WO2019078022A1 - プライマー及び木の実の検出方法 - Google Patents

プライマー及び木の実の検出方法 Download PDF

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WO2019078022A1
WO2019078022A1 PCT/JP2018/037221 JP2018037221W WO2019078022A1 WO 2019078022 A1 WO2019078022 A1 WO 2019078022A1 JP 2018037221 W JP2018037221 W JP 2018037221W WO 2019078022 A1 WO2019078022 A1 WO 2019078022A1
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dna
seq
pcr
primer
nuts
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PCT/JP2018/037221
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美奈 伊藤
泰生 溝田
克利 大野
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日清食品ホールディングス株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Definitions

  • the present invention is a nut that may cause allergy (almonds, beach nuts, brazil nuts, butternuts, cashews, chestnuts, chincapine, coconut, ginkgo, hazelnuts, hickory nuts, lychees, macadamia nuts, pecan nuts, pine nuts, Pilnuts, pistachios, shea nuts, walnuts) are targeted for detection, and when such nuts are contained in food materials, products, etc., detection of nuts that enable detection with high sensitivity even if the amount is very small
  • the present invention relates to a method, and PCR primers, primer sets, and kits used in the method.
  • Foodstuffs that may cause allergies may cause small amounts of unintended contamination during the production, distribution, and processing stages, so as a food material or product provider, perform quality control of whether they are mixed or not. Is important.
  • the target nuts are, for example, in the EU and Singapore, eight kinds of almonds, walnuts, pecan nuts, hazelnuts, macadamia nuts, brazil nuts, cashew nuts, pistachios, and further pines in Canada. There are nine species added with fruit. In addition to the above-mentioned nine species, there are a total of 19 species in the United States, including beach nuts, butternuts, chestnuts, chinkapins, coconuts, ginkgo, hickory nuts, lychees, pyri nuts and shea nuts.
  • Japan is different from foreign countries, it is not recommended to display the nuts in a batch as a whole, and it is recommended to display walnuts and cashew nuts separately as "similar to specified raw materials”.
  • September 20, 25 food and drink list 257).
  • the intake of tree nuts has increased, and in the future the number of patients with food allergies to nuts other than walnuts and cashew nuts has increased, and to those according to the specified raw materials. It is thought that there is also much addition.
  • PCR method In order to test the presence or absence of contamination of fruit, it is necessary to combine multiple detection methods for individual fruit, but performing ELISA and Western blot several times is time-consuming and expensive.
  • a plurality of sets of reagents can be prepared and tested simultaneously, which is considered to be useful as a real tree detection method.
  • proteins are less stable to various processing in food manufacturing processes than DNA, so methods for detecting proteins may not be applicable to highly processed test foods. high. Therefore, the PCR method that targets the base sequence of DNA, which is considered to be relatively stronger in processing than in protein, is considered to be suitable for detection from food materials and products that have undergone various processing steps.
  • Non-patent Document 1 For the purpose of variety analysis of chestnuts, methods using SSR markers have been reported (Non-patent Document 1), but it is premised that they are used when the test sample is a plant of a single species. In the case of a sample in which plant species are mixed, the PCR primers used are very likely to react with other plant DNAs, which makes it difficult to specifically detect chestnuts. Therefore, it can not be used to specifically detect chestnut DNA in foods containing multiple plants.
  • a detection method of coconut a detection method using an immunochromatography method using coconut specific protein target has been established, and it is commercially available as an inspection kit and is available. However, a DNA base sequence is targeted There is no report on the detection method.
  • nuts that may cause food allergies (almonds, beach nuts, brazil nuts, butternuts, cashews, chestnuts, chincapine, coconut, ginkgo, hazelnuts, hickory nuts, lychees, macadamia nuts, pecan nuts, pine nuts)
  • a method to easily detect fruits pyri nuts, pistachios, shea nuts, walnuts under the same conditions, and there is a method that can scientifically verify whether these tree fruits are mixed in food materials or products. It is highly anticipated as a food quality control method.
  • the present invention is a nut that may cause allergy (almonds, beach nuts, brazil nuts, butternuts, cashews, chestnuts, chincapine, coconut, ginkgo, hazelnuts, hickory nuts, lychees, macadamia nuts, pecan nuts, pine nuts,
  • the main purpose was to provide a PCR primer set that uses pyri nuts, pistachios, shea nuts, walnuts) in a method capable of specifically detecting all food materials and products simultaneously.
  • the present inventors focused on the commonality and specificity in the gene sequences of the target tree and other organisms to be detected, and achieved the above-mentioned conception of a tree that is a food allergy causing food.
  • a tree that is a food allergy causing food.
  • the present invention relates to the following set of PCR primers for real detection of trees. That is, the present invention relates first to the following items.
  • a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including at its 3 'end the base sequence of base Nos. 9 to 23 in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing, and the bases of base Nos. 5 to 19 in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing
  • a set of PCR primers for detecting almond comprising a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the sequence at the 3 'end side.
  • Item 2 A PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of base Nos. 7 to 21 in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing on the 3 'end side, and bases of base Nos.
  • a PCR primer set for detecting beach nuts comprising a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the sequence at the 3 'end side.
  • a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including at its 3 'end the base sequence of base Nos. 9 to 23 in SEQ ID NO: 5 of the sequence listing, and the bases of base Nos. 5 to 19 in SEQ ID NO: 6 of the sequence listing A PCR primer set for detection of brazil nuts comprising a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the sequence at the 3 'end side.
  • a PCR primer set for detecting cashew nuts comprising a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the sequence at the 3 'end side.
  • Item 5 A PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of base Nos. 6 to 20 in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing on the 3 'end side, and the bases of base Nos.
  • a set of PCR primers for detection of chestnuts comprising a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the sequence at the 3 'end side.
  • a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including at its 3 'end the base sequence of base Nos. 4 to 18 in SEQ ID NO: 11 of the sequence listing, and the bases of base Nos. 4 to 18 in SEQ ID NO: 12 of the sequence listing A PCR primer set for coconut detection comprising a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the sequence at the 3 'end side.
  • a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing at its 3 'end the base sequence of base Nos. 7 to 21 in SEQ ID NO: 13 of the sequence listing, and the bases of base Nos. 13 to 27 in SEQ ID NO: 14 of the sequence listing A set of PCR primers for detecting silver globules, which comprises a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the sequence at the 3 'end side.
  • Item 8 A PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including at its 3 'end the base sequence of base Nos. 7 to 21 in SEQ ID NO: 15 of the sequence listing, and the bases of base Nos.
  • a PCR primer set for detection of hazelnut comprising a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the sequence at the 3 'end side.
  • Item 9 A PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including at its 3 'end the base sequence of base Nos. 6 to 20 in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing, and the bases of base Nos. 9 to 23 in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing
  • a PCR primer set for detecting hickory nuts comprising a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the sequence at the 3 'end side.
  • Item 10 A PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing at its 3 'end the base sequence of base Nos. 7 to 21 in SEQ ID NO: 19 of the sequence listing, and the bases of base Nos. 6 to 20 in SEQ ID NO: 20 of the sequence listing
  • a PCR primer set for litchi detection comprising a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the sequence at the 3 'end side.
  • Item 11 A PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including at its 3 'end the base sequence of base Nos. 6 to 20 in SEQ ID NO: 21 of the sequence listing, and the base of base Nos.
  • a set of PCR primers for detecting macadamia nuts comprising a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the sequence at the 3 'end side.
  • Item 12 A PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of base Nos. 4 to 18 in SEQ ID NO: 23 in the sequence listing on the 3 'end side, and bases of base Nos. 6 to 20 in SEQ ID NO: 24 in the sequence listing
  • a set of PCR primers for detecting pecan nuts comprising a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the sequence at the 3 'end side.
  • Item 13 A PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of base Nos. 5 to 19 in SEQ ID NO: 25 in the sequence listing on the 3 'end side, and the base of base Nos. 8 to 22 in SEQ ID NO: 26 in the sequence listing
  • a pine real detection PCR primer set comprising a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the sequence at the 3 'end side.
  • Item 14 A PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing at its 3 'end the nucleotide sequence of base Nos. 8 to 22 in SEQ ID NO: 27 in the sequence listing, and the bases of base Nos.
  • a pyrinut detection PCR primer set comprising a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the sequence at the 3 'end side.
  • Item 15 A PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including at its 3 'end the base sequence of base numbers 10 to 24 in SEQ ID NO: 29 in the sequence listing, and the base of base numbers 15 to 29 in SEQ ID NO: 30 in the sequence listing.
  • a set of PCR primers for pistachio detection which comprises a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the sequence at the 3 'end side.
  • Item 16 A PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including at its 3 'end the base sequence of base Nos. 8 to 22 in SEQ ID NO: 31 in the sequence listing, and the bases of base Nos. 4 to 18 in SEQ ID NO: 32 in the sequence listing
  • a set of PCR primers for detection of shea nuts comprising a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the sequence at the 3 'end.
  • Item 17 A PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including at its 3 'end the base sequence of base Nos. 6 to 20 in SEQ ID NO: 33 in the sequence listing, and the base of base Nos. 6 to 20 in SEQ ID NO: 34 in the sequence listing
  • a PCR primer set for detecting walnut comprising a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the sequence at the 3 'end side.
  • each of the above-mentioned primer sets capable of detecting these combinations of four specific ones of them. It is possible to perform simultaneous PCR (multiplex PCR) by mixing and detecting simultaneously by one PCR test. That is, the present invention also contemplates the following items.
  • a primer set according to claim 9 a primer set according to claim 17, a primer set according to claim 15, and a pecan nut, a walnut, a pistachio, and a primer set comprising the primer set according to claim 4.
  • Method for simultaneous PCR detection of cashew nuts Item 19: The primer set according to claim 1, the primer set according to claim 8, the primer set according to claim 11, and the almond, hazelnut, macadamia nut using the primer set comprising the primer set according to claim 3 Method for simultaneous PCR detection of brazil nuts.
  • Item 20 The primer set according to claim 1, the primer set according to claim 8, the primer set according to claim 11, and the almond, hazelnut, macadamia nut using the primer set comprising the primer set according to claim 3 Method for simultaneous PCR detection of brazil nuts.
  • a primer set according to claim 9 a primer set according to claim 17, a primer set according to claim 8, and a pecan nut, a walnut, a hazelnut and a primer set comprising the primer set according to claim 4.
  • Item 22 A primer set according to claim 9, a primer set according to claim 17, a primer set according to claim 11, and a pecan nut, walnut or macadamia nut using the primer set comprising the primer set according to claim 3.
  • Item 23 A primer set according to claim 1, a primer set according to claim 8, a primer set according to claim 15, and an almond, hazelnut, pistachio and cashew nut using the primer set comprising the primer set according to claim 4 Simultaneous PCR detection method.
  • nuts (almonds, beach nuts, brazil nuts, butternuts, cashew nuts, chestnuts, chincapines, coconuts, ginkgo, hazelnuts, hickory nuts, lychees, macadamia nuts, pecan nuts Enables detection of DNA derived from pine nuts, pyri nuts, pistachios, shea nuts, and walnuts), and whether or not the above-mentioned tree nuts are mixed in the test food material or test food, or whether it is used or not.
  • the effect of enabling the implementation of management inspection is achieved. It can also contribute to prevention of allergies and investigation of causative substances when allergic symptoms occur.
  • B A photograph after electrophoresis showing the detection sensitivity of beach nut DNA in PCR using SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
  • C A photograph after electrophoresis showing the detection sensitivity of Brazil nut DNA in PCR using SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • D A photograph after electrophoresis showing sensitivity of detection of cashew nut DNA in PCR using SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
  • (E) A photograph after electrophoresis showing the detection sensitivity of the chestnut DNA in PCR using SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10.
  • (F) A photograph after electrophoresis showing the detection sensitivity of coconut DNA in PCR using SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12.
  • (G) A photograph after electrophoresis showing the detection sensitivity of silverpox DNA in PCR using SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14.
  • (H) A photograph after electrophoresis showing the detection sensitivity of hazelnut DNA in PCR using SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16.
  • the present inventors developed the following 17 kinds of PCR primer sets for real detection of a tree according to the above-described purpose.
  • the PCR primer set for detecting a fruit of a tree of the present invention is characterized by one having a base sequence characteristic to almonds, one having a base sequence characteristic to beach nuts, one having a base sequence characteristic to brazil nuts, cashew nuts Having a unique base sequence, having a base sequence characteristic of chestnut, having a base sequence characteristic of coconut, having a base sequence characteristic of hazelnut, having a base sequence characteristic of ginkgo
  • the target nucleotide sequence is preferably one with a large copy number per cell from the viewpoint of sensitivity improvement, and the chloroplast rbc (large subunit gene for ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase / oxygenase) gene sequence, matk (matk)
  • the maturase-encoding gene) gene sequence, the internal transcription spacer region 1 (ITS 1) nucleotide sequence of the rRNA gene, and the internal transcription spacer region 2 (ITS 2) nucleotide sequence were selected as candidates.
  • ITS 1 internal transcription spacer region 1
  • ITS 2 internal transcription spacer region 2
  • the species to be detected is set to almonds (Prunus dulcis), and the almonds and their related species peaches (Prunus percica)
  • the nucleotide sequences of the ITS region of prunes (Prunus domestica), plum (Prunus mume), plum (Prunus salicina), apricot (Prunus armeniaca), and cherry (Prunus avium) were compared.
  • the base sequence of the ITS region was highly homologous to the closely related species, and it was difficult to select an almond-specific base sequence, the multiple parallel sequence map was compared and examined in detail. A base sequence region can be selected, and a PCR primer set was newly designed from the base sequence region.
  • the nucleotide sequence region of the species to be detected is designed so that it hybridizes under stringent conditions but does not hybridize to the species not to be detected. did.
  • the biological species to be detected is set to be a beach nut (Fagus spp.), And it is a beach nut and its related species, a chestnut of the same family.
  • Genus Curea (Castanea spp.), Genus Ivy (Castanopsis spp.), Quercus acorn (Quercus spp.), Homonymaceae Pecan Hickory Nuts (Carya spp.), Pecan Nuts (Carya illinoinensis)
  • a nucleotide sequence region specific to a beach nut was selected, and a PCR primer set was newly designed from the nucleotide sequence region. At that time, it was designed ingeniously so that it would hybridize under stringent conditions with the relevant nucleotide sequence region of the species to be detected but not with the species not to be detected.
  • brazil nuts (Bertholletia excelsa), and the brazil nuts and their related species Of the same order of the family Acacutidae Sheer butternut (Vitellaria paradoxa), acacutaceae Fruclico miracle fruit (Synseparum dulcificum), the Kakinoki family Kakinoki oyster (Diospyros kaki), the Kakinokiaceae camellia tea (Camellia sinensis)
  • the base sequences of the ITS regions of the Kiwifruit (Actinidia deliciosa) of the Matatabiaceae family and the blueberry (Vaccinium spp.) Of the azalea family were compared.
  • a nucleotide sequence region specific to Brazil nuts was selected, and a PCR primer set was newly designed from the nucleotide sequence region. At that time, it was designed ingeniously so that it would hybridize under stringent conditions with the relevant nucleotide sequence region of the species to be detected but not with the species not to be detected.
  • the species to be detected is set as cashew nuts (Anacardium occidentale), which is a cashew nut and its related species, kakinoki.
  • the nucleotide sequences of the ITS regions of the genus Pistachio (Pistacia vera), the mango genus Mango (Mangifera indica), and the pink pepper family (Schinus molle) are compared.
  • a base sequence region specific to cashew nuts was selected, and a PCR primer set was newly designed from the base sequence region. At that time, it was designed ingeniously so that it would hybridize under stringent conditions with the relevant nucleotide sequence region of the species to be detected but not with the species not to be detected.
  • Chestnut and related beech Beechnuts (Fagus spp.), Aquilinia (Castanopsis spp.), Quercus acorn (Quercus spp.), Homonychidae Pecan Hickory nuts
  • the nucleotide sequence of the ITS region is highly homologous to closely related species, it was difficult to select a chestnut-specific nucleotide sequence, but the multiple parallel sequence diagram was compared and examined in detail, and the region for the sense primer was hickory nuts Select the region with high homology to pecan nuts, select the region for antisense primer with low homology to hickory nuts and pecan nuts, but select the region with high homology to acorn, and use for detection except for chestnuts
  • the biological species to be detected is set to coconut (coconid cococococococcal coconut palm (Cocos nucifera)), and coconut and its close relatives, date palms
  • coconut coconid cococococococcal coconut palm (Cocos nucifera)
  • coconut and its close relatives, date palms The nucleotide sequences of the ITS region of the genus date palm (Phoenix dactylifera) and that of the Euterpe acai (Euterpe oleracea) were compared.
  • a nucleotide sequence region specific to coconut was selected, and a PCR primer set was newly designed from the nucleotide sequence region. At that time, it was designed ingeniously so that it would hybridize under stringent conditions with the relevant nucleotide sequence region of the species to be detected but not with the species not to be detected.
  • the biological species to be detected is set to ginkgo (Ginko biloba), and chloroplast matK gene sequences of ginkgo and other gymnosperm plants Compared.
  • a gene sequence region specific for ginkgo was selected, and a PCR primer set was newly designed from the gene sequence region.
  • the gene sequence region of the species to be detected was designed in a creative manner so as to hybridize under stringent conditions but not to the species not to be detected.
  • hazelnut the species to be used for detection is set as hazelnut (Boccidae: Corylus spp.), And hazelnut and homozygous walnut as a related species thereof.
  • Family Pecan hickory nuts (Carya spp.), Pecan nuts (Carya illinoinensis), walnut family walnut family (Jugrans spp.), Chestnut family chestnut family (Castanea spp.), Beech family beech nuts
  • the species to be detected is set as hickory nuts (Beech order Walnut family Carya spp.), And it is hickory nuts and their related species.
  • the species to be detected is set as lychee (Litchi chinensis), and the same family of lychee and its related species, rambutan.
  • the nucleotide sequences of the ITS region of the genus Rambutan (Nephelium lappaceum) were compared.
  • a base sequence region specific to lychee was selected, and a PCR primer set was newly designed from the base sequence region. At that time, it was designed ingeniously so that it would hybridize under stringent conditions with the relevant nucleotide sequence region of the species to be detected but not with the species not to be detected.
  • the species to be detected is set as macadamia nuts (Macadamia spp.), which are macadamia nuts and their related species.
  • the nucleotide sequences of the ITS region of lotus root (Nelumbo nucifera) of the same order of the lotus family Hass were compared.
  • a nucleotide sequence region specific to macadamia nut was selected, and a PCR primer set was newly designed from the nucleotide sequence region. At that time, it was designed ingeniously so that it would hybridize under stringent conditions with the relevant nucleotide sequence region of the species to be detected but not with the species not to be detected.
  • pecan nuts Bechellanaceae Pecan genus Pecan (Carya illinoinensis)
  • pecan nuts are a kind of hickory nuts (pecan genus) mentioned above, it is considered that it is necessary to distinguish pecan nuts from other hickory nuts because they are the most widely distributed hickory nuts in the market.
  • Pecan nuts and their related relatives hickory nuts (Carya ovata, Carya laciniosa), homozygous walnut family walnuts (Juglans spp.), Chestnut family chestnuts (Castanea spp.), Beech family Beech beach nuts (Fagus spp.), Beech family snails (Castanopsis spp.), Beech family acorns (Quercus spp.), Hazelnut hazelnuts (Corylus spp.) ITS area The nucleotide sequences were compared.
  • the base sequence of the ITS region is highly homologous to the closely related species, it was difficult to select a pecan nut specific base sequence, but a detailed comparison of multiple parallel sequence diagrams showed that it was specific to pecan nut A base sequence region can be selected, and a PCR primer set was newly designed from the base sequence region. At that time, it was designed ingeniously so that it would hybridize under stringent conditions with the relevant nucleotide sequence region of the species to be detected but not with the species not to be detected.
  • the species to be detected is set to pine nuts (Pinus spp. Pinus spp.), And the pine nuts and other gymnosperms are set.
  • the base sequences of the ITS regions of A nucleotide sequence region specific to pine nuts was selected, and a PCR primer set was newly designed from the nucleotide sequence region. At that time, it was designed ingeniously so that it would hybridize under stringent conditions with the relevant nucleotide sequence region of the species to be detected but not with the species not to be detected.
  • the biological species to be detected is set to pyrinut (Copperonaceae family Prunus pyrinut (Canarium ovatum)), and the pyrinut and its related relatives Cashew nut (Anacardium occidentale), Urushi family Pistachio (Pistacia vera), Urushi family Mango (Mangifera indica), Urushi Family Pink Pink Pepper (Schinus molle), Mukuroji Reishi
  • the nucleotide sequences of the ITS region of lychee (Litchi chinensis), rambutan Rambutan (Nephelium lappaceum), and Citrus orange (Citrus sinensis) were compared.
  • a nucleotide sequence region specific to pyrinut was selected, and a PCR primer set was newly designed from the nucleotide sequence region. At that time, it was designed ingeniously so that it would hybridize under stringent conditions with the relevant nucleotide sequence region of the species to be detected but not with the species not to be detected.
  • the species to be detected is set to pistachio (Pistacia vera) and it is related to pistachio and its related species, cashew nut tree plant.
  • the nucleotide sequences of ITS regions of cashew nuts of the genus (Anacardium occidentale), mangoes of the genus Mango (Mangifera indica), and pink peppers of the genus Amaranth (Schinus molle) were compared.
  • a nucleotide sequence region specific to pistachio was selected, and a PCR primer set was newly designed from the nucleotide sequence region. At that time, it was designed ingeniously so that it would hybridize under stringent conditions with the relevant nucleotide sequence region of the species to be detected but not with the species not to be detected.
  • the biological species to be detected is set as shea nuts (Vitellaria spp. Sheer butternut (Vitellira paradox)), and is a closely related species, the same family of Frukuriko.
