JP6651294B2 - リアルタイムpcrによる食物アレルゲンの検出方法及びキット - Google Patents
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Description
[1]飲食品又は飲食品原材料中に含まれる食物アレルゲンの有無を判定する方法であって、
(a)飲食品又は飲食品原材料より抽出されたDNAを鋳型として、食物アレルゲン検出用のプライマーセットを用いてリアルタイムPCRを行い、増幅シグナルのCt値を得る工程;
(b)前記食物アレルゲン由来のDNAを鋳型として、工程(a)と同じ条件のリアルタイムPCRを行い、増幅シグナルのCt値を得る工程であって、
(b−1)該DNAが、前記プライマーセットの標的配列を含む環状の形態であり、かつ該DNAの量(コピー数)と工程(a)にて用いられる飲食品又は飲食品原材料より抽出されたDNAの量(ng)が24コピー数を上回る量:50ngとなる量比にてリアルタイムPCRに用いられる、あるいは
(b−2)該DNAが、前記プライマーセットの標的配列を含む直鎖状の形態であり、かつ該DNAの量(コピー数)と工程(a)にて用いられる飲食品又は飲食品原材料より抽出されたDNAの量(ng)が6コピー数を上回る量:50ngとなる量比にてリアルタイムPCRに用いられる、工程;
(c)工程(a)で得られたCt値と工程(b)で得られたCt値を比較する工程であって、工程(a)で得られたCt値が、工程(b)で得られたCt値以下である場合に、該飲食品又は飲食品原材料中に食物アレルゲンが含まれることを示す、工程。
[2]飲食品又は飲食品原材料中にタンパク質濃度として10μg/g以上の量にて食物アレルゲンが含まれるものを陽性と判定する方法である、[1]の方法。
[3]工程(a)において50ng量の飲食品又は飲食品原材料より抽出されたDNAを鋳型として、かつ工程(b)において、24コピー数を上回る量の食物アレルゲン由来の環状のDNA又は6コピー数を上回る量の食物アレルゲン由来の直鎖状のDNAを鋳型として、それぞれリアルタイムPCRに用いられる、[1]又は[2]の方法。
[4]工程(b)において、食物アレルゲン由来のDNAが環状のDNAである場合50コピー数又はそれ以上の量にて、又は食物アレルゲン由来のDNAが直鎖状のDNAである場合12.5コピー数又はそれ以上の量にて、リアルタイムPCRに用いられる、[3]の方法。
[5]工程(c)において、工程(a)で得られたCt値が、工程(b)で得られたCt値未満である場合に、前記飲食品又は飲食品原材料中に食物アレルゲンが含まれることを示す、[1]〜[4]のいずれかの方法。
[6]食物アレルゲンが小麦、そば及び落花生からなる群から選択される一以上の食物アレルゲンである、[1]〜[5]のいずれかの方法。
[7]食物アレルゲンが小麦であり、使用するプライマーセットが以下の(i)のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、(ii)−(iv)より選択される少なくとも一つのオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む、[6]の方法。
(i)配列番号1に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
(ii)配列番号2に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
(iii)配列番号3に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
(iv)配列番号4に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
[8]食物アレルゲンがそばであり、使用するプライマーセットが以下の(v)のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、(vi)のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む、[6]の方法。
(v)配列番号6に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
(vi)配列番号7に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
[9]食物アレルゲンが落花生であり、使用するプライマーセットが以下の(vii)のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、(viii)のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含むか、あるいは以下の(ix)のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、(x)のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む、[6]の方法。
(vii)配列番号9に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および
(viii)配列番号10に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、あるいは
(ix)配列番号22に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および
(x)配列番号23に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
[10]リアルタイムPCRによる増幅産物の検出を、蛍光標識されたプローブを用いて行う、[1]〜[9]のいずれかの方法。
食物アレルゲン検出用のプライマーセット、及び
食物アレルゲン由来のDNAであって、該DNAが前記プライマーセットの標的配列を含む環状の形態であり、24コピー数を上回る量にて存在するか、もしくは該DNAが前記プライマーセットの標的配列を含む直鎖状の形態であり、6コピー数を上回る量にて存在する、
