JP5271531B2 - リンゴ検出用プライマーセットおよびリンゴ検出方法 - Google Patents
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Description
(1) リンゴのITS(Internal Transcribed Spacer)-1 領域のリンゴに特徴的な塩基配列を含むDNA断片を特異的に増幅するリンゴ検出用プライマーセットであって、当該プライマーセットの一方のプライマーが、配列番号2に示す塩基配列のうちの3’末端から連続する10塩基〜16塩基を含むオリゴヌクレオチドである、上記リンゴ検出用プライマーセット。
(2) 前記リンゴに特徴的な塩基配列が、配列番号4に示す塩基配列の78〜81番目のttcgである、(1)に記載のリンゴ検出用プライマーセット。
(3) 前記プライマーセットの他方のプライマーが、配列番号1に示す塩基配列のうちの連続する少なくとも10塩基を含むオリゴヌクレオチドである、(1)または(2)に記載のリンゴ検出用プライマーセット。
(4) 配列番号1に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号2に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとから構成される、(1)〜(3)のいずれかに記載のリンゴ検出用プライマーセット。
(5) 試料より抽出したDNAを鋳型とし、(1)〜(4)のいずれかに記載のプライマーセットを用いてPCRを行い、当該PCRにより得られる目的とする増幅産物の有無を検出する工程を含む、リンゴの検出方法。
(6) 前記増幅産物の長さが150bp以内であることを特徴とする、(5)に記載のリンゴの検出方法。
(7) 前記増幅産物の塩基配列からプライマー配列を除いた塩基配列が、配列番号4に示す塩基配列の78〜81番目のリンゴに特徴的な塩基配列ttcgを含むかどうかを指標として前記増幅産物がリンゴ由来のDNAから増幅されたものであるかを確認する工程をさらに含む、(5)または(6)に記載のリンゴの検出方法。
(8) (1)〜(4)のいずれかに記載のプライマーセットを含む、リンゴ検出用キット。
リンゴ検出用プライマーの設計にあたり、検出すべき対象をリンゴ(Malus domestica)とし、また、検出してはならないものはリンゴ属(Malus属)以外の植物とした。リンゴ以外のリンゴ属植物は、食用として加工され流通しているものはほとんどないことから、検出の有無を問わないこととした。
リンゴ:Malus domestica cultivar American Mother(AF186484)
リンゴ:Malus domestica cultivar Esopus Spitzenburg(AF186483)
リンゴ:Malus domestica cultivar D'Arcy Spice(AF186482)
リンゴ:Malus domestica cultivar Autumn Pearmain(AF186481)
リンゴ:Malus domestica cultivar Ashmeads Kernal(AF186480)
リンゴ:Malus domestica cultivar Brameleys Seedling(AF186479)
リンゴ:Malus domestica cultivar Reinette Simerenko(AF186478)
リンゴ:Malus domestica cultivar Leathercoat(AF186477)
リンゴ:Malus domestica(U16195)
もも:Prunus persica(AF143535)
あんず:Prunus armeniaca(AF318756)
すもも:Prunus salicina(AY735322)
うめ:Prunus mume(AY735338)
アーモンド:Prunus dulcis(AF318754)
プルーン:Prunus domestica(AF179485)
スピノサモモ:Prunus spinosa(AF318730)
桜桃:Prunus avium(AF318737)
ラズベリー:Rubus idaeus(AF055757)
いちご:Fragaria x ananassa(AF163494)
ビワ:Eriobotrya japonica(U16192)
マルメロ:Cydonia oblonga(AF186531)
ジューンベリーの近縁種:Amelanchier bartramiana(U83924)
ジューンベリーの近縁種:Amelanchier wiegandii(U83956)
ジューンベリーの近縁種:Amelanchier alnifolia(U83958)
ジューンベリーの近縁種:Amelanchier asiatica(U83968)
ナシの近縁種:Pyrus salicifolia(AF186532)
ナシの近縁種:Pyrus calleryana(U16202)
ナシ:Pyrus pyrifolia(AF287247)
リンゴの配列から弱いながらも非特異的増幅産物が得られる可能性があると予想されたが、いずれも標的増幅産物と断片長が40bp以上異なることから、たとえ増幅したとしても容易に判別可能であり、問題ないと考えた。
(1) DNA試料の調製
サンプルは、リンゴとして、ふじ、王林、ジョナゴールド、紅玉、陸奥の5品種(種子)、リンゴ以外の植物試料として、いちご(果実)、ラズベリー(果実)、すもも(種子)、あんず(種子)、桜桃(種子)、うめ(種子)、アーモンド(葉)、プルーン(種子)、もも(種子)、洋ナシ(種子)、ナシ(種子)、ビワ(種子)、サンザシ(果実)、ジューンベリー(葉)、かりん(果実)、マルメロ(葉)、アロエベラ(葉)、パイナップル(果実)、パパイヤ(果実)、オレンジ(果実)、ミカン(果実)、メロン(果実)、柿(種子)、いちじく(果実)、マンゴー(果実)、バナナ(果実)、アボカド(果実)、ブルーベリー(果実)、ぶどう(果実)、キウイ(果実)、コメ(種子)、大豆(種子)、とうもろこし(種子)、小麦(種子)、ばれいしょ(塊茎)、にんじん(根)、たまねぎ(鱗茎)、白菜(葉)、ほうれんそう(葉)、きゅうり(果実)、トマト(果実)の計41種を用いた。