  • Genus miracle fruit (Synseparum dulcificum), homonymysia of the family Sabaliaceae Brazilian nutwood genus (Bertholletia excelsa), the family of the family of echinodermidaceae oysters (Diospyros kaki), tea of the family of echinoidaceae camellia (Camellia sinensis), family Matatabi
  • the nucleotide sequences of the ITS regions of kiwifruit (Actinidia deliciosa) and blueberry (Vaccinium spp.) Of the azalea family were compared. A base sequence region specific for shea nuts was selected, and a PCR primer set was newly designed from the base sequence region. At that time, it was designed ingeniously so that it would hybridize under stringent conditions with the relevant nucleotide sequence region of the species to be detected but not with the species not to be detected.
  • Pecan Hickory nuts (Carya ovata, Carya laciniosa), Pecan nuts (Carya illinoinensis), Homoclinic chestnuts (Castanea spp.), Beech family Beech Nucleotide sequences of the ITS region of beechnuts (Fagus spp.), Beechaceae snails (Castanopsis spp.), Beechaceae Quercus acorns (Quercus spp.), Birchaceae Hazelnuts (Corylus spp.) Compared. A nucleotide sequence region specific to walnut was selected, and a PCR primer set was newly designed from the nucleotide sequence region. At that time, it was designed ingeniously so that it would hybridize under stringent conditions with the relevant nucleotide sequence region of the species to be detected but not with the species not to be detected.
  • Each primer was designed so as not to cause hybridization between the sense primer and the antisense primer or hybridization with the individual primers themselves, that is, to prevent formation of so-called primer dimers as much as possible.
  • base substitutions are applied to the primers so as not to cause a decrease in detection specificity and detection sensitivity of the primers.
  • the bases of base numbers 3 and 4 in SEQ ID NO: 1 which is the sense primer of the almond detection primer are originally A, detection specificity and detection of the primer to avoid formation of the primer dimer by the sense primer itself T is used in place of A as a base substitution that does not lead to a decrease in sensitivity.
  • SEQ ID NO: 10 is C to A
  • the base of base No. 6 in SEQ ID NO: 15 is G to A
  • the base of base No. 3 in SEQ ID NO: 21 is C to A
  • SEQ ID NO: The base No. 4 in No. 24 is substituted from C to A
  • the base No. 7 is substituted from A to T.
  • each PCR primer was designed such that the annealing conditions (annealing temperature, annealing time) which most influence the reaction conditions become identical in the PCR reaction. It was very difficult to make the annealing conditions of multiple types of PCR primers identical, but by carefully examining the number of bases of PCR primers and the base sequences of the primers themselves, each detection specificity is not impaired.
  • the annealing conditions were designed to be the same.
  • primers which can not possess intended performance are designed May be For example, in the PCR using the PCR primer set for detecting pecan nuts consisting of SEQ ID NO: 69 and SEQ ID NO: 70 in the research stage of the present invention, pecan nut DNA despite the use of a base sequence unique to pecan nuts. As well as hickory nut (over Tahycholic) DNA was also detected and did not show the intended detection specificity.
  • a tree nut (almond, beach nut, brazil nut, butternut, cashew nut, chestnut, chinkapin contained in various foods) It is possible to detect DNAs derived from coconut, ginkgo, hazelnut, hickory nut, lychee, macadamia nut, pecan nut, pine nut, pyri nut, pistachio, shea nut, or walnut) at high sensitivity and specifically at the same time.
  • nucleic acid analysis is performed by analyzing the presence or absence of a characteristic base sequence by utilizing the existence of a characteristic base sequence according to individual species, genus or group in biological classification. It is an effective means for grasping the species, genus or group of the organism, and is a method useful for detection of a specific microorganism or identification of a species.
  • nucleotide sequences of the primers provided by the present invention are as follows.
  • Base number 12345678901234567890123456789 Sequence number 1 (almond S) AGTTCTAGTTTCAAAGCGGGGGC SEQ ID NO: 2 (almond AS) ACGACGGGCAACCGAGGTC SEQ ID NO: 3 (Beachnut S) GCCTTTCGTCCCCAAACGGTC SEQ ID NO: 4 (Beachnut AS) TGCCACGGTCGCTTCGAATG Sequence number 5 (Brazil nut S) GACGAGTGGTGGATCACGACACG Sequence number 6 (Brazil nut AS) TCGATGCCTTGCGCGCTTCG Sequence number 7 (cashew nut S) TGGCGTTCGGAACGAACCCG Sequence number 8 (cashew nut AS) GCGATGCGGGCGGGCATAG SEQ ID NO: 9 (Kuri S) GGAACGCGCCAAGGAAATCA Sequence number 10 ( ⁇ ⁇ ⁇ AS) TCCGCC CA
  • sequence number 69 (pecan nut S) CCCC AAAC ACC TCG TATGATGTGTA SEQ ID NO: 70 (Pecan nut AS) TGTAGTTGCGCTCGTCGCC (S represents a sense primer and AS represents an antisense primer.)
  • a PCR primer consisting of a DNA having a maximum length of 15 bases and a maximum of 30 bases including the base sequence of base Nos. 9 to 23 in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing on the 3 'end side is used as a sense primer.
  • a primer set using as a antisense primer a PCR primer consisting of a DNA having a length of 15 to 30 bases, which contains the base sequence of base Nos. 5 to 19 in SEQ ID NO: 2 on the 3 'end of the row table.
  • This primer set can be suitably used for almond detection.
  • a PCR primer consisting of a DNA having a maximum length of 15 bases and a maximum of 30 bases including the base sequence of base Nos. 7 to 21 in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing on the 3 'end
  • a primer set using as a antisense primer a PCR primer consisting of a minimum of 15 up to 30 bases of DNA containing at its 3 'end the base sequence of base numbers 6 to 20 in SEQ ID NO: 4 in the row table.
  • This primer set can be suitably used for beach nut detection.
  • a PCR primer consisting of a DNA having a maximum length of 15 bases and a maximum of 30 bases including the base sequence of base Nos. 9 to 23 in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing on the 3 'end
  • a primer set using as a antisense primer a PCR primer consisting of a minimum of 15 up to 30 bases of DNA containing the base sequence of base numbers 5 to 19 in SEQ ID NO: 6 in the column list on the 3 'end side.
  • This primer set can be suitably used for Brazil nut detection.
  • a PCR primer consisting of a DNA having a maximum length of 15 bases and a maximum of 30 bases including the base sequence of base Nos. 6 to 20 in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing on the 3 'end
  • a primer set using as a antisense primer a PCR primer consisting of a minimum of 15 up to 30 bases of DNA containing at its 3 'end the base sequence of base numbers 5 to 19 in SEQ ID NO: 8 in the row table.
  • This primer set can be suitably used for cashew nut detection.
  • a PCR primer consisting of a DNA having a maximum length of 15 bases and a maximum of 30 bases including the base sequence of base Nos. 6 to 20 in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing on the 3 'end
  • a primer set using as a antisense primer a PCR primer consisting of a DNA of the shortest 15 maximum of 30 bases containing the base sequence of base numbers 4 to 18 in SEQ ID NO: 10 in the column list on the 3 'end side.
  • This primer set can be suitably used for chestnut detection.
  • the present invention uses, as a sixth primer set, a PCR primer consisting of a DNA having a maximum length of 15 bases and a maximum of 30 bases including the base sequence of base Nos. 4 to 18 in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing on the 3 'end
  • a primer set using as a antisense primer a PCR primer consisting of a minimum of 15 up to 30 bases of DNA containing at its 3 'end the base sequence of base numbers 4 to 18 in SEQ ID NO: 12 in the row table.
  • the primer set can be suitably used for coconut detection.
  • a PCR primer consisting of a DNA having a maximum length of 15 bases and a maximum of 30 bases including the base sequence of base Nos. 7 to 21 in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing on the 3 'end
  • a primer set using as a antisense primer a PCR primer consisting of a minimum of 15 up to 30 bases of DNA containing at its 3 'end the base sequence of base numbers 13 to 27 in SEQ ID NO: 14 in the row table.
  • the present primer set can be suitably used for detecting silver dust.
  • a PCR primer consisting of a DNA having a maximum length of 15 bases and a maximum of 30 bases including the base sequence of base Nos. 7 to 21 in SEQ ID NO: 15 in the sequence listing on the 3 'end side is used as a sense primer.
  • a primer set using as a antisense primer a PCR primer consisting of a minimum of 15 up to 30 bases of DNA containing at its 3 'end the base sequence of base numbers 11 to 25 in SEQ ID NO: 16 in the row table.
  • This primer set can be suitably used for hazelnut detection.
  • the present invention uses, as a ninth primer set, a PCR primer consisting of a DNA having a maximum length of 15 bases and a maximum of 30 bases containing the base sequence of base Nos. 6 to 20 in SEQ ID NO: 17 on the 3 'end side as a sense primer.
  • a primer set using as a antisense primer a PCR primer consisting of a minimum of 15 up to 30 bases of DNA containing at its 3 'end the base sequence of base numbers 9 to 23 in SEQ ID NO: 18 in the row table.
  • the primer set can be suitably used for detecting hickory nuts.
  • the present invention uses, as a tenth primer set, a PCR primer consisting of a DNA having a maximum length of 15 bases and a maximum of 30 bases including the base sequence of base Nos. 7 to 21 in SEQ ID NO: 19 in the sequence listing on its 3 'end
  • a primer set using as a antisense primer a PCR primer consisting of a DNA of the shortest 15 up to 30 bases including the base sequence of base Nos. 6 to 20 in SEQ ID NO: 20 in the column list on the 3 'end side.
  • This primer set can be suitably used for litchi detection.
  • the present invention uses, as an eleventh primer set, a PCR primer consisting of a DNA having a maximum length of 15 bases and a maximum of 30 bases including the base sequence of base Nos. 6 to 20 in SEQ ID NO: 21 on the 3 'end side as a sense primer.
  • a primer set using as a antisense primer a PCR primer consisting of a DNA having a length of 15 to 30 bases, including the base sequence of base Nos. 8 to 22 in SEQ ID NO: 22 on the 3 'end side of the array table.
  • the primer set can be suitably used for macadamia nut detection.
  • the present invention uses, as a twelfth primer set, a PCR primer consisting of a DNA having a maximum length of 15 bases and a maximum of 30 bases containing the base sequence of base Nos. 4 to 18 in SEQ ID NO: 23 on the 3 'end side as a sense primer.
  • a primer set using as a antisense primer a PCR primer consisting of a DNA of the shortest 15 up to 30 bases including the base sequence of base Nos. 6 to 20 in SEQ ID NO: 24 in the column list on the 3 'end side.
  • This primer set can be suitably used for pecan nut detection.
  • a PCR primer consisting of a DNA having a maximum length of 15 bases and a maximum of 30 bases including the base sequences of base Nos. 5 to 19 in SEQ ID NO: 25 in the sequence listing on the 3 'end
  • a primer set using as a antisense primer a PCR primer consisting of a minimum of 15 up to 30 bases of DNA containing at its 3 'end the base sequence of base numbers 8 to 22 in SEQ ID NO: 26 in the row table.
  • This primer set can be suitably used for pine real detection.
  • the present invention uses, as a 14th primer set, a PCR primer consisting of a DNA having a maximum length of 15 bases and a maximum of 30 bases containing the base sequence of base Nos. 8 to 22 in SEQ ID NO: 27 on the 3 'end side as a sense primer.
  • a primer set using as a antisense primer a PCR primer consisting of a DNA of the shortest 15 up to 30 bases containing the base sequence of base numbers 4 to 18 in SEQ ID NO: 28 on the 3 'end side.
  • This primer set can be suitably used for pyri nut detection.
  • the present invention uses, as a fifteenth primer set, a PCR primer consisting of a DNA having a maximum length of 15 bases and a maximum of 30 bases containing the base sequence of base numbers 10 to 24 in SEQ ID NO: 29 on the 3 'end side as a sense primer.
  • a primer set using as a antisense primer a PCR primer consisting of a DNA having a length of 15 to 30 bases, which contains the base sequence of base Nos. 15 to 29 in SEQ ID NO: 30 on the 3 'end of the row table.
  • This primer set can be suitably used for pistachio detection.
  • the present invention uses, as a sixteenth primer set, a PCR primer consisting of a DNA having a maximum length of 15 bases and a maximum of 30 bases including the nucleotide sequence of base numbers 8 to 22 in SEQ ID NO: 31 in the sequence listing on the 3 'end
  • a primer set using as a antisense primer a PCR primer consisting of a minimum of 15 up to 30 bases of DNA containing at its 3 'end the base sequence of base numbers 4 to 18 in SEQ ID NO: 32 of the row table.
  • This primer set can be suitably used for shea nut detection.
  • the present invention uses, as a seventeenth primer set, a PCR primer consisting of a DNA having a maximum length of 15 bases and a maximum of 30 bases including the base sequence of base Nos. 6 to 20 in SEQ ID NO: 33 in the sequence listing on its 3 'end
  • a primer set using as a antisense primer a PCR primer consisting of a DNA of the shortest 15 up to 30 bases including the base sequence of base numbers 6 to 20 in SEQ ID NO: 34 in the row on the 3 'end side.
  • This primer set can be suitably used for walnut detection.
  • the length of the base sequence is set to 15 to 30 because the appropriate length of the base sequence as a primer for PCR is about 15 to 30, and 15 bases at the 3 'end side It is important to identify 15 sequences at the 3 'end in the specific amplification reaction of PCR, and the base sequence at the 5' end is slightly different, or the length of the sequence is slightly different. Even so, the adverse effect on the PCR reaction itself is usually small.
  • a PCR primer (1 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing on the 3' end side Is a primer consisting of a DNA of the base sequence of SEQ ID NO: 1) as a sense primer
  • a PCR primer (2 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing on the 3' end side
  • This primer set can be suitably used for detecting almonds, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 1 and the primer of SEQ ID NO: 2 as a set.
  • the primer of sequence number 35 can be illustrated as a specific example of (1 '), and the primer of sequence number 36 can be illustrated as a specific example of (2').
  • a PCR primer (3 ') consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing on the 3' end side Is a primer consisting of a DNA of the base sequence of SEQ ID NO: 3) as a sense primer
  • a PCR primer (4 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing on the 3' end side
  • This primer set can be suitably used for beach nut detection, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 3 and the primer of SEQ ID NO: 4 as a set.
  • the primer of sequence number 37 can be illustrated as a specific example of (3 '), and the primer of sequence number 38 can be illustrated as a specific example of (4').
  • a PCR primer (5 ') consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing on the 3' end side Is a primer consisting of a DNA of the base sequence of SEQ ID NO: 5) as a sense primer
  • a PCR primer (6 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing on the 3' end side
  • the present primer set can be suitably used for detecting Brazil nuts, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 5 and the primer of SEQ ID NO: 6 as a set.
  • the primer of sequence number 39 can be illustrated as a specific example of (5 '), and the primer of sequence number 40 can be illustrated as a specific example of (6').
  • a PCR primer (7 ') consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing on the 3' end side Is a primer consisting of a DNA of the base sequence of SEQ ID NO: 7 as a sense primer
  • a PCR primer (8 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 8 in the sequence listing on the 3' end side
  • This primer set can be suitably used for cashew nut detection, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 7 and the primer of SEQ ID NO: 8 as a set.
  • the primer of sequence number 41 can be illustrated as a specific example of (7 '), and the primer of sequence number 42 can be illustrated as a specific example of (8').
  • a PCR primer (9 ') consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 9 in the sequence listing on the 3' end side Is a primer consisting of a DNA of the base sequence of SEQ ID NO: 9) as a sense primer
  • a PCR primer (10 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 10 in the sequence listing on the 3' end side
  • This primer set can be suitably used for detection of chestnuts, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 9 and the primer of SEQ ID NO: 10 as a set.
  • the primer of sequence number 43 can be illustrated as a specific example of (9 '), and the primer of sequence number 44 can be illustrated as a specific example of (10').
  • a PCR primer (11 ') consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 11 in the sequence listing on the 3' end side Is a primer consisting of a DNA of the base sequence of SEQ ID NO: 11) as a sense primer
  • a PCR primer (12 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 12 in the sequence listing on the 3' end side
  • This primer set can be suitably used for coconut detection, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 11 and the primer of SEQ ID NO: 12 as a set.
  • the primer of sequence number 45 can be illustrated as a specific example of (11 '), and the primer of sequence number 46 can be illustrated as a specific example of (12').
  • a PCR primer (13 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 13 in the sequence listing on the 3' end side Is a primer consisting of a DNA of the base sequence of SEQ ID NO: 13) as a sense primer
  • a PCR primer (14 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 14 in the sequence listing on the 3' end side
  • This primer set can be suitably used for detecting silver globules, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 13 and the primer of SEQ ID NO: 14 in a set.
  • the primer of sequence number 47 can be illustrated as a specific example of (13 '), and the primer of sequence number 48 can be illustrated as a specific example of (14').
  • a PCR primer (15 ') consisting of a DNA of at most 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 15 in the sequence listing on the 3' end side Is a primer consisting of a DNA of the base sequence of SEQ ID NO: 15) as a sense primer
  • a PCR primer (16 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 16 in the sequence listing on the 3' end side
  • This primer set can be suitably used for hazelnut detection, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 15 and the primer of SEQ ID NO: 16 as a set.
  • the primer of sequence number 49 can be illustrated as a specific example of (15 ')
  • the primer of sequence number 50 can be illustrated as a specific example of (16').
  • a PCR primer (17 ') consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 17 in the sequence listing on the 3' end side Is a primer consisting of a DNA of the base sequence of SEQ ID NO: 17 as a sense primer, and a PCR primer (18 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 18 in the sequence listing on the 3' end
  • a PCR primer (18 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 18 in the sequence listing on the 3' end
  • This primer set can be suitably used for detecting hickory nuts, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 17 and the primer of SEQ ID NO: 18 in combination.
  • the primer of sequence number 51 can be illustrated as a specific example of (17 ')
  • the primer of sequence number 52 can be illustrated as a specific example of (18').
  • a PCR primer (19 ') consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 19 in the sequence listing on the 3' end side Is a primer consisting of a DNA of the base sequence of SEQ ID NO: 19) as a sense primer
  • a PCR primer (20 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 20 in the sequence listing on the 3' end side
  • This primer set can be suitably used for litchi detection, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 19 and the primer of SEQ ID NO: 20 as a set.
  • the primer of sequence number 53 can be illustrated as a specific example of (19 '), and the primer of sequence number 54 can be illustrated as a specific example of (20').
  • a PCR primer (21 ') consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 21 in the sequence listing on the 3' end side Is a primer consisting of a DNA of the base sequence of SEQ ID NO: 21) as a sense primer
  • a PCR primer (22 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 22 in the sequence listing on the 3' end side
  • This primer set can be suitably used for detecting macadamia nut, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 21 and the primer of SEQ ID NO: 22 in combination.
  • the primer of sequence number 55 can be illustrated as a specific example of (21 '), and the primer of sequence number 56 can be illustrated as a specific example of (22').
  • a PCR primer (23 ') consisting of a DNA of at most 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 23 in the sequence listing on the 3' end side Is a primer consisting of a DNA of the base sequence of SEQ ID NO: 23) as a sense primer
  • a PCR primer (24 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 24 in the sequence listing on the 3' end side
  • This primer set can be suitably used for pecan nut detection, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 23 and the primer of SEQ ID NO: 24 as a set.
  • the primer of sequence number 57 can be illustrated as a specific example of (23 '), and the primer of sequence number 58 can be illustrated as a specific example of (24').
  • a PCR primer (25 ') consisting of a DNA of at most 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 25 in the sequence listing on the 3' end side Is a primer consisting of a DNA of the base sequence of SEQ ID NO: 25) as a sense primer
  • a PCR primer (26 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 26 in the sequence listing on the 3' end side
  • This primer set can be suitably used for detection of pine nuts, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 25 and the primer of SEQ ID NO: 26 as a set.
  • the primer of sequence number 59 can be illustrated as a specific example of (25 '), and the primer of sequence number 60 can be illustrated as a specific example of (26').
  • a PCR primer (27 ') consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 27 in the sequence listing on the 3' end side Is a primer consisting of a DNA of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27) as a sense primer
  • a PCR primer (28 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28 in the sequence listing on the 3' end side
  • This primer set can be suitably used for detection of pyrinut, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 27 and the primer of SEQ ID NO: 28 as a set.
  • the primer of sequence number 61 can be illustrated as a specific example of (27 '), and the primer of sequence number 62 can be illustrated as a specific example of (28').
  • a PCR primer (29 ') consisting of a DNA of at most 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 29 in the sequence listing on the 3' end side Is a primer consisting of a DNA of the base sequence of SEQ ID NO: 29) as a sense primer
  • a PCR primer (30 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 30 in the sequence listing on the 3' end side
  • This primer set can be suitably used for pistachio detection, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 29 and the primer of SEQ ID NO: 30 as a set.
  • the primer of sequence number 63 can be illustrated as a specific example of (29 '), and the primer of sequence number 64 can be illustrated as a specific example of (30').
  • a PCR primer (31 ') consisting of a DNA of at most 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 31 in the sequence listing on the 3' end side Is a primer consisting of a DNA of the base sequence of SEQ ID NO: 31) as a sense primer
  • a PCR primer (32 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 32 in the sequence listing on the 3' end side
  • This primer set can be suitably used for shea nut detection, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 31 and the primer of SEQ ID NO: 32 as a set.
  • the primer of sequence number 65 can be illustrated as a specific example of (31 '), and the primer of sequence number 66 can be illustrated as a specific example of (32').
  • a PCR primer (33 ') consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 33 in the sequence listing on the 3' end side Is a primer consisting of a DNA of the base sequence of SEQ ID NO: 33 as a sense primer, and a PCR primer (34 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 34 in the sequence listing on the 3' end
  • a PCR primer (34 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 34 in the sequence listing on the 3' end
  • This primer set can be suitably used for walnut detection, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 33 and the primer of SEQ ID NO: 34 as a set.
