JP5902517B2 - 小麦の検出方法 - Google Patents
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
(1) 被検試料から抽出したDNAを鋳型とし、配列番号1に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号2、3及び4に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの混合物とから構成されるプライマー対、および配列番号5に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブを用いてリアルタイムPCRを行い、小麦標的増幅産物に由来する蛍光シグナルにより小麦の存在を検出することを特徴とする、小麦の検出方法。
(2) 小麦の存在を検出する指標としてリアルタイムPCRより得られる蛍光シグナルの増加を用いることを特徴とする、(1)に記載の検出方法。
(3) 前記小麦が、小麦属またはエギロプス属に属する植物であることを特徴とする、(1)または(2)に記載の検出方法。
(4) 前記プローブが5’末端を蛍光物質で、3’末端を消光物質で修飾したTaqManプローブであることを特徴とする、(1)〜(3)のいずれかに記載の検出方法。
(5) 配列番号5に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ。
(6) 前記プローブが5’末端を蛍光物質で、3’末端を消光物質で修飾したTaqManプローブであることを特徴とする、(5)に記載のプローブ。
(7) 配列番号1に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号2、3及び4に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの混合物とから構成されるプライマー対、および配列番号5に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブからなる小麦検出用プライマー対およびプローブのセット。
(8) (7)に記載の小麦検出用プライマー対およびプローブのセットを含む、小麦検出用キット。
配列番号2:5'-AAAGGCCATAATGCCAGCTG-3'
配列番号3:5'-TGAGGCCGTCATGCCGGCTG-3'
配列番号4:5'-TGAGGCCATAATGTCGGCTG -3'
下記の小麦のITS-2配列を含む特定の部分より設計した下記の配列番号1に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号2、3及び4に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの混合物からなるプライマー対を用いたリアルタイムPCRにおいて小麦由来のシグナル(蛍光)が得られると予想されるプローブを設計するために、小麦属(Triticum)植物の配列およびエギロプス(Aegilops)属植物 の配列を収集し、アラインメントした。
配列番号2:5'-AAAGGCCATAATGCCAGCTG-3'
配列番号3:5'-TGAGGCCGTCATGCCGGCTG-3'
配列番号4:5'-TGAGGCCATAATGTCGGCTG-3'
Triticum aestivum (AF438186)
Triticum aestivum (AF438187)
Triticum aestivum (AF438188)
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Triticum aestivum (AY346111)
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Triticum aestivum (AY346114)
Triticum aestivum (AY346120)
Triticum aestivum (AY450258)
Triticum aestivum (Z11761)
Triticum araraticum (AJ238920)
Triticum araraticum (AJ238921)
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Triticum dicoccoides (AJ238913)
Triticum dicoccoides (AJ238915)
Triticum dicoccoides (AJ238916)
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Triticum dicoccum (AJ301801)
Triticum dicoccum (AJ301801)
Triticum monococcum (AJ301800)
Triticum timopheevii (AJ238923)
Triticum timopheevii (AJ238924)
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Triticum turgidum (AJ238918)
Triticum turgidum (AJ238919)
Triticum turgidum (AY450266)
Triticum urartu (AJ301803)
