CN111172311B - 大豆核桃过敏原基因二重荧光定量pcr检测试剂盒 - Google Patents

大豆核桃过敏原基因二重荧光定量pcr检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒。该技术方案针对大豆过敏原基因GlymBd 28K和核桃过敏原基因jug r1设计特异性的探针和引物，组成大豆核桃二重荧光定量PCR引物和探针组合，该试剂盒可对两种过敏原成分同时实现检测作用。在此基础上，本发明通过构建大豆核桃过敏原基因标准质粒，优化二重荧光定量PCR反应体系以及引物探针浓度、退火温度优化，构建标准曲线，分别进行特异性试验、重复性试验和敏感性试验，对本发明的检测效果进行了验证。本发明提供的试剂盒具有高效、快速、特异性好等特点，能在1～2h之内得出结果，满足快速检测食品中大豆核桃过敏原的要求。

Description

大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域，进一步涉及基于基因检测技术的食物过敏原检测试剂盒，具体涉及一种大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒。
背景技术
近几年来，由于过敏性疾病发病率的增加和转基因技术的发展、转基因农作物的商品化等因素，人们开始重新评价食物过敏带来的问题，食物过敏对大众健康的影响也才开始受到重视，成为一种全球关注的公共卫生问题。实验室中用来鉴别致敏成分的常用方法主要是基于酶联免疫吸附实验(ELISA)和PCR反应。在食品安全方面，ELISA技术已广泛应用于兽药残留、农药残留、动植物疫情、有害微生物、动植物毒素等方面的快速检测分析，并取得了较好的效果。随着人们对食品过敏认识的深入和重视程度的加强，越来越多的ELISA技术已被开发出来，用于食品中致敏原蛋白提取物和特殊食品致敏原的检测和定量分析。
此外，致敏物质的DNA分子可以通过PCR技术来扩增，在PCR过程中DNA分子的引物也得到了扩增。产物即可利用分子量的大小在琼脂糖电泳上进行分离。一般来说，选择合适的引物可使具有一定同源性的DNA分子之间的交叉反应降低到最低程度，尽可能地减少假阳性结果的产生。PCR技术的这一特点使得它在检测致敏物质方面相对于其他检测方法具有很大的优势。
国际上，对食品致敏成分的研究从上个世纪80年代开始越来越受到人们的关注。而且各国政府和机构也越来越重视在食品标签上标注致敏成分。欧盟联合法律EC89/2003规定，在其管辖范围内出售的含有花生、坚果、鸡蛋、牛奶、甲壳类、鱼类、芝麻、含麸质谷类、大豆、芹菜、芥末、每千克或每升在10毫克以上的硫碘氧化物和亚硫酸盐的食品都必须在其产品标签中标明。除食品法典委员会所确定的八类致敏原物质及10mg/kg以上的亚硫酸盐外，还包括芹菜、羽扇豆、软体动物及这几类产品致敏原标签和消费者保护方案，规定所有在美国销售的包装食品必须符合有关食品致敏原标注要求，其中致敏原主要指：牛奶、蛋、鱼类、甲壳贝类、坚果类、小麦、花生、大豆等8种成分；其它国家包括韩国、日本、加拿大、澳大利亚也都要求在其本国销售的食品标签中标注其中所含有的致敏成分。
我国虽然研究食品致敏成分的工作开展得相对较晚，但随着经济发展水平和人们生活水平的提高，以及人们对饮食和健康的重视，食品致敏成分的研究工作得以顺利开展而且取得了很大的进展。而且，自我国加入WTO以来，国际化进程的加速也对我国在食品安全方面提出了更高的要求，因此我国先后颁布了一些相关的国家标准和地方标准，包括中华人民共和国出入境检验检疫行业标准、北京市标准化指导性技术文件、广州市地方技术规范及中华人民共和国国家标准。