を含む、上記キット。
[12]さらに、リアルタイムPCRによる増幅産物の検出を行うための蛍光標識されたプローブを含む、[11]のキット。
[13]食物アレルゲンが小麦であり、プライマーセットが以下の(i)のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、(ii)−(iv)より選択される少なくとも一つのオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む、[11]又は[12]のキット。
(i)配列番号1に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
(ii)配列番号2に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
(iii)配列番号3に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
(iv)配列番号4に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
[14]さらに、配列番号5に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む蛍光標識されたプローブ又はその変異体を含む、[13]のキット。
[15]食物アレルゲン由来のDNAが、配列番号19の塩基配列からなるDNA又はその変異体を含む、[13]又は[14]のキット。
[16]食物アレルゲンがそばであり、プライマーセットが以下の(v)のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、(vi)のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む、[11]又は[12]のキット。
(v)配列番号6に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
(vi)配列番号7に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
[17]さらに、配列番号8に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む蛍光標識されたプローブ又はその変異体を含む、[16]のキット。
[18]食物アレルゲン由来のDNAが、配列番号20の塩基配列からなるDNA又はその変異体を含む、[16]又は[17]のキット。
[19]食物アレルゲンが落花生であり、使用するプライマーセットが以下の(vii)のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、(viii)のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む、あるいは、以下の(ix)のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、(x)のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む、[11]又は[12]のキット。
(vii)配列番号9に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および
(viii)配列番号10に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、あるいは
(ix)配列番号22に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および
(x)配列番号23に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
[20]さらに、配列番号11に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む蛍光標識されたプローブ又はその変異体、あるいは配列番号24に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む蛍光標識されたプローブ又はその変異体を含む、[19]のキット。
[21]食物アレルゲン由来のDNAが、配列番号21の塩基配列からなるDNA又はその変異体、あるいは配列番号25の塩基配列からなるDNA又はその変異体を含む、[19]又は[20]のキット。
[22]食物アレルゲン由来のDNAを環状の形態にて50コピー数又はそれ以上の量にて含むか、あるいは、食物アレルゲン由来のDNAを直鎖状の形態にて12.5コピー数又はそれ以上の量にて含む、[11]〜[21]のいずれかのキット。
(a)飲食品又は飲食品原材料より抽出されたDNAを鋳型として、食物アレルゲン検出用のプライマーセットを用いてリアルタイムPCRを行い、増幅シグナルのCt値を得る工程;
(b)前記食物アレルゲン由来のDNAを鋳型として、工程(a)と同じ条件のリアルタイムPCRを行い、増幅シグナルのCt値を得る工程であって、該DNAが前記プライマーセットの標的配列を含み、かつ工程(a)における飲食品又は飲食品原材料より抽出されたDNAの使用量(ng)に基づいて決定することができる特定の量(コピー数)にてリアルタイムPCRに用いられる、工程;
(c)工程(a)で得られたCt値と工程(b)で得られたCt値を比較する工程であって、工程(a)で得られたCt値が、工程(b)で得られたCt値以下または未満である場合に、該飲食品又は飲食品原材料中に食物アレルゲンが含まれることを示す、工程。
本発明において好ましくは、プローブを用いて、増幅されたDNAを検出・定量する。
・PCRによる増幅産物のサイズを80〜300bp、より典型的には80〜150bpとする。
・各プライマーのサイズは17〜25塩基程度とする。
・各プライマーのGC含量は40〜60%とし、部分的にGCリッチ又はATリッチでないものとする。
・各プライマーが同程度のTm値を有する。
