CN110846410A - 运用实时荧光定量pcr检测食品中核桃过敏原的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种运用实时荧光定量PCR检测食品中核桃过敏原的方法。该技术方案针对核桃过敏原基因jug r 1设计特异性引物和探针，并确定反应条件，从而建立了荧光定量PCR检测核桃过敏原的方法。具体来看，本发明首先在NBCI数据库中，根据核桃过敏原基因jug r 1设计特异性引物和探针；在此基础上，以从检测样本中提取的DNA作为模板，以特异性引物及探针对目的基因进行扩增；扩增过程使用实时荧光定量PCR仪器对荧光强度进行测量，若出现扩增曲线则说明样本中含有核桃过敏原成分，反之则不含有核桃过敏原成分。本发明方法具有良好的特异性和重复性，检测的灵敏度可达到1.18×10‑ 11ng/μl。

Description

运用实时荧光定量PCR检测食品中核桃过敏原的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域，进一步涉及基于基因检测技术的食物过敏原检测方法，具体涉及一种运用实时荧光定量PCR检测食品中核桃过敏原的方法。
背景技术
食物过敏也称为食物变态反应或消化系统变态反应、过敏性胃肠炎等，是由于某种食物或食品添加剂等引起的IgE介导和非IgE介导的免疫反应，而导致消化系统内或全身性的变态反应。食物过敏已成为全球共同关注的焦点问题，它能引起急性或慢性疾病，危害人类健康。研究显示，成人的食物过敏率约为5％，而儿童的食物过敏率接近于8％，并且数据表明，发病人数和死亡人数均呈上升趋势。在所有的过敏反应中，花生和坚果引起的过敏反应能达到47％。
2006年1月1日后，由FAD发布的《食物过敏原标识和消费者保护法案》正视生效，法案中规定的乳、蛋、鱼、甲壳类水生动物、树坚果、小麦、花生、大豆等八种主要食物过敏原在其食物包装袋上必须进行标注。
核桃属于树坚果的一种，是常见的过敏原成分。目前国内外对于核桃过敏原成分的检测主要集中在ELISA及PCR等方面。目前对于核桃过敏原检测方法，FAD推荐的试剂盒只有一种ELISA试剂盒。但如果产品在加工过程中，蛋白遭到破坏，ELISA试剂盒可能无法检测。相对于蛋白而言，DNA性质比较稳定，以其作为检测目标更加可靠；然而，选择何种基因作为检测目标，采用怎样的检测方法才能保证检测的特异性和灵敏性，现有技术尚未获得理想的解决方案。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种运用实时荧光定量PCR检测食品中核桃过敏原的方法，以解决现有技术中缺乏此类方法的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是，如何在基于基因检测的核桃过敏原成分检测方法中，充分保证特异性和灵敏。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
运用实时荧光定量PCR检测食品中核桃过敏原的方法，该方法以核桃jug r 1基因作为检测目标。
作为优选，该方法中所采用的探针，其5’端由Cy5基团标记，3’端由BHQ2基团标记。
作为优选，该方法先提取检材的DNA，以其为模板，以序列为5’-AGTGCATATTTCATACCTTTC-3’和5’-CGATCTCCATGGTTGTTA-3’的核苷酸片段为上、下游引物，以序列为5’-CAATGACCAGGCTCGCAACTC-3’的核苷酸片段为探针，执行实时荧光定量PCR反应。
作为优选，所述实时荧光定量PCR反应的反应体系如下：荧光定量混合液10μL，浓度为17.5μM的上游引物1μL，浓度为17.5μM的下游引物1μL，浓度为9.5μM的探针0.5μL，DNA模板1μL，H2O 6.5μL，总量20μL；所述实时荧光定量PCR反应的反应程序如下：95℃5min；95℃1min，47.6℃30sec，39个循环。