Aegilops bicornis (AF149192)
Aegilops bicornis (AJ238907)
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Aegilops longissima (AJ238908)
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Aegilops speltoides (AJ238904)
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Aegilops speltoides (AY450267)
Aegilops speltoides (AY450268)
Aegilops speltoides (Z11762)
Aegilops squarrosa (AF149193)
Aegilops tauschii (AJ238910)
Aegilops triuncialis (AF156994)
Aegilops umbellulata (AF149197)
Aegilops uniaristata (AF149200)
Aegilops vavilovii (AF156999)
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配列番号5:5'-CGGATGCACTGCITTGATAAAG-3'
配列番号1に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号2、3及び4に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの混合物からなるプライマー対および配列番号5に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ(以下、「本発明の小麦検出用プライマー対・プローブのセット」という)用いるリアルタイムPCRの性能を評価した。
[試料]
(i)小麦(小麦の原種であるエギロプス属植物及び掛け合わせ品種のライコムギを含む。):
Triticum aestivum cv. 農林61号(市販品)
Triticum aestivum cv. Chinese Spring (KT020-003)
Triticum aestivum cv. Sapporo Haru (KT020-004)(以上、普通コムギ)
Triticum turgidum L (KU-147)(リベットコムギ)
Triticum durum Desf (KU-125)(デュラムコムギ)
Triticum monococcum L. (KU-104-2)(一粒コムギ)
Triticum timopheevi Zhuk (KU-107-1)(チモフェービ系)
Aegilops speltoides Tausch (KU-2-1)(クサビコムギ)
Aegilops squarrosa L. (KU-20-1)(タルホコムギ)
Triticum aestivum-rye amphidiploid (TACBOW0065)(ライコムギ)
オオムギ(みのり種:市販品)
ライムギ(市販品)
エン麦(前進種:市販品)
ハトムギ(市販品)
トウモロコシ(市販品)
ソバ(市販品)
コメ(コシヒカリ:市販品)
ダイズ(鶴の子大豆:市販品)
農林61号以外の小麦、オオムギ、ライムギ、エン麦、ハトムギ、トウモロコシは発芽させ、葉からDNA抽出を行った。他の試料は、種子からDNA抽出を行った。DNA抽出は、QIAGEN社製のGenomic-tip 20/Gを用い、以下の方法で行った。
上記のようにして調製した各DNA試料液を用いてそれぞれ2点併行でリアルタイムPCRを行った。リアルタイムPCRは、QIAGEN社製のQuantiTect Probe PCR Kitを用い、以下の方法で行った。
(1) モデル分解DNAの作製
小麦DNAをダイズDNA 20 ng/μl TE buffer (pH8.0)溶液で20 pg/μl(1/1000濃度)に希釈した溶液をオートクレーブにより123℃で1分加熱することでDNAを分解させて、モデル分解DNAを作製した。
(1)で作製したモデル分解DNA、市販加工食品でDNA分解の激しかったまぐろ水煮から抽出したDNAを、それぞれDNA分析用マイクロチップ電気泳動装置MultiNA(島津製作所)に負荷し、DNA断片長によってそれぞれのDNAを分離した。DNA二重らせんにインターカレートする化合物を利用して得られた蛍光強度の極大値、および極大値に対応するDNA断片長を確認した(図3)。極大値に対応するDNA断片長は、DNA分解が激しいほど短くなると考えられることから、モデル分解DNAはまぐろ水煮の場合と同様に加熱処理によってDNAがかなりの損傷(分解)を受けていることを確認した。
(1)で調製したモデル分解DNA、DNAの分解を受けていない(オートクレーブ未処理)モデル未分解DNAを試料とし、本発明の小麦検出用プライマー対・プローブのセットを用いて実施例2と同様にしてそれぞれ2点併行でリアルタイムPCRを行い、結果を解析して小麦検出の有無を判定した。
(1)小麦標準試料の調製および小麦標準試料のタンパク質定量
モデル加工食品に添加する小麦標準試料として、農林61号(中力粉)の全粒を粉砕したものを用いた。