・目的遺伝子に特異的/比較的特定性の高い配列に設計する。配列の特異性等については、NCBIのBLAST検索などを用いて確認することができる。
・プライマー内部又はプライマー間で3塩基以上の相補的配列を有さない。
・3’末端の塩基がTになるプライマーは避ける。
・3’末端の塩基がGになるプライマーは避ける。
・プローブのサイズは10〜30塩基程度とする。
・プローブのGC含量は20〜80%とし、配列内に4塩基以上Gの連続を有さない。
・プライマーよりも高い(例えば8〜10℃程度高い)Tm値を有する。
・標的配列に特異的/比較的特定性の高い配列に設計する。配列の特異性等については、NCBIのBLAST検索などを用いて確認することができる。
・5’末端が蛍光物質(例えば、6−FAMTM、TETTM、VICTM、HEXTM、NEDTM、PET等)で標識されていている。
・3’末端が消光物質(クエンチャー)(例えば、TAMRA、ROX等)で標識されていている。
(i)配列番号1に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(ii)配列番号2に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(iii)配列番号3に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(iv)配列番号4に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
プローブは配列番号5に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むものを利用することができる。
(v)配列番号6に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(vi)配列番号7に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
プローブは配列番号8に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むものを利用することができる。
(vii)配列番号9に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(viii)配列番号10に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
プローブは配列番号11に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むものを利用することができる。
または、食物アレルゲンが落花生である場合、プライマーセットは以下の(ix)のオリゴヌクレオチドと、(x)のオリゴヌクレオチドを含み:
(ix)配列番号22に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(x)配列番号23に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
プローブは配列番号24に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むものを利用することができる。
5’−CATGGTGGGCGTCCTCGCTTTATCAATGCAGTGCATCCGGCGCGCAGCTGGCATTATGGCCTTT−3’(配列番号19)
5’−CGCCAAGGACCACGAACAGAAGCGCGTCCCGAGCCTCCCGGTCCCCGGGCGGCACGGCGGCGTCGCGTCGTTTCTACGAAACAGAACGACTCTCGGCAACG−3’(配列番号20)
5’−CAAAACCCCGGCGCGGAAAGCGCCAAGGAAGCCAAACGTTTCTGCTCTCCCCGCCGGCTCCGGAGACGGCATCCGGTCGGGGCGAC−3’(配列番号21);
5’−TTGGTTCAAAGAGACGGGCTCTTGGTGGGGAGCGGCACCGCGGCAGATGGTGGTCGAGAACAACCCTCGTG−3’(配列番号25)
式中、「A260値」は分光光度計によって得られた波長260nmにおける吸光値、「L」はDNA(あるいは当該DNAを含むプラスミド又はベクター)のサイズ(bp)、「V」は溶液量(μL)を示す。
1.吸光度測定では区別できない標的配列以外の夾雑DNAや標的配列の分解DNAなどを測定しないため、PCR増幅可能な標的配列のコピー数のみを測定可能であること;
2.吸光度測定よりも低いコピー数で測定可能であること。
従って、測定原理の違いや1.に記載の利点から、吸光度測定とDigital PCR測定とでは、同一試料であっても異なるコピー数として算出され得る。
また、2.に記載の利点から、判定基準とする食物アレルゲン由来のDNAのコピー数に近い濃度(例えば200−2000コピー/μL)での定量が可能であり、濃度測定後の希釈によるばらつきを抑え得る。
1)DNA抽出量とDNA分解度の分析
リアルタイムPCR検査が難しい加工食品を選定する指標として、(1)DNA抽出量と(2)DNA分解度を用いることができる。加工食品はそれぞれ異なる原材料を含んでおり、食品毎に1g(又は単位重量)あたりから抽出されてくるDNA量は異なる。そのため、同量のアレルゲンを含む食品であっても、抽出されたDNA量が多いもの程、希釈率が高くなるため、20ng/μLに調整した鋳型DNA試料液中に含まれる食物アレルゲンのDNA濃度は低くなる。よって、DNAが多く抽出されるもの程、検査が難しい食品であるといえる。また、多くの加工食品では、食品自体のpHや加工による加熱などによりDNAが短く分解されており、その程度も異なる。そのため、同量のアレルゲンを含む食品であっても、抽出されたDNAの分解が進んでいるもの程、食物アレルゲンのDNA由来の標的配列を含むDNA分子の残存量は少なくなる。よって、DNAが短く断片化されているもの程、リアルタイムPCR検査が難しい食品であるといえる。
市販されているさまざまな種類の加工食品について、下記方法により抽出DNA量とDNA分解度を求めた。