为了能够有效检测食品中的致敏成分，避免因为没有发现或标注不完善而引发的食物过敏现象，各国先后发展了免疫印迹法、ELISA法、PCR法、等离子共振免疫法等实验室方法用于检测食物致敏原，并逐步建立了可以用于检测食品中的花生、面筋、大豆、鱼、虾等致敏原的检测方法。然而，现有方法在检测效果方面存在着不同程度的缺陷。其中，部分方法以蛋白作为检测目标，由于在产品加工过程中蛋白易遭到破坏，因此导致此类方法的可靠性难以保证；相对于蛋白而言，DNA性质比较稳定，以其作为检测目标更加可靠，因此PCR法在此方面具有一定的优势，然而，选择何种基因作为检测目标，采用怎样的检测方法才能保证检测的特异性和灵敏性，现有技术尚未获得理想的解决方案。此外，在目前的检测技术中，无法在一个反应体系中检测两种过敏原，使得针对多种过敏原的检测只能分别进行。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒，以解决现有技术中缺乏此类试剂盒的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是，如何在一个反应体系中同时检测大豆过敏原、核桃过敏原两种成分。
本发明要解决的再一技术问题是，对基于基因检测的核桃过敏原成分检测试剂盒，如何充分保证其特异性和灵敏性。
本发明要解决的又一技术问题是，对基于基因检测的大豆过敏原成分检测试剂盒，如何充分保证其特异性和灵敏性。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括用于扩增大豆基因GlymBd 28K的引物及用于标记大豆基因GlymBd 28K的探针，还包括用于扩增核桃基因jug r 1的引物及用于标记核桃基因jug r 1的探针。
作为优选，所述用于扩增大豆基因GlymBd 28K的引物分别是序列为GCTGCAGATAACGTGAAG和CTAGCGGAAAGGAGATTG的核苷酸片段，所述用于标记大豆基因GlymBd28K的探针是序列为CTCTGACCTTCTCCTATGTTCACCAA的核苷酸片段。
作为优选，所述用于扩增核桃基因jug r 1的引物分别是序列为AGTGCATATTTCATACCTTTC和CGATCTCCATGGTTGTTA的核苷酸片段，用于标记核桃基因jug r 1的探针是序列为CAATGACCAGGCTCGCAACTC的核苷酸片段。
作为优选，该试剂盒包括以下反应体系：Taq Premix Ex Taq TM(Probe qPCR)(2×Conc.)10μL，用于扩增大豆基因GlymBd 28K的上游引物0.5μL，用于扩增大豆基因GlymBd28K的下游引物0.5μL，用于标记大豆基因GlymBd 28K的探针0.25μL，用于扩增核桃基因jugr 1的上游引物0.5μL，用于扩增核桃基因jug r 1的下游引物0.5μL，用于标记核桃基因jugr 1的探针0.25μL，模板1μL，灭菌水补齐至20μL。
作为优选，所述模板为待测样本的DNA；该试剂盒还包括用于提取待测样品DNA的提取试剂。
作为优选，所述模板为大豆标准质粒和核桃标准质粒。
作为优选，所述大豆标准质粒是通过以下方法构建的：取大豆植株的新鲜叶片，提取总DNA，以其为模板PCR扩增大豆GlymBd 28K基因，扩增产物经分离纯化后加一个粘性末端A尾，而后与pMD18-T载体连接，而后将连接产物转入感受态的大肠杆菌E.coli DH5α中，从菌液中提取质粒，经鉴定得到所述大豆标准质粒。
作为优选，所述以其为模板PCR扩增大豆GlymBd 28K基因，此过程所采用的上下游引物分别是序列为CTAGAAACATTGGAAACACC的核苷酸片段和序列为ATCACATACCCTCAAGACAT的核苷酸片段；此过程的PCR反应体系为：上、下游引物各1μL，提取的植物DNA模板1μL，primer STAR GXL酶0.5μL，5×buffer 5μL，dNTP 1μL，ddH2O补齐至25μL。
作为优选，所述核桃标准质粒是通过以下方法构建的：取核桃植株的新鲜叶片，提取总DNA，以其为模板PCR扩增核桃jug r 1基因，扩增产物经分离纯化后加一个粘性末端A尾，而后与pMD18-T载体连接，而后将连接产物转入感受态的大肠杆菌E.coli DH5α中，从菌液中提取质粒，经鉴定得到所述核桃标准质粒。