  • the primer of sequence number 67 can be illustrated as a specific example of (33 '), and the primer of sequence number 68 can be illustrated as a specific example of (34').
  • Tree fruit detection method comprises a step of extracting DNA from a sample, a step of performing PCR using this DNA as a template and the primer set of the present invention, and detection of amplified DNA.
  • the sample contains berry fruits (almonds, beech nuts, brazilian nuts, cashews, chestnuts, coconuts, sorghum, hazelnuts, hickory nuts, lychees, macadamia nuts, pecan nuts, pine nuts, pyri nuts, pistachios, shea nuts, walnuts). And detecting the presence or absence.
  • PCR primer set for detection of a tree of the present invention when detecting almonds, use PCR primer set for detecting almonds as well as beach nuts, brazil nuts, cashew nuts, chestnuts, coconuts, ginkgo, hazelnuts, hickory nuts, lychees, macadamia nuts, pecan nuts, When detecting pine nuts, pyri nuts, pistachios, shea nuts, walnuts, PCR primer set for detecting beach nuts, PCR primer set for detecting Brazil nuts, PCR primer set for detecting cashew nuts, PCR primer set for detecting chestnuts, coconut PCR primer set for detection, PCR primer set for detection of ginkgo, PCR primer set for detection of hazelnut, PCR primer set for detection of hickory nuts, PCR primer set for detection of ly
  • the type of detection method is not particularly limited, and any known method can be used as appropriate.
  • the method of PCR amplification using a PCR primer, the method of detecting a PCR amplification product with a probe, etc. can be illustrated.
  • a target base sequence in DNA in a sample is selectively amplified using a real detection primer set of the tree of the present invention selected according to the detection purpose, and a PCR amplification product is obtained There is a method of measuring the presence or absence of
  • the confirmation of the presence or absence of the PCR amplification product can usually be carried out by separating the PCR amplification product by agarose gel electrophoresis, and staining the nucleic acid with ethidium bromide, Cybergreen I or the like.
  • the presence or absence of a PCR amplification product can be automatically confirmed by the detection system of the device.
  • the amount of PCR amplification product dependent on the amount of fluorescence emitted when Cybergreen I binds to double-stranded DNA can be monitored for each cycle.
  • the amount of fluorescence the presence or absence and the size of the amplification product may be confirmed by agarose gel electrophoresis described above.
  • the size of the PCR amplification product using the primer of SEQ ID NO: 1 and the primer of SEQ ID NO: 2 is about 515 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose electrophoresis indicates that almond is present in the test sample.
  • the size of the PCR amplification product using the primer of SEQ ID NO: 3 and the primer of SEQ ID NO: 4 is about 75 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose gel electrophoresis indicates that a beach nut is present in the test sample.
  • the size of the PCR amplification product using the primer of SEQ ID NO: 5 and the primer of SEQ ID NO: 6 is about 91 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose gel electrophoresis indicates that Brazilian nuts are present in the test sample.
  • the size of the PCR amplification product using the primer of SEQ ID NO: 7 and the primer of SEQ ID NO: 8 is about 102 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose gel electrophoresis indicates that cashew nuts are present in the test sample.
  • the size of the PCR amplification product using the primer of SEQ ID NO: 9 and the primer of SEQ ID NO: 10 is about 293 bp. Detection of an amplification product of the size in agarose electrophoresis indicates that a chestnut is present in the test sample.
  • the size of the PCR amplification product using the primer of SEQ ID NO: 11 and the primer of SEQ ID NO: 12 is about 224 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose gel electrophoresis indicates that coconut is present in the test sample.
  • the size of the PCR amplification product using the primer of SEQ ID NO: 13 and the primer of SEQ ID NO: 14 is about 186 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose gel electrophoresis indicates that ginkgo is present in the test sample.
  • the size of the PCR amplification product using the primer of SEQ ID NO: 15 and the primer of SEQ ID NO: 16 is about 361 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose gel electrophoresis indicates that hazelnut is present in the test sample.
  • the size of the PCR amplification product using the primer of SEQ ID NO: 17 and the primer of SEQ ID NO: 18 is about 543 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose gel electrophoresis indicates that hickory nuts were present in the test sample.
  • the size of the PCR amplification product using the primer of SEQ ID NO: 19 and the primer of SEQ ID NO: 20 is about 162 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose gel electrophoresis indicates that Lychee is present in the test sample.
  • the size of the PCR amplification product using the primer of SEQ ID NO: 21 and the primer of SEQ ID NO: 22 is about 111 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose gel electrophoresis indicates that macadamia nuts were present in the test sample.
  • the size of the PCR amplification product using the primer of SEQ ID NO: 23 and the primer of SEQ ID NO: 24 is about 468 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose gel electrophoresis indicates that pecan nuts were present in the test sample. Since pecan nuts are a kind of hickory nuts, pecan nuts can be detected also by the above-mentioned hickory nut detection primer.
  • the size of the PCR amplification product using the primer of SEQ ID NO: 25 and the primer of SEQ ID NO: 26 is about 139 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose electrophoresis indicates that pine nuts were present in the test sample.
  • the size of the PCR amplification product using the primer of SEQ ID NO: 27 and the primer of SEQ ID NO: 28 is about 83 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose gel electrophoresis indicates that pyrinut is present in the test sample.
  • the size of the PCR amplification product using the primer of SEQ ID NO: 29 and the primer of SEQ ID NO: 30 is about 163 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose gel electrophoresis indicates that pistachio was present in the test sample.
  • the size of the PCR amplification product using the primer of SEQ ID NO: 31 and the primer of SEQ ID NO: 32 is about 518 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose gel electrophoresis indicates that shea nuts are present in the test sample.
  • the size of the PCR amplification product using the primer of SEQ ID NO: 33 and the primer of SEQ ID NO: 34 is about 501 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose gel electrophoresis indicates that a walnut is present in the test sample.
  • Multiplex PCR refers to a method of simultaneously amplifying a plurality of gene regions by simultaneously using a plurality of primers in one PCR reaction system.
  • pecan nuts are a kind of hickory nuts
  • pecan nuts can be detected also by the above-mentioned hickory nut detection primer.
  • hickory nut detection primer is used for pecan nut detection.
  • amplification products of all these sizes it suggests that any of the fruit of the tree is present in the test sample.
  • the ratio of primer concentration to be subjected to PCR for each primer for pecan nut, walnut, pistachio and cashew nut is not particularly limited, but preferably it is preferably pecan nut
  • the ratio of primer concentration to be subjected to PCR for each primer for almonds, hazelnuts, macadamia nuts and brazil nuts is not particularly limited, but preferably almonds
  • pecan nuts are a kind of hickory nuts, it is possible to detect pecan nuts also by the above-mentioned detection primer for hickory nuts.
  • detection primer for hickory nuts is used.
  • the ratio of the primer concentration to be subjected to PCR for each primer for pecan nuts, walnuts, hazelnuts and cashew nuts is not particularly limited, but preferably it is preferably pecan nuts
  • the ratio of the primer concentration to be subjected to PCR for each primer for almonds, pistachios, macadamia nuts and brazil nuts is not particularly limited, but preferably almonds
  • the primer for detection it is preferable to use other three types (pistachio, macadamia nut, brazil nut) at a ratio of 2 or more to a ratio of 1, respectively.
  • pecan nuts are a kind of hickory nuts, it is possible to detect pecan nuts also by the above-mentioned detection primer for hickory nuts.
  • detection primer for hickory nuts is used. Use Also, for example, when amplification products of all these sizes are detected, it suggests that any of the fruit of the tree is present in the test sample.
  • the ratio of the primer concentration to be subjected to PCR for each primer for pecan nuts, walnuts, macadamia nuts and brazil nuts is not particularly limited, but preferably With respect to the primer for detecting pecan nut, it is preferable to use the other three (walnut, macadamia nut, brazil nut) at a ratio of 0.9 or less with respect to a ratio of 1, respectively. Furthermore, it is more preferable to use in a ratio of 0.1 to 0.7. Furthermore, it is most preferable to use in a ratio of 0.2 to 0.4. It is possible to detect suitably about four types by making it into such a ratio.
  • PCR amplification product of almond about 515 bp
  • PCR amplification product of hazelnut about 361 bp
  • PCR amplification product of pistachio about 163 bp
  • amplification product of cashew nut about 102 bp
  • the ratio of the primer concentration to be subjected to PCR for each primer for almond, hazelnut, pistachio and cashew nut is not particularly limited, but preferably for almond detection.
  • the primer of the invention it is preferable to use two or more of the other three types (hazel nut, pistachio and cashew nut) with respect to the ratio of one. Furthermore, it is more preferable to use in a ratio of 4 to 8. Furthermore, it is most preferable to use in a ratio of 5 to 7.
  • a fluorescent substance labeled probe which hybridizes with the internal base sequence of the PCR amplification product is added to the reaction solution, and the probe
  • a method of confirming the presence or absence of a PCR amplification product by automatically detecting the amount of fluorescence generated when the probe is degraded after hybridization with the amplification product with a real-time PCR device.
  • a Molecular Beacon method, Cycleave PCR method, a method using a hybridization probe, etc. may be mentioned.
  • the PCR primers used in these methods may be any of the real detection PCR primer sets of the tree of the present invention, and the species targeted from the internal base sequence of the PCR amplification product amplified by each PCR primer set A common base sequence region may be separately selected, and a probe based on that region may be used.
  • the type of test sample to be targeted is not particularly limited.
  • a test sample a food material, a processed food, etc.
  • food ingredients include food ingredients that do not intentionally contain separately produced nuts at food ingredient production plants that handle nuts.
  • processed food include confectionery, noodles, powdered soup, liquid soup, hot air dried or freeze dried ingredients, and various cooked foods containing these processed food.
  • Another example is a processed food that does not intentionally contain separately produced nuts at food manufacturing plants that handle nuts.
  • a wiping sample of the manufacturing facility is also mentioned as a test sample.
  • the form of the sample is not particularly limited, and a general known DNA extraction method (notice of the deputy director of the consumer agency, about a test method of a food containing an allergic substance, March 26, 2014, consumption list No. 36) And commercially available DNA extraction kits (eg, Nucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits (GE Healthcare Biosciences Corp., USA), DNA Extraction Isoplant II kits (Nippon Gene Co. Ltd., Japan), DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) GmbH, Hilden, Germany), etc.] can be applied to the above detection method as long as the sample is capable of recovering DNA.
  • Genomic DNA and organelle-derived DNA mitochondriachondrial DNA or chloroplast DNA
  • the present invention can also be used as a present detection kit.
  • the composition of the kit is not particularly limited as long as it comprises at least one set of the above-mentioned real detection PCR primer set of the present invention tree.
  • a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the nucleotide sequence of nucleotide numbers 9 to 23 in SEQ ID NO: 1 at the 3 'end, and the nucleotide sequence of nucleotide numbers 5 to 19 in SEQ ID NO: 2 are 3'
  • PCR primers consisting of DNA of 30 bases;
  • a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing at its 3 'end the base sequence of base Nos. 9-23 in SEQ ID NO: 5 and a maximum of the base sequence containing base Nos.
  • PCR primers consisting of DNA of 30 bases;
  • a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including at its 3 'end the base sequence of base Nos. 7 to 21 in SEQ ID NO: 15 and a maximum of the base sequence at base no.
  • a PCR primer consisting of DNA of up to 30 bases contained in A PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the nucleotide sequence of nucleotide numbers 5 to 19 in SEQ ID NO: 25
  • PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 1 on the 3 'end side, and a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 2 on the 3' end side Set with PCR primers;
  • the kit can contain appropriate reagents, various containers, and the like according to the purpose of use and the like.
  • a polymerization reagent for synthesizing a PCR primer extension product for example, a thermostable DNA polymerase, deoxyribonucleotide, magnesium, a buffer for PCR reaction, and storage capable of appropriately maintaining the quality thereof Containers etc. can be included.
  • Example 1 Confirmation of detection specificity of PCR primer set for detection of fruit of tree against DNA derived from various animals, plants, fungi and bacteria
  • PCR primer set for detection of fruit of tree of the present invention
  • various organisms An experiment to determine the detection specificity of PCR for derived DNA was performed as follows.
  • the purified human DNA used was purchased from Cemines (CeMines, LLC, USA).
  • Pepper Chinese yam, green onion, coconut, date palm, acai, banana, macadamia nut (Australia, Kenya), lotus root, peanut, soybean, almond (US, Spain), peach, prune, plum, plum, plum, apricot, cherry , Apple, loquat, strawberry, pumpkin, pecan nut, walnut (American, French), hazelnut, pyri nut, cashew (Indian, Vietnamese), pistachio (Iranian, American), mango, pink pepper, lychee, Rambutan, cabbage, brazil nuts, shea nuts, miracle fruits, oysters, tea, kiwifruit, blueberries, sesame seeds, potatoes, carrots, ginkgo, pine nuts were purchased from stores, and rice was obtained from domestic growers.
  • the purified DNA of buckwheat and wheat was prepared from buckwheat flour and wheat flour purchased from a store using Genomic-tip 20 / G.
  • the purified corn DNA was purchased from BioChain Institute, Inc., USA.
  • the purified DNA of hickory nuts was prepared from leaves distributed from the University of Tokyo graduate School of Science and Technology attached botanical garden using DNeasy Plant Mini Kit.
  • the purified DNA of chestnut (Japanese chestnut, Chinese gourd, European chestnut) was prepared using the DNeasy Plant Mini Kit from leaves provided by the National Institute of Agriculture and Food Technology Research Institute Fruit Tree Research Institute.
  • the purified DNA of chestnut was prepared from the leaves distributed from the National Forest Research Institute, Tama Forest Science Park using the DNeasy Plant Mini Kit.
  • the purified DNAs of beach nuts (beech and canine beech), shii and acorn (silaka) were prepared from leaves obtained from nature using DNeasy Plant Mini Kit.
  • the purified DNAs of Pichia anomala (Pichia anomala IFO 0144) and Bacillus cereus (Bacillus cereus ATCC 11950) are cultured in an appropriate medium from the respective cultures, and then the Puregene Yeast and Gram-Positive DNA Isolation kit ( The one prepared using Gentra Systems Inc., USA) was used. All purified DNAs have been subjected to an operation for removing RNA with an RNase.
  • reaction solution containing 5 ⁇ L of the prepared DNA sample solution was prepared using SYBR Premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) (Takara Bio Inc., Japan) manufactured by Takara Bio Inc.
  • This reagent contains TaKaRa Ex Taq HS (hot start type), dNTP Mixture, Mg 2+ and SYBR Green I in solution.
  • the reaction solution was prepared as a composition based on SYBR Premix Ex Taq and containing 250 nM sense primer and 250 nM antisense primer.
  • the PCR reaction is performed on a LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Germany), and amplification reaction conditions are as follows.
  • the temperature is raised to 95 ° C at a rate of 20 ° C / sec, kept at the same temperature for 5 seconds, and then lowered to 68 ° C at a rate of 20 ° C / sec, 10
  • the amplification cycle was carried out 35 times consisting of three steps of incubating at the same temperature for 2 seconds, and further raising the temperature to 72 ° C. at a rate of 10 ° C./sec, followed by incubating at the same temperature for 30 seconds.
  • the PCR amplification products were recorded as SYBR Green I-dependent fluorescence at the final step of each cycle.
  • a PCR primer for detecting almond a PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 1 and 2
  • an amplification product of around 515 bp was confirmed only when using almond (American, Spanish) DNA and it was judged positive. (table 1). It was negative when the closely related species peach DNA, prune DNA, plum DNA, plum DNA, apricot DNA, cherry DNA, and other species DNA including other plants were used (Table 1).
  • PCR primer for beach nut detection (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 3 and 4)
  • an amplification product of around 75 bp is confirmed only when using beach nut (beech, canine beech) DNA, and it is judged positive. It was done (Table 1).
  • Related species of chestnut Japanese chestnut, Chinese chestnut, black gourd, chinkapin
  • chii DNA acorn (silaka) DNA
  • pecan nut DNA hickory nut DNA
  • walnut American, French origin
  • a PCR primer for detection of chestnut (a PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 9 and 10)
  • an amplification product of around 293 bp is confirmed only when using chestnut (Japanese chestnut, Chinese gourd, European chestnut, chincapin) DNA. , was determined to be positive (Table 1).
  • Related species include beach nut (beech and dog beech) DNA, chii DNA, acorn (silaka) DNA, pecan nut DNA, hickory nut DNA, walnut (American and French) DNA, hazelnut DNA and other plants When other species DNA was used, it was negative (Table 1).
  • hazelnut detection PCR primer a PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 15 and 16
  • an amplification product of around 361 bp was confirmed only when hazelnut DNA was used, and it was judged as positive (Table 1).
  • PCR primers for detecting hickory nuts (PCR primer set consisting of SEQ ID NOS: 17 and 18) are used, amplification products of around 543 bp are confirmed only when using hickory nuts (overtahickory) DNA and pecan nut DNA , Was determined to be positive (Table 1).
  • Walnut American origin, France origin
  • DNA chestnut
  • chestnut Japanese gourd, European grit, chinkapin
  • beach nut beach nut (beech, canine beech) DNA
  • hazelnut DNA hazelnut DNA
  • shii DNA acorn (silake) DNA It was negative when using other species DNA including other plants (Table 1).
  • pecan nut detection PCR primer (a PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 23 and 24) was used, an amplification product of around 468 bp was confirmed only when using pecan nut DNA, and it was judged positive (Table 1) ).
  • PCR primer for shear nut detection (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 31 and 32) was used, an amplification product of around 518 bp was confirmed only when shear DNA was used (Table 1). It was negative when the relative species miracle fruit DNA, brazil nut DNA, oyster DNA, tea DNA, kiwifruit DNA, blueberry DNA, and other species DNA including other plants were used (Table 1).
  • a PCR primer for detecting walnut a PCR primer set consisting of SEQ ID NOS: 33 and 34
  • an amplification product of about 501 bp is confirmed only when using walnut (American, French) DNA and is judged as positive. It was done (Table 1).
  • Example 2 Confirmation of detection sensitivity of PCR using PCR primer set for detection of tree fruit
  • Almonds American
  • Beech Nuts Beech
  • Chestnuts Chukokuguri
  • coconut Hazelnuts
  • Ginkgo Hazelnuts
  • Lychee Macadamia Nuts
  • Pecan Nuts Prepared in Example 1 Dilute the DNA of pine nuts, pyri nuts, pistachios (American), shea nuts, and walnuts (American) with sterile water, 1 fg / ⁇ l, 10 fg / ⁇ l, 100 fg / ⁇ l, 1 pg / ⁇ l
  • a dilution series of 10 pg / ⁇ l and 100 pg / ⁇ l DNA solutions was subjected to
  • the detection sensitivity when using a PCR primer for detecting almond is 100 fg DNA / analysis
  • a PCR primer for detecting beach nuts SEQ ID NO:
  • the detection sensitivity when using a PCR primer set consisting of 3 and 4 is 10 fg DNA / analysis
  • the detection sensitivity using a PCR primer for detecting Brazil nut (a PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 5 and 6)
  • the sensitivity is 100 fg DNA / analysis
  • the detection sensitivity when using a PCR primer for detecting cashew nut is 1 pg DNA / analysis
  • the detection sensitivity when using (a PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 9 and 10) is 1 pg DNA / analysis
  • a PCR primer for detecting coconut PC consisting of SEQ ID NO:
  • the detection sensitivity when using a PCR primer for detecting pecan nut is 10 fg DNA / analysis, and a PCR primer for detecting pine real (SEQ ID NOS: 25 and 26)
  • the detection sensitivity when using a PCR primer set consisting of 100 fg DNA / analysis is used, and the detection sensitivity when using a PCR primer for detecting pyrinut (a PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 27 and 28) is 100
  • Detection sensitivity when using fg DNA / analysis and PCR primers for pistachio detection is 100 fg DNA / analysis and a PCR primer for shea nut detection (SEQ ID NO: 31)
  • the detection sensitivity is 10 fg DNA / analysis
  • the PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 33 and 34 has a detection sensitivity of 10 fg DNA / analysis
  • Example 3 Detection of DNA derived from fruit of trees in fruit containing foods by means of PCR using a PCR primer set for detecting fruit of trees
  • the PCR analysis using a PCR primer set for detection of fruit of trees of the present invention is as follows. The practicality of the present invention was examined.
  • a commercial food (Table 2), which is specified to contain various nuts as a raw material, was prepared, and 10 to 100 g was crushed with a multi-bead shocker. Each DNA was extracted from 2 g of the mixed disrupted substance using Genomic-tip 20 / G kit. At the time of extraction, an operation of removing RNA with a RNase was also performed. After measuring the amount of food sample DNA extracted, the concentration of food sample DNA was adjusted to 10 ng / ⁇ L using sterile water. In addition, since it was difficult to obtain commercial foods containing beach nuts, hickory nuts, and shea nuts as raw materials, 10 pg of each DNA was prepared as a coconut sample (Nisshin Cisco) DNA solution (10 ng / ⁇ L) as a substitute sample.
  • the one added at a concentration of / ⁇ L was used.
  • 5 ⁇ l of the PCR primer set for detection of wood used in Example 1 5 ⁇ L of the prepared DNA solution was subjected to PCR under the PCR reaction conditions described in Example 1. If amplification is confirmed from the amount of fluorescence, separate the PCR amplification product (5 ⁇ L of the reaction solution) by 2% (wt / vol) agarose gel electrophoresis, and use Gel Doc ez EZ (Bio Rad) to separate the amplification product. The presence of amplification product was confirmed by visualization.
  • One MARK 100 (GeneDireX) was used as a molecular weight marker.
  • PCR amplification products amplified from food sample DNA are sequenced directly by Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) after direct sequencing from both directions using BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems) was analyzed.