モデル加工食品には、微量の小麦が含まれていた場合に、小麦の存在を検出することが難しいと考えられる食品を選定した。選定にあたっては、試料中のDNAが多いもの、DNA分解が進んでいるもの、PCR阻害があるものを指標とした。その結果、DNAが多いモデルにboiled beef、DNA分解が激しいモデルに鶏肉団子のスープ、PCR阻害があるモデルにブルーベリーピューレを選択した。
小麦ELISAによる定量検査の結果、食品中に小麦全タンパク質が10 μg/g以上の場合は微量を超える小麦が混入している可能性がある。数μg/gを超えるレベルの小麦を含有する場合、法令で小麦の存在を表示することが義務付けられている。
100 gビーカーに水30 g、粉寒天0.3 gを入れ、火にかけた。細かな泡が立ち沸騰してきたら、吹きこぼれないように弱火にして2分沸騰させ、寒天をよく煮溶かした。これに砂糖7 g、塩1.3 gを入れ、寒天調味液を作った。レトルトパウチに牛肉100 g、上記寒天調味液を入れて、138.6 gとなるように水を入れて調整した。このレトルトパウチに、小麦標準試料14.3 mgを入れ、封をして5℃にて終夜静置した後、121℃1分のオートクレーブ処理を行い、5分間水冷し、5℃にて終夜静置したものをboiled beefとした。レトルトパウチから内容物を取り出し、ブレンダーで粉砕均一化し、5 gずつ20個に分けて保存した。
鶏ひき肉89 g、片栗粉9 g、塩2 g、水10 gを入れ、混ぜ合わせ、約5 gずつまとめて団子にした。これを100℃の水に入れ、1分煮沸した。団子を2つのレトルトパウチに等量入れ、水を入れてそれぞれ100 g、合計200 gに調整した。このレトルトパウチに小麦標準試料20.6 mgを入れ、封をして123℃12分のオートクレーブ処理を行い、5分間水冷し、5℃にて終夜静置したものを鶏肉団子スープとした。レトルトパウチから内容物を取り出し、ブレンダーで粉砕均一化し、10 gずつ20個に分けて保存した。
洗ったブルーベリー30 gをブレンダーで粉砕してピューレを作製した。50 mLチューブにピューレ 5 gと小麦標準試料 51.5 mgを添加して撹拌し、加工食品中の小麦全タンパク質1000 μg/gモデルを作製した。50 mLチューブに1000 μg/gモデル 0.5 gとピューレ 4.5 gを加えて撹拌し、100 μg/gモデルを作製した。50 mLチューブに100 μg/gモデル 2.2 gとピューレ19.8 gを加えて撹拌し、10 μg/gモデルを作製した。得られた10 μg/gモデルを1 gずつ20個に分けて保存した。
DNA抽出は、QIAGEN社製のGenomic-tip 20/Gを用い、以下の方法で行った。
細かく粉砕した試料約2 gを50 mLチューブに入れ、15 mLのbuffer G2、20 μLのRNase A(100 mg/mL)、100 μLのプロテイナーゼK溶液を加え、混合した後、50 ℃で2時間保温した。その後は実施例2と同様にしてDNA抽出し、DNA濃度を測定した。超純水で20 ng/μLに希釈したものをPCRの鋳型DNA試料とした。これらDNA試料2.5 μLを1反応液あたりのPCRに用いた。なお、ここで得られたDNAがPCR増幅可能レベルの純度であることは、植物葉緑体DNAの一部を増幅するプライマーまたは動物ミトコンドリアDNAの一部を増幅するプライマーのどちらかにより、PCR増幅産物が得られることで確認した。
Claims (6)
- 被検試料から抽出したDNAを鋳型とし、配列番号1に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号2、3及び4に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの混合物とから構成されるプライマー対、および配列番号5に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、5’末端を蛍光物質で、3’末端を消光物質で修飾したTaqMan(登録商標)プローブを用いてリアルタイムPCRを行い、小麦標的増幅産物に由来する蛍光シグナルにより小麦の存在を検出することを特徴とする、小麦の検出方法。
- 小麦の存在を検出する指標としてリアルタイムPCRより得られる蛍光シグナルの増加を用いることを特徴とする、請求項1に記載の検出方法。
- 前記小麦が、小麦属またはエギロプス属に属する植物であることを特徴とする、請求項1または2に記載の検出方法。
- 配列番号5に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、5’末端を蛍光物質で、3’末端を消光物質で修飾したTaqMan(登録商標)プローブ。
- 配列番号1に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号2、3及び4に示す
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの混合物とから構成されるプライマー対、および配
列番号5に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、5’末端を蛍光物質で、3’末端を消光物質で修飾したTaqMan(登録商標)プローブからなる小麦検出用プライマー対およびプローブのセット。 - 請求項5に記載の小麦検出用プライマー対およびプローブのセットを含む、小麦検出用
キット。
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