作为优选，在执行该方法前，先以核桃标准质粒为模板，以序列为5’-AGTGCATATTTCATACCTTTC-3’和5’-CGATCTCCATGGTTGTTA-3’的核苷酸片段为上、下游引物，以序列为5’-CAATGACCAGGCTCGCAACTC-3’的核苷酸片段为探针，执行实时荧光定量PCR反应；绘制标准曲线。
作为优选，所述核桃标准质粒是通过以下方法构建的：取核桃植株的新鲜叶片，提取总DNA，以其为模板PCR扩增核桃jug r 1基因，扩增产物经分离纯化后与pUC18载体连接，而后将连接产物转入感受态的大肠杆菌E.coli DH5α中，从菌液中提取质粒，经鉴定得到所述核桃标准质粒。
作为优选，所述以其为模板PCR扩增核桃jug r 1基因，此过程所采用的上下游引物分别是序列为5’-TTCAACGTGACCATCTCCCC-3’的核苷酸片段和序列为5’-ACACGAGGATGTGCTTGCTA-3’的核苷酸片段。
作为优选，所述以其为模板PCR扩增核桃jug r 1基因，此过程的PCR反应体系为：GXL酶2μL，5×Buffer20μL，dNTP4μL，上游引物2μL，下游引物2μL，模板DNA 4μL，ddH2O 66μL，总量100μL。
作为优选，所述以其为模板PCR扩增核桃jug r 1基因，此过程的PCR反应程序为：98℃5min；98℃30s，54℃30s，68℃1min，34个循环；68℃10min。
作为优选，用于绘制标准曲线的若干样本，其核桃标准质粒的浓度范围为1.55×103～1.55×109copies/μL。
在以上技术方案中，提供了核桃过敏原的引物探针序列以及构建质粒流程，并给出了实时荧光定量PCR反应程序及体系。
本方法使用的引物序列一：Primer-F：5’-TTCAACGTGACCATCTCCCC-3’；
本方法使用的引物序列二：Primer-R：5’-ACACGAGGATGTGCTTGCTA-3’；
本方法使用的引物序列三：Prime-F：5’-AGTGCATATTTCATACCTTTC-3’；
本方法使用的引物序列四：Prme-R：5’-CGATCTCCATGGTTGTTA-3’；
本方法使用的探针序列一：Probe：5’-CAATGACCAGGCTCGCAACTC-3’；
本发明提供了一种运用实时荧光定量PCR检测食品中核桃过敏原的方法。该技术方案针对核桃过敏原基因jug r 1设计特异性引物和探针，并确定反应条件，从而建立了荧光定量PCR检测核桃过敏原的方法。具体来看，本发明首先在NBCI数据库中，根据核桃过敏原基因jug r 1设计特异性引物和探针，并在探针序列5，端用Cy5基团标记，3，端用BHQ2基团标记；在此基础上，以从检测样本中提取的DNA作为模板，以特异性引物及探针对目的基因进行扩增；扩增过程使用实时荧光定量PCR仪器对荧光强度进行测量，若出现扩增曲线则说明样本中含有核桃过敏原成分，反之则不含有核桃过敏原成分。
本发明方法与花生、小麦、榛子、芝麻等均无交叉反应，说明其特异性良好，检测的灵敏度可达到1.18×10-11ng/μl。重复性试验中，变异系数在2％内，说明该方法的重复性较好。本发明所阐述的方法可用于检测食品中核桃的过敏原成分，对避免使用该类食物而导致过敏反应有实际意义。
附图说明
图1是本发明具体实施方式中获得的扩增动力学曲线。
图2是本发明具体实施方式中获得的标准曲线。
图3是本发明方法的特异性实验结果图；图中，1、核桃；2、大豆；3、小麦；4、燕麦；5、杏；6、梨；7、苹果；8、樱桃；9、李子；10、青椒；11、西红柿；12、玉米；13、葱；14、马铃薯；15、蒜。
图4是本发明方法的灵敏性实验结果图。
图5是常规PCR方法的灵敏性实验结果图。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
1、标准质粒的构建以及荧光定量PCR反应方法的构建
样本：核桃。