  • the analyzed nucleotide sequence data is compared and analyzed with the GenBank nucleotide sequence database (BLAST search) or the DNA database owned by the inventors, and the species of DNA derived from the PCR amplification product is assigned based on the similarity of the nucleotide sequence. Identified.
  • PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 3 and 4
  • it is derived from a beach nut-containing food substitute sample [Coconutable (50 ng of beach nut DNA added (Nisshin Cisco))] Only in DNA, amplification products around 75 bp were confirmed and judged as positive. It was negative when DNA from other food samples was used (Table 2).
  • the base sequence of the PCR amplification product amplified from the DNA derived from the alternative sample of the beach nut-containing food matched the ITS base sequence of the beach nut.
  • PCR using the PCR primer does not detect beach nut-derived DNA or other DNA from beach nut-free food samples in a plurality of commercial foods, but a small amount of beach added to the beach nut-free food It was confirmed that nut-derived DNA could be specifically detected.
  • PCR primers for detection of brazil nuts (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 5 and 6) are used, amplification products of around 91 bp only in DNA derived from realatin muesli (doset cereal), which is a food containing brazil nuts was confirmed and judged positive. It was negative when DNA from other food samples was used (Table 2).
  • the base sequence of the PCR amplification product amplified from DNA derived from reality muesli Doset serial
  • PCR using the PCR primer does not detect brazil nut-derived DNA or other DNA from brazil nut-free food samples in a plurality of commercial foods, it is specific to brazil nut-containing food samples from brazil nut-containing food samples Confirmed that it can be detected.
  • a PCR primer for detecting cashew nut (a PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 7 and 8) is used, DNA derived from realatin muesli (doset cereal) and triple nut chocolate (merry chocolate kampani), which are cashew nut containing foods The amplification product around 102 bp was confirmed only in and was judged as positive. It was negative when DNA from other food samples was used (Table 2).
  • PCR using the PCR primers does not detect cashew nut-derived DNA or other DNA from cashew nut-free food samples in a plurality of commercial food products, but can specifically detect cashew nut-derived DNA from cashew nut-containing food samples. confirmed.
  • PCR primers PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 11 and 12
  • it is a DNA containing triple nut chocolate (Merry Chocolate Kampani) and coconut rice (Nisshin Cisco), which are coconut-containing foods. Only the amplified product around 224 bp was confirmed and judged as positive. It was negative when DNA from other food samples was used (Table 2).
  • the nucleotide sequences of PCR amplification products amplified from DNA derived from triple nut chocolate (Merry Chocolate Kampani) and coconut sablet (Nisshin Cisco) matched the ITS nucleotide sequences of coconut. . That is, although PCR using the PCR primers does not detect coconut-derived DNA or other DNA from coconut-free food samples in a plurality of commercial foods, it can specifically detect coconut-derived DNA from coconut-containing food samples. confirmed.
  • a PCR primer for detecting ginkgo (a PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 13 and 14)
  • an amplification product of around 186 bp is confirmed only in a ginna-containing food, Ginnan sheep (Yamagishi Motors) derived DNA , was determined to be positive. It was negative when DNA from other food samples was used (Table 2).
  • the base sequence of the PCR amplification product amplified from the DNA derived from Ginnan sheep (Yamushi Motors) matched the chloroplast matK gene sequence of ginkgo.
  • PCR using the PCR primers does not detect ginkgo-derived DNA or other DNA from ginkgo non-containing food samples in a plurality of commercial food products, but can specifically detect ginkgo-derived DNA from ginkgo-containing food samples confirmed.
  • a PCR primer for detection of hazelnut a PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 15 and 16
  • an amplification product of around 361 bp is obtained only in DNA derived from reality muesli (doset cereal), which is a hazelnut-containing food. It was confirmed and judged positive. It was negative when DNA from other food samples was used (Table 2).
  • the base sequence of the PCR amplification product amplified from DNA derived from reality muesli Doset serial
  • ITS base sequence of hazelnut that is, although PCR using the PCR primers does not detect hazelnut-derived DNA or other DNA from hazelnut-free food samples in a plurality of commercial food products, it can specifically detect hazelnut-derived DNA from hazelnut-containing food samples. confirmed.
  • a PCR primer for detecting hickory nuts (a PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 17 and 18) is used, it is derived from a substitute sample of hickory nut-containing food [Coconutable with 50pg hickory nut DNA (Nisshin Cisco)] An amplification product of around 543 bp was confirmed and judged as positive only in triple-nut chocolate (Merry Chocolate Kampani), which is a food containing DNA and pecan nuts. It was negative when DNA from other food samples was used (Table 2).
  • the base sequence of the PCR amplification product amplified from the DNA derived from the alternative sample of hickory nut-containing food and the DNA derived from triple nut chocolate is the ITS base sequence of hickory nut Matched with. That is, although PCR using the PCR primers does not detect hickory-derived DNA or other DNA from hickory nut-free food samples in a plurality of commercial food products, it can be used in pecan nut-containing food samples and hickory nut-free foods. It was confirmed that a trace amount of added hickory nut-derived DNA could be specifically detected.
  • PCR primer for lychee detection PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 19 and 20
  • an amplification product of around 162 bp is confirmed only in DNA derived from fruit therapy white peach (Fusicco) which is a lychee-containing food And was judged positive. It was negative when DNA from other food samples was used (Table 2).
  • the base sequence of the PCR amplification product amplified from the DNA derived from fruit therapy white peach (Fusicco) matched the ITS base sequence of lychee.
  • PCR using the PCR primers does not detect lychee-derived DNA or other DNA from lychee non-containing food samples in a plurality of commercial food products, but can specifically detect lychee-derived DNA from lychee-containing food samples confirmed.
  • PCR using the PCR primers does not detect macadamia nut-derived DNA or other DNA from macadamia nut-free food samples in a plurality of commercial food products, it is specific to macadamia nut-derived DNA from macadamia nut-containing food samples. Confirmed that it can be detected.
  • a PCR primer for detecting pecan nut (a PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 23 and 24)
  • an amplification product of around 468 bp is obtained only in triple nut chocolate (merry chocolate kampani) which is a pecan nut-containing food. It was confirmed and judged positive. It was negative when DNA from other food samples was used (Table 2).
  • the base sequence of the PCR amplification product amplified from the triple nut chocolate (Merry Chocolate Kampani) -derived DNA matched the ITS nucleotide sequence of pecan nut.
  • PCR using the PCR primers does not detect pecan nut-derived DNA or other DNA from pecan nut-free food samples in a plurality of commercial food products, it is specific to pecan nut-derived DNA from pecan nut-containing food samples Confirmed that it can be detected.
  • PCR using the PCR primers does not detect pine nut-derived DNA or other DNA from a pine nut-free food sample in a plurality of commercial food products, it does not detect pine nut-containing food samples. It was confirmed that DNA could be specifically detected.
  • PCR using the PCR primer does not detect pyrinut-derived DNA or other DNA from pyri-nut-free food samples in a plurality of commercial food products, but can specifically detect pyrinut-derived DNA from pyrinut-containing food samples confirmed.
  • PCR using the PCR primer does not detect pistachio-derived DNA or other DNA from pistachio-free food samples in a plurality of commercial food products, it can specifically detect pistathio-derived DNA from pistachio-containing food samples. confirmed.
  • PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 31 and 32
  • DNA derived from a substitute sample of a shea nut-containing food [Coconuts rice (Nisshin Cisco) supplemented with 50pg shearnut DNA]
  • An amplification product of around 518 bp was confirmed and judged as positive. It was negative when DNA from other food samples was used (Table 2).
  • the base sequence of the PCR amplification product amplified from the DNA derived from the alternative sample of the shea nut-containing food matched the ITS base sequence of the shea nut.
  • PCR using the PCR primer does not detect shea nut DNA or other DNA from a shea nut non-containing food sample in a plurality of commercial food products, but a small amount of shea nut DNA added to a shea nut non-food food It confirmed that it could detect specifically.
  • a PCR primer for detecting walnut (a PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 33 and 34)
  • an amplification product of around 501 bp is confirmed only in DNA derived from azuki-kilnut danish (a bread made by Shikishima), which is a walnut-containing food. And was judged positive. It was negative when DNA from other food samples was used (Table 2).
  • the base sequence of the PCR amplification product amplified from the DNA derived from Azuki crunch danish (Bunki bread) was in agreement with the ITS base sequence of walnut. That is, PCR using the PCR primer does not detect walnut-derived DNA or other DNA from walnut-free food samples in a plurality of commercial food products, but can specifically detect walnut-derived DNA from walnut-containing food samples. confirmed.
  • Example 4 Multiplex detection of eight combinations of almond, brazil nut, cashew nut, hazelnut, macadamia nut, pecan nut, pistachio, and walnut
  • Example 1 Sterile DNA of almond (American), brazil nut, cashew nut (Indian), hazelnut, macadamia nut (Australian), pecan nut, pistachio (American) and walnut (American) prepared in Example 1
  • the sample solution was prepared by
  • PCR primer described in SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 7, 8, 15, 16, 17, 18, 21, 22, 22, 30, 30, and 34 is synthesized by Eurofin Genomics. Were used in the following PCR.
  • the PCR reaction solution contains 20 ⁇ L of a composition containing SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) from Takara Bio Inc., 1 ⁇ L of each DNA solution prepared to 1 pg / ⁇ L, and 4 kinds of sense primers and antisense primers. Prepared.
  • the concentration of each primer was 100 nM for the pecan nut detection primer, and 250 nM for the other three primers used in the reaction system.
  • the primer for detecting almond was 500 nM, and the other three primers used in the same reaction system were 100 nM.
  • the PCR reaction was performed on an Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific), and amplification reaction conditions are as follows.
  • FIG. 2A In the case of multiplex (simultaneous detection) of four pecan nuts, walnuts, pistachios and cashews, as shown in FIG. 2A, it was possible to detect any of the nuts of the target tree to be detected.
  • lane numbers 1 to 5 were obtained by adding only pecan nut DNA and performing PCR (lane 1), and adding only walnut DNA and performing PCR (lane 2) ), Only pistachio DNA is added and PCR is performed (lane 3), only cashew nut DNA is added and PCR is performed (lane 4), all (pecan nuts, walnuts, pistachios, cashew nuts) What was added and PCR-reacted (lane 5) is shown.
  • FIG. 2C In the case of multiplex (simultaneous detection) of 4 species of pecan nut, walnut, hazelnut and cashew nut, as shown in FIG. 2C, it was possible to detect any of the nuts of the target tree to be detected.
  • lane numbers 1 to 5 were obtained by adding only pecan nut DNA and performing PCR (lane 1), and adding only walnut DNA and performing PCR (lane 2) ), Only hazelnut DNA added and PCR reaction (lane 3), cashew DNA added only and PCR reaction (lane 4), all (pecan nuts, walnuts, hazelnuts, cashew nuts) What was added and PCR-reacted (lane 5) is shown.
  • lane numbers 1 to 5 were obtained by adding only almond DNA and performing PCR (lane 1) or adding only pistachio DNA and performing PCR (lane 2) Only those with added macadamia nut DNA and PCR reacted (Lane 3), those with only added Brazil nut DNA and PCR reacted (Lane 4), all (Almond, Pistachio, Macadamia nut, Brazil nut) The result of addition of DNA and PCR reaction (lane 5) is shown.
  • lane numbers 1 to 5 were obtained by adding only pecan nut DNA and performing PCR (lane 1) or adding only walnut DNA and performing PCR (lane 2) ), Macadamia nut DNA only added and PCR reaction (lane 3), Brazil nut DNA only added and PCR reaction (lane 4), all (pecan nuts, walnuts, macadamia nuts, Brazil nuts)
  • the thing (lane 5) to which PCR reaction was performed is shown by adding the DNA of).
  • lane numbers 1 to 5 were obtained by adding only almond DNA and performing PCR (lane 1), and adding only hazelnut DNA and performing PCR (lane 2) After addition of pistachio DNA only, PCR reaction (Lane 3), only cashew nut DNA added and PCR reaction (Lane 4) All (almond, hazelnut, pistachio, cashew nut) DNA is added The PCR reaction (lane 5) is shown.

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Abstract

［課題］　アレルギーを引き起こす恐れのある木の実が食品原料や製品等に含まれていた場合に、その量が微量であっても高感度で検出する。 ［解決手段］　アレルギーを引き起こす恐れのある木の実（アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ）を検出対象とし、それぞれの対象物に特異的であり、同一条件下で検査可能なPCRプライマーを提供する。また、主要８種（アーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、ピスタチオ、及びクルミ）について、マルチプレックスPCRにより特定４種ずつの同時検出を可能とする。

Description

プライマー及び木の実の検出方法
　本発明は、アレルギーを引き起こす恐れのある木の実（アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ）を検出対象とし、当該木の実が食品原料や製品等に含まれていた場合に、その量が微量であっても高感度で検出することを可能とする木の実の検出方法、並びにその方法に使用するPCRプライマー、プライマーセット、及びキットに関するものである。
　食物アレルギーを引き起こす恐れのある食品のうち、特にその患者数の多い乳、卵、魚、甲殻類、小麦、大豆、落花生、木の実の8品目は、「The Big-8」とも言われ、アメリカ、カナダ、シンガポール、EU等、世界の多くの国や地域において、共通して含有食品への表示が義務付けられている。
　アレルギーを引き起こす恐れのある食品は、生産、流通、加工段階での意図しない微量の混入も起こり得るため、食品原料ないし製品の提供者としては、それらが混入しているか否かの品質管理を行うことが重要となる。
　乳、卵については、それぞれに特徴的な蛋白質を検出する方法（ELISA法、ウェスタンブロット法、及びイムノクロマト法）が、魚については、それぞれに特徴的なDNA塩基配列を検出する方法（PCR法）が、また、甲殻類、小麦、大豆、落花生については、その両方の検出方法が、各々確立されており、検査キットとして商用的に入手、利用可能となっている。一方、木の実とは総称であり、生物学的に非常に幅広い生物種が含まれるため、木の実としてまとめて検出する方法は確立されていない。
　木の実表示義務のある各国において、表示対象となる木の実とは、例えば、EU、シンガポールでは、アーモンド、クルミ、ピーカンナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ピスタチオの8種、カナダではさらに松の実を加えた9種が挙げられている。アメリカでは最も多く、上記の9種に加え、ビーチナッツ、バターナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヒッコリーナッツ、ライチ、ピリナッツ、シアナッツの計19種が挙げられている。
　日本は諸外国とは異なり、木の実を一括した表示対象とせず、クルミとカシューナッツを「特定原材料に準ずるもの」として個別に表示することが推奨されている（アレルギー物質を含む食品に関する表示について、平成25年9月20日、消食表第257号）。近年、日本人の食生活の欧米化に伴って、木の実摂取量は増加しており、今後クルミ、カシューナッツ以外の木の実に対する食物アレルギー患者数の増加や、それに伴う「特定原材料に準ずるもの」への追加も大いにあると考えられる。
　木の実混入の有無を検査するためには、個々の木の実に対する検出法を複数組み合わせることになるが、ELISA法やウェスタンブロット法を複数回行うことは、膨大な手間と費用がかかる。一方PCR法の場合、PCR条件が同一であれば、複数セットの試薬を調製し、一斉に検査することが可能となるため、木の実検出法として有用であると考えられる。また、一般に、蛋白質は、DNAと比べて、食品製造工程における様々な加工処理に対する安定性が低いため、蛋白質を検出する方法は、高度に加工された被験食品に対しては適用できない可能性が高い。そのため、蛋白質よりも加工処理に比較的強いとされるDNAの塩基配列を標的としたPCR法は、様々な加工処理工程を経た食品原料や製品中からの検出法に適していると考えられる。
　現在、アーモンド、クルミ、ピーカンナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ピスタチオの8種については、PCR法を用いた個別の検出法が確立されており、検査キットとして商用的に入手、利用可能となっている。該キットはTaqManプローブを用いたリアルタイムPCR法を採用することによって検出特異性を確保しているが、リアルタイムPCR用機器、試薬を必要とするため、プローブを用いない通常のPCR法と比較すると費用がかかる。また、前述の通り、食物アレルギーを引き起こす恐れのある木の実には少なくとも19種が存在し、該キットでは検出不可能な木の実が多く存在する。
個別の木の実検出法としては他にも、アーモンド、ヘーゼルナッツ、カシューナッツ、クルミについて、PCR法による検出方法が報告されている（特許文献1、2、3、4）が、いずれも単一種の木の実を検出する方法であり、複数種の木の実を検出することはできない。
　また、クリの品種解析を目的として、SSRマーカーを用いた方法が報告されている（非特許文献1）が、被験試料が単一種の植物である場合に使用することを前提としており、複数の植物種が混合する試料の場合、使用するPCRプライマーは、他の植物DNAとも反応する可能性が非常に高いために、クリを特異的に検出することは困難となる。それ故に、複数の植物を含む食品中のクリDNAを特異的に検出するために使用することはできない。
　また、ココナッツの検出法としては、ココナッツ特異的蛋白質標的としたイムノクロマト法を用いた検出法が確立されており、検査キットとして商用的に入手、利用可能となっているが、DNA塩基配列を標的とした検出法に関する報告はない。
　ビーチナッツ、バターナッツ、チンカピン、銀杏、ヒッコリーナッツ、ライチ、ピリナッツ、松の実、シアナッツについては、これまでに検出法に関する報告はない。
　上述したように、食物アレルギーを引き起こす恐れのある木の実（アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ）を同一条件で簡便に検出する方法は報告されておらず、これらの木の実が食品原料や製品に混入しているか否かを科学的に検証可能な手法が、食品の品質管理手法として待望されている。
CN 101643786A CN 101643787A CN 101792815A 特開2009-279000、プライマー及び特定植物の検出方法 井上栄一, 山本俊哉, 阮樹安, 松木裕美, 安西弘行, 原弘道, ニホングリSSRマーカーによる朝鮮半島由来のクリ7品種の解析; 園学研, 7(4):475-480, 2008
　本発明は、アレルギーを引き起こす恐れのある木の実（アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ）を、食品原料や製品中から特異的に、一斉に検出できる方法に用いるPCRプライマーセットを提供することを、主目的とした
。
　また、段落[０００５]に記載しているが、木の実表示義務のある各国において、表示対象となる木の実の具体例が挙げられており、例えばEUやシンガポールでは8種、カナダでは9種、アメリカでは19種記載されている。ここで、これらに共通して含まれるアーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、ピスタチオ、及びクルミの８種については、食品原料として使用される頻度が高く、生産、流通、加工段階での意図しない微量の混入を検査するニーズが高いと考えられる。そこで、これらの８種のうち、特定の４種の組み合わせについて、一回のPCRで同時に検出することが可能な同時PCR（マルチプレックスPCR）の方法についても提供することを課題とした。
　
　上記課題を達成するために、本発明者らは、分子生物学的観点から、検出対象とする木の実及びその他の生物の遺伝子配列における共通性と特異性に着目し、食物アレルギー原因食物である木の実（アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ）を高感度に検出することができる方法を鋭意研究した。その結果、アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、あるいはクルミの各々に特徴的な塩基配列を見いだし、これらの塩基配列を利用してPCR法などの核酸分析を行うことで、アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、あるいはクルミをそれぞれ簡便に検出し得ることを見いだし、更に鋭意検討を重ねて、それらを同一条件のもとで検出できるよう工夫し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、以下の木の実検出用PCRプライマーセットに関する。すなわち、本願発明はまず
以下の項に関するものである。
項1.  配列表の配列番号1における塩基番号9～23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号2における塩基番号5～19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるアーモンド検出用PCRプライマーセット。
項２.　配列表の配列番号3における塩基番号7～21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号4における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるビーチナッツ検出用PCRプライマーセット。
項３.  配列表の配列番号5における塩基番号9～23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号6における塩基番号5～19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるブラジルナッツ検出用PCRプライマーセット。
項４.  配列表の配列番号7における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号8における塩基番号5～19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるカシューナッツ検出用PCRプライマーセット。
項５.  配列表の配列番号9における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号10における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるクリ検出用PCRプライマーセット。