作为优选，所述以其为模板PCR扩增核桃jug r 1基因，此过程所采用的上下游引物分别是序列为TTCAACGTGACCATCTCCCC的核苷酸片段和序列为ACACGAGGATGTGCTTGCTA的核苷酸片段；此过程的PCR反应体系为：上、下游引物各1μL，提取的植物DNA模板1μL，primerSTAR GXL酶0.5μL，5×buffer5μL，dNTP 1μL，ddH2O补齐至25μL。
本发明提供了一种大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒。该技术方案针对大豆过敏原基因GlymBd 28K和核桃过敏原基因jug r1设计特异性的探针和引物，组成大豆核桃二重荧光定量PCR引物和探针组合，该试剂盒既可检测单个大豆敏原基因或者核桃过敏原基因，又可对二者同时加以检测，且二者之间不互相发生反应，进一步提高了检测的特异性。在此基础上，本发明通过构建大豆核桃过敏原基因标准质粒，优化二重荧光定量PCR反应体系以及引物探针浓度、退火温度优化，构建标准曲线，分别进行特异性试验、重复性试验和敏感性试验，对本发明的检测效果进行了验证。本发明提供的试剂盒具有高效快速等特点，能在1～2h之内得出结果，满足快速检测食品中大豆核桃过敏原的要求；而且该方法不需要凝胶电泳鉴定，大大缩短了检测时间。
附图说明
图1是本发明二重荧光定量反应预实验的结果图。
图2是本发明具体实施方式中建立的二重荧光定量标准曲线。
图3是本发明二重荧光定量PCR反应的特异性试验结果图；图中，1、核桃；2、大豆；3、小麦；4、燕麦；5、杏；6、梨；7、苹果；8、樱桃；9、李子；10、青椒；11、西红柿；12、玉米；13、葱；14、马铃薯；15、蒜。
图4是本发明二重荧光定量PCR反应的敏感性试验结果图。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
大豆，核桃，小麦，燕麦，杏，梨，苹果，樱桃，李子，青椒，西红柿，玉米，葱，马铃薯，蒜等十五种植物，并按照(1)中方法提取植物DNA备用。
所需设备：
Applied Biosystems 7500定量PCR仪(Thermo Fisher Scientific)
CFX96 Real-Time PCR Detection System(BIO-RAD)
Multiskan GO微量核酸蛋白检测系统(Thermo Fisher Scientific)
Centrifuge 5424R小型高速冷冻离心机(Eppendorf)
DYY-6D电泳仪(北京六一)
OSE-470L TGreen切胶仪/蓝光透射仪(天根生化科技(北京)有限公司)
ZWY-2102C立式恒温振荡摇床(上海智城)
实验流程：
(1)在NCBI上查找过敏原基因，并设计特异性引物，构建标准质粒。
大豆引物：Prime-F:CTAGAAACATTGGAAACACC；
Prime-R:ATCACATACCCTCAAGACAT
核桃引物：Prime-F:TTCAACGTGACCATCTCCCC
Prime-R:ACACGAGGATGTGCTTGCTA
(2)大豆、核桃植物DNA提取。
取植物叶片置于1.5ml离心管中，先加入少量CTAB(2％)，研磨后加入400μL CTAB，轻轻混匀。65℃温浴40min，期间轻轻混匀。取出样品，放置室温后加入等体积于CTAB的；氯仿：异戊醇(24:1)，并轻轻混匀。室温离心，12,000rpm，10min。将400μL上清液转移到新的离心管中，加入800μL无水乙醇充分混匀后置于-20℃冰箱中4h以上。室温离心，13,000rpm，10min。弃掉上清液，加入4℃预冷的70％乙醇1ml，室温静置5-10min。室温离心，12,000rpm，5min，弃掉上清，于60℃恒温仪上放置2-5min，蒸干多余乙醇。
(3)分别扩增大豆和核桃目的基因片段。
PCR反应体系，加入步骤(1)中的上下游引物各1μL，提取的植物DNA模板1μL，primer STAR GXL酶0.5μL，5×buffer 5μL，dNTP 1μL，ddH2O补齐至25μL。
反应条件：94℃，30s，54℃，30s，72℃，1min；
(4)大豆和核桃标准质粒的制备。