取新鲜叶片置于25ml灭菌离心管中，先加入少量(100μL)CTAB(2％)，并用研磨机研磨，然后加入400μL CTAB，轻轻搅匀。将装有样品的小管放入65℃水浴中温浴40min-1h，期间轻轻混匀几次。取出样品，放置室温，加入等体积CTAB的氯仿：异戊醇(24:1)并轻轻混匀。在室温下离心，12,000rpm，10min。将上清液转移至一新管中，400μL即可。加入两倍于上清体积的无水乙醇充分混匀，置于-20℃至少30min(4h以上)。在室温下离心，13,000rpm，10min。弃上清，加入与4℃预冷的70％乙醇1mL，室温静置5-10min。室温下离心，12,000rpm，5min。除去上清，于60℃恒温仪上放置2-5min，蒸干多余乙醇。1％琼脂糖凝胶电泳，110V，40min。点样：2μL PCR产物+2μL 6×buffer+2μL ddH2O。
PCR扩增：
反应体系如以下表1所示。
表1 PCR扩增反应体系
Figure BDA0002328413420000041
PCR程序：
98℃5min；
98℃30s，54℃30s，68℃1min，34个循环；
68℃10min。
扩增得到的PCR产物进行分离纯化后用pUC18载体进行连接转入大肠杆菌感受态E.coli DH5α中，蓝白斑筛选后摇菌。
从菌液中提取质粒，双酶切鉴定，以及测序通过后表明质粒构建完成。
荧光定量PCR：
反应体系如以下表1所示。
表2荧光定量PCR反应体系
Figure BDA0002328413420000051
荧光定量PCR程序：
95℃5min；
95℃1min，47.6℃30sec，39个循环。
2、标准曲线构建以及检测性能验证实验
标准曲线构建：
以引物序列三和引物序列四为引物，对提取的质粒进行特异性扩增，此时，在八连管中分别加入浓度为1.55×109～1.55×103copies/μL七个试验孔，剩余为阴性对照，三个平行试验。
特异性试验：
提取核桃、土豆、小麦、核桃、西红柿、苹果、梨、樱桃、杏子八种植物的DNA，使用引物序列三、四和探针分别对这九种植物进行检测。
敏感性试验：
分别对质粒含量为1.55×1010～1.57×100copies/μL的标准品进行检测，以优化后的条件进行TaqMan实时荧光定量PCR检测以及普通PCR扩增。
重复性试验：
用建立的TaqManqPCR方法分别检测质粒含量为1.55×108、1.55×106、1.55×104、1.55×102和1.55×100copies/μL的标准品。
使用建立的TaqMan q-PCR对市售样品中10份豆腐乳进行检测，分析该法的实用性和市售样品中豆腐乳中含有大豆过敏原的情况。
检测结果如下：
标准曲线构建结果
以10倍浓度梯度稀释后的质粒为模板，以优化好的实时荧光定量PCR反应条件进行PCR扩增，获得扩增动力学曲线(图1)和标准曲线(图2)。结果显示，标准质粒浓度与Ct值之间呈现良好的线性关系，相关系数R2为0.995，扩增效率为109.5％，在合理范围90-110％之间。标准曲线的线性回归方程为Y＝-3.113lg X+40.890，Y为Ct值，X为标准质粒的拷贝数。
特异性实验性结果
由图3可知，建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法仅对核桃有阳性扩增信号，对其他植物小麦、燕麦、核桃花生等8种植物DNA均未检测到荧光信号，表明建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法特异性强。
敏感性试验结果
由图4、图5可见，建立的实时荧光定量PCR方法对质粒含量为1.55×1010～1.55×101copies/μL均有阳性扩增信号(见图4)，表明本研究建立的方法最低检测限度为1.55×101copies/μL。而普通PCR检测的灵敏度仅为1.55×105copies/μL(见图5)。
重复性试验结果
重复性检测结果显示，不同稀释梯度的质粒标准品(1.55×108、1.55×106和1.55×104copies/μL)组Ct值的变异系数在0.28％-0.61％之间，组间Ct值的变异系数在0.82％-1.18％之间(见表3)。
表3重复性实验结果
Figure BDA0002328413420000071
3、实际检测效果验证
检测加工食品：