項６.  配列表の配列番号11における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号12における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるココナッツ検出用PCRプライマーセット。
項７.　配列表の配列番号13における塩基番号7～21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号14における塩基番号13～27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなる銀杏検出用PCRプライマーセット。
項８.　配列表の配列番号15における塩基番号7～21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号16における塩基番号11～25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるヘーゼルナッツ検出用PCRプライマーセット。
項９.　配列表の配列番号17における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号18における塩基番号9～23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるヒッコリーナッツ検出用PCRプライマーセット。
項１０.　配列表の配列番号19における塩基番号7～21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号20における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるライチ検出用PCRプライマーセット。
項１１.　配列表の配列番号21における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号22における塩基番号8～22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるマカダミアナッツ検出用PCRプライマーセット。
項１２.　配列表の配列番号23における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号24における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるピーカンナッツ検出用PCRプライマーセット。
項１３.　配列表の配列番号25における塩基番号5～19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号26における塩基番号8～22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなる松の実検出用PCRプライマーセット。
項１４.　配列表の配列番号27における塩基番号8～22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号28における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるピリナッツ検出用PCRプライマーセット。
項１５.　配列表の配列番号29における塩基番号10～24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号30における塩基番号15～29の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるピスタチオ検出用PCRプライマーセット。
項１６.　配列表の配列番号31における塩基番号8～22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号32における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるシアナッツ検出用PCRプライマーセット。
項１７.　配列表の配列番号33における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号34における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるクルミ検出用PCRプライマーセット。
　
　さらに、上記木の実のうち、アーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、ピスタチオ、及びクルミについては、これらのうちの特定の４種の組合せについて、これらを検出可能な上記各プライマーセットを混合して一回のPCR試験によって同時に検出する同時PCR（マルチプレックスPCR）が可能である。すなわち、本願発明は以下の項に関するものも意図している。
項１８.　請求項９記載のプライマーセット、請求項１７記載のプライマーセット、請求項１５に記載のプライマーセット及び請求項４に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したピーカンナッツ、クルミ、ピスタチオ及びカシューナッツの同時PCR検出方法。
項１９.　請求項１記載のプライマーセット、請求項８記載のプライマーセット、請求項１１に記載のプライマーセット及び請求項３に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したアーモンド、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ及びブラジルナッツの同時PCR検出方法。
項２０.　請求項９記載のプライマーセット、請求項１７記載のプライマーセット、請求項８に記載のプライマーセット及び請求項４に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したピーカンナッツ、クルミ、ヘーゼルナッツ及びカシューナッツの同時PCR検出方法。
項２１.　請求項１記載のプライマーセット、請求項１５記載のプライマーセット、請求項１１に記載のプライマーセット及び請求項３に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したアーモンド、ピスタチオ、マカダミアナッツ及びブラジルナッツの同時PCR検出方法。
項２２.　請求項９記載のプライマーセット、請求項１７記載のプライマーセット、請求項１１に記載のプライマーセット及び請求項３に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したピーカンナッツ、クルミ、マカダミアナッツ及びブラジルナッツの同時PCR検出方法。
項２３.　請求項１記載のプライマーセット、請求項８記載のプライマーセット、請求項１５に記載のプライマーセット及び請求項４に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したアーモンド、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ及びカシューナッツの同時PCR検出方法。
　本発明によれば、PCR等を用いた核酸分析によって、木の実（アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ）由来DNAの検出を可能とし、被験食品原料や被験食品中に、上記木の実が混入しているか否か、又は、使用されているか否かといった品質管理検査の実施を可能にするという効果を奏する。また、アレルギーの未然防止、アレルギー症状が生じた際の原因物質の調査等にも寄与することができる。
　また、アーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、ピスタチオ、及びクルミに関しては、これらの木の実を検出するプライマーを混合して同時PCR（マルチプレックスPCR）することにより、これらのうちの４種を同時に検出することが可能となる。
本発明におけるプライマーセットを用いた場合のDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ａ）配列番号1及び配列番号2を用いたPCRにおけるアーモンドDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｂ）配列番号3及び配列番号4を用いたPCRにおけるビーチナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｃ）配列番号5及び配列番号6を用いたPCRにおけるブラジルナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｄ）配列番号7及び配列番号8を用いたPCRにおけるカシューナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｅ）配列番号9及び配列番号10を用いたPCRにおけるクリDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｆ）配列番号11及び配列番号12を用いたPCRにおけるココナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｇ）配列番号13及び配列番号14を用いたPCRにおける銀杏DNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｈ）配列番号15及び配列番号16を用いたPCRにおけるヘーゼルナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｉ）配列番号17及び配列番号18を用いたPCRにおけるヒッコリーナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｊ）配列番号19及び配列番号20を用いたPCRにおけるライチDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｋ）配列番号21及び配列番号22を用いたPCRにおけるマカダミアナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｌ）配列番号23及び配列番号24を用いたPCRにおけるピーカンナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｍ）配列番号25及び配列番号26を用いたPCRにおける松の実DNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｎ）配列番号27及び配列番号28を用いたPCRにおけるピリナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｏ）配列番号29及び配列番号30を用いたPCRにおけるピスタチオDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｐ）配列番号31及び配列番号32を用いたPCRにおけるシアナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｑ）配列番号33及び配列番号34を用いたPCRにおけるクルミDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。 （Ａ）ピーカンナッツ、クルミ、ピスタチオ、カシューナッツの４種についてのマルチプレックスPCRの結果を示した電気泳動後の写真である。（Ｂ）アーモンド、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ及びブラジルナッツの４種についてのマルチプレックスPCRの結果を示した電気泳動後の写真である。（Ｃ）ピーカンナッツ、クルミ、ヘーゼルナッツ及びカシューナッツの４種についてのマルチプレックスPCRの結果を示した電気泳動後の写真である。（Ｄ）アーモンド、ピスタチオ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツの４種についてのマルチプレックスPCRの結果を示した電気泳動後の写真である。（Ｅ）ピーカンナッツ、クルミ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツの４種についてのマルチプレックスPCRの結果を示した電気泳動後の写真である。（Ｆ）アーモンド、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、カシューナッツの４種についてのマルチプレックスPCRの結果を示した電気泳動後の写真である。
以下、本発明を詳細に説明する。
木の実検出用PCRプライマーセット
本発明者等は、上記の目的に従い、以下の17種の木の実検出用PCRプライマーセットを開発した。本発明の木の実検出用PCRプライマーセットには、アーモンドに特徴的な塩基配列を有するもの、ビーチナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、ブラジルナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、カシューナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、クリに特徴的な塩基配列を有するもの、ココナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、ヘーゼルナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、銀杏に特徴的な塩基配列を有するもの、ヒッコリーナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、ライチに特徴的な塩基配列を有するもの、マカダミアナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、ピーカンナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、ピリナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、松の実に特徴的な塩基配列を有するもの、ピスタチオに特徴的な塩基配列を有するもの、シアナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、及びクルミに特徴的な塩基配列を有するものがある。
　それぞれのプライマーセットは以下のようにして設計した。標的とする塩基配列は、感度向上の観点から、1細胞あたりのコピー数が多いものが望ましく、クロロプラストのrbcL(large subunit gene for ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase)遺伝子配列、matk（maturase-encoding gene）遺伝子配列、rRNA遺伝子の内部転写スペーサー領域1（ITS1）塩基配列、及び内部転写スペーサー領域2（ITS2）塩基配列を候補として選定した。各種植物のそれらの配列を既知のDNAデータベース（GenBank nucleotide sequence database）から取得、あるいは、一部の植物については独自に解析することによって取得し、それらの膨大な塩基配列の多重並列配列図を作成した。その中でも、ITS領域は進化速度が速く、より近縁の種の識別が可能となるため、各種木の実特異的プライマーの標的配列として好適であった。
　アーモンド検出用プライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をアーモンド（バラ目バラ科サクラ属ヘントウ（Prunus dulcis））に設定し、アーモンドと、その近縁種である同属のモモ（Prunus percica）、プルーン（Prunus domestica）、ウメ（Prunus mume）、スモモ（Prunus salicina）、アンズ（Prunus armeniaca）、サクランボ（Prunus avium）のITS領域の塩基配列を比較した。ITS領域の塩基配列は近縁種との相同性が高く、アーモンド特異的な塩基配列を選出することは困難であったが、多重並列配列図を詳細に比較検討したところ、アーモンドに特異的な塩基配列領域を選出することができ、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。設計の際には、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
　ビーチナッツ検出用プライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をビーチナッツ（ブナ目ブナ科ブナ属（Fagus spp.））に設定し、ビーチナッツと、その近縁種である同科クリ属のクリ（Castanea spp.）、シイ属のシイ（Castanopsis spp.）、コナラ属のドングリ（Quercus spp.）、同目クルミ科ペカン属のヒッコリーナッツ（Carya spp.）、ピーカンナッツ（Carya illinoinensis）、クルミ科クルミ属のクルミ（Juglans spp.）、カバノキ科ハシバミ属のヘーゼルナッツ（Corylus spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。ビーチナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
　ブラジルナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をブラジルナッツ（ツツジ目サガリバナ科ブラジルナッツノキ属ブラジルナッツノキ（Bertholletia excelsa））に設定し、ブラジルナッツと、その近縁種である同目アカテツ科シアーバターノキ属のシアナッツ（Vitellaria paradoxa）、アカテツ科フルクリコ属のミラクルフルーツ（Synsepalum dulcificum）、カキノキ科カキノキ属のカキ（Diospyros kaki）、カキノキ科ツバキ属の茶（Camellia sinensis）、マタタビ科マタタビ属のキウイフルーツ（Actinidia deliciosa）、ツツジ科スノキ属のブルーベリー（Vaccinium spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。ブラジルナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
　また、カシューナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をカシューナッツ（ムクロジ目ウルシ科カシューナットノキ属カシューナットノキ（Anacardium occidentale））に設定し、カシューナッツと、その近縁種である同科カイノキ属のピスタチオ（Pistacia vera）、マンゴー属のマンゴー（Mangifera indica）、サンショウモドキ属のピンクペッパー（Schinus molle）のITS領域の塩基配列を比較した。カシューナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
　また、クリ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をクリ（ブナ目ブナ科クリ属（Castanea spp.））に設定した。チンカピン（Castanea pumila）もクリ属の一種であるため、検出対象とした。クリと、近縁種である同科ブナ属のビーチナッツ（Fagus spp.）、シイ属のシイ（Castanopsis spp.）、コナラ属のドングリ（Quercus spp.）、同目クルミ科ペカン属のヒッコリーナッツ（Carya spp.）、ピーカンナッツ（Carya illinoinensis）、クルミ科クルミ属のクルミ（Jugrans spp.）、カバノキ科ハシバミ属のヘーゼルナッツ（Corylus spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。ITS領域の塩基配列は近縁種との相同性が高く、クリ特異的な塩基配列を選出することは難しかったが、多重並列配列図を詳細に比較検討し、センスプライマー用の領域をヒッコリーナッツ、ピーカンナッツと相同性が高い領域から選出し、アンチセンスプライマー用の領域をヒッコリーナッツ、ピーカンナッツと相同性が低いが、ドングリとは相同性が高い領域を選出し、検出目的のクリ以外の生物種(ヒッコリーナッツ、ピーカンナッツ)に対して交錯性を示すセンスプライマーと、それらとはまた別の生物種(ドングリ)に対する交錯性を示すアンチセンスプライマーを互いに組み合わせることで、検出目的とするクリの当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないPCRプライマーセットを創意工夫して、新規に設計した。
　また、ココナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をココナッツ（ヤシ目ヤシ科ココヤシ属ココヤシ（Cocos nucifera））に設定し、ココナッツと、その近縁種である同科ナツメヤシ属のナツメヤシ（Phoenix dactylifera）、エウテルペ属のアサイー（Euterpe oleracea）のITS領域の塩基配列を比較した。ココナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
　また、銀杏検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種を銀杏（イチョウ目イチョウ科イチョウ属イチョウ（Ginko biloba））に設定し、銀杏と、その他裸子植物のクロロプラストmatK遺伝子配列を比較した。銀杏に特異的な遺伝子配列領域を選定し、当該遺伝子配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該遺伝子配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
　また、ヘーゼルナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をヘーゼルナッツ（ブナ目カバノキ科ハシバミ属（Corylus spp.））に設定し、ヘーゼルナッツと、その近縁種である同目クルミ科ペカン属のヒッコリーナッツ（Carya spp.）、ピーカンナッツ（Carya illinoinensis）、クルミ科クルミ属のクルミ（Jugrans spp.）、クリ科クリ属のクリ（Castanea spp.）、ブナ科ブナ属のビーチナッツ（Fagus spp.）、ブナ科シイ属のシイ（Castanopsis spp.）、ブナ科コナラ属のドングリ（Quercus spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。ヘーゼルナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
　また、ヒッコリーナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をヒッコリーナッツ（ブナ目クルミ科ペカン属（Carya spp.））に設定し、ヒッコリーナッツと、その近縁種である同目クルミ科クルミ属のクルミ（Juglans spp.）、クリ科クリ属のクリ（Castanea spp.）、ブナ科ブナ属のビーチナッツ（Fagus spp.）、ブナ科シイ属のシイ（Castanopsis spp.）、ブナ科コナラ属のドングリ（Quercus spp.）、カバノキ科ハシバミ属のヘーゼルナッツ（Corylus spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。ヒッコリーナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
　また、ライチ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をライチ（ムクロジ目ムクロジ科レイシ属レイシ（Litchi chinensis））に設定し、ライチとその近縁種である同科ランブータン属のランブータン（Nephelium lappaceum）のITS領域の塩基配列を比較した。ライチに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
　また、マカダミアナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をマカダミアナッツ（ヤマモガシ目ヤマモガシ科マカダミア属（Macadamia spp.））に設定し、マカダミアナッツと、その近縁種である同目ハス科ハス属のレンコン（Nelumbo nucifera）のITS領域の塩基配列を比較した。マカダミアナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
　また、ピーカンナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をピーカンナッツ（ブナ目クルミ科ペカン属ペカン（Carya illinoinensis））に設定した。ピーカンナッツは前述のヒッコリーナッツ（ペカン属）の一種であるが、ヒッコリーナッツの中で最も多く市場に流通していることから、ピーカンナッツをその他のヒッコリーナッツと識別する必要があると考えた。ピーカンナッツと、その近縁種である同属のヒッコリーナッツ（Carya ovata、Carya laciniosa）、同目クルミ科クルミ属のクルミ（Juglans spp.）、クリ科クリ属のクリ（Castanea spp.）、ブナ科ブナ属のビーチナッツ（Fagus spp.）、ブナ科シイ属のシイ（Castanopsis spp.）、ブナ科コナラ属のドングリ（Quercus spp.）、カバノキ科ハシバミ属のヘーゼルナッツ（Corylus spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。ITS領域の塩基配列は近縁種との相同性が高く、ピーカンナッツ特異的な塩基配列を選出することは難しかったが、多重並列配列図を詳細に比較検討したところ、ピーカンナッツに特異的な塩基配列領域を選出することができ、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
　また、松の実検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種を松の実（マツ目マツ科マツ属（Pinus spp.））に設定し、松の実と、その他裸子植物のITS領域の塩基配列を比較した。松の実に特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
　また、ピリナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をピリナッツ（ムクロジ目カンラン科カンラン属ピリナッツ（Canarium ovatum））に設定し、ピリナッツと、その近縁種である同目ウルシ科カシューナットノキ属のカシューナッツ（Anacardium occidentale）、ウルシ科カイノキ属のピスタチオ（Pistacia vera）、ウルシ科マンゴー属のマンゴー（Mangifera indica）、ウルシ科サンショウモドキ属のピンクペッパー（Schinus molle）、ムクロジ科レイシ属のライチ（Litchi chinensis）、ムクロジ科ランブータン属のランブータン（Nephelium lappaceum）、ミカン科ミカン属のオレンジ（Citrus sinensis）のITS領域の塩基配列を比較した。ピリナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
　また、ピスタチオ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をピスタチオ（ムクロジ目ウルシ科カイノキ属ピスタチオ（Pistacia vera））に設定し、ピスタチオと、その近縁種である同科カシューナットノキ属のカシューナッツ（Anacardium occidentale）、マンゴー属のマンゴー（Mangifera indica）、サンショウモドキ属のピンクペッパー（Schinus molle）のITS領域の塩基配列を比較した。ピスタチオに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
　また、シアナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をシアナッツ（ツツジ目アカテツ科シアーバターノキ属シアーバターノキ（Vitellaria paradoxa））に設定し、近縁種である同科フルクリコ属のミラクルフルーツ（Synsepalum dulcificum）、同目サガリバナ科ブラジルナッツノキ属のブラジルナッツ（Bertholletia excelsa）、カキノキ科カキノキ属のカキ（Diospyros kaki）、カキノキ科ツバキ属の茶（Camellia sinensis）、マタタビ科マタタビ属のキウイフルーツ（Actinidia deliciosa）、ツツジ科スノキ属のブルーベリー（Vaccinium spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。シアナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
　また、クルミ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をクルミ（ブナ目クルミ科クルミ属（Juglans spp.））に設定した。バターナッツ（Juglans cinerea）もクルミ属の一種であるため、検出対象とした。クルミと、その近縁種である同科ペカン属のヒッコリーナッツ（Carya ovata、Carya laciniosa）、ピーカンナッツ（Carya illinoinensis）、同目クリ科クリ属のクリ（Castanea spp.）、ブナ科ブナ属のビーチナッツ（Fagus spp.）、ブナ科シイ属のシイ（Castanopsis spp.）、ブナ科コナラ属のドングリ（Quercus spp.）、カバノキ科ハシバミ属のヘーゼルナッツ（Corylus spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。クルミに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
　なお、センスプライマーとアンチセンスプライマーのハイブリダイズや、個々のプライマー自身によるハイブリダイズを生じないように、すなわち、いわゆるプライマーダイマーの形成を極力回避するような工夫を施して、各々のプライマーを設計した。例えば、プライマーダイマーの形成を回避させるために、プライマーの検出特異性及び検出感度の低下を導かないような塩基置換をプライマーに施している。アーモンド検出用プライマーのセンスプライマーである配列番号1における塩基番号3及び4の塩基は、本来、Aであるが、センスプライマー自身によるプライマーダイマーの形成を回避するために、プライマーの検出特異性及び検出感度の低下を導かないような塩基置換として、Aの代わりにTを採用している。同様に、配列番号10における塩基番号8の塩基をCからAに、配列番号15における塩基番号6の塩基をGからAに、配列番号21における塩基番号3の塩基をCからAに、配列番号24における塩基番号4の塩基をCからAに、塩基番号7の塩基をAからTに置換している。
さらに、上記17種のプライマーセットによるPCR反応条件を同一にするため、PCR反応において、その反応条件を最も左右するアニーリング条件（アニーリング温度、アニーリング時間）が同一になるよう各PCRプライマーを設計した。複数種のPCRプライマーのアニーリング条件を同一にすることは非常に困難であったが、PCRプライマーの塩基数、プライマー自身の塩基配列を詳細に検討することにより、各々の検出特異性を損なうことなく、アニーリング条件が同一となるよう設計した。
　本発明が提供するプライマーの塩基配列について網羅的に述べてきたが、理論上は首尾よく設計されたプライマーであっても、意図する性能（検出特異性等）を保有しえないプライマーが設計される場合がある。例えば、本発明の研究段階において、配列番号６９と配列番号７０とからなるピーカンナッツ検出用PCRプライマーセットを用いたPCRでは、ピーカンナッツに特有の塩基配列を用いたにも関わらず、ピーカンナッツDNAだけでなく、ヒッコリーナッツ（オーバータヒッコリー）DNAも検出し、意図した検出特異性を示さなかった。このように、単に論理的にプライマーを設計すれば、意図する性能（検出特異性等）を取得できるとは限らず、必要な性能を保有しない場合も生じうるために、その設計の際には、論理的設計だけでなく、さらなる工夫とその性能評価試験が重要となる。本発明が提供するプライマーは、論理的設計の上に、さらなる工夫を施して設計したものであり、最終的には性能評価試験をクリアーしたものである。
　従って、本発明の木の実検出用PCRプライマーセットを用いたPCR法などの核酸分析の手法を用いて、各種食品中に含まれる木の実（アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、あるいはクルミ）由来DNAを高感度かつ特異的に、一斉に検出することができる。
ここで、核酸分析とは、生物分類における、個々の種、属、あるいは、グループによって特徴的な塩基配列が存在することを利用して、その特徴的な塩基配列の有無を分析することによって、その生物の種、属、あるいは、グループを把握するために有効な手段であって、特定の微生物の検出や生物種の同定などに有用に用いられる方法である。
　本発明が提供するプライマーの塩基配列は以下のとおりである。
塩基番号　　　　　12345678901234567890123456789
配列番号１ （アーモンドS）　　　　　　　AGTTCTAGTTTCAAAGCGGGGGC
配列番号２ （アーモンドAS）　　　　　　ACGACGGGCAACCGAGGTC
配列番号３ （ビーチナッツS）　　　　　　GCCTTTCGTCCCCAAACGGTC
配列番号４ （ビーチナッツAS）　　　　　　TGCCACGGTCGCTTCGAATG
配列番号５ （ブラジルナッツS）　　　　　　GACGAGTGGTGGATCACGACACG
配列番号６ （ブラジルナッツAS）　　　　　　TCGATGCCTTGCCGCTTCG
配列番号７ （カシューナッツS）　　　　　　TGGCGTTCGGAACGAACCCG
配列番号８ （カシューナッツAS）　　　　　　GCGATGCGGGCGGGCATAG
配列番号９ （クリS）　　GGAACGCGCCAAGGAAATCA
配列番号１０（クリAS）　TCCGCCCAGCCCCGAACC
配列番号１１（ココナッツS）　　　　　　　GACGCTCCGCCCCCTCGA
配列番号１２（ココナッツAS)　　　　　　GTGCGGCACGCACCTGGG
配列番号１３（銀杏S）　　GGTGCTCACTCCCCAGTCAGG
配列番号１４（銀杏AS)　CATCTAGCATTTTGATCCTAACCACGG
配列番号１５（ヘーゼルナッツS）　　　　　　ATGCCAGGGGCGAATCTTGTG
配列番号１６（ヘーゼルナッツAS)　　　　　　GCTACAGGGTCACAGAGCACAAGAC
配列番号１７（ヒッコリーナッツS）　　　　　　TGGGAGGGCACGATGAAAGC
配列番号１８（ヒッコリーナッツAS）　　　　　CGACGCAATAGGGTCGAGGAGAG
配列番号１９（ライチS）　GAGGCGTGGGGATGCGTTATC
配列番号２０（ライチAS）CGAGAGCCTTACGCCGACCG
配列番号２１（マカダミアナッツS）　　　　　　GCACCCCGTGTCTCTGTTCG
配列番号２２（マカダミアナッツAS）　　　　　CGATGTCCGAACAATGGCAAAG
配列番号２３（ピーカンナッツS）　　　　　　ACGGTTGGGAGGGCACGA
配列番号２４（ピーカンナッツAS）　　　　　　TGTAGTTGCGCTCGTCGCCC
配列番号２５（松の実S）　CAGGCGATGTTTCGTGGCG
配列番号２６（松の実AS）CCCTACCCAATGGGAGGACAAG
配列番号２７（ピリナッツS）　　　　　　　TGGTCGTAACGAACCTCGGTGC
配列番号２８（ピリナッツAS）　　　　　　CGTCACGGCGGCGCTTTC
配列番号２９（ピスタチオS）　　　　　　　GGTGTCGGTCGTATGCTTCTGCAT
配列番号３０（ピスタチオAS）　　　　　　GTCGTTATTGATAATGAAAGAAGGCTACC
配列番号３１（シアナッツS）　　　　　　　GCGTTGCCTCGGCTAAAAACTC
配列番号３２（シアナッツAS）　　　　　　GCGGTCAAGGCTCCGCAA
配列番号３３（クルミS）　GGTTGGGAGGGCACGTTGAG
配列番号３４（クルミAS）CGACGGGTCACGAGGGTTTC
また、本発明が提供する３０塩基のＤＮＡからなるプライマーとしては、例えば以下の塩基配列のものを上げることができる。
配列番号３５（アーモンドS）　　　　　　　cgacccgAGTTCTAGTTTCAAAGCGGGGGC
配列番号３６（アーモンドAS）　　　　　　gacgaacgcacACGACGGGCAACCGAGGTC
配列番号３７（ビーチナッツS）　　　　　　ggcttcgcgGCCTTTCGTCCCCAAACGGTC
配列番号３８（ビーチナッツAS）　　　　　　cggacgaggtTGCCACGGTCGCTTCGAATG
配列番号３９（ブラジルナッツS）　　　　　　acggcacGACGAGTGGTGGATCACGACACG
配列番号４０（ブラジルナッツAS）　　　　　　tggggtcgcggTCGATGCCTTGCCGCTTCG
配列番号４１（カシューナッツS）　　　　　　cgacggtcggTGGCGTTCGGAACGAACCCG
配列番号４２（カシューナッツAS）　　　　　　ggggtcgcgacGCGATGCGGGCGGGCATAG
配列番号４３（クリS）　　accccggcgcGGAACGCGCCAAGGAAATCA
配列番号４４（クリAS）　gggaggccaactTCCGCCCAGCCCCGAACC
配列番号４５（ココナッツS）　　　　　　　atcatgccaagcGACGCTCCGCCCCCTCGA
配列番号４６（ココナッツAS）　　　　　　ccgatggctgggGTGCGGCACGCACCTGGG
配列番号４７（銀杏S）　　gctctgaagGGTGCTCACTCCCCAGTCAGG
配列番号４８（銀杏AS）　aatCATCTAGCATTTTGATCCTAACCACGG
配列番号４９（ヘーゼルナッツS）　　　　　　acggcgtgcATGCCAGGGGCGAATCTTGTG
配列番号５０（ヘーゼルナッツAS）　　　　　　gcgcaGCTACAGGGTCACAGAGCACAAGAC
配列番号５１（ヒッコリーナッツS）　　　　　　caaaaacggtTGGGAGGGCACGATGAAAGC
配列番号５２（ヒッコリーナッツAS）　　　　　gcaagaaCGACGCAATAGGGTCGAGGAGAG
配列番号５３（ライチS）　gcctcggacGAGGCGTGGGGATGCGTTATC
配列番号５４（ライチAS）gcttcagggtCGAGAGCCTTACGCCGACCG
配列番号５５（マカダミアナッツS）　　　　　　gcgaagattgGCACCCCGTGTCTCTGTTCG
配列番号５６（マカダミアナッツAS）　　　　　cacgcacaCGATGTCCGAACAATGGCAAAG
配列番号５７（ピーカンナッツS）　　　　　　cccctcccaaaaACGGTTGGGAGGGCACGA
配列番号５８（ピーカンナッツAS）　　　　　　cgggaggccaTGTAGTTGCGCTCGTCGCCC
配列番号５９（松の実S）　ctgaaatgtggCAGGCGATGTTTCGTGGCG
配列番号６０（松の実AS）taaatccgCCCTACCCAATGGGAGGACAAG
配列番号６１（ピリナッツS）　　　　　　　accttcggTGGTCGTAACGAACCTCGGTGC
配列番号６２（ピリナッツAS）　　　　　　gtgcgggcgccgCGTCACGGCGGCGCTTTC
配列番号６３（ピスタチオS）　　　　　　　tcgtcgGGTGTCGGTCGTATGCTTCTGCAT
配列番号６４（ピスタチオAS）　　　　　　aGTCGTTATTGATAATGAAAGAAGGCTACC
配列番号６５（シアナッツS）　　　　　　　cctgaattGCGTTGCCTCGGCTAAAAACTC
配列番号６６（シアナッツAS）　　　　　　tgacctggggtcGCGGTCAAGGCTCCGCAA
配列番号６７（クルミS）　cccaaaaaacGGTTGGGAGGGCACGTTGAG
配列番号６８（クルミAS）gggcaacacaCGACGGGTCACGAGGGTTTC
本発明の研究段階において、意図した検出特異性を示さなかったプライマーの塩基配列は、以下の通りである。
配列番号６９（ピーカンナッツS）　    CCCCAACACCTCGTATGATGTGTA    
配列番号７０（ピーカンナッツAS）　   TGTAGTTGCGCTCGTCGCCC      
（ Sはセンスプライマーを表し、ASはアンチセンスプライマーを表す。）
　本発明は、第1のプライマーセットとして、配列表の配列番号1における塩基番号9～23の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号2における塩基番号5～19の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、アーモンド検出用に好適に使用できる。
