JP7446956B2 - Dnaの検出方法 - Google Patents
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Description
[1] 被験試料中の動物由来のDNAを検出する方法であって、被験試料から抽出されたDNAを鋳型とし、配列番号1で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号2で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号3で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号6で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されているプローブと、を用いてリアルタイムPCRを行い、測定された蛍光シグナルに基づいて、前記被験試料中の動物由来のDNAを検出することを特徴とする、DNAの検出方法。
[2] 前記プローブが、MGBプローブである、前記[1]のDNAの検出方法。
[3] 前記被験試料が、食品である、前記[1]又は[2]のDNAの検出方法。
[4] 配列番号6で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されていることを特徴とする、動物由来DNA検出用プローブ。
[5] MGBプローブである、前記[4]の動物由来DNA検出用プローブ。
[6] 配列番号1で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号2で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号3で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号6で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されているプローブと、を備える、動物由来DNA検出用キット。
[7] 被験試料中の植物由来のDNAを検出する方法であって、被験試料から抽出されたDNAを鋳型とし、配列番号4で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号5で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号7で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されているプローブと、を用いてリアルタイムPCRを行い、測定された蛍光シグナルに基づいて、前記被験試料中の植物由来のDNAを検出することを特徴とする、DNAの検出方法。
[8] 前記プローブが、MGBプローブである、前記[7]のDNAの検出方法。
[9] 前記被験試料が、食品である、前記[7]又は[8]のDNAの検出方法。
[10] 配列番号7で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されていることを特徴とする、植物由来DNA検出用プローブ。
[11] MGBプローブである、前記[10]の植物由来DNA検出用プローブ。
[12] 配列番号4で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号5で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号7で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されているプローブと、を備える、植物由来DNA検出用キット。
本発明に係るDNAの検出方法において、被験試料中の動物由来のDNAを検出するために用いられるプライマー及びプローブは、様々な動物の遺伝子中で広く保存されている領域とハイブリダイズするように設計されている。特に、食物アレルギーの原因となる畜肉、魚介類等に共通する領域を標的としているため、当該プライマー及びプローブを用いることにより、食品から抽出されたDNA中の畜肉、魚介類等に由来するDNAを網羅的に増幅させることができる。
本発明に係るDNAの検出方法では、被験試料から抽出されたDNAを鋳型とする。当該被験試料としては、動物由来DNA又は植物由来DNAが含まれているか否かを調べる必要があるものであれば特に限定されるものではない。本発明において用いられるプローブ及びプライマーは、特に、食物アレルギーの原因となる動物や植物に由来するDNAを特異的に増幅可能であることから、当該被験試料は、ヒトを含む各種の動物が使用等する、アレルギー物質の有無が問題となるものであることが好ましく、特に食品が好ましい。当該食品としては、生若しくは加熱した食品原料、添加物、加工食品、調味料、飲料等が挙げられる。食品原料としては、牛肉、豚肉、鶏肉等の畜肉;さけ、さば、かれい、いわし、たこ、えび、いか、かに、いくら、あわび等の魚介類;米、小麦、そば等の穀類;じゃがいも等のいも類;大豆;落花生、カシューナッツ、くるみ、ごま等の種実類;にんじん、ほうれんそう、きゅうり、たまねぎ等の野菜類;オレンジ、キウイフルーツ、バナナ、もも、りんご等の果実類;まつたけ、マッシュルーム等のきのこ類;青のり等の海藻類;緑茶、コーヒー、ココア等の嗜好性飲料の原料;等が挙げられる。本発明はPCR法を用いるため、微量のDNAが存在すれば検出可能であり、主原料の一部に混入した動物性又は植物性の原料等の検出にも使用可能である。
被験試料からのDNA抽出は、一般的な既知のDNA抽出法や市販の各種DNA抽出キット[例えば、Nucleon PhytoPure,plant and fungal DNA extraction kits(Amersham Biosciences Corp.,USA)、GM quicker 4(Nippon Gene Co.Ltd.,Japan)、DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen GmbH,Hilden,Germany)等]を用いて実施することができる。これらのDNA抽出法により、ゲノムDNA及び細胞小器官由来DNA(mtDNAや葉緑体DNA)を被験試料から抽出できる。中でも、被験試料が食品の場合には、非特許文献1に記載の方法又はこれに準じて行うことが好ましい。
