因和ITS-2的序列中的部分核苷酸序列。或者，引物(B)与能够在严格条件下与核酸分子杂交的引物(F)结合使用，所述核酸分子具有一段连续连接了特定植物属的ITS-2和LSU rRNA基因的序列中的部分核苷酸序列。本文中，5.8S rRNA基因高度保守，且包含许多对大量植物通用的序列。因此，引物(C)优选选自在严格条件下能够与具有5.8S rRNA基因的部分核苷酸序列的核酸分子杂交和具有当该引物与核酸分子杂交时能够与5.8SrRNA基因序列中的核苷酸序列互补结合的3’末端的引物，或者，引物(D)优选选自在严格条件下能够与具有5.8S rRNA基因的部分核苷酸序列的核酸分子杂交和具有当该引物与核酸分子杂交时能够与5.8S rRNA基因序列中的核苷酸序列互补结合的3’末端的引物，由此使得有可能将该引物普遍应用于各种植物。这些引物是固定的，且待检特定植物属的通用和特异引物选自ITS-1或ITS-2区。以这种方式，可以容易地设计具有高灵敏度的用于检测由属于特定植物属的植物所造成的污染的引物。引物(C)至(F)优选各由优选至少15个碱基、更优选15至30个碱基组成。

为设计这些引物，可以根据，例如，“Recent Advances in PCRMethodology：Basic Methodology and it′s Application”(Protein，Nucleic Acid and Enzyme，1996 Supplement，Kyoritsu Shuppan)、“Visual Experimental Note Series，Biotechnology ExperimentsIllustrated3，PCR for Real Amplification(Hontouni Hueru PCR inJapanese)，Cell Technology Supplement”(Nakayama，H.，1996，Syujunsha)、“PCR Technology--Principles and Applications of DNAAmplification—”(Erlich，H.A.(ed.)，supervised by Kato，K.，Takara Shuzo)来设计引物。然而，当特定植物属从其中DNA较不可能被片段化的未经处理的产物中进行检测时，引物可以是那些能够产生在700个碱基以内的扩增产物的引物。或者，当特定植物属从经处理的产物进行检测时，其DNA由于可能的片段化有可能较短。从这一点来看，由于能够达到高灵敏度，所以优选使用能够产生200个碱基以内的扩增产物的引物。

因此，引物(C)或(D)优选为能够在严格条件下与具有SEQ IDNO：1中所示核苷酸序列或其互补核苷酸序列的核酸分子杂交的引物。由于5.8S rRNA基因序列几乎跨整个基因序列在植物间都高度同源，因此任何能够与该基因序列中任何区域杂交的引物都可以使用。然而，由于SEQ ID NO：1中所示区域具有特别高的同源性，所以优选上述引物。更优选的是在严格条件下能够与具有SEQ ID NO：1中第11至63位的核苷酸序列或其互补核苷酸序列的核酸分子杂交的引物。优选作为引物(C)的这样的引物是SEQ ID NO：2至4中所示的任一寡核苷酸(其与具有SEQ ID NO：1所示序列的核酸分子杂交)。或者，优选作为引物(D)的这样的引物是SEQ ID NO：5至7中所示的任一寡核苷酸(其与具有SEQ ID NO：1所示序列的互补链的核酸分子杂交)。上述引物在严格条件下应当特异性与靶核酸分子杂交。此外，引物3’末端的核苷酸应当与靶DNA序列部分的相应核苷酸互补，以使得杂交后的引物能够作为引发延伸反应的引物起作用。因此，只要该引物满足这些要求，该引物可以是由SEQ ID NO：2至7中所示的任一核苷酸序列所指示的带有一个或若干个碱基缺失、取代或添加的寡核苷酸。

通过获得来自GenBank的待检特定植物属和其它植物属的多种植物的ITS-1-5.8S rRNA基因-ITS-2序列、以及进行比对以搜索对该特定植物属通用和高度特异的区域，可以鉴定出ITS-1或ITS-2序列中对特定植物属通用或特异的核苷酸序列。此外，为保持尤其特异于特定植物属及其相关植物物种的特异性，可以通过改变引物序列3’末端的核苷酸从这一鉴定出的区域中选择出一段引物序列。

例如，当特定植物属是荞麦属时，荞麦属ITS-1序列中通用和特异于荞麦属的核苷酸序列可以选自荞麦(Fagopyrum esculentum)(普通荞麦)的序列，因为大量可以商业获得的荞麦都是荞麦(普通荞麦)，而且可商业获得的荞麦的实际序列与GenBank中登记的荞麦序列一致。核苷酸序列的特定例子可以包括SEQ ID NO：8、9或10中所示的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。其优选例子可以包括SEQID NO：8中第11至61位的核苷酸序列或其互补核苷酸序列以及SEQID NO：9中第11至67位的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。SEQ IDNO：10中所示的核苷酸序列尤其可用作从中选择用于特异检测荞麦属成员的引物的区域，所述荞麦属成员为荞麦(普通荞麦)、苦荞麦(F.tataricum，Dattan荞麦)、F.homotropicum和金荞麦(F.cymosum)。

对荞麦属优选的引物(A)是SEQ ID NO：11至16中所示的任一寡核苷酸(其在严格条件下分别与SEQ ID NO：8的核苷酸序列的互补链(若寡核苷酸为SEQ ID NO：11至14所示)和与SEQ ID NO：9的核苷酸序列(若寡核苷酸为SEQ ID NO：15和16所示))杂交。或者，该引物可以是由SEQ ID NO：11至16中所示的任一核苷酸序列所指示的带有一个或若干个碱基缺失、取代或添加的寡核苷酸。ITS-2序列中通用和特异于荞麦属的核苷酸序列的例子可包括SEQID NO：36或37中所示的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。这些核苷酸序列尤其可用作从中选择用于特异检测荞麦属成员的引物的区域，所述荞麦属成员为荞麦(普通荞麦)、苦荞麦(Dattan荞麦)、F.homotropicum和金荞麦。优选使用SEQ ID NO：11至14中的任一引物与SEQ ID NO：15和16或SEQ ID NO：2至4中的任一引物的组合。

当特定植物属是落花生属时，落花生属ITS-1序列中通用和特异于落花生属的核苷酸序列可以选自A.villosa的序列，因为可商业获得的花生的实际序列与GenBank中登记的A.correntina和A.villosa的序列一致(尽管大量可商业获得的花生是落花生(Arachishypogaea))。核苷酸序列的特定例子可以包括SEQ ID NO：17至20中所示的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。优选地，该核苷酸序列是SEQ ID NO：17第11至62位的核苷酸序列或其互补核苷酸序列，SEQ ID NO：18第11至47位的核苷酸序列或其互补核苷酸序列，SEQ ID NO：19第11至50位的核苷酸序列或其互补核苷酸序列，或SEQ ID NO：20第11至58位的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。

对落花生属优选的引物(A)是SEQ ID NO：21至31、65和66中所示的任一寡核苷酸(其在严格条件下分别与SEQ ID NO：17的核苷酸序列的互补链(若寡核苷酸为SEQ ID NO：21至23所示)、与SEQ ID NO：18的核苷酸序列的互补链(若寡核苷酸为SEQ IDNO：24和25所示)、与SEQ ID NO：20的核苷酸序列的互补链(若寡核苷酸为SEQ ID NO：30和31所示)、以及与SEQ ID NO：19的核苷酸序列(若寡核苷酸为SEQ ID NO：26至29、65和66所示)杂交)。或者，该引物可以是具有SEQ ID NO：21至31、65和66所示的任一核苷酸序列且带有一个或若干个碱基缺失、取代或添加的寡核苷酸，只要该寡核苷酸在严格条件下与上述各相应序列杂交。落花生属ITS-2序列中通用和特异于落花生属的核苷酸序列的例子可包括SEQ ID NO：38中所示的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。优选地，该核苷酸序列是SEQ ID NO：38中第11至47位的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。对落花生属优选的引物(B)是SEQ ID NO：39中所示的寡核苷酸(其在严格条件下能与SEQ ID NO：38的核苷酸序列杂交)。或者，该引物可以是由SEQ ID NO：39中所示的核苷酸序列所指示的带有一个或若干个碱基缺失、取代或添加的寡核苷酸。优选使用SEQ ID NO：21、24和25的任一引物和SEQ ID NO：2至4的任一引物的组合，SEQ ID NO：21、24和25的任一引物和SEQ ID NO：39的引物的组合，SEQ ID NO：39的引物和SEQ IDNO：5至7的任一引物的组合，或SEQ ID NO：21至23、30和31的任一引物和SEQ ID NO：26至29、65和66的任一引物的组合。然而，更优选的是SEQ ID NO：21、24和25的任一引物与SEQ IDNO：2至4的任一引物的组合，或SEQ ID NO：21的引物与SEQ IDNO：26、65和66的任一引物的组合。

当特定植物属是小麦属时，小麦属ITS-2序列中通用和特异于小麦属的核苷酸序列的例子可以包括SEQ ID NO：40至42所示核苷酸序列或其互补核苷酸序列。优选地，该核苷酸序列是SEQ ID NO：40中第11至50位的核苷酸序列或其互补核苷酸序列，SEQ ID NO：41中第11至47位的核苷酸序列或其互补核苷酸序列，或SEQ IDNO：42中第11至47位的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。

对小麦属优选的引物(B)是SEQ ID NO：43至45中所示的任一寡核苷酸(其在严格条件下分别能与SEQ ID NO：40的核苷酸序列的互补链(若寡核苷酸为SEQ ID NO：43所示)、与SEQ ID NO：41的核苷酸序列(若寡核苷酸为SEQ ID NO：44所示)和与SEQ IDNO：42的核苷酸序列(若寡核苷酸为SEQ ID NO：45所示)杂交)。该引物可以是由SEQ ID NO：43至45中所示的任一核苷酸序列所指示的带有一个或若干个碱基缺失、取代或添加的寡核苷酸。优选使用SEQ ID NO：43的引物和SEQ ID NO：44和45的一或多个引物的组合。

当特定植物属是大豆属时，大豆属ITS-2序列中通用和特异于大豆属的核苷酸序列的例子可以包括SEQ ID NO：46、47和48所示核苷酸序列或其互补核苷酸序列。优选地，该核苷酸序列是SEQ IDNO：46中第11至48位的核苷酸序列或其互补核苷酸序列，SEQ IDNO：47中第11至55位的核苷酸序列或其互补核苷酸序列，或SEQID NO：48中第11至52位的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。

对大豆属优选的引物(B)是SEQ ID NO：49至56中所示的任一寡核苷酸(其在严格条件下分别能与SEQ ID NO：46的核苷酸序列的互补链(若寡核苷酸为SEQ ID NO：49所示)、与SEQ ID NO：47的核苷酸序列(若寡核苷酸为SEQ ID NO：50至65所示)、和与SEQ ID NO：48的核苷酸序列(若寡核苷酸为SEQ ID NO：56所示)杂交)。该引物可以是由SEQ ID NO：49至56中所示的任一核苷酸序列所指示的带有一个或若干个碱基缺失、取代或添加的寡核苷酸。优选使用SEQ ID NO：49的引物和SEQ ID NO：50至56的一或多个引物的组合。

为设计这些引物并对所设计出的引物进行评估，可以采用PCR模拟。

例如，在对用于检测荞麦属的引物的设计中，在ITS-1-5.8S rRNA基因-ITS-2序列部分中发现了一段通用且高度特异于包括可食用荞麦(普通荞麦和Dattan荞麦)在内的荞麦属植物的21个序列的区域，而且为保持对其它植物的特异性，通过改变引物序列3’末端的核苷酸可以从该区域选择出引物序列。然而，在ITS-1-5.8S rRNA基因-ITS-2序列部分中缺失的核苷酸位点和数量将因荞麦属中各物种不同而变化。因此，为了从荞麦属植物的全部21个序列获得同样大小的扩增产物，还需进行选择。如果能够获得相同大小的扩增产物，则可容易地检测出荞麦属的存在。模拟证实，可以从荞麦属植物的全部21条序列获得相同大小的扩增产物，尤其是通过选择荞麦属的引物(A)和引物(C)或两个引物(A)。由此使得可以容易地设计能够根据大小区分非特异性产物的引物。