　本発明は、第2のプライマーセットとして、配列表の配列番号3における塩基番号7～21の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号4における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ビーチナッツ検出用に好適に使用できる。
　本発明は、第3のプライマーセットとして、配列表の配列番号5における塩基番号9～23の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号6における塩基番号5～19の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ブラジルナッツ検出用に好適に使用できる。
　本発明は、第4のプライマーセットとして、配列表の配列番号7における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号8における塩基番号5～19の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、カシューナッツ検出用に好適に使用できる。
　本発明は、第5のプライマーセットとして、配列表の配列番号9における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号10における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、クリ検出用に好適に使用できる。
　本発明は、第6のプライマーセットとして、配列表の配列番号11における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号12における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ココナッツ検出用に好適に使用できる。
　本発明は、第7のプライマーセットとして、配列表の配列番号13における塩基番号7～21の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号14における塩基番号13～27の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、銀杏検出用に好適に使用できる。
　本発明は、第8のプライマーセットとして、配列表の配列番号15における塩基番号7～21の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号16における塩基番号11～25の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ヘーゼルナッツ検出用に好適に使用できる。
　本発明は、第9のプライマーセットとして、配列表の配列番号17における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号18における塩基番号9～23の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ヒッコリーナッツ検出用に好適に使用できる。
　本発明は、第10のプライマーセットとして、配列表の配列番号19における塩基番号7～21の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号20における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ライチ検出用に好適に使用できる。
　本発明は、第11のプライマーセットとして、配列表の配列番号21における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号22における塩基番号8～22の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、マカダミアナッツ検出用に好適に使用できる。
　本発明は、第12のプライマーセットとして、配列表の配列番号23における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号24における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ピーカンナッツ検出用に好適に使用できる。
　本発明は、第13のプライマーセットとして、配列表の配列番号25における塩基番号5～19の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号26における塩基番号8～22の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、松の実検出用に好適に使用できる。
　本発明は、第14のプライマーセットとして、配列表の配列番号27における塩基番号8～22の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号28における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ピリナッツ検出用に好適に使用できる。
　本発明は、第15のプライマーセットとして、配列表の配列番号29における塩基番号10～24の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号30における塩基番号15～29の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ピスタチオ検出用に好適に使用できる。
　本発明は、第16のプライマーセットとして、配列表の配列番号31における塩基番号8～22の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号32における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、シアナッツ検出用に好適に使用できる。
　本発明は、第17のプライマーセットとして、配列表の配列番号33における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号34における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、クルミ検出用に好適に使用できる。
　前記各プライマーにおいて、塩基配列の長さを15から30とするのは、PCR用プライマーとしての塩基配列の適切な長さが15～30程度であること、また、3´末端側15個の塩基配列を特定するのは、3´末端側15個程度がPCRの特異的な増幅反応において重要であって、5´末端側の塩基配列が若干異なっていたり、配列の長さが多少違っていたりしても、PCRの反応自体への悪影響が、たいていの場合、小さいためである。
　本発明においては、さらに、第1のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号1の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（1´）（最も好ましくは配列番号1の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号2の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（2´）（最も好ましくは配列番号2の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはアーモンド検出用に好適に使用でき、配列番号1のプライマーと配列番号2のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（1´）の具体例としては配列番号３５のプライマー、（2´）の具体例としては配列番号３６のプライマーを例示できる。
　本発明においては、さらに、第2のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号3の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（3´）（最も好ましくは配列番号3の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号4の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（4´）（最も好ましくは配列番号4の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはビーチナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号3のプライマーと配列番号4のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（3´）の具体例としては配列番号３７のプライマー、（4´）の具体例としては配列番号３８のプライマーを例示できる。
　本発明においては、さらに、第3のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号5の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（5´）（最も好ましくは配列番号5の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号6の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（6´）（最も好ましくは配列番号6の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはブラジルナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号5のプライマーと配列番号6のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（5´）の具体例としては配列番号３９のプライマー、（6´）の具体例としては配列番号４０のプライマーを例示できる。
　本発明においては、さらに、第4のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号7の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（7´）（最も好ましくは配列番号7の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号8の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（8´）（最も好ましくは配列番号8の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはカシューナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号7のプライマーと配列番号8のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（7´）の具体例としては配列番号４１のプライマー、（8´）の具体例としては配列番号４２のプライマーを例示できる。
　本発明においては、さらに、第5のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号9の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（9´）（最も好ましくは配列番号9の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号10の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（10´）（最も好ましくは配列番号10の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはクリ検出用に好適に使用でき、配列番号9のプライマーと配列番号10のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（9´）の具体例としては配列番号４３のプライマー、（10´）の具体例としては配列番号４４のプライマーを例示できる。
　本発明においては、さらに、第6のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号11の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（11´）（最も好ましくは配列番号11の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号12の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（12´）（最も好ましくは配列番号12の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはココナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号11のプライマーと配列番号12のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（11´）の具体例としては配列番号４５のプライマー、（12´）の具体例としては配列番号４６のプライマーを例示できる。
　本発明においては、さらに、第7のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号13の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（13´）（最も好ましくは配列番号13の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号14の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（14´）（最も好ましくは配列番号14の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは銀杏検出用に好適に使用でき、配列番号13のプライマーと配列番号14のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（13´）の具体例としては配列番号４７のプライマー、（14´）の具体例としては配列番号４８のプライマーを例示できる。
　本発明においては、さらに、第8のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号15の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（15´）（最も好ましくは配列番号15の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号16の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（16´）（最も好ましくは配列番号16の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはヘーゼルナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号15のプライマーと配列番号16のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（15´）の具体例としては配列番号４９のプライマー、（16´）の具体例としては配列番号５０のプライマーを例示できる。
　本発明においては、さらに、第9のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号17の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（17´）（最も好ましくは配列番号17の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（18´）（最も好ましくは配列番号18の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはヒッコリーナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号17のプライマーと配列番号18のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（17´）の具体例としては配列番号５１のプライマー、（18´）の具体例としては配列番号５２のプライマーを例示できる。
　本発明においては、さらに、第10のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（19´）（最も好ましくは配列番号19の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（20´）（最も好ましくは配列番号20の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはライチ検出用に好適に使用でき、配列番号19のプライマーと配列番号20のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（19´）の具体例としては配列番号５３のプライマー、（20´）の具体例としては配列番号５４のプライマーを例示できる。
　本発明においては、さらに、第11のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（21´）（最も好ましくは配列番号21の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（22´）（最も好ましくは配列番号22の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはマカダミアナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号21のプライマーと配列番号22のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（21´）の具体例としては配列番号５５のプライマー、（22´）の具体例としては配列番号５６のプライマーを例示できる。
　本発明においては、さらに、第12のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（23´）（最も好ましくは配列番号23の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（24´）（最も好ましくは配列番号24の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはピーカンナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号23のプライマーと配列番号24のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（23´）の具体例としては配列番号５７のプライマー、（24´）の具体例としては配列番号５８のプライマーを例示できる。
　本発明においては、さらに、第13のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（25´）（最も好ましくは配列番号25の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号26の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（26´）（最も好ましくは配列番号26の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは松の実検出用に好適に使用でき、配列番号25のプライマーと配列番号26のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（25´）の具体例としては配列番号５９のプライマー、（26´）の具体例としては配列番号６０のプライマーを例示できる。
　本発明においては、さらに、第14のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（27´）（最も好ましくは配列番号27の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号28の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（28´）（最も好ましくは配列番号28の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはピリナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号27のプライマーと配列番号28のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（27´）の具体例としては配列番号６１のプライマー、（28´）の具体例としては配列番号６２のプライマーを例示できる。
　本発明においては、さらに、第15のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号29の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（29´）（最も好ましくは配列番号29の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号30の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（30´）（最も好ましくは配列番号30の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはピスタチオ検出用に好適に使用でき、配列番号29のプライマーと配列番号30のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（29´）の具体例としては配列番号６３のプライマー、（30´）の具体例としては配列番号６４のプライマーを例示できる。
　本発明においては、さらに、第16のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号31の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（31´）（最も好ましくは配列番号31の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号32の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（32´）（最も好ましくは配列番号32の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはシアナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号31のプライマーと配列番号32のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（31´）の具体例としては配列番号６５のプライマー、（32´）の具体例としては配列番号６６のプライマーを例示できる。
　本発明においては、さらに、第17のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号33の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（33´）（最も好ましくは配列番号33の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号34の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（34´）（最も好ましくは配列番号34の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはクルミ検出用に好適に使用でき、配列番号33のプライマーと配列番号34のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（33´）の具体例としては配列番号６７のプライマー、（34´）の具体例としては配列番号６８のプライマーを例示できる。
木の実検出法
本発明の木の実検出方法は、試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、本発明のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中に木の実（アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、カシューナッツ、クリ、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ）が存在しているか否かを検出する工程とを含む方法である。
　即ち、上記本発明の木の実検出用PCRプライマーセットを用いて、試料中のDNAをPCR等で核酸分析することにより、試料中の木の実を特異的に検出することが可能となる。このとき、アーモンドを検出する場合には、アーモンド検出用PCRプライマーセットを使用し、同様にビーチナッツ、ブラジルナッツ、カシューナッツ、クリ、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミを検出する場合には、それぞれビーチナッツ検出用PCRプライマーセット、ブラジルナッツ検出用PCRプライマーセット、カシューナッツ検出用PCRプライマーセット、クリ検出用PCRプライマーセット、ココナッツ検出用PCRプライマーセット、銀杏検出用PCRプライマーセット、ヘーゼルナッツ検出用PCRプライマーセット、ヒッコリーナッツ検出用PCRプライマーセット、ライチ検出用PCRプライマーセット、マカダミアナッツ検出用PCRプライマーセット、ピーカンナッツ検出用PCRプライマーセット、松の実検出用PCRプライマーセット、ピリナッツ検出用PCRプライマーセット、ピスタチオ検出用PCRプライマーセット、シアナッツ検出用PCRプライマーセット、クルミ検出用PCRプライマーセットを使用すればよい。
　検出法（核酸分析）の種類は、特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、PCRプライマーを用いてPCR増幅する方法やPCR増幅産物をプローブで検出する方法等を例示することができる。
　PCRプライマーを用いてPCR増幅する方法としては、検出目的に応じて選択した上記本発明の木の実検出用プライマーセットを用いて、試料中のDNAにおける標的塩基配列を選択的に増幅させ、PCR増幅産物の有無を測定する方法が挙げられる。PCR増幅産物の有無の確認は、通常、PCR増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドやサイバーグリーンIなどの核酸染色によって行うことができる。リアルタイムPCR装置を用いてPCRを行う場合は、その装置の検出システムにより自動的にPCR増幅産物の有無を確認することができる。例えば、PCR反応液中にサイバーグリーンIを添加した場合、サイバーグリーンIが二本鎖DNAに結合したときに発する蛍光量に依存したPCR増幅産物量をサイクル毎にモニターすることができる。蛍光量によりPCR増幅が見られた場合には、先述のアガロースゲル電気泳動によって増幅産物の有無とそのサイズを確認すればよい。
　具体的には、配列番号1記載のプライマーと配列番号2記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約515 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にアーモンドが存在していたことを示唆する。
　具体的には、配列番号3記載のプライマーと配列番号4記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約75 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にビーチナッツが存在していたことを示唆する。
　具体的には、配列番号5記載のプライマーと配列番号6記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約91 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にブラジルナッツが存在していたことを示唆する。
　具体的には、配列番号7記載のプライマーと配列番号8記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約102 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にカシューナッツが存在していたことを示唆する。
　具体的には、配列番号9記載のプライマーと配列番号10記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約293 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にクリが存在していたことを示唆する。
　具体的には、配列番号11記載のプライマーと配列番号12記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約224 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にココナッツが存在していたことを示唆する。
　具体的には、配列番号13記載のプライマーと配列番号14記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約186 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に銀杏が存在していたことを示唆する。
　具体的には、配列番号15記載のプライマーと配列番号16記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約361 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にヘーゼルナッツが存在していたことを示唆する。
　具体的には、配列番号17記載のプライマーと配列番号18記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約543 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にヒッコリーナッツが存在していたことを示唆する。
　具体的には、配列番号19記載のプライマーと配列番号20記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約162 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にライチが存在していたことを示唆する。
　具体的には、配列番号21記載のプライマーと配列番号22記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約111 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にマカダミアナッツが存在していたことを示唆する。
　具体的には、配列番号23記載のプライマーと配列番号24記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約468 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にピーカンナッツが存在していたことを示唆する。
　尚、ピーカンナッツはヒッコリーナッツの一種であるため、前述のヒッコリーナッツの検出プライマーによってもピーカンナッツを検出可能である。
　具体的には、配列番号25記載のプライマーと配列番号26記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約139 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に松の実が存在していたことを示唆する。
　具体的には、配列番号27記載のプライマーと配列番号28記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約83 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にピリナッツが存在していたことを示唆する。
　具体的には、配列番号29記載のプライマーと配列番号30記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約163 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にピスタチオが存在していたことを示唆する。
　具体的には、配列番号31記載のプライマーと配列番号32記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約518 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にシアナッツが存在していたことを示唆する。
　具体的には、配列番号33記載のプライマーと配列番号34記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約501 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にクルミが存在していたことを示唆する。
さらに、上記のプライマーセットのうち、主要８種（アーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、ピスタチオ、及びクルミ）について特定の４種の組み合わせについてはマルチプレックス法による検出が可能である。具体的な組合せは以下である。
尚、マルチプレックスPCRとは、１回のPCR反応系に複数のプライマーを同時に使用することによって複数の遺伝子領域を同時に増幅する方法をいう。マルチプレックスPCRを実施することによって、PCR試薬の節約ができ、同時検出によってPCR実験作業の煩雑さを回避するとともに、検出対象である鋳型DNAを節約して有効利用できるというメリットがある。
（１）ピーカンナッツ、クルミ、ピスタチオ、カシューナッツの４種については、配列番号17記載のプライマーと配列番号18記載のプライマー（ヒッコリーナッツ用）、配列番号33記載のプライマーと配列番号34記載のプライマー（クルミ用）、配列番号29記載のプライマーと配列番号30記載のプライマー（ピスタチオ用）及び配列番号7記載のプライマーと配列番号8記載のプライマー（カシューナッツ用）の全てのプライマーが混合された状態でPCR試験に供することにより（マルチプレックス）、ピーカンナッツのPCR増幅産物（約543bp）、クルミのPCR増幅産物（約501bp）、ピスタチオのPCR増幅産物（約163bp）及びカシューナッツのPCR増幅産物（約102bp）を同時に検出することができ、これらのいずれかのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実が存在していたことを示唆する。
　尚、ピーカンナッツはヒッコリーナッツの一種であるため、前述のヒッコリーナッツの検出プライマーによってもピーカンナッツを検出可能である。本マルチプレックスPCRにおいては、ピーカンナッツの検出については、ヒッコリーナッツの検出プライマーを利用する。
また、例えば、これらの全てのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実のいずれも存在していたことを示唆する。
また、マルチプレックスによって検出対象とする木の実の増幅産物が検出された場合、二次検査として個別のプライマーを利用して再度確認検査を行うことが好ましい。
　尚、本マルチプレックスでのPCRの場合、ピーカンナッツ用、クルミ用、ピスタチオ用及びカシューナッツ用の各プライマーのPCRに供するプライマー濃度の比率については特に限定されるものではないが、好ましくは、ピーカンナッツ検出用のプライマーについて、他の三種（クルミ、ピスタチオ、カシューナッツ）がそれぞれ１の割合に対して、０．９以下の割合で使用することが好ましい。また、さらに好ましくは、０．１～０．７の割合で使用することが好ましい。さらに、最も好ましくは、０．２～０．４の割合で使用することが好ましい。
　このような割合にすることで４種のいずれについても好適に検出することが可能である。
（２）アーモンド、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツの４種については、配列番号1記載のプライマーと配列番号2記載のプライマー（アーモンド用）、配列番号15記載のプライマーと配列番号16記載のプライマー（ヘーゼルナッツ用）、配列番号21記載のプライマーと配列番号22記載のプライマー（マカダミアナッツ用）及び配列番号5記載のプライマーと配列番号6記載のプライマー（ブラジルナッツ用）の全てのプライマーが混合された状態でPCR試験に供することにより（マルチプレックス）、アーモンドのPCR増幅産物（約515bp）、ヘーゼルナッツのPCR増幅産物（約361bp）、マカダミアナッツのPCR増幅産物（約111bp）及びブラジルナッツのPCR増幅産物（約91bp）を同時に検出することができ、これらのいずれかのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実が存在していたことを示唆する。
　また、例えば、これらの全てのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実のいずれも存在していたことを示唆する。
また、マルチプレックスによって検出対象とする木の実の増幅産物が検出された場合、二次検査として個別のプライマーを利用して再度確認検査を行うことが好ましい。
　尚、本マルチプレックスでのPCRの場合、アーモンド用、ヘーゼルナッツ用、マカダミアナッツ用及びブラジルナッツ用の各プライマーのPCRに供するプライマー濃度の比率については特に限定されるものではないが、好ましくは、アーモンド検出用のプライマーについて、他の三種（ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツ）がそれぞれ１の割合に対して、２以上の割合で使用することが好ましい。また、さらに好ましくは、４～８の割合で使用することが好ましい。さらに、最も好ましくは、５～７の割合で使用することが好ましい。
　このような割合にすることで４種のいずれについても好適に検出することが可能である。さらに、（１）及び（２）の試験の両方を実施することにより、主要８種（アーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、ピスタチオ、及びクルミ）全てを検出することが可能である。
このように（１）及び（２）の４種×２回実施することで網羅的に上記８種全ての検出が可能となるような方法についても提供することができる。
（３）ピーカンナッツ、クルミ、ヘーゼルナッツ、カシューナッツの４種については、配列番号17記載のプライマーと配列番号18記載のプライマー（ヒッコリーナッツ用）、配列番号33記載のプライマーと配列番号34記載のプライマー（クルミ用）、配列番号15記載のプライマーと配列番号16記載のプライマー（ヘーゼルナッツ用）及び配列番号7記載のプライマーと配列番号8記載のプライマー（カシューナッツ用）の全てのプライマーが混合された状態でPCR試験に供することにより（マルチプレックス）、ピーカンナッツのPCR増幅産物（約543bp）、クルミのPCR増幅産物（約501bp）、ヘーゼルナッツのPCR増幅産物（約361bp）及びカシューナッツの増幅産物（約102bp）を同時に検出することができ、これらのいずれかのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実が存在していたことを示唆する。
　尚、ピーカンナッツはヒッコリーナッツの一種であるため、前述のヒッコリーナッツの検出プライマーによってもピーカンナッツを検出可能であり、本マルチプレックスPCRにおいては、ピーカンナッツの検出については、ヒッコリーナッツの検出プライマーを利用する。
　また、例えば、これらの全てのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実のいずれも存在していたことを示唆する。
また、マルチプレックスによって検出対象とする木の実の増幅産物が検出された場合、二次検査として個別のプライマーを利用して再度確認検査を行うことが好ましい。
　尚、本マルチプレックスでのPCRの場合、ピーカンナッツ用、クルミ用、ヘーゼルナッツ用及びカシューナッツ用の各プライマーのPCRに供するプライマー濃度の比率については特に限定されるものではないが、好ましくは、ピーカンナッツ検出用のプライマーについて、他の三種（クルミ、ヘーゼルナッツ、カシューナッツ）がそれぞれ１の割合に対して、０．９以下の割合で使用することが好ましい。また、さらに好ましくは、０．１～０．７の割合で使用することが好ましい。さらに、最も好ましくは、０．２～０．４の割合で使用することが好ましい。
　このような割合にすることで４種のいずれについても好適に検出することが可能である。