DNA抽出はQIAGEN社製のGenomic−tip 20/Gを用い、以下の方法で行った。
細かく粉砕した試料約2gを50mL容チューブに入れ、7.5mLのBuffer G2、20μLのRNase A(100mg/mL)、200μLのプロテイナーゼK溶液を加え混合後、50℃にて2時間保温した。遠心分離により水層を回収し、予め1mLのBuffer QBTで平衡化したGenomic−tip 20/Gに供してDNAをカラムに吸着させた。その後、6mLのBuffer QCでカラムを洗浄し、1mLのBuffer QFでDNAを溶出させてイソプロパノール沈殿により沈殿物を回収した。TE buffer(pH8.0)に溶解後、260nmの吸光度を測定してDNA濃度を求め、食品2gから抽出されるDNA量(μg)を算出した。
上記方法で抽出したDNA試料をDNA濃度20ng/μLとなるようにTE buffer(pH8.0)を用いて適宜希釈した。それらDNA試料をDNA分析用マイクロチップ電気泳動装置MultiNA(島津製作所)に負荷し、DNA断片長によってそれぞれのDNAを分離した。DNA二重らせんにインターカレートする化合物を利用して得られた蛍光強度の極大値、および極大値に対応するDNA断片長(bp)を求めた。分析例を図1に示す。極大値に対応するDNA断片長は、DNA分解が激しいほど短くなる。
市販の加工食品38品の抽出DNA量とDNA断片長を上記方法により分析した(表1)。
リアルタイムPCR検査が難しいものとして選定された加工食品に含まれる食物アレルゲンを検出できる感度を持つPCR法であれば、それ以外の殆どの加工食品に含まれる食物アレルゲンも検出できると考えられる。そこで、上記で選定されたあさり水煮を模して作製した「一定量の食物アレルゲンを含むモデル加工食品」は、後述の陽性/陰性判定基準の設定に用いることができる。
・小麦
添加する小麦は、農林61号の全粒を用い、消費者庁が情報提供する「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」に従って小麦粉末を作製した。あさり水煮モデル加工食品150g相当の原料に添加する小麦粉末量は、15.45mgとした。
添加するそばは、ダッタンそば又は普通そばを用いた。日本国内で食されているそば粉の主な種類に、更科そば粉、やぶそば粉、ダッタンそば粉がある。これら3種のそば粉を、実施例1と同様の操作により抽出した単位重量あたりのDNA抽出量は、ほぼ同等であったが、リアルタイムPCRの検出感度を比較した結果、同量のDNAからの増幅シグナルの立上がり(Ct値)はダッタンそば粉が遅かったため、一番検査が難しいと判断した。そこで、消費者庁が情報提供する「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」に従ってダッタンそば粉末を添加試料の一つとして作製した。また、普通そばは更科そば粉、やぶそば粉の原料であり、最も流通量が多いことから、普通そば粉末も添加試料の一つとして作製した。あさり水煮モデル加工食品150g相当の原料に添加するダッタンそば又は普通そばの粉末量は、いずれも20.16mgとした。
添加する落花生は、千葉県産落花生を用い、消費者庁が情報提供する「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」に従って落花生粉末を作製した。あさり水煮モデル加工食品150g相当の原料に添加する落花生粉末量は、6.75mgとした。
あさり水煮加工食品は、日本缶詰協会発行の『缶・びん詰・レトルト食品・飲料製造講義II(各論編)』を参考とし、原料に上記量にて小麦、ダッタンそば又は普通そば、落花生粉末を添加して、アレルギー物質を含むモデル加工食品の作製を行った。すなわち、2L容ビーカーにクエン酸3ナトリウム40g、リン酸水素2ナトリウム20gを量り入れ、2Lの蒸留水で攪拌溶解した液をあさり浸透液(pH8.8)とした。500mL容ビーカーに塩化ナトリウム3.56g、クエン酸2.4g、クエン酸3ナトリウム2.4gを量り入れ、400mLの蒸留水で攪拌溶解した液を調味液(pH3.98)とした。寸胴鍋にたっぷりの水を沸騰させ、500g冷凍生あさりむき身を入れ3分間ボイルした。湯切り後のあさり重量を量り、あさり重量の2倍以上の浸透液に30分以上浸漬させた。レトルトパウチに浸透液を軽く切ったあさり100g、調味料50g、上述の量の小麦、ダッタンそば又は普通そば、落花生粉末を入れ、密閉して混合した。蒸気式レトルト殺菌釜にて122℃にて33分(F0値=35)殺菌後、10分間の水冷却を行った。レトルトパウチから内容物を取り出し、ミルサーで粉砕均一化し、2gずつに分けて冷凍保存した。
以下、これをあさり水煮モデル加工食品(陽性モデル)とする。なお、別途、小麦、ダッタンそば又は普通そば、落花生粉末を添加しない陰性モデルも作製した。
実施例2で得られたあさり水煮モデル加工食品が適切に作製されたことを確認するために、以下の評価を行った。
作製したあさり水煮モデル加工食品(陽性モデル)に各食物アレルゲンタンパク質が10μg/g含まれていることを確認するため、小麦、そば、落花生のELISA測定を行った。チューブに分注したうちの任意の2試料を2回反復で市販ELISAキット(モリナガFASPEK特定原材料測定キット、森永生科学研究所社製)を用いてマニュアルに従って定量した。
食品メーカー3社から販売されている市販品あさり水煮缶と作製したあさり水煮モデル加工食品(小麦、ダッタンそば、落花生を添加した陽性モデル、および陰性モデル)を、実施例1の方法により、抽出DNA量と分解程度を分析し、加工食品の検査の難しさ評価グラフにプロットした結果(図3)、モデル加工食品は市販品と近い位置にプロットされることが確認された。また、モデル加工食品と市販品とで、あさり重量割合、粉砕して測定したpHに大差ないことが確認できた(表2)。これらの結果より、作製したあさり水煮モデル加工食品は、市販品と同様に、リアルタイムPCR検査が難しい加工食品の一つとして妥当と判断した。