在本发明中，上述引物用于通过PCR法检测属于待检特定植物属的植物。或者说，通过定量PCR法对植物进行定量。

对于PCR，比如各变性、退火和延伸步骤的温度和时间，酶(DNA聚合酶)的类型和浓度，dNTP、引物和氯化镁的浓度，以及模板DNA的量这样的条件可以根据，例如，Saiki RK等人，Science，230：1350-1354(1985)和“Plant Cell Technology Suppl.，Plant CellTechnology Series，PCR Experimental Protocols of Plants”(Shimamoto，K.和Sasaki，T eds.(1995))中所述的一般方法进行适当地修改和最优化。

或者，PCR扩增可以在PCR扩增所使用的引物和DNA模板的退火温度下进行，所述温度设定为高于根据比如HYB Simulator^TM版本4.0(Advanced Gene Computing Technologies，Inc.)和PrimerExpress^TM版本1.5(Applied Biosystems)这样的商业可获得的软件计算得出的引物Tm值的温度，优选在Tm值+10至+3℃的温度下，之后再于退火温度下进行附加的PCR扩增，所述退火温度设定在约为引物Tm值的温度下，优选在Tm值+7至±0℃的温度下。

利用实时PCR法的定量方法优选为定量PCR法。实时PCR法的例子包括但不限于，SYBR Green、Fluorogenic探针(例如，TaqMan^TM探针)、分子信标(Molecular Beacon)和LightCycler^TM探针法。近来，积极开发了多种实时PCR法，且本领域技术人员可以实施其中的任何一种方法。为设计该方法中所使用的探针，从能够在严格条件下与某一部位的内部区域杂交的序列中选择探针，所述内部区域与扩增靶序列的各PCR引物杂交。

一种尤其优选的实时PCR法是，其特征在于通过使用如上述所设计的特定植物属-特异性引物组以及在5’末端带有荧光染料且在3’末端带有猝灭剂的探针从而根据所放射的光量对DNA进行定量的方法，所述探针在严格条件下能够与杂交于扩增靶序列的PCR引物组的各寡核苷酸的部位的内部区域杂交，其中从探针5’末端的荧光染料所放射出的光受到3’末端的猝灭剂的抑制，在PCR反应中从引物进行Taq聚合酶-催化的DNA延伸的过程中，所述探针被Taq聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性降解从而使荧光染料与猝灭剂解离，由此探针放射出光。不需要整个探针序列包括在杂交于PCR引物的部位的内部区域中。在所设计的探针的3’-末端碱基和在与探针杂交的链的反义链上所设计的引物的3’-末端碱基之间可能重叠了1至10个碱基或1至5个碱基。更优选从具有通用于待检特定植物属的序列的区域选择探针序列。TaqMan^TM探针优选为上述探针。一种设计TaqMan探针的方法是本领域已知的(参见例如，Applied Biosystems，Japan，“Simple Operational Guideline for Primer Express Software，SimpleOperational Guideline for TaqMan Probe Search in Primer ExpressSoftware：Rev。C”(http://www.appliedbiosystems.co.jp/website/jp/product/ctlgpage.jsp？MODELCD＝19775&PLCD＝17689&BUCD＝131))。可以在针对给定植物或属于给定植物属的植物的定量PCR中所使用的探针在本文中称作“用于检测”给定植物或属于给定植物属的植物“的探针”。也即，在本说明书中，“用于检测的探针”指，通过该探针与用于检测植物属的引物组的组合使用能够检测属于各植物属的植物的探针。如上所述，在本文中，检测同时包括定性和定量检测。应当理解，这样的一种探针在定量检测中也是有利的。

探针中所使用的荧光染料的已知例子包括但不限于，FAM、HEX、TET和FITC。此外，猝灭剂的已知例子包括但不限于，TAMRA和Dabcyl，以及非荧光猝灭剂。

探针优选长为13至30个碱基，尤其优选长为13至25个碱基。即使探针的碱基长度很短，但为维持高Tm值更优选地使用在3’末端带有另外用MGB(Minor Groove Binden)标记的猝灭剂的探针。具体地，荞麦属的探针的例子为如SEQ IDNO：64所示的寡核苷酸。落花生属的探针的例子优选为如下寡核苷酸，若是SEQ IDNO：24和25的任一引物和SEQ IDNO：2至4的任一引物的组合，则为在严格条件下能够与SEQ IDNO：32或33所示的核苷酸序列的的互补核苷酸序列杂交的寡核苷酸，或者，若是SEQ IDNO：21至23的任一引物和SEQ IDNO：26至29、65和66的任一引物的组合，则是SEQ IDNO：34所示的寡核苷酸。对于SEQ IDNO：30和31的任一引物与SEQ IDNO：26至29的任一引物的组合，探针优选为在严格条件下能够与SEQ IDNO：35所示的核苷酸序列或其互补核苷酸序列杂交的寡核苷酸、以及SEQ IDNO：34所示的寡核苷酸。尤其优选以SEQ IDNO：34所示的寡核苷酸作为探针结合SEQ IDNO：21的引物与SEQ IDNO：26、65和66的任一引物的组合一起使用。

合成具有所设计序列的寡核苷酸后可以用商业可获得的试剂盒构建这样的探针。或者，探针的构建可以外购或定制，且探针的许多合同生产商是本领域已知的(例如，Applied Biosystems，日本(http//www.appliedbiosystems.co.jp))。

本发明的定量方法使用了修正样品和测试样品，在修正样品中来自待检特定植物属的样品(尤其是待定量的)和标准植物样品按照预定比率混合，在测试样品中向待检食物或食物成分中添加了已知量的标准植物样品。该方法包括，用同样的方法从修正样品和测试样品中提取基因组DNA；在相同条件下进行定量PCR法；用定量PCR法对修正样品确定来自标准植物的DNA拷贝数(Lo)/来自特定植物属的DNA拷贝数(Fo)的值，作为标准修正值；和对测试样品确定来自特定植物属的DNA拷贝数(Fs)/来自标准植物的DNA拷贝数(Ls)的值，以及通过以下方程用标准修正值来修正该值，从而计算出食物或食物成分(1g)中所含的属于特定植物属的植物的量(μg)。

属于特定植物属的植物的量(ppm(μg/g))＝Fs/Ls×Lo/Fo×

1,000,000

因此，该方法使得可以修正比如各待检食物或食物成分的DNA提取效率和对PCR反应的抑制以及甚至各待检样品间DNA含量差异这样的影响。该方法还可以在比如盐这样的不含DNA的食物成分以及包含该成分的食物中正确地定量检测属于特定植物属的植物。

当需要评估PCR扩增产物是否是假阳性时，可以通过对PCR完成后反应液中所含的PCR扩增产物进行DNA序列分析来严格地进行评估。

由于想要多种成分对DNA提取效率的影响尽可能一致，所以本发明中所使用的标准植物样品优选为任何一种处于与待检特定植物属相似的状态的样品。优选地，该标准植物样品源自不可能污染待检食物或食物成分的植物物种。根据目前的情况，在栽培过程中很难除去高地野草污染食物作物的可能性且痕量的衍生自野草的物质污染食物作物，优选使用除被认为是高地野草的植物物种之外的植物物种作为标准植物样品。也即，标准植物样品应当从不太可能被食物或食物成分中所使用的植物污染和不太可能污染食物或食物成分的植物物种中选择。

各种高地野草已知为上述高地野草。其主要例子包括禾本科(Poaceae)、竹亚科(Bambusoideae)、香蒲科(Typhaceae)、莎草科(Cyperaceae)、地星科(Asteraceae)、蓼科(Polygonaceae)、鸭跖草科(Commelinaceae)、木贼科(Equisetaceae)、桑科(Moraceae)、马齿苋科(Portulacaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、豆科(Leguminoae)、酢浆草科(Oxalidaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、伞形科(Apiaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、唇形科(Lamiacea)、车前草科(Plantaginaceae)、茄科(Solanaceae)和葫芦科(Cucurbitaceae)。详细信息参见，例如，The Weed Science Society of Japan网站的说明。

例如，可以一次大量获得和保存的均一材料，比如可商业获得的种子，更优选为标准植物样品。

标准植物样品可以来自任何植物组织(比如种子、叶和根茎)。若待检样品来自，例如，荞麦、小麦和花生种子，则标准植物样品和待检样品优选为种子。根据这些观点，在对不含例如西瓜、番木瓜和瓜的食物的检测中优选比如西瓜、番木瓜和瓜这样的果肉中含有大量被果肉和外壳使之与外界隔离的种子的植物物种。不作为食物作物栽培的植物物种也是优选的，即使它们的种子不与外界隔离。考虑到这些条件，本发明中使用的标准植物样品的例子包括但尤其不限于(只要满足条件)，那些源自喜林草属(Nemophila)(爵床科(Hydrophyllaceae))、苣苔花属(Gloxinia)(苦苣苔科(Gesneriaceae))和补血草(补血草属(Limonium))(蓝雪科(Plumbaginaceae))的植物样品。尤其优选的是补血草种子。

考虑到，例如，DNA提取效率和灵敏度和/或定量PCR法的精确性，优选避免使用那些含有大量对DNA提取或PCR反应表现抑制活性的成分的植物作为标准植物样品。

作为举例，本文实施例中以使用补血草种子作为标准植物样品进行举例说明。如上所述，高地野草极可能污染食物作物并因此不适宜作为标准植物样品。因此，本发明人调查了在The Weed ScienceSociety of Japan网站(http//wssj.ac.affrc.go.jp)中被描述为高地野草的全部860个类型的植物的科名，并选择了补血草作为属于不包括在这些科内的科的植物。用特异性检测补血草ITS-1序列的引物检查总的食物成分中是否存在补血草污染，所述食物成分也即，五个类型的可商业获得的小麦，五个类型的可商业获得的玉米粉，和三个类型的可商业获得的芥末。然而，在所有这些食物成分中根本检测不到污染。因此，预期补血草优选为本发明的标准植物样品。

本发明人已经证实了在含有大量高地野草的禾本科中使用水稻而非补血草作为标准植物样品不是优选的。这可能是因为，属于禾本科的高地野草植物在栽培过程中会污染所栽培的成分植物。

被选择作为标准植物样品的植物材料的粉碎粉末(例如，补血草种子)和被选择作为来自待检特定植物属的样品的植物(例如，荞麦)粉末以预定比率混合制成修正样品。除了该修正样品，将上述相同标准植物样品的粉碎粉末添加到待检食物或食物成分中制成测试样品。在粉碎过程中，重要的是必须充分考虑，以不产生其它食物成分的污染，且尤其是来自待检特定植物属的样品与标准植物样品彼此间的污染。例如，必须彻底的进行粉碎过程中所使用的器械等的洗涤工作。为制备修正和测试样品，优选修正样品中的来自特定植物属的样品和测试样品中的食物或食物成分的样品应当使用几乎相同的量，且修正样品中的标准植物样品和测试样品中来自标准样品的样品应当使用几乎相同的量。

接下来，从修正样品和测试样品提取DNA。可以用本领域已知的各种方法、且也可以用可商业获得的试剂盒或预包装柱进行该DNA提取。例如，参照QIAGEN Genomic DNA Handbook andUser-Developed Protocol：Isolation of genomic DNA from plants usingthe QIAGEN Genomic-tip可以使用由QIAGEN生产的Genomic-tip。

之后，将所提取的DNA用于定量PCR法。尽管用于定量分析的各种PCR技术是本领域已知的，但利用TaqMan^TM探针的定量实时PCR法将是方便和有利的。

用于检测(包括定量检测)标准植物样品的引物优选为从标准植物样品引发特异性DNA扩增的引物。此外，优选的是满足以下要求的引物：在对从修正样品中提取的基因组DNA进行的定量PCR法中，来自标准植物的DNA拷贝数与来自特定植物属的DNA拷贝数几乎无差异，所述修正样品中以预定比率混合了待检特定植物属的样品和标准植物样品；和两个拷贝数间的差异在100倍以内，优选在10倍以内。这是因为上述Lo/Fo比率是稳定的。