（４）アーモンド、ピスタチオ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツの４種については、配列番号1記載のプライマーと配列番号2記載のプライマー（アーモンド用）、配列番号29記載のプライマーと配列番号30記載のプライマー（ピスタチオ用）、配列番号21記載のプライマーと配列番号22記載のプライマー（マカダミアナッツ用）及び配列番号5記載のプライマーと配列番号6記載のプライマー（ブラジルナッツ用）のすべてのプライマーが混合された状態でPCR試験に供することにより（マルチプレックス）、アーモンドのPCR増幅産物（約515bp）、ピスタチオのPCR増幅産物（約163bp）、マカダミアナッツのPCR増幅産物（約111bp）及びブラジルナッツのPCR増幅産物（約91bp）を同時に検出することができ、これらのいずれかのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実が存在していたことを示唆する。
　また、例えば、これらの全てのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実のいずれも存在していたことを示唆する。また、マルチプレックスによって検出対象とする木の実の増幅産物が検出された場合、二次検査として個別のプライマーを利用して再度確認検査を行うことが好ましい。
　尚、本マルチプレックスでのPCRの場合、アーモンド用、ピスタチオ用、マカダミアナッツ用及びブラジルナッツ用の各プライマーのPCRに供するプライマー濃度の比率については特に限定されるものではないが、好ましくは、アーモンド検出用のプライマーについて、他の三種（ピスタチオ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツ）がそれぞれ１の割合に対して、２以上の割合で使用することが好ましい。また、さらに好ましくは、４～８の割合で使用することが好ましい。さらに、最も好ましくは、５～７の割合で使用することが好ましい。
　このような割合にすることで４種のいずれについても好適に検出することが可能である。
　さらに、（３）及び（４）の試験の両方を実施することにより、主要８種（アーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、ピスタチオ、及びクルミ）全てを検出することが可能である。
このように（３）及び（４）の４種×２回実施することで網羅的に上記８種全ての検出が可能となるような方法についても提供することができる。
（５）ピーカンナッツ、クルミ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツの４種については、配列番号17記載のプライマーと配列番号18記載のプライマー（ヒッコリーナッツ用）、配列番号33記載のプライマーと配列番号34記載のプライマー（クルミ用）、配列番号21記載のプライマーと配列番号22記載のプライマー（マカダミアナッツ用）及び配列番号5記載のプライマーと配列番号6記載のプライマー（ブラジルナッツ用）の全てのプライマーが混合された状態でPCR試験に供することにより（マルチプレックス）、ピーカンナッツのPCR増幅産物（約543bp）、クルミのPCR増幅産物（約501bp）、マカダミアナッツのPCR増幅産物（約111bp）及びブラジルナッツのPCR増幅産物（約91bp）を同時に検出することができ、これらのいずれかのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実が存在していたことを示唆する。
　尚、ピーカンナッツはヒッコリーナッツの一種であるため、前述のヒッコリーナッツの検出プライマーによってもピーカンナッツを検出可能であり、本マルチプレックスPCRにおいては、ピーカンナッツの検出については、ヒッコリーナッツの検出プライマーを利用する。また、例えば、これらの全てのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実のいずれも存在していたことを示唆する。
　また、マルチプレックスによって検出対象とする木の実の増幅産物が検出された場合、二次検査として個別のプライマーを利用して再度確認検査を行うことが好ましい。
　尚、本マルチプレックスでのPCRの場合、ピーカンナッツ用、クルミ用、マカダミアナッツ用及びブラジルナッツ用の各プライマーのPCRに供するプライマー濃度の比率については特に限定されるものではないが、好ましくは、ピーカンナッツ検出用のプライマーについて、他の三種（クルミ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツ）がそれぞれ１の割合に対して、０．９以下の割合で使用することが好ましい。また、さらに好ましくは、０．１～０．７の割合で使用することが好ましい。さらに、最も好ましくは、０．２～０．４の割合で使用することが好ましい。
　このような割合にすることで４種のいずれについても好適に検出することが可能である。
（６）アーモンド、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、カシューナッツの４種については、配列番号1記載のプライマーと配列番号2記載のプライマー（アーモンド用）、配列番号15記載のプライマーと配列番号16記載のプライマー（ヘーゼルナッツ用）、配列番号29記載のプライマーと配列番号30記載のプライマー（ピスタチオ用）及び配列番号7記載のプライマーと配列番号8記載のプライマー（カシューナッツ用）の全てのプライマーが混合された状態でPCR試験に供することにより（マルチプレックス）、アーモンドのPCR増幅産物（約515bp）、ヘーゼルナッツのPCR増幅産物（約361bp）、ピスタチオのPCR増幅産物（約163bp）及びカシューナッツの増幅産物（約102bp）を同時に検出することができ、これらのいずれかのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実が存在していたことを示唆する。
　また、例えば、これらの全てのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実のいずれも存在していたことを示唆する。
また、マルチプレックスによって検出対象とする木の実の増幅産物が検出された場合、二次検査として個別のプライマーを利用して再度確認検査を行うことが好ましい。
尚、本マルチプレックスでのPCRの場合、アーモンド用、ヘーゼルナッツ用、ピスタチオ用及びカシューナッツ用の各プライマーのPCRに供するプライマー濃度の比率については特に限定されるものではないが、好ましくは、アーモンド検出用のプライマーについて、他の三種（ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、カシューナッツ）がそれぞれ１の割合に対して、２以上の割合で使用することが好ましい。また、さらに好ましくは、４～８の割合で使用することが好ましい。さらに、最も好ましくは、５～７の割合で使用することが好ましい。
　このような割合にすることで４種のいずれについても好適に検出することが可能である。さらに、（５）及び（６）の試験の両方を実施することにより、主要８種（アーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、ピスタチオ、及びクルミ）全てを検出することが可能である。
このように（５）及び（６）の４種×２回実施することで網羅的に上記８種全ての検出が可能となるような方法についても提供することができる。
　PCR増幅産物をプローブで検出する方法としては、Taq Man法に代表されるように、PCR増幅産物の内部塩基配列とハイブリダイズするような蛍光物質標識プローブを反応液に添加し、該プローブがPCR増幅産物にハイブリダイズ後、該プローブが分解されるときに生じる蛍光量をリアルタイムPCR装置で自動的に検出することによって、PCR増幅産物の有無を確認する方法が挙げられる。なお、PCR増幅産物をプローブで検出するその他の方法としては、Molecular Beacon法、CycleavePCR法、ハイブリプローブを利用する方法等が挙げられる。これらの方法で使用するPCRプライマーは、本発明の木の実検出用PCRプライマーセットの何れかを使用すればよく、各々のPCRプライマーセットで増幅されるPCR増幅産物の内部塩基配列から標的とする生物種に共通な塩基配列領域を別途選択し、その領域に基づいたプローブを使用すればよい。
　本発明の木の実の検出法において、対象となる被験試料の種類は、特に限定されない。例えば、被験試料としては、食品原料や加工食品等が挙げられる。食品原料としては、木の実を取り扱う食品原料生産工場において、別途生産される木の実を意図的に含まない食品原料が挙げられる。加工食品としては、菓子類、麺類、粉末スープ、液体スープ、熱風乾燥又は凍結乾燥した具材、あるいは、これらの加工食品を含有する各種調理食品等が挙げられる。また、木の実を取り扱う食品製造工場において、別途生産される木の実を意図的に含まない加工食品が挙げられる。また、木の実を含む加工食品を製造後、木の実を含まない加工食品を製造する際には、木の実残渣の除去を念頭においた食品製造設備の入念な清掃作業が必須となる。この清掃作業方法の有効性、並びに、食品製造設備の木の実残渣の有無を確認する観点から、当該製造設備の拭き取り試料も被験試料として挙げられる。
　また、試料の形態も特に限定されず、一般的な既知のDNA抽出法（消費者庁次長通知、アレルギー物質を含む食品の検査方法について、平成26年3月26日、消食表第36号）や市販の各種DNA抽出キット［例えば、Nucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits（GE Healthcare Biosciences Corp., USA）、DNA Extraction IsoplantII kit（Nippon Gene Co. Ltd., Japan）、DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）等］によって、DNAの回収が可能な試料であれば、上記の検出法に適用することができる。上記のDNA抽出法によって、ゲノムDNA及び細胞小器官由来DNA（ミトコンドリアDNAやクロロプラストDNA）を、通常、試料から抽出することができる。
木の実検出用キット
　本発明は、また、木の実検出キットとして利用することも可能である。当該キットは、上記本発明の木の実検出用PCRプライマーセットの少なくとも１セットを含んで成るものであれば、その構成は特に限定されない。
具体的には、配列番号1における塩基番号9～23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号2における塩基番号5～19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号3における塩基番号7～21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号4における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号5における塩基番号9～23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号6における塩基番号5～19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号7における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号8における塩基番号5～19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号9における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号10における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号11における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号12における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号13における塩基番号7～21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号14における塩基番号13～27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号15における塩基番号7～21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号16における塩基番号11～25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号17における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号18における塩基番号9～23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号19における塩基番号7～21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号20における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号21における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号22における塩基番号8～22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列表の配列番号23における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号24における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号25における塩基番号5～19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号26における塩基番号8～22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号27における塩基番号8～22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号28における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号29における塩基番号10～24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号30における塩基番号15～29の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号31における塩基番号8～22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号32における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号33における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号34における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；の1セット以上を含む木の実検出キットが挙げられる。
　そして、好ましいものとして、配列番号1の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号2の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号3の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号4の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号5の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号6の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号7の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号8の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号9の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号10の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号11の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号12の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号13の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号14の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号15の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号16の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号17の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列表の配列番号23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号26の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号28の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号29の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号30の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号31の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号32の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；
配列番号33の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号34の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセットの1セット以上を含む木の実検出キットが挙げられる。
　その中でも、特に好ましいものとして、配列番号1の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号2の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；
配列番号3の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号4の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；
配列番号5の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号6の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；
配列番号7の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号8の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；
配列番号9の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号10の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；
配列番号11の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号12の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；
配列番号13の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号14からなるPCRプライマーとのセット；
配列番号15の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号16の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；
配列番号17の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号18の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；
配列番号19の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号20の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；
配列番号21の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号22の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；
配列表の配列番号23の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号24の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；
配列番号25の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号26の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；
配列番号27の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号28の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；
配列番号29の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号30の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；
配列番号31の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号32の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；
配列番号33の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号34の塩基配列からなるPCRプライマーとのセットの1セット以上を含む木の実検出キットが挙げられる。
　また、上記の各々のプライマーセット、及び当該の各々のプライマーセットで増幅されるPCR増幅産物を検出するためのプローブ等を含む木の実検出キットなども挙げられる。
　当該キットには、使用目的等に応じて、適当な試薬や各種容器等を含めることができる。具体的には、PCRプライマー伸長生成物を合成するための重合用試薬、例えば、耐熱性DNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド、マグネシウム及び、PCR反応用緩衝液、並びに、それらの品質を適切に保持可能な保存容器等を含めることができる。
実施例
　以下に、本発明について実施例を用いて、さらに、詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定して解釈されるものではない。また、本発明の要旨を逸脱することなく、適宜変更することが可能である。
実施例1
各種動物、植物、真菌、及び細菌由来DNAに対する木の実検出用PCRプライマーセットの検出特異性の確認
　本発明の木の実検出用PCRプライマーセットを使用したPCR分析法の有効性を確認するために、各種生物由来DNAに対するPCRの検出特異性を調べる実験を、下記のように実施した。
　ヒトの精製DNAは、セマイン社（CeMines, LLC, USA）から購入したものを使用した。
　ウシ、ブタ、ニワトリ、シロエビ、タラバガニ、コウイカ、ベニザケ、及びマサバの精製DNAは、商店から購入した各々の試料の（筋）肉質部分を凍結後、マルチビーズショッカー（安井器械、大阪）で破砕した試料からNucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits（GE Healthcare Biosciences Corp., USA）、DNA Extraction IsoplantII kit（Nippon Gene Co. Ltd., Japan）、またはDNeasy Blood&Tissue kit（Qiagen GmbH, Germany）を用いて調製したものを使用した。
　コショウ、ナガイモ、ネギ、ココナッツ、ナツメヤシ、アサイー、バナナ、マカダミアナッツ（オーストラリア産、ケニア産）、レンコン、ラッカセイ、ダイズ、アーモンド（アメリカ産、スペイン産）、モモ、プルーン、ウメ、スモモ、アンズ、サクランボ、リンゴ、ビワ、イチゴ、カボチャ、ピーカンナッツ、クルミ（アメリカ産、フランス産）、ヘーゼルナッツ、ピリナッツ、カシューナッツ（インド産、ベトナム産）、ピスタチオ（イラン産、アメリカ産）、マンゴー、ピンクペッパー、ライチ、ランブータン、キャベツ、ブラジルナッツ、シアナッツ、ミラクルフルーツ、カキ、茶、キウイフルーツ、ブルーベリー、ゴマ、ジャガイモ、ニンジン、銀杏、松の実は、商店から購入し、イネは国内栽培農家から入手した。これらの精製DNAは、各々の試料の一部（種子、果皮部、葉部、塊茎部）を70%エタノールで洗浄し、さらに、TE緩衝液で素早く洗浄後、マルチビーズショッカー（安井器械、大阪）で破砕した試料からGenomic-tip 20/G（Qiagen GmbH, Germany）、DNeasy plant Mini kits（Qiagen GmbH, Germany）、Nucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits、または、DNA Extraction IsoplantII kitを用いて調製したものを使用した。
　ソバ及びコムギの精製DNAは、商店から購入したそば粉及び小麦粉からGenomic-tip 20/Gを用いて調製したものを使用した。
　トウモロコシの精製DNAは、バイオチェイン・インスティテュート社（BioChain Institute, Inc., USA）から購入したものを使用した。
　ヒッコリーナッツ（オーバータヒッコリー）の精製DNAは、東京大学大学院理学系研究科附属植物園から分譲された葉からDNeasy Plant Mini Kitを用いて調製したものを使用した。
　クリ（和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ）の精製DNAは、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構果樹研究所から提供された葉からDNeasy Plant Mini Kitを用いて調製したものを使用した。
　クリ（チンカピン）の精製DNAは、独立行政法人森林総合研究所多摩森林科学園から分譲された葉からDNeasy Plant Mini Kitを用いて調製したものを使用した。
　ビーチナッツ（ブナ、イヌブナ）、シイ、ドングリ（シラカシ）の精製DNAは、自然界より入手した葉からDNeasy Plant Mini Kitを用いて調製したものを使用した。
　ピキア・アノマラ（Pichia anomala IFO 0144）、及びバチルス・セレウス菌（Bacillus cereus ATCC11950）の精製DNAは、各々の菌株を適切な培地で培養後、その培養液からPuregene Yeast and Gram-Positive DNA Isolation kit（Gentra Systems Inc., USA）を用いて調製したものを使用した。
なお、いずれの精製DNAもRNA分解酵素によるRNAの除去操作を実施してある。
　配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、及び34に記載の各々のPCRプライマーは、ユーロフィンジェノミクス社で合成されたものを、以下のPCRで使用した。
　上述したように準備した各種動物、植物、真菌、及び細菌DNA量を測定後、滅菌水を用いて、DNA濃度を10 ng/μLに調製した。調製した5 μLのDNA試料液を含む20 μL容量の反応液は、タカラバイオ社のSYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)（Takara Bio Inc., Japan）を用いて調製した。この試薬は、TaKaRa Ex Taq HS（ホットスタートタイプ）、dNTP Mixture、Mg2+およびSYBR Green Iを溶液中に含んでいる。反応液は、SYBR Premix Ex Taqをベースとし、250 nMセンスプライマー、250 nMアンチセンスプライマーを含む組成として、調製した。PCR反応は、LightCycler（Roche Diagnostics GmbH, Germany）で行い、増幅反応条件は以下の通りである。
　95℃で1分間のサイクルを一回実施後、20℃/秒の速度で95℃まで昇温後、5秒間同温度で保温、次に20℃/秒の速度で68℃まで降温後、10秒間同温度で保温、さらに10℃/秒の速度で72℃まで昇温後、30秒間同温度で保温する3つのステップからなる増幅サイクルを35回実施した。PCR増幅産物は、SYBR Green I依存性の蛍光量として、各々のサイクルの最終ステップに記録した。蛍光量から増幅が確認された場合は、2%（wt/vol）アガロースゲル電気泳動によってPCR増幅産物（反応液の5 μL）を分離し、Gel DOC EZ（Bio Rad）を用いて増幅産物を視覚化することによって、増幅産物の有無を確認した。分子量マーカーとしてOneMARK 100（GeneDireX）を使用した。電気泳動により標的サイズの増幅産物が検出された場合を、PCR反応陽性と判定した。これらのPCRの結果を表1に記載した。表中の＋（プラス）はPCR反応陽性を示し、－（マイナス）はPCR反応陰性を示す。
　アーモンド検出用PCRプライマー（配列番号1及び2からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、アーモンド（アメリカ産、スペイン産）DNAを使用した場合のみ515bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるモモDNA、プルーンDNA、ウメDNA、スモモDNA、アンズDNA、サクランボDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
　また、ビーチナッツ検出用PCRプライマー（配列番号3及び4からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ビーチナッツ（ブナ、イヌブナ）DNAを使用した場合のみ75bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるクリ（和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン）DNA、シイDNA、ドングリ（シラカシ）DNA、ピーカンナッツDNA、ヒッコリーナッツDNA、クルミ（アメリカ産、フランス産）DNA、ヘーゼルナッツDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
　また、ブラジルナッツ検出用PCRプライマー（配列番号5及び6からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ブラジルナッツDNAを使用した場合のみ91bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるシアナッツDNA、ミラクルフルーツDNA、カキDNA、茶DNA、キウイフルーツDNA、ブルーベリーDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
　また、カシューナッツ検出用PCRプライマー（配列番号7及び8からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、カシューナッツ（インド産、ベトナム産）DNAを使用した場合のみ102bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるピスタチオ（イラン産、アメリカ産）DNA、マンゴーDNA、ピンクペッパーDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
　また、クリ検出用PCRプライマー（配列番号9及び10からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、クリ（和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン）DNAを使用した場合のみ293bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるビーチナッツ（ブナ、イヌブナ）DNA、シイDNA、ドングリ（シラカシ）DNA、ピーカンナッツDNA、ヒッコリーナッツDNA、クルミ（アメリカ産、フランス産）DNA、ヘーゼルナッツDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
　また、ココナッツ検出用PCRプライマー（配列番号11及び12からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ココナッツDNAを使用した場合のみ224bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるナツメヤシDNA、アサイーDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
　また、銀杏検出用PCRプライマー（配列番号13及び14からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、銀杏DNAを使用した場合のみ186bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
　また、ヘーゼルナッツ検出用PCRプライマー（配列番号15及び16からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ヘーゼルナッツDNAを使用した場合のみ361bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるピーカンナッツDNA、ヒッコリーナッツDNA、クルミ（アメリカ産、フランス産）DNA、クリ（和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン）DNA、ビーチナッツ（ブナ、イヌブナ）DNA、シイDNA、ドングリ（シラカシ）DNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
　また、ヒッコリーナッツ検出用PCRプライマー（配列番号17及び18からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ヒッコリーナッツ（オーバータヒッコリー）DNA、ピーカンナッツDNAを使用した場合のみ543bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるクルミ（アメリカ産、フランス産）DNA、クリ（和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン）DNA、ビーチナッツ（ブナ、イヌブナ）DNA、ヘーゼルナッツDNA、シイDNA、ドングリ（シラカシ）DNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
　また、ライチ検出用PCRプライマー（配列番号19及び20からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ライチDNAを使用した場合のみ162bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるランブータンDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
　また、マカダミアナッツ検出用PCRプライマー（配列番号21及び22からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、マカダミアナッツ（オーストラリア産、ケニア産）DNAを使用した場合のみ111bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるレンコンDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
　また、ピーカンナッツ検出用PCRプライマー（配列番号23及び24からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ピーカンナッツDNAを使用した場合のみ468bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるヒッコリーナッツ（オーバータヒッコリー）DNA、クルミ（アメリカ産、フランス産）DNA、クリ（和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン）DNA、ビーチナッツ（ブナ、イヌブナ）DNA、ヘーゼルナッツDNA、シイDNA、ドングリ（シラカシ）DNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
　また、松の実検出用PCRプライマー（配列番号25及び26からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、松の実DNAを使用した場合のみ139bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
　また、ピリナッツ検出用PCRプライマー（配列番号27及び28からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ピリナッツDNAを使用した場合のみ83bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるカシューナッツ（インド産、ベトナム産）DNA、ピスタチオ（イラン産、アメリカ産）DNA、マンゴーDNA、ピンクペッパーDNA、ライチDNA、ランブータンDNA、オレンジDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
　また、ピスタチオ検出用PCRプライマー（配列番号29及び30からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ピスタチオ（イラン産、アメリカ産）DNAを使用した場合のみ163bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるカシューナッツ（インド産、ベトナム産）DNA、マンゴーDNA、ピンクペッパーDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
　また、シアナッツ検出用PCRプライマー（配列番号31及び32からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、シアナッツDNAを使用した場合のみ518bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるミラクルフルーツDNA、ブラジルナッツDNA、カキDNA、茶DNA、キウイフルーツDNA、ブルーベリーDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
　また、クルミ検出用PCRプライマー（配列番号33及び34からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、クルミ（アメリカ産、フランス産）DNAを使用した場合のみ501bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるピーカンナッツDNA、ヒッコリーナッツ（オーバータヒッコリー）DNA、クリ（和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン）DNA、ビーチナッツ（ブナ、イヌブナ）DNA、ヘーゼルナッツDNA、シイDNA、ドングリ（シラカシ）DNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。







































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実施例2
木の実検出用PCRプライマーセットを用いたPCRの検出感度の確認
　実施例1で使用した木の実検出用PCRプライマーセットを用いたPCRの検出感度を調べるために、下記のような実験を実施した。