作製したあさり水煮モデル加工食品からDNAを抽出し、PCR増幅によるDNA品質の確認を行った。DNA抽出は実施例1のDNA抽出法と同様の操作で行った。PCR増幅確認は消費者庁通知の『アレルギー物質を含む食品の検査方法』に記載されている動物検出用PCRプライマー及び反応条件を用いて、DNAが増幅されることを確認した。
上記で抽出したDNAを小麦検出、そば検出、落花生検出(配列番号9、10、11または配列番号22、23、24に示されるプライマー、プローブ)のリアルタイムPCR検査に供し、作製したあさり水煮モデル加工食品への小麦、そば、落花生粉末の添加の有無によって、Ct値が得られる/得られないことを確認した。
小麦検出の定性リアルタイムPCRでは、12.5μLの2×QuantiTect Probe PCR Master Mixに、配列番号1のプライマーを終濃度で0.2μMと、配列番号2のプライマーを終濃度で0.1μMと、配列番号3と配列番号4のプライマーを終濃度でそれぞれ0.05μMと、配列番号5のTaqMan MGBプローブを終濃度で0.1μM、鋳型DNAを加え、最終的に滅菌超純水で25μLとした。
配列番号1:5’−CATGGTGGGCGTCCTC−3’
配列番号2:5’−AAAGGCCATAATGCCAGCTG−3’
配列番号3:5’−TGAGGCCGTCATGCCGGCTG−3’
配列番号4:5’−TGAGGCCATAATGTCGGCTG−3’
配列番号5:5’−CGGATGCACTGCITTGATAAAG−3’
そば検出の定性リアルタイムPCRでは、12.5μLの2×QuantiTect Probe PCR Master Mixに、配列番号6のプライマーを終濃度で0.2μMと、配列番号7のプライマーを終濃度で0.2μMと、配列番号8のTaqMan MGBプローブを終濃度で0.1μM、鋳型DNAを加え、最終的に滅菌超純水で25μLとした。
配列番号6:5’−CGTTGCCGAGAGTCGTTCTGTTT−3’
配列番号7:5’−CGCCAAGGACCACGAACAGAAG−3’
配列番号8:5’−CGGGACGCGCTTC−3’
落花生検出の定性リアルタイムPCRでは、12.5μLの2×QuantiTect Probe PCR Master Mixに、配列番号9のプライマーを終濃度で0.2μMと、配列番号10のプライマーを終濃度で0.2μMと、配列番号11のTaqMan MGBプローブを終濃度で0.1μM、鋳型DNAを加え、最終的に滅菌超純水で25μLとした。あるいは、12.5μLの2×QuantiTect Probe PCR Master Mixに、配列番号22のプライマーを終濃度で0.2μMと、配列番号23のプライマーを終濃度で0.2μMと、配列番号24のTaqMan MGBプローブを終濃度で0.1μM、鋳型DNAを加え、最終的に滅菌超純水で25μLとした。
配列番号9:5’−CAAAACCCCGGCGCGGAAA−3’
配列番号10:5’−GTCGCCCCGACCGGATGC−3’
配列番号11:5’−TGCTCTCCCCGCCGGC−3’
配列番号22:5’−TTGGTTCAAAGAGACGGGCTC−3’
配列番号23:5’−CACGAGGGTTGTTCTCGACC−3’
配列番号24:5’−ACCGCGGCAGATGG−3’
以上の評価結果から、小麦、そば、落花生粉末を添加したあさり水煮モデル加工食品が適切に作製されたと判断した。
小麦PCR、そばPCR、落花生PCR(配列番号9、10、11に示されるプライマー、プローブ)の標的DNA配列をそれぞれ含む3つの増幅産物をPCRにより1つに連結して、それをTAクローニングベクターに導入して、大腸菌に形質転換した。形質転換した大腸菌からプラスミドを精製して、導入した塩基配列を確認した。
小麦のPCR標的DNA配列を含む増幅産物を得るためのPCRは、12.5μLの2×HotStarTaq Master Mixに、プライマーセットとして配列番号1(上記小麦フォワードプライマー)と配列番号12(制限酵素消化部位+小麦リバースプライマー)をそれぞれ終濃度で0.2μMと、鋳型DNAとして普通小麦(Triticum aestivum)由来DNAを用い、最終的に滅菌超純水で25μLとしてPCR反応液を入れた容器をPCR装置にセットし、95℃,15分の後、94℃,30秒(変性)に続いて66℃,1分(アニーリングおよび伸長ステップ)を行うサイクルを45回繰り返して反応させた。
以下に、本実施例にて新たに合成・使用したプライマー配列を記す。
配列番号13:5’−TCTAGACGCCAAGGACCACGAACAGAAG−3’
配列番号14:5’−AAGCTTCGTTGCCGAGAGTCGTTCTGTTTGG−3’
配列番号15:5’−GCTAGCCAAAACCCCGGCGCGGAAACCGCCAAGGAAGC−3’
上記で得られた3つのPCR産物を、Jayaraman Kら(1992.A PCR−Mediated Gene Synthesis Strategy Involving the Assembly of Oligonucleotides Representing Only One of the Strands.BioTechniques 12:392―398)の方法を参考にして、QIAGEN社製のHotStarTaq MasterMix Kitを用いて以下の方法により連結し、連結DNAを作製した。
結果、予想された約275bp付近のPCR増幅産物が得られた(データ省略)。
以下に、本実施例にて新たに合成・使用したプライマー配列を記す。
配列番号17:5’−GCTAGCCAAAACCCCGGCGCGGAAAC−3’
配列番号18:5’−TCCGGTCGGGGCGACTCTAGACGCCAAGGACCACG−3’
上記で得られた連結PCR産物を、pGEM−T Easy Vector System(Promega社製)を用いてpGEM−T Easy VectorにTA cloningし、大腸菌(E.coli DH5α)に形質転換した。コロニーPCRにより小麦、そば、落花生PCRの標的DNA配列を含む約277bpの挿入断片が含まれていることを確認できた。導入断片を持つ形質転換体をLB培地で液体培養して、菌体からQIAGEN社製のQIAprep Spin Miniprep Kitを用いてプラスミドを抽出、精製した。なお、精製したプラスミドに導入されたDNA断片の塩基配列は、プラスミド上にある配列のプライマーを用いた両鎖シークエンスにより解析した結果、意図した通り、形質転換体のプラスミドに導入されたDNA断片の塩基配列には、小麦PCR、そばPCR、落花生PCR(配列番号9、10、11に示されるプライマー、プローブ)の標的DNA配列がそれぞれ含まれていることが確認できた。