按照与第一小节相同的方式，用引物序列三、引物序列四结合探针序列一通过实时荧光定量PCR，分别对市售50批样品进行核桃过敏原成分实时荧光定量PCR检测。50批食品样品中，25批为标注过敏原标签食品，25批为未标注过敏原标签食品。
结果：
用本发明的方法对这50个样品进行检测，检测结果与包装标识相符。含有过敏原成分样品检测为阳性，未含有过敏原成分检测样品为阴性。
因此，本发明建立的实时荧光定量的方法体系适用于食品中核桃过敏原成分的检测。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.运用实时荧光定量PCR检测食品中核桃过敏原的方法，其特征在于，该方法以核桃jug r 1基因作为检测目标。
2.根据权利要求1所述的运用实时荧光定量PCR检测食品中核桃过敏原的方法，其特征在于，该方法中所采用的探针，其5’端由Cy5基团标记，3’端由BHQ2基团标记。
3.根据权利要求1所述的运用实时荧光定量PCR检测食品中核桃过敏原的方法，其特征在于，该方法先提取检材的DNA，以其为模板，以序列为5’-AGTGCATATTTCATACCTTTC-3’和5’-CGATCTCCATGGTTGTTA-3’的核苷酸片段为上、下游引物，以序列为5’-CAATGACCAGGCTCGCAACTC-3’的核苷酸片段为探针，执行实时荧光定量PCR反应。
4.根据权利要求3所述的运用实时荧光定量PCR检测食品中核桃过敏原的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR反应的反应体系如下：荧光定量混合液10μL，浓度为17.5μM的上游引物1μL，浓度为17.5μM的下游引物1μL，浓度为9.5μM的探针0.5μL，DNA模板1μL，H2O6.5μL，总量20μL；
所述实时荧光定量PCR反应的反应程序如下：95℃5min；95℃1min，47.6℃30sec，39个循环。
5.根据权利要求3所述的运用实时荧光定量PCR检测食品中核桃过敏原的方法，其特征在于，在执行该方法前，先以核桃标准质粒为模板，以序列为5’-AGTGCATATTTCATACCTTTC-3’和5’-CGATCTCCATGGTTGTTA-3’的核苷酸片段为上、下游引物，以序列为5’-CAATGACCAGGCTCGCAACTC-3’的核苷酸片段为探针，执行实时荧光定量PCR反应；绘制标准曲线。
6.根据权利要求5所述的运用实时荧光定量PCR检测食品中核桃过敏原的方法，其特征在于，所述核桃标准质粒是通过以下方法构建的：取核桃植株的新鲜叶片，提取总DNA，以其为模板PCR扩增核桃jug r 1基因，扩增产物经分离纯化后与pUC18载体连接，而后将连接产物转入感受态的大肠杆菌E.coli DH5α中，从菌液中提取质粒，经鉴定得到所述核桃标准质粒。
7.根据权利要求6所述的运用实时荧光定量PCR检测食品中核桃过敏原的方法，其特征在于，所述以其为模板PCR扩增核桃jug r 1基因，此过程所采用的上下游引物分别是序列为5’-TTCAACGTGACCATCTCCCC-3’的核苷酸片段和序列为5’-ACACGAGGATGTGCTTGCTA-3’的核苷酸片段。
8.根据权利要求7所述的运用实时荧光定量PCR检测食品中核桃过敏原的方法，其特征在于，所述以其为模板PCR扩增核桃jug r 1基因，此过程的PCR反应体系为：GXL酶2μL，5×Buffer20μL，dNTP4μL，上游引物2μL，下游引物2μL，模板DNA 4μL，ddH2O 66μL，总量100μL。
9.根据权利要求8所述的运用实时荧光定量PCR检测食品中核桃过敏原的方法，其特征在于，所述以其为模板PCR扩增核桃jug r 1基因，此过程的PCR反应程序为：98℃5min；98℃30s，54℃30s，68℃1min，34个循环；68℃10min。
10.根据权利要求5所述的运用实时荧光定量PCR检测食品中核桃过敏原的方法，其特征在于，用于绘制标准曲线的若干样本，其核桃标准质粒的浓度范围为1.55×103～1.55×109copies/μL。
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