将步骤(3)中扩增的PCR产物进行切胶纯化，纯化后的产物加一个粘性末端A尾后与pMD18-T载体进行连接后转入大肠杆菌DH5α中，在含氨苄青霉素的筛选培养基上进行筛选后，挑取白色重组质粒聚落进行摇菌培养。提取菌液中的重组质粒，双酶切鉴定后送阳性的重组菌株到宝生物工程(大连)有限公司公司进行测序。
将测序成功的大豆质粒和核桃质粒用酶标仪测定其DNA浓度后，计算其拷贝数。后将其稀释成相同浓度1.50×1011copies/μL，混匀，-20℃保存。
(5)荧光定量PCR探针和引物设计。
大豆：Prime-F1:GCTGCAGATAACGTGAAG
Prime-R1:CTAGCGGAAAGGAGATTG
Probe:CTCTGACCTTCTCCTATGTTCACCAA
核桃：Primer-F1:AGTGCATATTTCATACCTTTC
Prme-R1:CGATCTCCATGGTTGTTA
Probe:CAATGACCAGGCTCGCAACTC
以大豆和核桃质粒为模板，进行荧光定量PCR反应，体系如以下表1所示：
表1荧光定量PCR反应体系
Figure BDA0002358865160000061
Figure BDA0002358865160000071
两步法反应，95℃，5min，95℃，15s，57℃，30s，39个循环。
(6)结果判定。
根据仪器的扩增曲线可以看出含有质粒模板的点样孔出现扩增曲线，而阴性对照组没有出现扩增曲线，判定检测结果成立。
(7)体系优化。
上下游引物浓度按照5.0～20.0μmol/L两步法进行优化，第一步以2.5μmol/L的间隔共设置7个梯度，第二步以0.5μmol/L的间隔共设置11个梯度。探针浓度按照2.5～20.0μmol/L两步法进行优化，第一步以2.5μmol/L的间隔共设置8个梯度，第二步以1.25μmol/L的间隔共设置5个梯度。退火温度按照50.0～60.0℃两步法进行优化，第一步和第二步均根据荧光定量仪器设置8个梯度，第二步优化范围根据第一步优化结果来确定。
(8)标准曲线建立。
将稀释成1.50×1011copies/μL的质粒进行十倍稀释，取1.50×109-1.50×103copies/μL七个浓度为模板，以优化好的探针引物浓度加入体系中进行PCR反应。
结果如图2所示，R2值分别为大豆0.993，核桃0.999，斜率为大豆-3.210，核桃-3.371，由此可得拷贝数(X)和Ct值之间的线性表达关系为大豆Y＝-3.210lgX+40.587，核桃Y＝-3.371lgX+2.248；
(9)特异性试验
将提取的大豆核桃小麦等15种DNA为模板加入反应体系中，以优化好的反应条件(7)进行反应。
结果如图3所示。Ct值分别为5.6和8.3
(10)敏感性试验。
根据优化好的条件进行敏感性试验，以1.50×105copies/μL-1.50×10-7copies/μL的核桃大豆混合质粒为模板，进行PCR反应。
结果如图4所示，二重荧光定量PCR的检测结果最低检测限为1.50×10-5co pies/μL
(11)重复性试验
分别以四个浓度1.50×108copies/μL，1.50×106copies/μL，1.50×104copies/μL，1.50×102copies/μL的大豆核桃混合质粒为模板，进行三次重复。
结果显示，扩增结果均为阳性，并且组间变异系数分别为第一组浓度1.53％和1.52％，第二组浓度1.70％和1.99％，第三组浓度1.46％和1.55％，第四组浓度为1.91和1.89％，结果均在2％，说明该方法的稳定性和重复性良好。
加工食品检测
自超市购买一百种加工食品，其中，50种加工食品包装袋上标有过敏原信息，50种加工食品包装袋上没有标有过敏原信息。提取这一百种加工食品DNA，并以建立好的二重荧光定量PCR方法进行过敏原检测。