例如，在用补血草作为标准植物样品时，对于补血草可使用的引物由源自补血草ITS-1序列部分的以下序列组成：

5’-TTG GAC GTG TAT CCC TTG TGG TTC-3’(SEQ ID NO：57)；

和

5’-CAC GAA GGT GAA AGT TGC GTT CAT-3’(SEQ ID NO：58)。

如上述，任何一个能够与已经杂交于各扩增靶序列的PCR引物的部位的内部区域杂交的探针均可用作检测补血草的TaqMan探针。例如，具有衍生自ITS-1序列的一部分的以下序列的探针

5’-TGT GCG ACG CGG AAT G-3’(SEQ ID NO：59)

可以用荧光染料标记并用作TaqMan探针。

借助定量实时PCR法，根据标准曲线计算修正样品和测试样品的来自标准植物的DNA拷贝数与来自待检特定植物属的DNA拷贝数。

本领域技术人员易于用各种方法生成标准曲线。标准曲线可以通过利用长度已知的DNA作模板实施定量PCR法来产生，包括通过定量PCR法对标准植物样品和来自待检特定植物属的样品扩增靶序列。

此外，通过构建一个含有通过对标准植物样品和来自待检特定植物属的样品进行定量PCR法获得的扩增靶序列的标准曲线的质粒、并用该质粒作为模板可以产生具有更高可重复性和更少错误的标准曲线。将含有来自待检特定植物属的样品的扩增靶序列的DNA和含有来自标准植物样品的扩增靶序列的DNA插入到一个质粒载体中从而构建一个标准曲线的质粒。该质粒可以在大肠杆菌(E.coli)等中扩增，由此获得标准曲线的模板。

例如，经定量PCR法对标准植物样品和来自待检特定植物属的样品产生的扩增靶序列可以利用Jayaraman K.等人(1992.BioTechniques12：392-398)的采用外部和桥连引物的方法连接。

可以将标准植物样品和来自待检特定植物属的样品的扩增靶序列整合进一个质粒，由此减少由于稀释而产生的两条序列的浓度错误。或者，通过利用短质粒DNA分子，也可以减少由于稀释产生的错误。

由于所使用的标准曲线的模板具有已知的碱基长度，因此可以根据重量浓度和碱基长度来确定标准曲线模板溶液中所含的拷贝数。根据该拷贝数，计算测试样品中所含的拷贝数。

本发明的这样一种定量PCR检测法的概念可应用于待检特定成分源自动物的情况(比如家畜产品)以及待检特定成分源自微生物的情况。当待检特定成分源自动物时(比如家畜产品)，优选应当使用源自动物的成分作为标准样品。或者，当待检特定成分源自微生物时，优选应当使用源自微生物的成分作为标准样品。

本说明书包括日本专利申请第2003-139513号的说明书和/或附图中所述的内容，本申请要求了该专利申请的优先权。

附图简述

附图1A是检测Shirahana荞麦的PCR灵敏度的结果。PCR后，将所得PCR反应液进行2％琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙啶染色和用荧光图像分析仪进行分析；

附图1B是检测Dattan荞麦的PCR灵敏度的结果。PCR后，将所得PCR反应液进行2％琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙啶染色和用荧光图像分析仪进行分析；

附图2是检测荞麦PCR特异性的结果。PCR后，将所得PCR反应液进行2％琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙啶染色和用荧光图像分析仪进行分析；

附图3是检查其它植物种子的补血草PCR特异性的结果。PCR后，将所得PCR反应液进行2％琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙啶染色和用荧光图像分析仪进行分析；

附图4为检查各种食物成分的补血草PCR特异性的结果。PCR后，将所得PCR反应液进行2％琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙啶染色和用荧光图像分析仪进行分析；

附图5A是对荞麦DNA实施定量PCR法的结果。对500pg荞麦DNA和小麦、花生、大豆、玉米、芥末、胡椒和水稻DNA各50ng实施了定量PCR法。然而，在定量检测区域中未检测到除荞麦外的成分。因此，证实了只有荞麦可以被特异性地定量；

附图5B是对荞麦DNA实施定量PCR法的结果。尽管对500pg荞麦DNA和50ng补血草DNA实施了定量PCR法，但证实了在定量检测区域中未能检测到补血草；

附图6是对荞麦DNA实施定量PCR法的结果。对黑旋花属野草DNA实施了定量PCR法。甚至使用了50ng黑旋花属野草DNA作为模板，但其扩增率显著慢于用10拷贝的标准曲线质粒作为模板的扩增率，且扩增信号也没有达到阈值。在定量检测区域中未检测到黑旋花属野草。如此证实了只有荞麦能够被特异性地定量；

附图7是用标准曲线质粒对荞麦DNA实施定量PCR法的结果；

附图8是获自附图7所示结果的图；

附图9是对补血草DNA实施定量PCR法的结果。对500pg作为模板的补血草DNA实施PCR。尽管对小麦、花生、大豆、玉米、芥末、胡椒、水稻、黑旋花属野草DNA各50ng实施了定量PCR法，但在检测区域中均未检测到。由此证实了只有补血草可以被特异性地定量；

附图10是用标准曲线质粒对补血草DNA实施定量PCR法的结果；

附图11是获自附图10所示结果的图；

附图12为检查各种食物成分的花生PCR的特异性的结果。PCR后，将所得PCR反应液进行2％琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙啶染色和用荧光图像分析仪进行分析；

附图13对花生DNA实施定量PCR法的结果。对500fg花生DNA和小麦、荞麦、大豆、玉米、苹果、小豆(adzuki bean)和补血草DNA各50ng实施了定量PCR。然而，在定量检测区域中未检测到除花生外的成分。如此证实了，只有花生可以被特异性地定量；

附图14是用花生DNA对花生DNA进行定量PCR法的结果；和

附图15是获自附图14所示结果的图。

实施本发明的最佳方式

下文中，参照实施例，本发明将得到更具体的描述。

实施例1

A.DNA提取中所使用的植物样品

(1)荞麦种子：

使用了来自Takano的Shirahana荞麦(普通荞麦；荞麦，二倍体)和Dattan荞麦(tatary荞麦；苦荞麦，二倍体)种子。

(2)小麦、花生、大豆、玉米、芥末和补血草种子，以及白胡椒和水稻(糙米)：

使用了可商业获得的产品。

(3)小麦、大豆、玉米、芥末和黑旋花属野草叶子：

使用了从可商业获得的种子萌发的叶子。

B.DNA提取

(1)从荞麦种子和白胡椒提取DNA

参照QIAGEN Genomic DNA Handbook and User-DevelopedProtocol：Isolation of genomic DNA from plants using the QIAGENGenomic-tip，根据以下程序用QIAGEN生产的Genomic-tip进行DNA提取。

在15-ml的管中，加入1g粉碎的样品，添加4ml Carlson裂解缓冲液(0.1M Tris-HCl(pH9.5)、2％ CTAB、1.4M聚乙二醇#6000和20mM EDTA)、8μl RNA酶A(100mg/ml)、10μl 2-巯基乙醇和80μl蛋白酶K(20mg/ml)并混合，之后于74℃温育20分钟。恢复至室温后，向所得混合物中加入5ml苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)并充分混合。之后通过离心从其收集含水层。向该含水层中补充相同量的氯仿:异戊醇(24:1)并充分混合。之后通过离心从其收集含水层。再次向含水层中加入等量氯仿:异戊醇(24:1)并混合后，通过离心从其收集含水层。

从所得含水层取出1/2等分试样，并将其进行异丙醇沉淀从而收集所得沉淀物。将该沉淀物溶解于500μl缓冲液QBT中并加入到经1ml缓冲液QBT平衡的Genomic-tip 20/G柱中，随后DNA被柱吸附。随后，用5ml缓冲液QBT以及随后用2ml缓冲液QC洗涤该柱。最后，将经过1.7ml缓冲液QF洗脱和异丙醇沉淀收集得到的沉淀物溶解于40μl无菌超纯水。测量所得溶液中的DNA浓度，并将经过无菌超纯水适当稀释的DNA溶液用作PCR的模板DNA样品。

(2)从小麦、大豆、玉米、芥末和补血草种子以及水稻(糙米)提取DNA

参照DNeasy Plant Maxi试剂盒手册，根据以下程序用QIAGEN生产的DNeasy Plant Maxi试剂盒进行DNA提取。

在15-ml的管中，加入2g粉碎的样品，添加10ml缓冲液AP1和20μl RNA酶A(100mg/ml)并混合。将所得混合物于65℃温育15分钟，之后在约3000 × g下离心10分钟。将所得上清液的4-ml等分试样收集到15-ml的管中，依次向其中加入1.8ml缓冲液AP2。将所得混合物置于冰上10分钟，并在约3000 × g下离心10分钟。将所得上清液加到QIAshredder Spin柱上，并在约3000×g下离心5分钟。将5-ml等分试样的所得流通液收集到50-ml管中，向其中依次加入7.5ml缓冲液AP3/E并混合。将所得混合物加入到DNeasySpin柱上，并在约3,000 × g下离心5分钟以使DNA吸附到柱上。然后，向柱中添加12ml缓冲液AW，并在约3,000 × g下离心5分钟，之后洗涤该柱。再向其中添加12ml缓冲液AW并在约3000×g下离心10分钟，之后洗涤该柱。最后，向柱中添加1ml于65℃预温育的缓冲液AE并放置10分钟。之后将柱在约3000×g下离心5分钟并将DNA从柱中洗脱。测量所得溶液中的DNA浓度，并将经过无菌超纯水适当稀释的DNA溶液用作PCR的模板DNA样品。

(3)从花生种子提取DNA：

参照QIAGEN Genomic DNA Handbook和NucleoSpin Extract 2in 1 For Direct Purification of PCR Products，根据以下程序组合使用由QIAGEN生产的DNeasy Plant Maxi试剂盒和由MACHEREY-NAGEL生产的NucleoSpin Extract2in1进行DNA提取。

在15-ml管中，加入1g粉碎的样品，添加10ml缓冲液G2、100μl蛋白酶K(20mg/ml)和10μl RNA酶A(100mg/ml)并混合，之后于50℃温育1小时。将所得混合物在约3,000×g下离心10分钟以得到其上清液。将所得上清液加入到经1ml缓冲液QBT平衡过的Genomic-tip 20/G柱上，随后DNA被该柱吸附。然后，用4ml缓冲液QC洗涤柱。然后用1ml预热至50℃的缓冲液QF将DNA洗脱。向所得洗脱液中加入4体积的缓冲液NT2并混合。然后，将650-μl/运行的所得混合液加入到两个NucleoSpin提取柱中，并在约6,000×g下离心1分钟以使DNA吸附到柱上。重复该步骤直到全部量的混合液都被处理过。然后，向柱中加入600μl缓冲液NT3，并在约6,000×g下离心1分钟，之后洗涤柱。再向其中添加600μl缓冲液NT3，并以最大速度离心1分钟以完全除去保留在柱中的缓冲液NT3。最后，向柱中加入100μl缓冲液NE，并在最大速度下离心1分钟以使DNA从柱上洗脱。把从异丙醇沉淀收集得到的沉淀物溶解于50μl无菌超纯水中。测量所得溶液中的DNA浓度，并将经过无菌超纯水适当稀释的DNA溶液用作PCR的模板DNA样品。

(4)从小麦、大豆、玉米、芥末和黑旋花属野草叶子中提取DNA：

利用由QIAGEN生产的DNeasy Plant Mini试剂盒，参照DNeasyPlant Mini试剂盒手册，根据以下程序进行DNA提取。

在15-ml管中，加入0.5g粉碎的样品，添加3ml缓冲液AP1和30μlRNA酶A(100mg/ml)并混合，之后于65℃温育15分钟。向该混合物中添加975μl缓冲液AP2并置于冰上10分钟。将混合物离心以获得其上清液。将所得上清液加入到QIAshredder Spin柱中，依次离心以从柱中获得流通液。向该流通液中加入0.5体积的缓冲液AP3和1体积的乙醇并混合。然后，将650-μl/运行的所得混合液加到两个DNeasy Spin柱中，并在约6,000×g下离心约1分钟以使DNA吸附到柱上。重复该步骤直到全部量的混合液都被处理过。然后，向柱中加入500μl缓冲液AW，并在约6,000×g下离心1分钟，之后洗涤柱。再向其中添加500μl缓冲液AW，并以最大速度离心1分钟以完全除去保留在柱中的缓冲液AW。最后，向柱中加入120μl预热至65℃的缓冲液AE，并在约6,000×g下离心1分钟以使DNA从柱上洗脱。测量所得溶液中的DNA浓度，并将经过无菌超纯水适当稀释的DNA溶液用作PCR的模板DNA样品。