実施例1で調製したアーモンド（アメリカ産）、ビーチナッツ（ブナ）、ブラジルナッツ、カシューナッツ（インド産）、クリ（チュウゴクグリ）、ココナッツ、ヘーゼルナッツ、銀杏、ライチ、マカダミアナッツ（オーストラリア産）、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ（アメリカ産）、シアナッツ、及びクルミ（アメリカ産）の各DNAを滅菌水で希釈し、1 fg/μl、10 fg/μl、100 fg/μl、1 pg/μl、10 pg/μl、100 pg/μl のDNA溶液の希釈系列を作製し、これらの希釈した被験DNA液の1 μLを、実施例1に記載したPCR反応条件で、PCRに供した。PCR反応後、増幅産物の有無をアガロースゲル電気泳動によって確認した。
　図1に示すように、アーモンド検出用PCRプライマー（配列番号1及び2からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ビーチナッツ検出用PCRプライマー（配列番号3及び4からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、10 fg DNA/分析であり、ブラジルナッツ検出用PCRプライマー（配列番号5及び6からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、カシューナッツ検出用PCRプライマー（配列番号7及び8からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、1 ｐg DNA/分析であり、クリ検出用PCRプライマー（配列番号9及び10からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、1 pg DNA/分析であり、ココナッツ検出用PCRプライマー（配列番号11及び12からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 pg DNA/分析であり、銀杏検出用PCRプライマー（配列番号13及び14からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ヘーゼルナッツ検出用PCRプライマー（配列番号15及び16からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ヒッコリーナッツ検出用PCRプライマー（配列番号17及び18からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ライチ検出用PCRプライマー（配列番号19及び20からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、マカダミアナッツ検出用PCRプライマー（配列番号21及び22からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ピーカンナッツ検出用PCRプライマー（配列番号23及び24からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、10 fg DNA/分析であり、松の実検出用PCRプライマー（配列番号25及び26からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ピリナッツ検出用PCRプライマー（配列番号27及び28からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ピスタチオ検出用PCRプライマー（配列番号29及び30からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、シアナッツ検出用PCRプライマー（配列番号31及び32からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、10 fg DNA/分析であり、クルミ検出用PCRプライマー（配列番号33及び34からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、1 fg DNA/分析であった。
実施例3
木の実検出用PCRプライマーセットを用いたPCRによる木の実含有食品中の木の実由来DNAの検出
　各種木の実を原料として含有する市販食品等に対する本発明の木の実検出用PCRプライマーセットを用いたPCR分析を下記のように行い、本発明の実用性を検討した。
　各種木の実を原料として含有することが明記されている市販食品（表2）を準備し、10～100 gをマルチビーズショッカーで粉砕した。その混合破砕物の2 gから各々のDNAをGenomic-tip 20/G kitを用いて抽出した。抽出時には、RNA分解酵素によるRNAの除去操作も実施した。抽出した食品試料DNA量を測定後、滅菌水を用いて、食品試料DNAの濃度を10 ng/μLに調製した。なお、ビーチナッツ、ヒッコリーナッツ、およびシアナッツを原料として含有する市販食品の入手が困難であったため、代替試料として、ココナッツサブレ（日清シスコ）DNA溶液（10 ng/μL）に各DNAを10 pg/μLの濃度で添加したものを使用した。これらの調製DNA液の5 μLを、実施例1で使用した木の実検出用PCRプライマーセットを用い、実施例1に記載したPCR反応条件で、PCRに供した。蛍光量から増幅が確認された場合は、2%（wt/vol）アガロースゲル電気泳動によってPCR増幅産物（反応液の5 μL）を分離し、Gel DOC EZ（Bio Rad）を用いて増幅産物を視覚化することによって、増幅産物の有無を確認した。分子量マーカーとしてOneMARK 100（GeneDireX）を使用した。電気泳動により標的サイズの増幅産物が検出された場合を、PCR反応陽性と判定した。これらのPCRの結果を表2に記載した。表中の＋（プラス）はPCR反応陽性を示し、－（マイナス）はPCR反応陰性を示す。
さらに、食品試料DNAから増幅されたPCR増幅産物を、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit（Applied Biosystems社）を用いて、両方向からダイレクトシーケンス後、Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社）によって塩基配列を分析した。分析した塩基配列データをGenBank nucleotide sequence database（BLAST search）もしくは、発明者らが保有するDNAデータベースと比較解析し、その塩基配列の類似性に基づいて、PCR増幅産物由来DNAの生物種を帰属・同定した。
　その結果、アーモンド検出用PCRプライマー（配列番号1及び2からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、アーモンド含有食品である、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）及びプチチョコリーフパイ（エル・マドロン）由来DNAにおいてのみ、515bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）及びプチチョコリーフパイ（エル・マドロン）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、アーモンドのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、アーモンド非含有食品試料からアーモンド由来DNAやその他のDNAを検出しないが、アーモンド含有食品試料からアーモンド由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
　また、ビーチナッツ検出用PCRプライマー（配列番号3及び4からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、ビーチナッツ含有食品の代替試料［50pgビーチナッツDNAを添加したココナッツサブレ(日清シスコ)］由来DNAにおいてのみ、75 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、ビーチナッツ含有食品の代替試料由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ビーチナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ビーチナッツ非含有食品試料からビーチナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ビーチナッツ非含有食品中に添加された微量のビーチナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
　また、ブラジルナッツ検出用PCRプライマー（配列番号5及び6からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ブラジルナッツ含有食品である、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）由来DNAにおいてのみ、91bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ブラジルナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ブラジルナッツ非含有食品試料からブラジルナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ブラジルナッツ含有食品試料からブラジルナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
　また、カシューナッツ検出用PCRプライマー（配列番号7及び8からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、カシューナッツ含有食品である、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）及びトリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）由来DNAにおいてのみ、102bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）及びトリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、カシューナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、カシューナッツ非含有食品試料からカシューナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、カシューナッツ含有食品試料からカシューナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
　また、クリ検出用PCRプライマー（配列番号9、及び10からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、クリ含有食品である、栗饅頭（山久YK）由来DNAにおいてのみ、293bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、栗饅頭（山久YK）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、クリのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、クリ非含有食品試料からクリ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、含有食品試料からクリ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
　また、ココナッツ検出用PCRプライマー（配列番号11及び12からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、ココナッツ含有食品である、トリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）及びココナッツサブレ（日清シスコ）由来DNAにおいてのみ、224bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、トリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）及びココナッツサブレ（日清シスコ）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ココナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ココナッツ非含有食品試料からココナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ココナッツ含有食品試料からココナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
　また、銀杏検出用PCRプライマー（配列番号13及び14からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、銀杏含有食品である、ぎんなん羊羹（山岸モータース）由来DNAにおいてのみ、186bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、ぎんなん羊羹（山岸モータース）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、銀杏のクロロプラストmatK遺伝子配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、銀杏非含有食品試料から銀杏由来DNAやその他のDNAを検出しないが、銀杏含有食品試料から銀杏由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
　また、ヘーゼルナッツ検出用PCRプライマー（配列番号15及び16からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、ヘーゼルナッツ含有食品である、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）由来DNAにおいてのみ、361bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ヘーゼルナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ヘーゼルナッツ非含有食品試料からヘーゼルナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ヘーゼルナッツ含有食品試料からヘーゼルナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
　また、ヒッコリーナッツ検出用PCRプライマー（配列番号17及び18からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、ヒッコリーナッツ含有食品の代替試料［50pgヒッコリーナッツDNAを添加したココナッツサブレ（日清シスコ）］由来DNA、及びピーカンナッツ含有食品であるトリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）においてのみ、543 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、ヒッコリーナッツ含有食品の代替試料由来DNA及びトリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ヒッコリーナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ヒッコリーナッツ非含有食品試料からヒッコリー由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ピーカンナッツ含有食品試料、及びヒッコリーナッツ非含有食品中に添加された微量のヒッコリーナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
　また、ライチ検出用PCRプライマー（配列番号19及び20からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、ライチ含有食品である、フルーツセラピー　ホワイトピーチ（フジッコ）由来DNAにおいてのみ、162bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、フルーツセラピー　ホワイトピーチ（フジッコ）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ライチのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ライチ非含有食品試料からライチ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ライチ含有食品試料からライチ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
　また、マカダミアナッツ検出用PCRプライマー（配列番号21及び22からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、マカダミアナッツ含有食品である、プチチョコリーフパイ（エル・マドロン）由来DNAにおいてのみ、111bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、プチチョコリーフパイ（エル・マドロン）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、マカダミアナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、マカダミアナッツ非含有食品試料からマカダミアナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、マカダミアナッツ含有食品試料からマカダミアナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
　また、ピーカンナッツ検出用PCRプライマー（配列番号23及び24からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、ピーカンナッツ含有食品であるトリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）においてのみ、468 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、トリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ピーカンナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ピーカンナッツ非含有食品試料からピーカンナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ピーカンナッツ含有食品試料からピーカンナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
　また、松の実検出用PCRプライマー（配列番号25及び26からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、松の実含有食品であるまぜるだけのスパゲッティソース　バジル（エスビー食品）においてのみ、139 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、まぜるだけのスパゲッティソース　バジル（エスビー食品）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、松の実のITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、松の実非含有食品試料から松の実由来DNAやその他のDNAを検出しないが、松の実含有食品試料から松の実由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
　また、ピリナッツ検出用PCRプライマー（配列番号27及び28からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、ピリナッツ含有食品であるLA2PU CRISPY PILINUT with Garlic（ロイヤルコンツェルン）においてのみ、83 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、LA2PU CRISPY PILINUT with Garlic（ロイヤルコンツェルン）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ピリナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ピリナッツ非含有食品試料からピリナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ピリナッツ含有食品試料からピリナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
　また、ピスタチオ検出用PCRプライマー（配列番号29及び30からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ピスタチオ含有食品である、プチチョコリーフパイ（エル・マドロン）由来DNAにおいてのみ、163bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、プチチョコリーフパイ（エル・マドロン）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ピスタチオのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ピスタチオ非含有食品試料からピスタチオ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ピスタチオ含有食品試料からピスタチオ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
　また、シアナッツ検出用PCRプライマー（配列番号31及び32からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、シアナッツ含有食品の代替試料［50pgシアナッツDNAを添加したココナッツサブレ（日清シスコ）］由来DNAにおいてのみ、518 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、シアナッツ含有食品の代替試料由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、シアナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、シアナッツ非含有食品試料からシアナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、シアナッツ非含有食品中に添加された微量のシアナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
　また、クルミ検出用PCRプライマー（配列番号33及び34からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、クルミ含有食品である、あずきくるみデニッシュ（敷島製パン）由来DNAにおいてのみ、501bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、あずきくるみデニッシュ（敷島製パン）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、クルミのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、クルミ非含有食品試料からクルミ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、クルミ含有食品試料からクルミ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例4
アーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、ピスタチオ、及びクルミの８種について、特定の４種の組み合わせでのマルチプレックス法による検出
　実施例1で調製したアーモンド（アメリカ産）、ブラジルナッツ、カシューナッツ（インド産）、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ（オーストラリア産）、ピーカンナッツ、ピスタチオ（アメリカ産）及びクルミ（アメリカ産）の各DNAを滅菌水で希釈し、試料溶液を調製した。
　配列番号1、2、5、6、7、8、15、16、17、18、21、22、29、30、33、及び34に記載の各々のPCRプライマーは、ユーロフィンジェノミクス社で合成されたものを、以下のPCRで使用した。
PCR反応液は、タカラバイオ社のSYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)、1 pg/μLに調製した各DNA溶液1 μL、及び4種類のセンスプライマーとアンチセンスプライマーを含む組成として、20 μL容量に調製した。各々のプライマー濃度は、ピーカンナッツ検出用プライマーは100 nM、同反応系に用いるその他３種のプライマーは250 nMとした。また、アーモンド検出用プライマーは500 nM、同反応系に用いるその他３種のプライマーは100 nMとした。PCR反応は、Applied Biosystems 7500リアルタイムPCRシステム（Thermo Fisher Scientific）で行い、増幅反応条件は以下の通りである。
　95℃で30秒間のサイクルを一回実施後、95℃まで昇温後、5秒間同温度で保温、次に70℃まで降温後、40秒間同温度で保温する2つのステップからなる増幅サイクルを35回実施した。4%（wt/vol）アガロースゲル電気泳動によってPCR増幅産物（反応液の5 μL）を分離し、エチジウムブロマイド染色後、Chemi DOC Touch（Bio Rad）を用いて増幅産物の有無を確認した。分子量マーカーとしてOneMARK 100（GeneDireX）を使用した。
　ピーカンナッツ、クルミ、ピスタチオ、カシューナッツの４種についてのマルチプレックス（同時検出）の場合、図２の（Ａ）に示すように、検出対象木の実のいずれについても、検出することができた。
尚、図２（Ａ）において１～５の各レーン番号は、ピーカンナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン１）、クルミDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン２）、ピスタチオDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン３）、カシューナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン４）、全て（ピーカンナッツ、クルミ、ピスタチオ、カシューナッツ）のDNAを添加してPCR反応させたもの（レーン５）を示す。
　アーモンド、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ及びブラジルナッツの４種についてのマルチプレックス（同時検出）の場合、図２の（Ｂ）に示すように、検出対象木の実のいずれについても、検出することができた。
　
尚、図２（Ｂ）において１～５の各レーン番号は、アーモンドDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン１）、ヘーゼルナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン２）、マカダミアナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン３）、ブラジルナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン４）、全て（アーモンド、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツ）のDNAを添加してPCR反応させたもの（レーン５）を示す。
　ピーカンナッツ、クルミ、ヘーゼルナッツ及びカシューナッツの４種についてのマルチプレックス（同時検出）の場合、図２の（Ｃ）に示すように、検出対象木の実のいずれについても、検出することができた。
尚、図２（Ｃ）において１～５の各レーン番号は、ピーカンナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン１）、クルミDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン２）、ヘーゼルナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン３）、カシューナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン４）、全て（ピーカンナッツ、クルミ、ヘーゼルナッツ、カシューナッツ）のDNAを添加してPCR反応させたもの（レーン５）を示す。
　アーモンド、ピスタチオ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツの４種についてのマルチプレックス（同時検出）の場合、図２の（Ｄ）に示すように、検出対象木の実のいずれについても、検出することができた。
尚、図２（Ｄ）において１～５の各レーン番号は、アーモンドDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン１）、ピスタチオDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン２）、マカダミアナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン３）、ブラジルナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン４）、全て（アーモンド、ピスタチオ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツ）のDNAを添加してPCR反応させたもの（レーン５）を示す。
　ピーカンナッツ、クルミ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツの４種についてのマルチプレックス（同時検出）の場合、図２の（Ｅ）に示すように、検出対象木の実のいずれについても、検出することができた。
尚、図２（Ｅ）において１～５の各レーン番号は、ピーカンナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン１）、クルミDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン２）、マカダミアナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン３）、ブラジルナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン４）、全て（ピーカンナッツ、クルミ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツ）のDNAを添加してPCR反応させたもの（レーン５）を示す。
　アーモンド、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、カシューナッツの４種についてのマルチプレックス（同時検出）の場合、図２の（Ｆ）に示すように、検出対象木の実のいずれについても、検出することができた。
尚、図２（Ｆ）において１～５の各レーン番号は、アーモンドDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン１）、ヘーゼルナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン２）、ピスタチオDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン３）、カシューナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの（レーン４）、全て（アーモンド、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、カシューナッツ）のDNAを添加してPCR反応させたもの（レーン５）を示す。

Claims (23)

  1. 　配列表の配列番号1における塩基番号9～23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号2における塩基番号5～19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるアーモンド検出用PCRプライマーセット。
  2. 　配列表の配列番号3における塩基番号7～21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号4における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるビーチナッツ検出用PCRプライマーセット。
  3. 　配列表の配列番号5における塩基番号9～23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号6における塩基番号5～19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるブラジルナッツ検出用PCRプライマーセット。
  4. 　配列表の配列番号7における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号8における塩基番号5～19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるカシューナッツ検出用PCRプライマーセット。
  5. 　配列表の配列番号9における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号10における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるクリ検出用PCRプライマーセット。
  6. 　配列表の配列番号11における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号12における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるココナッツ検出用PCRプライマーセット。
  7. 　配列表の配列番号13における塩基番号7～21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号14における塩基番号13～27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなる銀杏検出用PCRプライマーセット。
  8. 　配列表の配列番号15における塩基番号7～21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号16における塩基番号11～25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるヘーゼルナッツ検出用PCRプライマーセット。
  9. 　配列表の配列番号17における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号18における塩基番号9～23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるヒッコリーナッツ検出用PCRプライマーセット。
  10. 　配列表の配列番号19における塩基番号7～21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号20における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるライチ検出用PCRプライマーセット。
  11. 　配列表の配列番号21における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号22における塩基番号8～22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるマカダミアナッツ検出用PCRプライマーセット。
  12. 　配列表の配列番号23における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号24における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるピーカンナッツ検出用PCRプライマーセット。
  13. 　配列表の配列番号25における塩基番号5～19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号26における塩基番号8～22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなる松の実検出用PCRプライマーセット。
  14. 　配列表の配列番号27における塩基番号8～22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号28における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるピリナッツ検出用PCRプライマーセット。
  15. 　配列表の配列番号29における塩基番号10～24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号30における塩基番号15～29の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるピスタチオ検出用PCRプライマーセット。
  16. 　配列表の配列番号31における塩基番号8～22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号32における塩基番号4～18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるシアナッツ検出用PCRプライマーセット。
  17. 　配列表の配列番号33における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号34における塩基番号6～20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるクルミ検出用PCRプライマーセット。
  18. 　請求項９記載のプライマーセット、請求項１７記載のプライマーセット、請求項１５に記載のプライマーセット及び請求項４に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したピーカンナッツ、クルミ、ピスタチオ及びカシューナッツの同時PCR検出方法。
  19. 　請求項１記載のプライマーセット、請求項８記載のプライマーセット、請求項１１に記載のプライマーセット及び請求項３に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したアーモンド、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ及びブラジルナッツの同時PCR検出方法。
  20. 　請求項９記載のプライマーセット、請求項１７記載のプライマーセット、請求項８に記載のプライマーセット及び請求項４に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したピーカンナッツ、クルミ、ヘーゼルナッツ及びカシューナッツの同時PCR検出方法。
  21. 　請求項１記載のプライマーセット、請求項１５記載のプライマーセット、請求項１１に記載のプライマーセット及び請求項３に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したアーモンド、ピスタチオ、マカダミアナッツ及びブラジルナッツの同時PCR検出方法。
  22. 　請求項９記載のプライマーセット、請求項１７記載のプライマーセット、請求項１１に記載のプライマーセット及び請求項３に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したピーカンナッツ、クルミ、マカダミアナッツ及びブラジルナッツの同時PCR検出方法。
  23. 　請求項１記載のプライマーセット、請求項８記載のプライマーセット、請求項１５に記載のプライマーセット及び請求項４に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したアーモンド、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ及びカシューナッツの同時PCR検出方法。
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