プラスミド溶液のコピー数ベースでの濃度は、分光光度計で測定された260nmの吸光度「A260値」、一般的な吸光度とDNA濃度の関係式「260nmの吸光度1におけるDNA濃度50ng/μL」、プラスミドの長さ「3,292bp」、DNAの平均分子量「660/塩基対」から下記式(2’)により算出した。PCR反応の鋳型とするプラスミド溶液の濃度調整は、サケ精子DNA 20ng/μL含有TE Buffer(pH8.0)を用いて希釈した。
小麦PCR、そばPCR、及び落花生PCR(配列番号22、23、24に示されるプライマー、プローブ)の標的DNA配列をそれぞれ含む配列を人工遺伝子合成装置にて直列に合成し、クローニングベクターに導入して、大腸菌に形質転換した。形質転換した大腸菌からプラスミドを精製して、導入した塩基配列を確認した。
人工遺伝子作製サービス(ファスマック社)に委託して、下記配列をpUC19のSmaIサイトに含む環状プラスミドを作製した。
配列番号26:5’−CATGGTGGGCGTCCTCGCTTTATCAATGCAGTGCATCCGGCGCCCAGCTGGCATTATGGCCTTTCGCCAAGGACCACGAACAGAAGCGCGTCCCGAGCCTCCCGGTCCCCGGGCGGCACGGCGGCGTCGCGTCGTTTCTACCAAACAGAACGACTCTCGGCAACGTTGGTTCAAAGAGACGGGCTCTTCGTGGGGAGCGGCACCGCGGCAGATGGTGGTCGAGAACAACCCTCGTG−3’
プラスミドに組込まれた配列の増幅は、直鎖状プラスミドの方が、環状プラスミドよりも早いサイクル数で増幅することが知られている。そこで、制限酵素消化によって直鎖状プラスミドを作製した。
プラスミド溶液のコピー数ベースでの濃度は、分光光度計で測定された260nmの吸光度「A260値」、一般的な吸光度とDNA濃度の関係式「260nmの吸光度1におけるDNA濃度50ng/μL」、プラスミドの長さ「2,922bp」、DNAの平均分子量「660/塩基対」から下記式(2’’)により算出した。PCR反応の鋳型とするプラスミド溶液の濃度調整は、サケ精子DNA 20ng/μL含有TE Buffer(pH8.0)を用いて希釈した。
PCR反応液は、15μLのQuantStudioTM 3D Digital PCR Master Mix,2X(ライフテクノロジーズジャパン社製)に、そば検出用である、配列番号6のプライマーを終濃度で0.2μMと、配列番号7のプライマーを終濃度で0.2μMと、配列番号8のTaqMan MGBプローブを終濃度で0.1μM、鋳型DNAは直鎖状ポジティブコントロールプラスミドを用い、量は吸光度から計算された量で1000コピー/μLとなる濃度をPCR反応液に12μL(2/5量)加え、最終的に滅菌超純水で30μLとした。
結果、吸光度から計算された量が1000コピー/μLとなるDNA溶液は、Digital PCRで検出された標的配列の濃度は598コピー/μLと算出された。
1)小麦、そば、落花生の定性リアルタイムPCR反応
実施例3で得られたあさり水煮モデル加工食品(陽性モデル)DNAと、実施例4又は実施例5で得られたポジティブコントロールプラスミドA又はBをそれぞれ鋳型として、小麦PCR、そばPCR、落花生PCR(ポジティブコントロールプラスミドAの時は配列番号9、10、11のプライマー、プローブ;ポジティブコントロールプラスミドBの時は配列番号22、23、24のプライマー、プローブ)の定性リアルタイムPCRを行ない、タンパク質濃度として10μg/g相当量の食物アレルゲンを含むあさり水煮モデルを陽性と判定するポジティブコントロールプラスミドのコピー数を決定した。リアルタイムPCRは、実施例3に示した方法で行い、ポジティブコントロールBを用いる場合のみサイクル数を40とした。
<PCR結果の解析方法>
まず、あさり水煮モデル加工食品(陽性モデル)DNA 50ngとポジティブコントロールプラスミド24,25,50,60,100,120コピーそれぞれの試料について「16回併行測定したCt値」から平均値(X)、標準偏差(σ)を算出した。次に、実際の食物アレルゲン検査において同一試料を2回併行測定することを想定して、これらの値から「2回併行測定したCt値の平均」の平均値X、標準偏差σ/√2を求めた。最後に、あさり水煮モデル加工食品(陽性モデル)の下限Ct値とプラスミド上限Ct値が重ならない標準偏差の最大の係数zを下記式(4’)で求め、式(4’)が成立する確率f(z)を下記式(5)で求めた。なお、Ct値の解析条件はそれぞれの装置に付属する解析ソフトのデフォルト条件で行ない、LightCycler NanoでCq値と呼ばれる値は、Ct値と読み替えた。
あさり水煮モデル加工食品(陽性モデル)は、実施例4のポジティブコントロールプラスミドAと比較した場合はそば粉末にダッタンそばを使用したモデルを用い、実施例5のポジティブコントロールプラスミドBと比較した場合はそば粉末に普通そばを使用したモデルを用いた。
・X2、σ2:ポジティブコントロールプラスミドの平均Ct値、標準偏差
ポジティブコントロールプラスミド24,25,50,60,100,120コピー/反応液、あさり水煮モデル加工食品抽出DNAをそれぞれ16点併行測定し、得られたCt値から、式(5)により式(4’)が成立する確率を算出した結果を下記表3に示す。
1)小麦、そば、落花生の定性リアルタイムPCR反応