C.检测荞麦ITS-1-5.8S rRNA基因序列的部分的PCR

(1)用于检测荞麦属的引物：

用通用于以下在GenBank中登记属于荞麦属植物的21条序列的ITS-1-5.8S rRNA基因序列的序列作为引物序列：

1：硬枝荞麦(Fagopyrum urophyllum)(AB000342)

2：硬枝荞麦(AB000341)

3：苦荞麦(亚种：potanini)(AB000340)

4：苦荞麦(AB000339)

5：长柄野荞麦(Fagopyrum statice)(AB000338)

6：长柄野荞麦(AB000337)

7：Fagopyrum pleioramosum(AB000336)

8：线叶野荞麦(Fagopyrum lineare)(AB000335)

9：小野荞麦(Fagopyrum leptopodum)(AB000334)

10：Fagopyrum homotropicum(AB000333)

11：细柄野荞麦(Fagopyrum gracilipes)(AB000332)

12：Fagopyrum esculentum ancestralis(AB000331)

13：荞麦(AB000330)

14：金荞麦(AB000329)

15：金荞麦(AB000328)

16：金荞麦(AB000327)

17：金荞麦(AB000326)

18：金荞麦(AB000325)

19：金荞麦(AB000324)

20：Fagopyrum capillatum(AB000323)

21：Fagopyrum callianthum(AB000322)

然后，合成具有以下序列的寡核苷酸(oligo)DNA引物(由QIAGEN生产，OPC-纯化的寡核苷酸)，并用作检测荞麦ITS-1-5.8SrRNA基因序列的部分的PCR引物(下文中称作荞麦PCR)：

5’-CGC CAA GGA CCA CGA ACA GAA G-3’(SEQ ID NO：14)；

和

5’-CGT TGC CGA GAG TCG TTC TGT TT-3’(SEQ ID NO：15)。

(2)用于检测荞麦属的引物的特异性(PCR模拟)：

用PCR模拟软件Amplify1.0(Bill Engels)来证实模拟结果是否显示用检测荞麦的引物获得了PCR扩增产物，所述模拟根据属于荞麦属的植物的21条序列、8条除荞麦外的有可能成为变应原的植物的序列(花生、小麦、大豆、胡桃、日本松蕈(matsutake mushroom)、桃、苹果和桔子)、4条常用作食物成分的植物的序列(玉米、水稻、胡椒和芥末)和27条与荞麦相关的植物物种的序列。本文中所使用的荞麦相关植物物种是指，当用Genbank中登记的普通荞麦，即荞麦的核苷酸序列(AB000330)中的ITS-1序列部分进行BLAST同源性检索时，达到60分数命中(Score60bits)或更高的除荞麦属之外的植物。此处，选择各植物所属的某一属中达到最高分数的物种的序列作为该属的代表性序列。对该序列的ITS-1-5.8S rRNA基因-ITS-2序列区域进行PCR模拟。模拟中所使用序列的GenBank登记号和模拟结果示于表1A至1C。表1A至1C中的缩写字母和符号如下所示：

实心星形：预计产生具有靶大小左右大小(±10bp)的PCR扩增产物的那些

W值：产生PCR扩增产物的可能性

高可能性...W6>W5>W4>W3>W2...低可能性

数值(bp)：PCR扩增产物的大小(bp)

从扩增中获得的值减去2的值

-：预计不产生PCR扩增产物的那些

[表1A]

[表1B]

[表1C]

如表1A至1C中所示的，从模拟结果预期，从属于荞麦属的植物的21条序列可获得具有101bp靶大小的PCR扩增产物。此外还预期，从8条除荞麦外的有可能成为变应原的植物的序列(花生、小麦、大豆、胡桃、日本松蕈、桃、苹果和桔子)、4条常用作食物成分的植物的序列(玉米、水稻、胡椒和芥末)和27条与荞麦相关的植物物种的序列未能得到具有靶大小的PCR扩增产物以及非特异性PCR扩增产物。

(3)荞麦PCR：

根据以下程序，用QIAGEN生产的HotStarTaq Master Mix试剂盒进行荞麦PCR。

将SEQ ID NO：14和15(各终浓度为0.5μM)的引物和模板DNA加入到12.5μl 2×HotStartTaq Master Mix(HotStar Taq DNA聚合酶，含有3mM MgCl₂的PCR缓冲液，和dNTP各400μM)中，用无菌超纯水调节其终体积至25μl形成反应液，依次将其置于0.2-ml微管中、并根据以下PCR步骤用由Applied Biosystems生产的热循环仪GeneAmp PCR System 9600进行反应：95℃下酶活化15分钟；95℃变性1分钟，66℃退火2分钟，72℃延伸1分钟，进行45个循环；和最后于72℃延伸4分钟。将所得PCR反应液在含有溴化乙啶的2％琼脂糖凝胶上跑电泳，并用由Amersham Biosciences生产的荧光图像分析仪FluorImager 595进行分析。结果示于附图1A、1B和2。附图1A、1B、和2中的缩写字母和符号如下所示：

M：100-bp DNA序列梯标记

(-)：未添加模板DNA

数字：所添加的模板DNA量

箭标：PCR扩增产物靶带(约101bp)

通过使用用于扩增植物叶绿体DNA的部分的引物获得PCR扩增产物证实了，所提取的植物DNA的纯度水平可以进行PCR扩增(数据未显示)。

(4)荞麦PCR的灵敏度和特异性：

荞麦的PCR结果是，从500至50fg的Shirahana荞麦(普通荞麦)和Dattan荞麦DNA获得了从荞麦靶ITS-1-5.8S rRNA基因序列预期的约101bp大小的PCR扩增产物，如附图1A和1B所示。可以检测到500至50fg荞麦DNA的灵敏度相当于如下灵敏度水平：当以50ng提取自特定样品的DNA作为模板进行PCR时，可以检测到样品DNA中所含的10至1ppm荞麦DNA。

荞麦的PCR结果是，从小麦叶、花生种子、大豆叶、玉米叶、芥末叶和白胡椒以及水稻DNA各50ng未获得具有靶大小的PCR扩增产物和非特异性PCR扩增产物，如附图2所示。类似地，还证实了从鲑精DNA也未获得PCR扩增产物(数据未显示)。如附图2所示，尽管从50至5ng黑旋花属野草(一个荞麦相关物种)的叶片DNA获得了一条具有靶大小但条带模糊的PCR扩增产物，但从500pg或更少的该DNA却未得到具有靶大小的PCR扩增产物和非特异性PCR扩增产物。不会将500pg或更低的黑旋花属野草DNA检测为假阳性的特异性相当于如下特异性水平：当以50ng提取自特定样品的DNA作为模板进行PCR时，不会将1％或更低的黑旋花属野草DNA(如果存在的话)检测为假阳性。此外，还存在这样的可能性，即PCR条件的改变会导致甚至从50至5ng黑旋花属野草DNA也不产生具有靶大小的扩增产物。

(5)荞麦PCR扩增产物的核苷酸序列分析：

用SEQ ID NO：14和15的引物通过双链直接测序分析由此获得的Shirahana荞麦DNA-衍生的PCR扩增产物的核苷酸序列。将所得核苷酸序列与GenBank中登记的普通荞麦，即荞麦的核苷酸序列(AB000330)进行比较，以证实Shirahana荞麦DNA-衍生的PCR扩增产物的核苷酸序列与GenBank中登记的普通荞麦(荞麦)核苷酸序列(AB000330)的靶位点100％匹配。这证明了，利用引物进行的PCR扩增出并检测到了荞麦ITS-1-5.8S rRNA基因序列的一部分。

这些结果显示，利用引物进行的荞麦PCR能够，以高灵敏度和特异性，检测荞麦属普通植物的ITS-1-5.8S rRNA基因序列。我们决定在对荞麦ITS-1-5.8S rRNA基因序列拷贝数进行定量的PCR(下文中称作，对荞麦序列的定量PCR法)中使用该引物。

D.检测补血草ITS-1序列部分的PCR(用于修正)

以下，调查了经PCR对修正中所使用的标准植物样品的检测。

在本实施例中，用补血草作标准植物样品，补血草是一种未在日本The Weed Science Society所述的高地野草中列出的种子植物，其种子易于获得。

(1)用于检测补血草的引物：

根据Genebank中登记的补血草DNA序列(AJ222860)，设计了用于检测补血草ITS-1序列中一部分的PCR(下文中称作补血草PCR)的具有以下序列的引物，以合成寡核苷酸DNA引物(由QIAGEN生产，OPC-纯化的寡核苷酸)：

5’-TTG GAC GTG TAT CCC TTG TGG TTC-3’(SEQ ID NO：57)；

和

5’-CAC GAA GGT GAA AGT TGC GTT CAT-3’(SEQ ID NO：58)。

(2)补血草PCR：

除上述引物各使用0.2μM的终浓度外，基本上以与上述实施例1.C.(3)相同的方式进行补血草PCR。结果示于附图3和4。

通过使用用于扩增一部分植物叶绿体DNA的引物获得PCR扩增产物证实了，所提取的植物DNA的纯度水平可以进行PCR扩增(数据未显示)。

(3)补血草PCR的特异性：

补血草的PCR结果是，从50ng补血草种子DNA获得了从补血草靶ITS-1序列预期的约101bp大小的PCR扩增产物，如附图3所示。此外，从Shirahana荞麦种子、Dattan荞麦种子、小麦种子、花生种子、大豆种子、玉米种子、芥末种子、白胡椒、水稻和黑旋花属野草叶片DNA各50ng未获得具有靶大小的PCR扩增产物和非特异性PCR扩增产物，如附图3所示。类似地，还证实了从鲑精DNA也未获得PCR扩增产物(数据未显示)。

由此推测用于检测补血草DNA的引物具有对补血草DNA的特异性。

(4)评估食物成分中是否存在补血草污染：

以下验证了补血草是否适于用作标准植物样品。也即，为证实补血草不污染食物或食物成分，进行了补血草PCR。

补血草PCR的结果是，从5种类型的小麦、5种类型的玉米粉和3种类型的芥末种子DNA各50ng未得到具有靶大小的PCR扩增产物和非特异性PCR扩增产物，如附图4所示。

(5)评估补血草中是否存在荞麦污染：

进行了如下述建立的荞麦序列定量PCR法以验证荞麦是否污染了补血草种子样品。对荞麦序列定量PCR法的结果是，经证实，从补血草种子DNA未发现指示扩增的荧光信号，以及未观察到污染(数据未显示)。

(6)对补血草PCR扩增产物的核苷酸序列分析：

用SEQ ID NO：57和58的引物经双链直接测序分析所获得的源自补血草DNA的PCR扩增产物的核苷酸序列。将所得核苷酸序列与GenBank中登记的补血草(Limonium sinuatum)的核苷酸序列(AJ222860)进行比较，以证实源自补血草DNA的PCR扩增产物的核苷酸序列与GenBank中登记的补血草(Limonium sinuatum)核苷酸序列(AJ222860)的靶位点100％匹配。可以证实，补血草PCR扩增出并检测到了补血草靶ITS-1序列的一部分。

这些结果暗示，补血草和食物成分间并没有相互污染，且补血草适于用作用于修正的标准植物样品。由此我们决定在对补血草ITS-1序列拷贝数进行定量的PCR(下文中称作，对补血草序列的定量PCR法)中使用SEQ ID NO：57和58的引物。

E.构建定量分析中所使用的标准曲线的质粒

(1)对荞麦PCR和补血草PCR靶DNA序列的连接PCR和对连接PCR扩增产物的核苷酸序列分析

将荞麦靶扩增产物和补血草靶扩增产物经PCR法连接并导入TA克隆载体。将TA克隆载体导入大肠杆菌并扩增，由此构建了用于定量分析荞麦和补血草拷贝数的标准曲线的质粒。

首先，合成了具有以下序列的寡核苷酸DNA引物(QIAGEN生产，OPC-纯化的寡核苷酸)并将其用作引物。这些引物包含上述荞麦PCR和补血草PCR中所使用的荞麦和补血草引物位点。