结果显示，有过敏原信息标签的加工食品检测结果均为阳性，未标有过敏原信息的加工食品中，有10种结果为阳性，通过食品配料表可看出，食品配方中存在大豆成分。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括用于扩增大豆基因GlymBd 28K的引物及用于标记大豆基因GlymBd28K的探针，还包括用于扩增核桃基因jugr 1的引物及用于标记核桃基因jugr 1的探针；所述用于扩增大豆基因GlymBd28K的引物分别是序列为GCTGCAGATAACGTGAAG和CTAGCGGAAAGGAGATTG的核苷酸片段，所述用于标记大豆基因GlymBd28K的探针是序列为CTCTGACCTTCTCCTATGTTCACCAA的核苷酸片段；所述用于扩增核桃基因jugr1的引物分别是序列为AGTGCATATTTCATACCTTTC 和CGATCTCCATGGTTGTTA的核苷酸片段，用于标记核桃基因jugr1的探针是序列为CAATGACCAGGCTCGCAACTC的核苷酸片段。
2.根据权利要求1所述的大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括以下反应体系：Taq Premix Ex Taq TM 10μL，用于扩增大豆基因GlymBd28K的上游引物0.5μL，用于扩增大豆基因GlymBd 28K的下游引物0.5μL，用于标记大豆基因GlymBd 28K的探针0.25μL，用于扩增核桃基因jug r 1的上游引物0.5μL，用于扩增核桃基因jug r 1的下游引物0.5μL，用于标记核桃基因jug r 1的探针0.25μL，模板1μL，灭菌水补齐至20μL。
3.根据权利要求2所述的大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述模板为待测样本的DNA；该试剂盒还包括用于提取待测样品DNA的提取试剂。
4.根据权利要求2所述的大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述模板为大豆标准质粒和核桃标准质粒。
5.根据权利要求4所述的大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述大豆标准质粒是通过以下方法构建的：取大豆植株的新鲜叶片，提取总DNA，以其为模板PCR扩增大豆GlymBd28K基因，扩增产物经分离纯化后加一个粘性末端A尾，而后与pMD18-T载体连接，而后将连接产物转入感受态的大肠杆菌E.coli DH5α中，从菌液中提取质粒，经鉴定得到所述大豆标准质粒。
6.根据权利要求5所述的大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述以其为模板PCR扩增大豆GlymBd28K基因，此过程所采用的上下游引物分别是序列为CTAGAAACATTGGAAACACC的核苷酸片段和序列为ATCACATACCCTCAAGACAT的核苷酸片段；此过程的PCR反应体系为：上、下游引物各1μL，提取的植物DNA模板1μL，primerSTAR GXL酶0.5μL，5×buffer5μL，dNTP1μL，ddH2O补齐至25μL。
7.根据权利要求4所述的大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述核桃标准质粒是通过以下方法构建的：取核桃植株的新鲜叶片，提取总DNA，以其为模板PCR扩增核桃jugr 1基因，扩增产物经分离纯化后加一个粘性末端A尾，而后与pMD18-T载体连接，而后将连接产物转入感受态的大肠杆菌E.coli DH5α中，从菌液中提取质粒，经鉴定得到所述核桃标准质粒。
8.根据权利要求7所述的大豆核桃过敏原基因二重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述以其为模板PCR扩增核桃jugr 1基因，此过程所采用的上下游引物分别是序列为TTCAACGTGACCATCTCCCC的核苷酸片段和序列为ACACGAGGATGTGCTTGCTA的核苷酸片段；此过程的PCR反应体系为：上、下游引物各1μL，提取的植物DNA模板1μL，primerSTAR GXL酶0.5μL，5×buffer5μL，dNTP1μL，ddH2O补齐至25μL。
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