上記のようにして調製した各DNA試料をPCRの鋳型とし、前記配列番号1の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー、配列番号2の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとするプライマーセットを用いてPCRを行った。
PCR反応は、0.2mlチューブ、GeneAmp PCR System9700(アプライドバイオシステムズ社製)を用い、下記表2のPCR反応液組成とPCR反応条件にて行った。
PCR反応後の溶液8μlをそれぞれエチジウムブロマイド含有の3%アガロースゲル電気泳動に供した。同時に分子量マーカーとして100bp DNA Ladder(タカラバイオ株式会社)を100bpのバンドのDNA量が5ngになるように供し、UV照射で視覚化することで、PCR増幅産物の有無および断片長の確認を行い、さらにPCR増幅産物の断片が100bpのバンド5ngよりも明瞭に確認できるかの判定を行った。上記電気泳動による検出結果を図2〜5に示す。図2に示すように、試験した5品種のリンゴでは、DNA 50fgを鋳型に用いた場合、約134bpの断片長の標的増幅産物が明瞭に確認された。一方、図3〜5に示すように、リンゴ以外の植物41種ではDNA 50ngを鋳型に用いても約134bpの断片長の標的増幅産物が見られなかった。このことから、本プライマーセットは、リンゴを特異的に検出することが示された。また、サケ精子DNA 50ngに添加したリンゴDNA 50fg(1ppm重量/重量)を鋳型に用いた場合でも、約134bpの断片長の標的増幅産物が明瞭に確認されたことから、1ppmレベルの感度でリンゴを検出できることが示された。
リンゴ(王林)から得られた標的増幅産物の塩基配列をダイレクトシーケンス法により確認したところ、標的増幅産物のプライマー配列を除いた塩基配列は以下の塩基配列を有していた。
(1) リンゴ標準試料の調製
リンゴの果皮を剥き、芯を取り除いた果肉部分を凍結乾燥後粉砕し、直ちに等量の炭酸カルシウムを混ぜて均一化した。これをリンゴ標準試料とした。
リンゴ標準試料2gを50mLチューブに採取し、タンパク質抽出用緩衝液(0.5% SDS、2% 2-メルカプトエタノール、0.5M NaCl、0.1M Tris-HCl (pH8.6))20mLを加え、よく混合して固形物を分散させ、室温下16時間振とう抽出した。抽出液を10,000×gで30分間遠心分離した後、上清を孔径0.8μmのミクロフィルターでろ過し、タンパク質抽出液とした。得られたタンパク質抽出液16μlについて、2-D Quant kit(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)を用い、キットの説明に従ってタンパク質濃度を定量した。
リンゴを含む可能性があると思われる、市場によく見られる食品を候補に挙げ、そのうちリンゴDNAの検出が困難と思われた加工食品を選択した。その中から、モデル加工食品の1つ目には、加工工程においてDNAの分解が最も激しいと考えられ、検出できない可能性が高いと考えられるジャムを選定した。モデル加工食品の2つ目には、食品中のDNA量が多いため、添加したリンゴのDNA濃度が相対的に薄くなり、検出できない可能性が高いと考えられる、クッキーを選定した。
ジャムは図6、クッキーは図7に示す方法によって作製した。ジャム、クッキーともに、リンゴ標準試料 添加品/無添加品を作製した。添加品については、モデル加工食品の最終重量あたりのリンゴタンパク質が10μg/gとなるようにリンゴ標準試料を添加した。なお、添加品については、ジャム、クッキーとも、それぞれ2回反復で作製し、無添加品はそれぞれ1回作製した。
実施例2の(1)と同様にして、粉砕均一化したモデル加工食品2gからそれぞれ1回DNAを抽出しDNA濃度を測定した。20ng/μlより濃いものについてはTE緩衝液(pH8.0)で20ng/μlに希釈し、20ng/μlより薄いものについては、そのままのものをDNA試料とした(リンゴタンパク質10μg/g相当)。また、リンゴ標準試料を添加したジャムから抽出したDNA試料を、添加しなかったジャムから抽出したDNA試料で10倍希釈したものを、ジャム1/10希釈DNA試料とした。クッキーでも同様にして作製したものをクッキー1/10希釈DNA試料とした(リンゴタンパク質1μg/g相当)。これらDNA試料2.5μlを1反応液あたりのPCRに用いた。
調製したそれぞれのDNA試料について2回反復で、実施例2の(2)と同様にしてPCR反応を行った。
実施例2の(3)と同様にして検出を行った。
標的増幅産物の塩基配列は実施例3と同様にして確認した。
作製したモデル加工食品に添加したリンゴタンパク質量、および配列番号1のプライマーと配列番号2のプライマーからなるプライマーセットを用いたPCR法での標的増幅産物の検出結果を表3に示す。PCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動写真を図8に示す。
Claims (4)
- 試料より抽出したDNAを鋳型とし、配列番号1に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成されるプライマーセットを用いてPCRを行い、当該PCRにより得られた134bpの標的増幅産物の有無を検出する工程を含む、リンゴの検出方法。
- 前記増幅産物の塩基配列からプライマー配列を除いた塩基配列が、配列番号4に示す塩基配列の78〜81番目のリンゴに特徴的な塩基配列ttcgを含むかどうかを指標として前記増幅産物がリンゴ由来のDNAから増幅されたものであるかを確認する工程をさらに含む、請求項1に記載のリンゴの検出方法。
- 配列番号1に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、リンゴ検出用プライマーセット。
- 請求項3に記載のプライマーセットを含む、リンゴ検出用キット。
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