5’-TCT AGA CGC CAA GGA CCA CGA ACA GAA G-3’(SEQ IDNO：60)

5’-CAA AAG CTT CGT TGC CGA GAG TCG TTC TGT TT-3’(SEQID NO：61)

5’-ACG AAG CTT TTG GAC GTG TAT CCC TTG TGG TTC-3’(SEQ ID NO：62)

5’-GGATCC CAC GAA GGT GAA AGTTGC GTTCAT-3’(SEQ IDNO：63)。

参照Jayaraman K.等人的方法根据下述程序用QIAGEN生产的HotStarTaq Master Mix试剂盒构建了一个连接质粒(1992.A PCR-Mediated Gene Synthesis Strategy Involving the Assembly ofOligonucleotides Representing Only One of the Strands，BioTechniques 12：392-398)。

向25μl 2×HotStartTaq Master Mix(HotStar Taq DNA聚合酶，含有3mM MgCl₂的PCR缓冲液，和dNTP各400μM)中添加dNTP(终浓度500μM)，加入SEQ ID NO：60和63(各1.0μM终浓度)的引物作为外部引物、SEQ ID NO：61和62(各25nM终浓度)的引物作为桥连引物。加入实施例1.C.(4)中获得的带有荞麦PCR靶DNA序列的PCR扩增产物和实施例1.D.(3)中获得的带有补血草PCR靶DNA序列的PCR扩增产物作为模板DNA。用无菌超纯水将终体积调至50μl形成反应液，将其依次置于0.2-ml微管中、并根据以下PCR步骤用MJ Research生产的热循环仪PTC-200 DNAEngine进行反应：95℃下酶活化15分钟；95℃变性1分钟，40℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，进行15个循环；95℃变性1分钟，66℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，进行30个循环。将所得PCR反应液在含有溴化乙啶的2％琼脂糖凝胶上跑电泳，并用由AmershamBiosciences生产的荧光图像分析仪FluorImager 595进行分析。用SEQ ID NO：60和63的引物经双链直接测序分析所得PCR扩增产物的核苷酸序列。

连接PCR的结果是，获得了具有预期约200bp大小的PCR扩增产物(数据未显示)。核苷酸序列分析的结果证实，该PCR扩增产物含有荞麦PCR和补血草PCR的靶DNA序列(数据未显示)。

(2)将连接PCR扩增产物插入质粒中并对所插入的DNA片段进行核苷酸序列分析：

用pGEM-T Easy Vector System(Promega生产)，将由此获得的PCR扩增产物TA-克隆进pGEM-T Easy Vector中，然后用该载体转化大肠杆菌(E.coli JM109(DH5α))。在LB培养基中液体培养带有约220-bp插入片段转化体，所述插入片段经菌落PCR和核苷酸序列分析可以证实包含荞麦PCR和补血草PCR的靶DNA序列。用QIAGEN生产的QIAGEN Hi Speed Plasmid Midi试剂盒提取和纯化来自所得培养物的质粒。用质粒上序列的引物经双链测序分析纯化的质粒中所插入的DNA片段的核苷酸序列。结果证实，正如所期望的，转化体质粒中所插入的DNA片段核苷酸序列含有荞麦PCR和补血草PCR的靶DNA序列(数据未显示)。

(3)制备标准曲线的质粒的稀释系列：

根据上述提取和纯化的质粒的质粒长度和吸收(Abs.260nm)计算质粒分子数目(拷贝数)。用5ng/μl鲑精DNA(Wako PureChemical Industries生产，来自鲑鱼睾丸的溶解于无菌超纯水的纤维状脱氧核糖核酸钠)稀释该质粒，以制备10⁹至10¹拷贝/2.5μl的标准曲线的质粒稀释系列。我们决定在对荞麦和补血草序列的定量PCR法中使用该稀释系列生成标准曲线。

F.定量荞麦序列拷贝数的PCR

(1)用于检测荞麦序列的TaqMan MGB探针：

合成具有以下序列的TaqMan MGB探针(Applied Biosystems日本生产的，报道分子染料FAM)，并将其用作检测荞麦序列的探针。用GenBank中登记为荞麦属植物ITS-1-5.8S rRNA基因序列的21条序列的通用序列作为探针序列。

5’-CGG GAC GCG CTT C-3’(SEQ ID NO：64)

(2)荞麦序列的定量PCR法：

根据以下程序用QIAGEN生产的QuantiTect Probe PCR试剂盒进行对荞麦序列的定量PCR法。

将SEQ ID NO：14和15的引物(终浓度各为0.2μM)、SEQ IDNO：64的TaqMan MGB探针(终浓度0.2μM)和模板DNA加入到12.5μl 2×QuantiTect Probe PCR Master Mix中。用无菌超纯水将终体积调至25μl得到溶液，依次将该溶液分配到96孔PCR板中。对于标准曲线，分配的是补充有标准曲线的质粒DNA稀释系列的溶液而非模板DNA。将其中分配了各溶液的96孔PCR板置于AppliedBiosystems生产的实时PCR仪Sequence Detection System 7700中，溶液在里面根据以下PCR步骤发生反应：50℃ 2分钟；95℃ 15分钟；和95℃变性1分钟，66℃退火2分钟，和72℃延伸1分钟，进行45个循环。用一式两份样品进行各反应(在2孔中)。反应结束后，分析延伸步骤中取得的荧光数据。首先将基线设定为0至1循环，然后在证实荧光升高的循环开始出现之前将其适当地设定在一个范围内。根据Kuribara H等人，2002，Novel Reference Molecules forQuantitation of Genetically Modified Maize and Soybean，JournalAOAC International 85：1077-1089中所述的方法设定阈值。结果示于附图5A、5B、6、7和8。

通过使用用于扩增一部分植物叶绿体DNA的引物成功获得PCR扩增产物证实了，所提取的植物DNA的纯度水平可以进行PCR扩增(数据未显示)。

(3)对荞麦序列定量PCR法的特异性：

对荞麦序列定量PCR法的结果是，从Shirahana荞麦种子DNA得到了指示扩增的荧光信号，如附图5A和5B所示。另一方面，从小麦叶片、花生种子、大豆叶片、玉米叶片、芥末叶片、白芥末、水稻和补血草种子DNA各50ng未观察到指示扩增的荧光信号。类似地，在鲑精DNA中未观察到指示扩增的荧光信号(数据未显示)。尽管如附图6所示在50ng黑旋花属野草叶片DNA中观察到了微弱的扩增信号，但其出现在晚于10拷贝标准曲线阈值循环的阈值循环(Ct值)处、并且未达到阈值线。

该特异性相当于如下特异性水平：当以50ng提取自补加有补血草的特定样品的DNA作为模板进行PCR时，该样品不会被定量为假阳性，即使该样品是一种百分之百不可食用的野草物种——黑旋花属野草(荞麦的相关物种)。

(4)对荞麦序列定量PCR法的定量性质和灵敏度：

对荞麦序列定量PCR法的结果是，可以证实定量性质和灵敏度，在所述定量性质和灵敏度用10⁸至10¹拷贝的标准曲线质粒能够画出相关系数为0.999且斜率为的-3.504的标准曲线，如附图7和8所示。获得指示扩增的荧光信号的灵敏度也可以从50 fg Shirahana荞麦DNA发现。此外，在作出5ng至50 fg Shirahana荞麦DNA的Ct值图时，在该范围内还可证实能画出相关线性曲线的定量性质(数据未显示)。

这些结果证明，同时使用SEQ ID NO：14和15引物和SEQ IDNO：64探针的对荞麦序列的定量PCR法能够以高灵敏度和特异性检测荞麦属普通植物的ITS-1-5.8S rRNA基因序列并定量其拷贝数。我们决定在对污染荞麦量的测量中组合使用对荞麦序列的定量PCR法和以下所示的用于修正的对补血草序列的定量PCR法。

G.定量补血草序列拷贝数的PCR

(1)用于检测补血草序列的TaqMan MGB探针：

合成具有以下序列的TaqMan MGB探针(Applied Biosystems日本生产的，报道分子染料FAM)，并将其用作检测补血草序列的探针。

5’-TGT GCG ACG CGG AAT G-3’(SEQ ID NO：59)

(2)对补血草序列的定量PCR法和分析：

除了SEQ ID NO：57和58的引物各以终浓度0.2μM使用，且SEQ ID NO：59的TaqMan MGB探针以终浓度0.2μM使用之外，以与实施例1.F.(2)基本相同的方式进行对补血草序列定量PCR法。结果示于附图9、10和11。

(3)对补血草序列定量PCR法的特异性：

对补血草序列定量PCR法的结果是，从补血草种子DNA发现了指示扩增的荧光信号，如附图9所示。另一方面，从Shirahana荞麦种子、Dattan荞麦种子、小麦种子、花生种子、大豆种子、玉米种子、芥末种子、白芥末、水稻和黑旋花属野草叶片DNA各50ng未观察到指示扩增的荧光信号。类似地，在鲑精DNA中未观察到指示扩增的荧光信号(数据未显示)。

(4)对补血草序列定量PCR法的定量性质：

对补血草序列定量PCR法的结果是，证实了定量性质，在所述定量性质用10⁸至10¹拷贝的标准曲线质粒能够画出相关系数为0.999且斜率为的-3.386的标准曲线，如附图10和11所示。

这些结果证明，同时使用SEQ ID NO：57和58引物和SEQ IDNO：59探针的对补血草序列的定量PCR法能够特异性地检测补血草的ITS-1序列并定量其拷贝数。我们决定在对污染荞麦量的测量中组合使用用于修正的对补血草序列的定量PCR法和实施例1.F中所示的对荞麦序列的定量PCR法。

实施例2

A.用作标准的补血草，多种荞麦粉样品，和制备人工污染样品中所使用的荞麦、水稻和小麦

(1)补血草：

使用了Sakata Seed Corporation出售的切割花(cut flower)的Excellent Light Blue(单个批次)。

(2)荞麦：

使用了Takano Co.，Ltd出售的Shirahana荞麦(普通荞麦；荞麦，二倍体)荞麦粉、Dattan荞麦(苦荞麦，二倍体)荞麦粉、TakaneRuby(荞麦，二倍体)荞麦粉和Great Ruby(荞麦，四倍体)荞麦粉。在制备人工污染样品时使用了Shirahana荞麦粉。

(3)小麦：

使用了商业购买的Norin 61。

(4)水稻：

使用了商业购买的无化学药剂Akita Komachi糙米。

B.用作标准的补血草和制备人工污染样品时所使用的水稻和小麦的粉碎和DNA提取

(1)粉碎：

用装有转子(用不锈钢制造，24-边)和筛子(用不锈钢制造，0.20mm)的Ultra Centrifugal Mill ZM1(由Retsch生产的)进行粉碎。

(2)洗涤粉碎机

在粉碎样品之前和之后，用水洗涤粉碎机的各部分，比如盛样品的容器、样品盖、转子、筛子、扣件和夹具，浸入10％漂白液中，用水洗涤，并使之干燥。粉碎机的主体部分用气枪清洗和擦拭，然后使用。

(3)用荞麦和补血草验证粉碎机未受污染：

大量粉碎样品前，先取其部分或者用未受荞麦和补血草污染的商购的带有玉米外壳的冻干玉米进行粉碎。之后从其提取DNA，以通过如实施例1.F和实施例1.G所示的对荞麦序列和补血草序列的定量PCR法验证从50ng模板DNA是否存在指示扩增的荧光信号。若未观察到荧光信号，则将该粉碎机评定为未受污染，并继续进行下述的样品大量粉碎工作。若观察到了荧光信号，则将该粉碎机评定为受到污染。此时，再次洗涤粉碎机，并在该粉碎机中粉碎已被证实未受荞麦和补血草污染的糙米(1kg)。洗涤粉碎机和更换新筛子后，再次粉碎未受荞麦和补血草污染的商购的带有玉米外壳的冻干玉米，并以与上述相同的方式验证是否存在荧光信号。在可以评定该粉碎机未受荞麦和补血草污染后，继续进行下述的样品大量粉碎工作。