実施例3で得られたあさり水煮モデル加工食品(陽性モデル)DNA、実施例4で得られたポジティブコントロールプラスミドA、実施例5で得られた直鎖状のポジティブコントロールプラスミドBをそれぞれ鋳型として、小麦、そば、落花生のリアルタイムPCRを行ない、タンパク質濃度として10μg/g相当量の食物アレルゲンを含むあさり水煮モデルに含まれる標的配列のコピー数をそれぞれ測定した。リアルタイムPCRは、機種はライフテクノロジーズ社製ABI PRISM 7900HTを用い、実施例3に示した方法で行い、ポジティブコントロールBを用いる場合のみサイクル数を40とした。
また、あさり水煮モデル加工食品(陽性モデル)は、実施例4のポジティブコントロールプラスミドAと比較した場合は、そば粉末にダッタンそばを使用したモデルを用い、実施例5の直鎖状のポジティブコントロールプラスミドBと比較した場合は、そば粉末に普通そばを使用したモデルを用いた。
まず、あさり水煮モデル加工食品(陽性モデル)DNA 50ngについて「16回併行測定したCt値」から平均Ct値を算出した。解析結果から得られた検量線を用いて平均Ct値からコピー数を算出した結果、あさり水煮DNA 50ng中の小麦、そば、落花生標的配列のコピー数は、実施例4で得られたポジティブコントロールプラスミドAから計算した場合でそれぞれ427,199,485コピーであり、実施例5で得られた直鎖状のポジティブコントロールプラスミドBから計算した場合でそれぞれ140,146,63コピーと算出された。
Claims (22)
- 飲食品又は飲食品原材料中に含まれる、小麦、そば及び落花生からなる群から選択される一以上の食物アレルゲンの有無を判定する方法であって、下記の工程(a)、(b)及び(c):
(a)飲食品又は飲食品原材料より抽出されたDNAを鋳型として、食物アレルゲン検出用のプライマーセットを用いてリアルタイムPCRを行い、増幅シグナルのCt値を得る工程;
(b)前記食物アレルゲン由来のDNAを鋳型として、工程(a)と同じ条件のリアルタイムPCRを行い、増幅シグナルのCt値を得る工程であって、
(b−1)該DNAが、前記プライマーセットの標的配列を含む環状の形態であり、かつ該DNAの量(コピー数)と工程(a)にて用いられる飲食品又は飲食品原材料より抽出されたDNAの量(ng)が24コピー数を上回る量:50ngとなる量比にてリアルタイムPCRに用いられる、あるいは
(b−2)該DNAが、前記プライマーセットの標的配列を含む直鎖状の形態であり、かつ該DNAの量(コピー数)と工程(a)にて用いられる飲食品又は飲食品原材料より抽出されたDNAの量(ng)が6コピー数を上回る量:50ngとなる量比にてリアルタイムPCRに用いられる、工程;及び
(c)工程(a)で得られたCt値と工程(b)で得られたCt値を比較する工程であって、工程(a)で得られたCt値が、工程(b)で得られたCt値以下である場合に、該飲食品又は飲食品原材料中に食物アレルゲンが含まれることを示す、工程
を含む方法。 - 飲食品又は飲食品原材料中にタンパク質濃度として10μg/g以上の量にて食物アレルゲンが含まれるものを陽性と判定する方法である、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)において50ng量の飲食品又は飲食品原材料より抽出されたDNAを鋳型として、かつ工程(b)において、24コピー数を上回る量の食物アレルゲン由来の環状のDNA又は6コピー数を上回る量の食物アレルゲン由来の直鎖状のDNAを鋳型として、それぞれリアルタイムPCRに用いられる、請求項1又は2に記載の方法。
- 工程(b)において、食物アレルゲン由来のDNAが環状のDNAである場合50コピー数又はそれ以上の量にて、又は食物アレルゲン由来のDNAが直鎖状のDNAである場合12.5コピー数又はそれ以上の量にて、リアルタイムPCRに用いられる、請求項3に記載の方法。
- 工程(c)において、工程(a)で得られたCt値が、工程(b)で得られたCt値未満である場合に、前記飲食品又は飲食品原材料中に食物アレルゲンが含まれることを示す、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 食物アレルゲンが小麦であり、使用するプライマーセットが以下の(i)のオリゴヌクレオチドと、(ii)−(iv)より選択される少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
(i)配列番号1に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
(ii)配列番号2に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
(iii)配列番号3に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
(iv)配列番号4に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド - 食物アレルゲンがそばであり、使用するプライマーセットが以下の(v)のオリゴヌクレオチドと、(vi)のオリゴヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
(v)配列番号6に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
(vi)配列番号7に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド - 食物アレルゲンが落花生であり、使用するプライマーセットが以下の(vii)のオリゴヌクレオチドと、(viii)のオリゴヌクレオチドを含むか、あるいは以下の(ix)のオリゴヌクレオチドと、(x)のオリゴヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
(vii)配列番号9に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および
(viii)配列番号10に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、あるいは
(ix)配列番号22に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および