(4)大量粉碎补血草并验证不存在荞麦对粉碎的粉的污染：

在已经验证未受荞麦污染的粉碎机中，粉碎约1kg补血草。从粉碎的粉末取样十份2-g等分试样，并根据实施例1.B.(2)所述的方法用DNeasy Plant Maxi试剂盒从其提取DNA，以通过对荞麦序列的定量PCR法验证从50ng模板DNA不产生指示扩增的荧光信号(数据未显示)。用这些方法保证未受荞麦污染的补血草粉末。

(5)大量粉碎水稻和小麦并验证不存在荞麦和补血草对粉碎的粉的污染：

在已经验证未受荞麦和补血草污染的粉碎中，粉碎约500g水稻。从粉碎的粉末取样五份2-g等分试样，并根据实施例1.B.(2)所述的方法用DNeasy Plant Maxi试剂盒从其提取DNA，以通过对荞麦序列和补血草序列的定量PCR法验证从50ng模板DNA不产生指示扩增的荧光信号(数据未显示)。对小麦进行同样操作程序。用这些方法获得未受荞麦和补血草污染的水稻和小麦粉碎粉末。

C.制备人工污染的样品

(1)含荞麦粉的人工污染的水稻粉碎粉末：

制备了六个抗-静电OP袋(Fukusuke Kogyo生产，PZ型第6号(特别的抗-补血草处理)，可以用拉链再封闭，且三侧密封)，其中称量并放置了45.00g水稻粉碎粉末，并编号为1～6。在1号袋中，称量并放置了5.00g荞麦粉。将袋口封闭，用手使袋中的内容物混合15分钟，从而获得含有10％荞麦粉的水稻粉碎粉末。接下来，称量5.00g含有10％(100,000ppm)荞麦粉的该水稻粉末，并置于2号袋中。将袋口封闭，用手使袋中的内容物混合15分钟，从而获得含有1％(10,000ppm)荞麦粉的水稻粉碎粉末。重复这些稀释和混合步骤从而制备含有100,000至1ppm荞麦粉的水稻粉碎粉末。

(2)含有荞麦粉的人工污染小麦粉碎粉末样品：

以上述相同方式制备含有100,000至1ppm荞麦粉的小麦粉碎粉末。

(3)含有荞麦粉的人工污染水稻和小麦粉碎粉末样品：

在一个抗静电OP袋(Fukusuke Kogyo生产，PZ型第5号(特别的抗-补血草处理)，可以用拉链再封闭，且三侧密封)中称量并放置了12.5g含有10ppm荞麦粉的水稻粉碎粉末和12.5g含有10ppm荞麦粉的小麦粉碎粉末。将袋口封闭，用手使袋中的内容物混合15分钟，从而获得含有10ppm荞麦粉的水稻和小麦粉碎粉末。

D.根据DNA提取确定人工污染样品-取样规模

(1)Shirahana荞麦粉的颗粒大小分布测量：

假定荞麦粉为球形的，对于测定荞麦粉颗粒的大小，测量了Shirahana荞麦粉的颗粒大小分布(激光衍射/散射法，干燥处理，在0.5kg/cm²压力条件下)。该测定外包给了Seishin Enterprise Co.，Ltd.，Powder Technology Centre。结果是，Shirahana荞麦粉的颗粒大小(中值大小)(×50)为80.941μm。

(2)荞麦粉的体积密度测量：

为测定荞麦粉密度(包括颗粒间和颗粒内空隙和孔洞的密度)，对Shirahana荞麦粉进行了体积密度测量(汞(Hg)法：在该方法中，将荞麦粉置于具有固定容积的室中，然后向室中灌满水银)。该测量外包给了Seishin Enterprise Co.，Ltd.，Powder Technology Centre。结果，Shirahana荞麦粉的体积密度(Hg法)是1.181g/cm³。

荞麦粉所占体积＝(室的体积)-(所添加的水银的体积)荞麦粉体积密度(Hg法)＝(所加入的荞麦粉重量)/(荞麦粉所占体积)

(3)人工污染样品中荞麦粉颗粒数的试计算和确定取样规模：

从所测量的Shirahana荞麦粉值(颗粒大小为80.941μm，且密度为1.181g/cm³)计算出了每颗粒荞麦粉的重量，以试计算各种荞麦粉浓度的人工污染样品中的荞麦粉颗粒数。结果示于表2。该结果揭示，当定量中用于DNA提取的样品是从含有10ppm目的污染荞麦的人工污染样品取样时，在已经取样的样品中放置至少约100粒荞麦粉需要4g或更多的用于DNA提取的样品。我们决定取样5-g等分试样进行DNA提取。

[表2]

人工污染样品中的Shirahana荞麦粉颗粒数

100个颗粒或更多

E.从100％荞麦粉+补血草标准、和人工污染样品+补血草标准提取DNA

(1)各种荞麦粉样品：

从Shirahana荞麦粉取样了六个样品，从Takane Ruby荞麦粉、Great Ruby荞麦粉和Dattan荞麦粉各取样了三个样品。这些样品在DNA提取中使用。

(2)人工污染的样品：

从含有100ppm Shirahana荞麦粉的小麦粉碎粉末、含有10ppmShirahana荞麦粉的小麦粉碎粉末、含有10ppm Shirahana荞麦粉的水稻粉碎粉末和含有10ppm Shirahana荞麦粉的小麦和水稻粉碎粉末各取样了三个样品，并用于DNA提取。

(3)DNA提取：

参照QIAGEN Genomic DNA Handbook and User-DevelopedProtocol：Isolation of genomic DNA from plants using the QIAGENGenomic-tip，根据以下程序用QIAGEN生产的Genomic-tip提取DNA。

将5g样品和1g补血草粉碎粉末置于50-ml管中，并向管中添加30ml Carlson裂解缓冲液(0.1M Tris-HCl(pH9.5)、2％ CTAB、1.4M聚乙二醇#6000和20mM EDTA)、60μl RNA酶A(100mg/ml)、75μl2-巯基乙醇和600μl蛋白酶K(20mg/ml)。为进一步提高样品的分散度，向混合物中加入三个氧化锆球(Nikkato生产，YTZ球，φ7mm)，用摇动器(Iwaki Sangyo生产，KM Shaker V-DX)在Speed100处混合10分钟或更久直到团块消除，之后于74℃温育20分钟。在温育过程中，每五分钟手摇管并混合。

在3,000 x g离心10分钟后，将4ml所得上清液收集到一支15-ml的管中，并加入5ml苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)且充分混合。该混合物在3,000 x g离心10分钟后，将所得上清液(含水层)收集到一支15-ml的管中，并加入3.5ml氯仿:异戊醇(24:1)且充分混合。该混合物在3,000 x g离心10分钟后，将所得上清液(含水层)收集到一支15-ml的管中，并再次用氯仿:异戊醇(24:1)提取和离心以收集上清液(含水层)。把经异丙醇沉淀从上清液(含水层)的150-μl等分试样收集到的沉淀物溶解在100μl无菌超纯水中，并加入900μl缓冲液QBT。将所得溶液应用于经1ml缓冲液QBT平衡的Genomic-tip 20/G柱，随后DNA吸附到该柱上。然后，用4ml缓冲液QC洗涤该柱。最后把用1ml缓冲液QF洗脱DNA和异丙醇沉淀收集到的沉淀物溶解于40μl无菌超纯水中。测量所得溶液中的DNA浓度，用无菌超纯水适当稀释DNA溶液，并将其用作PCR的模板DNA样品。

F.计算从补加有补血草标准的100％荞麦粉提取的DNA中的 “补血草序列拷贝数/荞麦序列拷贝数的比率”

用实施例1.F.和实施例1.G中所述的方法进行对荞麦序列和补血草序列的定量PCR法。根据标准曲线，定量了从补加有补血草标准的100％荞麦粉提取的50ng DNA的荞麦序列拷贝数和补血草序列拷贝数。根据定量值，计算了“补血草序列拷贝数/荞麦序列拷贝数＝Lo/Fo比率”。通过同时测量2个孔中的相同样品以及从两个测量值获得比率平均值计算了各荞麦粉样品的Lo/Fo比率。

Lo/Fo比率测量的结果是，Shirahana荞麦粉(各在两个孔中一式两份测量的6个提取的样品)的Lo/Fo比率是2.36，Takane Ruby荞麦粉的是3.25，Great Ruby荞麦粉的是2.70，以及Dattan荞麦粉(各在两个孔中一式两份测量的3个提取的样品)的是4.75，如表3所示。我们决定用此处获得的Shirahana荞麦粉的Lo/Fo比率和实施例2.G中计算的人工污染样品的“荞麦序列拷贝数/补血草序列拷贝数＝Fs/Ls比率”来确定污染荞麦的量。多种荞麦粉样品在Lo/Fo比率测量中的原始数据示于表4A和4B。

[表3]

多种荞麦粉样品的Lo/Fo比率

[表4A]

Lo/Fo比率测量中多种荞麦粉样品的原始数据(第一次测量)

第一次测量中多种荞麦粉样品的原始数据

[表4A]

Lo/Fo比率测量中多种荞麦粉样品的原始数据(第一次测量)

[表4B]

Lo/Fo比率测量中多种荞麦粉样品的原始数据(第二次测量)

第二次测量中多种荞麦粉样品的原始数据

[表4B]

Lo/Fo比率测量中多种荞麦粉样品的原始数据(第二次测量)

Dattan荞麦粉的测量值偏离Shirahana荞麦粉的测量值最多，然而，它只是Shirahana荞麦粉测量值的两倍。由此认为本发明的方法作为定量PCR方法具有足够的准确性。

G.计算从补加有补血草标准的人工污染样品提取的DNA的“荞麦序列拷贝数/补血草序列拷贝数比率”和计算污染人工污染样品的荞麦量

用实施例1.F.和实施例1.G所述的方法进行对荞麦序列和补血草序列的定量PCR法。根据标准曲线，定量了50ng从补加有补血草标准的人工污染样品提取的DNA的荞麦序列拷贝数和补血草序列拷贝数。根据定量值计算了“荞麦序列拷贝数/补血草序列拷贝数＝Fs/Ls比率”。通过提取来自相同样品的三个样品，各样品在两个孔中进行测量，计算了人工污染样品的Fs/Ls比率。用此处计算出的Fs/Ls比率和实施例2.F中计算出的Lo/Fo比率根据以下方程测定了污染人工污染样品(1g)的荞麦量(μg)。

污染荞麦的量(ppm(μg/g))＝Fs/Ls×Lo/Fo×1,000,000

Fs/Ls比率测量的结果和污染荞麦量的计算结果是，在对含有100ppm Shirahana荞麦粉的小麦粉碎粉末、含有10ppm Shirahana荞麦粉的小麦粉碎粉末、含10ppm Shirahana荞麦粉的水稻粉碎粉末和含10ppm Shirahana荞麦粉的小麦和水稻粉碎粉末的两次测量的每一次中都能够得到合理的值，如表5所示。Fs/Ls比率测量中多种人工污染样品的原始数据示于6A和6B。

[表5]

人工污染样品中污染的荞麦量的测量结果总结(PCR)

人工污染样品中污染的荞麦量的测量结果

^＊从每一个人工污染样品提取3个样品，且以n＝2进行每一次测量。

^＊将从补充了1g补血草属(补血草)标准的5g人工污染样品提取的50ng DNA进行PCR。

^＊将Shirahana荞麦Lo/Fo值＝2.36用于计算人工污染样品中的荞麦粉浓度(ppm)。

^＊含有10ppm荞麦的水稻的No.1和No.3样品以参考值显示，因为它们落在定量补血草序列拷贝数的标准曲线范围之外。

[表6A]

污染的荞麦量的测量中多种人工污染样品的原始数据(第一次测量)

第一次测量中人工污染样品的原始数据

[表6A]

^＊含有10ppm荞麦的水稻的人工污染样品以参考值显示，因为补血草序列的拷贝数超过了标准曲线范围。

[表6B]

污染的荞麦量的测量中多种人工污染样品的原始数据(第二次测量)

第二次测量中人工污染样品的原始数据

[表6B]

实施例3

A.DNA提取中所使用的植物样品

(1)花生、荞麦(Shirahana荞麦)和补血草种子：

使用了与实施例1.A.(1)和实施例1.A.(2)中相同的种子。

(2)小麦、大豆和玉米叶片：

使用了与实施例1.A.(3)中相同的叶片。

(3)小豆、杏仁、胡桃、澳大利亚坚果、和榛实种子、松子、向日葵种子、罂粟种子、芝麻和苹果：

使用了商购的产品。

(4)荞麦(Shirahana荞麦)和小豆叶片

使用了从商购种子萌发的叶片。

B.DNA提取

(1)从补血草种子提取DNA

以与实施例1.B.(2)相同的方式提取DNA。

(2)从花生、杏仁、和榛实种子、罂粟种子和芝麻提取DNA：

以与实施例1.B.(3)相同的方式提取DNA。

(3)从荞麦(Shirahana荞麦)、小麦、大豆、玉米和小豆叶片和苹果种子提取DNA：

以与实施例1.B.(4)相同的方式提取DNA。

(4)从澳大利亚坚果种子提取DNA：

参照QIAGEN Genomic DNA Handbook根据以下程序用QIAGEN生产的Genomic-tip提取DNA。

在50-ml的管中，加入1g粉碎的样品，添加10ml缓冲液G2、200μl蛋白酶K(20mg/ml)和20μl RNA酶A(100mg/ml)并混合，之后于50℃温育1小时。然后在约3000 × g离心所得混合物10分钟以得到其上清液。对已经除去了油内容物和粉末的上清液以约3,000 x g进一步离心10分钟以得到其上清液。将所得上清液加入到经1ml缓冲液QBT平衡的Genomic-tip 20/G柱中，之后DNA被该柱吸附。然后，用4ml缓冲液QC洗涤该柱。将经过1ml预热至50℃的缓冲液QF洗脱和异丙醇沉淀收集得到的沉淀物溶解于100μl无菌超纯水中。测量所得溶液中的DNA浓度，并将经过无菌超纯水适当稀释的DNA溶液用作PCR的模板DNA样品。

(5)从胡桃种子、松子和向日葵种子提取DNA：

在15-ml的管中，加入1g粉碎的样品，添加10ml缓冲液AP1和10μl RNA酶A(100mg/ml)并混合，之后于65℃温育60分钟。之后将所得溶液在约3000 × g下离心10分钟以得到其上清液。向该上清液中加入1.5ml缓冲液AP2。将所得混合物置于冰上10分钟并离心以得到其上清液。将所得上清液加到QIAshredder Spin柱上，以通过离心从该柱得到流通液。向该流通液中加入1.5体积的缓冲液AP3和1体积乙醇，并混合。将所得混合物加入到DNeasy Spin柱上并在约1,500 × g下离心1分钟以使DNA吸收到柱上。然后，向柱中加入10ml缓冲液AW，并在约1,500 x g下离心1分钟，之后洗涤该柱。再向柱中添加10ml缓冲液AW，并在约1,500 x g下离心1分钟。随后，在约3,000 x g下离心10分钟以完全除去柱中残余的缓冲液AW。最后向柱中加入1ml预热至65℃的无菌超纯水并保持5分钟。之后以约3,000 x g将柱离心5分钟以从柱中将DNA洗脱。将经异丙醇沉淀收集到的沉淀物溶解到100μl无菌超纯水中。测量所得溶液中的DNA浓度，并将经过无菌超纯水适当稀释的DNA溶液用作PCR的模板DNA样品。

C.检测花生ITS-1序列的部分的PCR

(1)检测花生的引物：

用通用于以下11条在GenBank中登记的落花生属植物序列的ITS-1序列的序列作为引物序列。关于这些植物中的落花生，还使用了一条从分析商购花生获得的序列以替代GenBank中登记的落花生(AF156675)。

1：Arachis batizocoi(AF203553)

2：Arachis correntina(AF203554)

3：Arachis hermannii(AF203556)

4：Arachis hoehnei(AJ320395)

5：落花生(AF156675和从分析商购花生获得的序列)

6：Arachis magna(AF203555)

7：Arachis major(AF203552)

8：Arachis palustris(AF203557)

9：Arachis pintoi(AF203551)

10：Arachis triseminata(AF204233)

11：绒毛落花生(AF203558)

然后，合成了具有如下序列的寡核苷酸DNA引物(由QIAGEN生产，OPC-纯化的寡核苷酸)，并将其用作检测花生ITS-1序列的部分的PCR(下文中称作花生PCR)的引物。

5’-GCG GAA AGC GCC AAG GAA GC-3’(SEQ ID NO：21)

5’-GTC GCC CCG ACC GGA TG-3’(SEQ ID NO：66)

5’-CGT CGC CCC GAC CGG AT-3’(SEQ ID NO：26)

5’-TCG TCG CCC CGA CCG GAT G-3’(SEQ ID NO：65)

(2)用于检测花生的引物的特异性(PCR模拟)：

用PCR模拟软件Amplify 1.0(Bill Engels)来证实模拟结果是否显示用检测花生的引物获得了PCR扩增产物，所述模拟根据属于落花生属的植物的11条序列、8条除花生外的有可能成为变应原的植物的序列(荞麦、小麦、大豆、胡桃、日本松蕈、桃、苹果和桔子)、8条常用作食物成分的植物的序列(玉米、水稻、胡椒、芥末、胡萝卜、香菇(shiitake mushroom)、大白菜和芜菁)、6条豆科植物的序列(菜豆、利马豆、小扁豆、鹰嘴豆、绿豆和小豆)、69条与花生相关的植物物种的序列，和补血草。本文中所使用的花生相关植物物种是指，当用Genbank中登记的花生，即落花生的核苷酸序列(AF156675)中的ITS-1序列部分进行BLAST同源性检索时达到60分数命中或更高的、除落花生属之外的植物。此处，选择各植物所属的某一属中达到最高分数的物种的序列作为该属的代表性序列。对该序列的ITS-1-5.8S rRNA基因-ITS-2序列进行PCR模拟。在组合使用SEQ ID NO：21和65的引物的模拟中所使用序列的GenBank登记号和模拟结果示于表7A至7E。表7A至7E中的缩写字母和符号如下所示：

W值：产生PCR扩增产物的可能性

高可能性...W6>W5>W4>W3>W2...低可能性

数值(bp)：PCR扩增产物的大小(bp)

从扩增中获得的值减去2的值

-：预计不产生PCR扩增产物的那些

[表7A]

[表7B]

[表7C]

[表7D]

[表7E]

如表7A至7C中所示，从模拟结果预期，组合使用SEQ ID NO：21和65的引物时，从属于落花生属的植物的11条序列可获得具有76bp靶大小的PCR扩增产物。此外还预期，从7条除花生外的有可能成为变应原的植物的序列(荞麦、小麦、大豆、胡桃、日本松蕈、桃和桔子)、8条常用作食物成分的植物的序列(玉米、水稻、胡椒、芥末、胡萝卜、香菇、大白菜和芜菁)、6条豆科植物的序列(菜豆、利马豆、小扁豆、鹰嘴豆、绿豆和小豆)、69条与花生相关的植物物种的序列，以及补血草，未能得到具有靶大小的PCR扩增产物以及非特异性PCR扩增产物。由于预计可能从苹果得到具有大小不同于靶大小、但具有微弱信号的非特异性PCR扩增产物，所以我们决定通过实际PCR对苹果进行再次验证。PCR模拟的结果显示，预计在组合使用具有SEQ ID NO：21和66所示序列的引物和组合使用SEQ ID NO：21和26的引物这两种情况中，都可以从落花生属植物序列得到具有靶大小的PCR扩增产物。

(3)花生PCR：

根据以下程序，用QIAGEN生产的HotStarTaq Master Mix试剂盒进行花生PCR。

将引物(各终浓度为0.2μM)和模板DNA加入到12.5μl 2×HotStartTaq Master Mix(HotStar Taq DNA聚合酶，含有3mMMgCl₂的PCR缓冲液，和dNTP各400μM)中，用无菌超纯水调节其终体积至25μl以形成反应液。依次将其置于0.2-ml微管中、并根据以下PCR步骤用由Applied Biosystems生产的热循环仪GeneAmpPCR System 9600进行反应：95℃下酶活化15分钟；95℃变性30秒，68℃退火和延伸30秒，进行45个循环；和最后于72℃延伸4分钟。将所得PCR反应液在含有溴化乙啶的2％琼脂糖凝胶上跑电泳，并用由Amersham Biosciences生产的荧光图像分析仪FluorImager 595进行分析。组合使用SEQ ID NO：21和65的引物的结果作为代表示于附图12。附图12中的缩写字母和符号如下所示：

M：100-bp DNA序列梯标记

(-)：未添加模板DNA

数字：所添加的模板DNA量

箭标：PCR扩增产物靶带(约76bp)

通过使用用于扩增植物叶绿体DNA或核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶基因序列的部分的引物获得PCR扩增产物证实了，所提取的植物DNA的纯度水平可以进行PCR扩增(数据未显示)。

(4)花生PCR的灵敏度和特异性：

花生的PCR结果是，从500fg的花生DNA获得了从花生靶ITS-1序列预期的约76bp大小的PCR扩增产物，如附图12所示。使得可以检测到500fg花生DNA的灵敏度相当于如下灵敏度水平：当以50ng提取自特定样品的DNA作为模板进行PCR时，可以检测到样品DNA中所含的10ppm荞麦DNA。

花生的PCR结果是，从苹果种子、小麦叶片、荞麦叶片、小豆叶片、大豆叶片、玉米叶片和补血草种子DNA各50ng未获得具有靶大小的PCR扩增产物和非特异性PCR扩增产物，如附图12所示。尽管PCR模拟已经预计到可能从苹果得到具有大小不同于靶大小、但具有微弱信号的非特异性PCR扩增产物，但经证实这一问题不会发生。类似地，还证实了从杏仁种子、榛实种子、澳大利亚坚果种子、胡桃种子、罂粟种子、松子、向日葵种子、芝麻和鲑精DNA也未获得PCR扩增产物(数据未显示)。此外，从所得结果，发现花生PCR在组合使用SEQ ID NO：21和66的引物和组合使用SEQ ID NO：21和26的引物这两种情况中都具有类似的灵敏度和特异性(数据未显示)。

(5)花生PCR扩增产物的核苷酸序列分析：

用SEQ ID NO：21和65的引物通过双链直接测序分析组合使用SEQ ID NO：21和65的引物获得的花生DNA-衍生的PCR扩增产物的核苷酸序列。将所得核苷酸序列与商购花生，即落花生的核苷酸序列相比较，以证实花生DNA-衍生的PCR扩增产物的核苷酸序列与商购花生(落花生)的核苷酸序列的靶位点百分之百匹配(数据未显示)。这证明了，利用引物进行的PCR扩增和检测到了花生ITS-1序列的一部分。此外，从所得结果发现，在组合使用SEQ ID NO：21和66的引物和组合使用SEQ ID NO：21和26的引物这两种情况中，PCR都扩增和检测到了花生ITS-1序列的一部分(数据未显示)。

这些结果显示，利用引物进行的花生PCR能够，以高灵敏度和特异性，检测落花生属普通植物的ITS-1序列。我们决定在对花生ITS-1序列拷贝数进行定量的PCR(下文中称作对花生序列的定量PCR法)中使用这些引物。

D.定量花生序列拷贝数的PCR

(1)用于检测花生序列的TaqMan MGB探针：

合成具有以下序列的TaqMan MGB探针(Applied Biosystems日本生产，报道分子染料FAM)，并将其用作检测花生序列的探针。用GenBank中登记为落花生属植物ITS-1序列的11条序列的通用序列和从分析商购花生获得的序列作为探针序列。

5’-TGC TCT CCC CGC CGG C-3’(SEQ ID NO：34)