(x)配列番号23に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド - リアルタイムPCRによる増幅産物の検出を、蛍光標識されたプローブを用いて行う、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 飲食品又は飲食品原材料中に含まれる食物アレルゲンの有無をリアルタイムPCR法により判定する方法に用いられるキットであって、
食物アレルゲン検出用のプライマーセット、及び
食物アレルゲン由来のDNAであって、該DNAが前記プライマーセットの標的配列を含む環状の形態であり、24コピー数を上回る量にて存在するか、もしくは該DNAが前記プライマーセットの標的配列を含む直鎖状の形態であり、6コピー数を上回る量にて存在する、
を含み、
食物アレルゲンが小麦であり、プライマーセットが以下の(i)のオリゴヌクレオチドと、(ii)−(iv)より選択される少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを含む上記キット。
(i)配列番号1に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
(ii)配列番号2に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
(iii)配列番号3に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
(iv)配列番号4に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド - さらに、リアルタイムPCRによる増幅産物の検出を行うための蛍光標識されたプローブを含む、請求項10に記載のキット。
- 前記プローブが、配列番号5に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む蛍光標識されたプローブである、請求項11に記載のキット。
- 食物アレルゲン由来のDNAが、配列番号19の塩基配列からなるDNAを含む、請求項10〜12のいずれか1項に記載のキット。
- 飲食品又は飲食品原材料中に含まれる食物アレルゲンの有無をリアルタイムPCR法により判定する方法に用いられるキットであって、
食物アレルゲン検出用のプライマーセット、及び
食物アレルゲン由来のDNAであって、該DNAが前記プライマーセットの標的配列を含む環状の形態であり、24コピー数を上回る量にて存在するか、もしくは該DNAが前記プライマーセットの標的配列を含む直鎖状の形態であり、6コピー数を上回る量にて存在する、
を含み、
食物アレルゲンがそばであり、プライマーセットが以下の(v)のオリゴヌクレオチドと、(vi)のオリゴヌクレオチドを含む、上記キット。
(v)配列番号6に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
(vi)配列番号7に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド - さらに、リアルタイムPCRによる増幅産物の検出を行うための蛍光標識されたプローブを含む、請求項14に記載のキット。
- 前記プローブが、配列番号8に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む蛍光標識されたプローブである、請求項15に記載のキット。
- 食物アレルゲン由来のDNAが、配列番号20の塩基配列からなるDNAを含む、請求項14〜16のいずれか1項に記載のキット。
- 飲食品又は飲食品原材料中に含まれる食物アレルゲンの有無をリアルタイムPCR法により判定する方法に用いられるキットであって、
食物アレルゲン検出用のプライマーセット、及び
食物アレルゲン由来のDNAであって、該DNAが前記プライマーセットの標的配列を含む環状の形態であり、24コピー数を上回る量にて存在するか、もしくは該DNAが前記プライマーセットの標的配列を含む直鎖状の形態であり、6コピー数を上回る量にて存在する、
を含み、
食物アレルゲンが落花生であり、使用するプライマーセットが以下の(vii)のオリゴヌクレオチドと、(viii)のオリゴヌクレオチドを含む、あるいは、以下の(ix)のオリゴヌクレオチドと、(x)のオリゴヌクレオチドを含む、上記キット。
(vii)配列番号9に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および
(viii)配列番号10に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、あるいは
(ix)配列番号22に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および
(x)配列番号23に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド - さらに、リアルタイムPCRによる増幅産物の検出を行うための蛍光標識されたプローブを含む、請求項18に記載のキット。
- 前記プローブが、配列番号11に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む蛍光標識されたプローブ、あるいは配列番号24に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む蛍光標識されたプローブである、請求項19に記載のキット。
- 食物アレルゲン由来のDNAが、配列番号21の塩基配列からなるDNA、あるいは配列番号25の塩基配列からなるDNAを含む、請求項18〜20のいずれか1項に記載のキット。
- 食物アレルゲン由来のDNAを環状の形態にて50コピー数又はそれ以上の量にて含むか、あるいは、食物アレルゲン由来のDNAを直鎖状の形態にて12.5コピー数又はそれ以上の量にて含む、請求項10〜21のいずれか1項に記載のキット。
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