(2)对花生序列的定量PCR法：

根据以下程序用QIAGEN生产的QuantiTect Probe PCR试剂盒进行对花生序列的定量PCR法。

将引物(终浓度各为0.2μM)、SEQ ID NO：34的TaqMan MGB探针(终浓度0.1μM)和模板DNA加入到12.5μl 2 × QuantiTectProbePCR Master Mix中。用无菌超纯水将终体积调至25μl以得到溶液，依次将该溶液分配到96孔PCR板中。将其中分配了溶液的96孔PCR板置于Applied Biosystems生产的实时PCR仪SequenceDetection System 7700中，溶液在里面根据以下PCR步骤发生反应：95℃15分钟；和95℃变性30秒，68℃退火和延伸30秒，进行45个循环；和最终于72℃延伸4分钟。用相同的样品一式两份进行各反应(在2孔中)。反应结束后，分析延伸步骤中取得的荧光数据。首先将基线设定为0至1循环，然后在证实荧光升高的循环开始出现之前将其适当地设定在一个范围内。根据Kuribara H等人，2002，Novel Reference Molecules for Quantitation of Genetically ModifiedMaize and Soybean，Journal AOAC International85：1077-1089中所述的方法设定阈值线。组合使用SEQ ID NO：21和65的引物的情况作为代表示于附图13、14和15。

通过使用用于扩增一部分植物叶绿体DNA或核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶基因序列的引物获得PCR扩增产物证实了，所提取的植物DNA的纯度水平可以进行PCR扩增(数据未显示)。

(3)对花生序列的定量PCR法的特异性：

对花生序列的定量PCR法的结果是，从花生种子DNA获得了指示扩增的荧光信号，如附图13所示。另一方面，从苹果种子、小麦叶片、荞麦叶片、小豆叶片、大豆叶片、玉米叶片和补血草种子DNA各50ng未观察到指示扩增的荧光信号。类似地，在杏仁种子、榛实种子、澳大利亚坚果种子、胡桃种子、罂粟种子、松子、向日葵种子、芝麻、苹果和鲑精DNA中未观察到指示扩增的荧光信号(数据未显示)。此外，从所得结果发现，在组合使用SEQ ID NO：21和66的引物和组合使用SEQ ID NO：21和26的引物这两种情况中，该定量PCR法具有相似的特异性(数据未显示)。

(4)对花生序列的定量PCR法的定量性质和灵敏度：

对花生序列的定量PCR法的结果是，可以验证定量性质和灵敏度，在所述定量性质和灵敏度用50ng至500fg量的花生DNA能够画出相关系数为0.996且斜率为的-3.911的标准曲线，如附图14和15所示。达到指示扩增的荧光信号的灵敏度也可以在50fg花生DNA发现。此外，从所得结果发现，在组合使用SEQ ID NO：21和66的引物和组合使用SEQ ID NO：21和26的引物这两种情况中，该定量PCR法具有相似的定量性质和灵敏度(数据未显示)。

这些结果证明，结合使用SEQ ID NO：21和65的引物与SEQ IDNO：34的探针的对花生序列的定量PCR法、结合使用SEQ ID NO：21和66的引物与SEQ ID NO：34的探针的对花生序列的定量PCR法以及结合使用SEQ ID NO：21和26的引物与SEQ ID NO：34的探针的对花生序列的定量PCR法能够以高灵敏度和特异性检测落花生属普通植物的ITS-1序列以及定量花生序列的拷贝数，只要生成了含有花生靶序列的标准曲线的质粒和标准曲线。本发明的对花生序列的定量PCR法可以与在测量污染花生量中用于修正的对补血草序列的定量PCR法组合使用。

实施例4：在加工样品中证实定量PCR法的定量性质：

通过向80g含有100ppm(在下文中，W/W)荞麦的小麦中加入35g水和0.8g盐制成生面团(直径6cm，厚1mm)，对该生面团进行如下四种中的任何一种热处理：(1)烘焙(160℃，10分钟)、(2)油炸(185℃，5秒)、(3)蒸(100℃，10分钟)和煮(100℃，10分钟)，并将其用作烹调加工产品模型。然后将其与补血草标准样品混合，之后以上述相同的方式提取DNA。用由具有SEQ IDNO：14所示序列的核苷酸和具有SEQ ID NO：15所示序列的核苷酸组成的引物组，组合具有SEQ ID NO：64所示序列的探针，对所加热样品中所含的荞麦进行定量。当考虑水含量时，根据在加工产品中的荞麦所测得的定量值，确定所使用的小麦中的荞麦浓度。结果，(1)烘焙产品的荞麦浓度为145ppm，(2)油炸产品的荞麦浓度为56ppm，(3)蒸制产品的荞麦浓度为198ppm，和(4)煮制产品的荞麦浓度为143ppm，并显示了足够的定量性质。由此暗示，采用本发明的方法进行的定量可以在食物加工中所有最为普遍的热处理方法(烘焙、油炸、蒸和煮)中进行。因此，认为本发明的方法对于用除上述加工方法外的方法加工的加工食物能够维持其定量性质。由此，本发明的方法可广泛应用于加工的食物。

本文所引用的所有公开文件、专利和专利申请均全文引入本文作为参考。

工业实用性

本发明的对污染食物或食物成分的特定植物属的植物进行定量的PCR法能够检测和定量食物或食物成分中存在的极低量的属于特定植物属的植物，且同样地，对检测是否存在属于比如荞麦属、落花生属、小麦属和大豆属这样的变应原性植物属的植物、以及对该植物进行的定量尤其有效。本发明的PCR法是这样一种方法，其中对比如各待检样品的DNA提取效率和对PCR反应的抑制这样的影响的修正不是通过外在添加纯化的DNA作为标准来修正比如反应液中对PCR反应的抑制这样的影响来进行的，而是通过从外在补加了标准植物样品的样品中同时提取来自待检特定植物属的DNA和来自标准植物的DNA而非纯化DNA以实施定量PCR法来进行的。由于能够在标准植物样品和来自待检特定植物属的样品间的比如DNA提取效率以及对PCR反应的抑制的影响是一致的这样的条件下进行测量，所以该方法使得可以进行高度可靠的定量。本发明的方法有这样一个优点：该方法能够修正比如DNA提取效率和对PCR反应的抑制、甚至待检样品间的DNA含量差异这样的影响。该方法还可以在比如盐这样的不含DNA的食物成分或包含该成分的食物中正确地定量检测属于特定植物属的植物。

因此，本发明可用于定量检测污染食物或食物成分的、属于变应原性特定植物属的植物。此外，即便存在假阳性的话，通过将PCR扩增产物进行DNA序列分析，该利用PCR法的定量分析也能可靠地将其排除，且由此可以说该方法具有优越的工业实用性。

本发明的定量PCR法比ELISA法具有更宽的动力学范围，且能够达到足够高的定量检测污染食物或食物成分的特定成分的特异性和灵敏度。此外，与合成材料(引物和探针)组合使用的方法可以实现测量结果的高重复性和可靠性。

序列表

<110>House Foods Corporation

<120>食物或食物原材料中特定属的植物的定量PCR检测方法

<130>PH-2153-PCT

<150>JP 2003-139513

<151>2003-05-16

<160>66

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>73

<212>DNA

<213>荞麦(Fagopyrum esculentum)

<400>1

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>2

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>3

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>4

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>5

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>6

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>7

<210>8

<211>71

<212>DNA

<213>荞麦(Fagopyrum esculentum)

<400>8

<210>9

<211>77

<212>DNA

<213>荞麦(Fagopyrum esculentum)

<400>9

<210>10

<211>58

<212>DNA

<213>荞麦(Fagopyrum esculentum)

<400>10

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>11

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>12

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>13

<210>14

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>14

<210>15

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>15

<210>16

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>16

<210>17

<211>72

<212>DNA

<213>Arachis vi1losa

<400>17

<210>18

<211>57

<212>DNA

<213>Arachis villosa

<400>18

<210>19

<211>60

<212>DNA

<213>Arachis villosa

<400>19

<210>20

<211>68

<212>DNA

<213>Arachis villosa

<400>20

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>21

<210>22

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>22

<210>23

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>23

<210>24

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>24

<210>25

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>25

<210>26

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>26

<210>27

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>27

<210>28

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>28

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>29

<210>30

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>30

<210>31

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>31

<210>32

<211>20

<212>DNA

<213>Arachis villosa

<400>32

<210>33

<211>24

<212>DNA

<213>Arachis villosa

<400>33

<210>34

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR探针

<400>34

<210>35

<211>36

<212>DNA

<213>Arachis villosa

<400>35

<210>36

<211>53

<212>DNA

<213>荞麦(Fagopyrum esculentum)

<400>36

<210>37

<211>56

<212>DNA

<213>荞麦(Fagopyrum esculentum)

<400>37

<210>38

<211>57

<212>DNA

<213>Arachis villosa

<400>38

<210>39

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>39

<210>40

<211>60

<212>DNA

<213>普通小麦(Triticum aestivum)

<400>40

<210>41

<211>57

<212>DNA

<213>普通小麦(Triticum aestivum)

<400>41

<210>42

<211>57

<212>DNA

<213>普通小麦(Triticum aestivum)

<400>42

<210>43

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>43

<210>44

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>44

<210>45

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>45

<210>46

<211>58

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<400>46

<210>47

<211>65

<212>DNA

213>大豆(Glycine max)

<400>47

<210>48

<211>62

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<400>48

<210>49

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>49

<210>50

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>50

<210>51

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>51

<210>52

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>52

<210>53

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>53

<210>54

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>54

<210>55

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>55

<210>56

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>56

<210>57

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>57

<210>58

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>58

<210>59

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR探针

<400>59

<210>60

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>60

<210>61

<211>32

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>61

<210>62

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>62

<210>63

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>63

<210>64

<211>13

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR探针

<400>64

<210>65

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>65

<210>66

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>66

Claims

将待检食物或食物成分和标准植物样品以与上述修正样品相同的量混合制成测试样品，并从该测试样品中提取基因组DNA；

用定量PCR法对修正样品确定来自标准植物的DNA拷贝数(Lo)和来自特定植物属的DNA拷贝数的值(Fo)；和

用定量PCR法对测试样品确定来自特定植物属的DNA拷贝数(Fs)和来自标准植物的DNA拷贝数(Ls)，和

根据下式使用上述拷贝数计算出食物或食物成分中所含的属于特定植物属的植物的量：

属于特定植物属的植物的量(ppm(μg/g))＝

Fs/Ls×Lo/Fo×1,000,000。

2.根据权利要求1的方法，其中所述定量PCR法是实时PCR法。

3.根据权利要求2的方法，其特征在于该实时PCR法根据通过使用在5’末端带有荧光染料和在3’末端带有猝灭剂的、能与基因组DNA部位的内部区域杂交的探针所放射出的光量对DNA进行定量，该内部区域与PCR引物组的各寡核苷酸杂交，其中从探针5’末端的荧光染料发射出的光受到3’末端的猝灭剂抑制，在PCR反应中从引物开始的Taq聚合酶-催化的DNA延伸过程中，该探针被Taq聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性降解从而使荧光染料与猝灭剂解离，随之导致发光。

4.根据权利要求1至3之中任一项的方法，其中所述标准植物属于除高地杂草和食物作物之外的植物物种。

5.根据权利要求4的方法，其中所述标准植物是补血草。

6.根据权利要求1至5之中任一项的方法，其中所述待检特定植物属是荞麦属、落花生属、小麦属或大豆属。

7.根据权利要求2或3的方法，其中所述标准植物是补血草，用于检测补血草的引物组是由具有SEQ ID NO：57所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：58所示序列的寡核苷酸组成的组，且用于检测补血草的探针是具有SEQ ID NO：59所示序列的寡核苷酸。

8.根据权利要求2或3的方法，其中所述待检特定植物属是荞麦属，用于检测荞麦属的引物组是由具有SEQ ID NO：14所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：15所示序列的寡核苷酸组成的组，且用于检测荞麦属的探针是具有SEQ ID NO：64所示序列的寡核苷酸。

9.根据权利要求2或3的方法，其中所述待检特定植物属是落花生属，用于检测落花生属的引物组是由具有SEQ ID NO：21所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：26、65或66所示序列的寡核苷酸组成的组，且用于检测落花生属的探针是具有SEQ ID NO：34所示序列的寡核苷酸。