動物由来DNAを検出する場合には、被験試料から抽出されたDNAと、動物検出用F1プライマー、動物検出用F2プライマー、動物検出用R1プライマー、及び動物検出用プローブを含有させた反応液を調製し、当該反応液をリアルタイムPCR装置に設置して常法によりリアルタイムPCRを行う。動物検出用F1プライマーと動物検出用F2プライマーは、リアルタイムPCRの反応液中に等モル量となるように添加する。同様に、植物由来DNAを検出する場合には、被験試料から抽出されたDNAと、植物検出用F1プライマー、植物検出用R1プライマー、及び植物検出用プローブを含有させた反応液を調製し、当該反応液をリアルタイムPCR装置に設置して常法によりリアルタイムPCRを行う。
本発明に係るDNAの検出方法において、動物由来DNAの検出に用いられる動物検出用F1プライマー、動物検出用F2プライマー、動物検出用R1プライマー、及び動物検出用プローブをまとめてキット化することが好ましい。同様に、植物由来DNAの検出に用いられる植物検出用F1プライマー、植物検出用R1プライマー、及び植物検出用プローブをまとめてキット化することが好ましい。これらのキットにより、各方法をより簡便に実施することができる。さらに、これらのキットは、リアルタイムPCRを行うためのTaqDNAポリメラーゼ、dNTP、反応バッファー等を含むことが好ましい。
以降の実験において、被験試料からの動物由来DNAの抽出には、市販の抽出キット「GM quicker 4」(Nippon Gene Co.Ltd.,Japan)を使用した。また、植物由来DNAの抽出には、市販の抽出キット「DNeasy Plant Mini Kit」(Qiagen GmbH,Hilden,Germany)を使用した。抽出方法は、いずれもプロトコルに従った。
以降の実験において、動物由来DNAを検出するためのリアルタイムPCRには、表1に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド(動物検出用F1プライマー、動物検出用F2プライマー、及び動物検出用R1プライマー)を用いた。植物由来DNAを検出するためのリアルタイムPCRには、表1に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド(植物検出用F1プライマー、及び植物検出用R1プライマー)を用いた。
以降の実験において、リアルタイムPCRは以下の方法で行った。
PCR反応組成液(動植物共通)は、1μLのDNA(20ng/μL)、12.5μLの「TaqMan Universal PCR Master Mix」(Applied Biosystems Corp.,USA)、0.25μLの各プライマー(50μM)(ただし、動物由来DNAの検出の場合には、0.125μLの動物検出用F1プライマー、0.125μLの動物検出用F2プライマー、0.25μLの動物検出用R1プライマー(いずれも50μM))、及び0.5μLのプローブ(10μM)を加え、さらに反応液の液量が25μLとなるように超純水を添加した。また、抽出したDNAの濃度が20ng/μLに満たない場合は、抽出DNA溶液原液1μLを使用した。
食品原料となる様々な動植物について、表1に記載のプライマーによって増幅される遺伝子領域にプローブを設計した。動物検出用プローブはmtDNAの16S rRNA遺伝子の塩基配列を、植物検出用プローブは葉緑体DNAのtrnL-trnF遺伝子間領域の塩基配列を比較検討して、設計した。設計したプローブを用いてリアルタイムPCRで各動植物由来のDNAが検出できるかを調べた。
表7及び表8に記載の加工食品について、DNAを抽出し、実施例1の動物検出用プローブを用いた動物DNA検知系及び植物検出用プローブを用いた植物DNA検知系を用いて、実施例1と同様にリアルタイムPCRを行った。表7に記載の加工食品については動物検出用プローブを用いた動物DNA検知系で、表8に記載の加工食品については植物検出用プローブを用いた植物DNA検知系を用いた。その結果を表7及び8に示す。表中、「〇」は増幅産物が検出されたことを、「×」は増幅産物が検出されなかったことを示す。
Claims (12)
- 被験試料中の動物由来のDNAを検出する方法であって、
被験試料から抽出されたDNAを鋳型とし、
配列番号1で表される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号2で表される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号3で表される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号6で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されているプローブと、
を用いてリアルタイムPCRを行い、測定された蛍光シグナルに基づいて、前記被験試料中の動物由来のDNAを検出することを特徴とする、DNAの検出方法。 - 前記プローブが、MGBプローブである、請求項1に記載のDNAの検出方法。
- 前記被験試料が、食品である、請求項1又は2に記載のDNAの検出方法。
- 配列番号6で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されていることを特徴とする、動物由来DNA検出用プローブ。
- MGBプローブである、請求項4に記載の動物由来DNA検出用プローブ。
- 配列番号1で表される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号2で表される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号3で表される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号6で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されているプローブと、
を備える、動物由来DNA検出用キット。 - 被験試料中の植物由来のDNAを検出する方法であって、
被験試料から抽出されたDNAを鋳型とし、
配列番号4で表される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号5で表される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号7で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されているプローブと、
を用いてリアルタイムPCRを行い、測定された蛍光シグナルに基づいて、前記被験試料中の植物由来のDNAを検出することを特徴とする、DNAの検出方法。 - 前記プローブが、MGBプローブである、請求項7に記載のDNAの検出方法。
- 前記被験試料が、食品である、請求項7又は8に記載のDNAの検出方法。
- 配列番号7で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されていることを特徴とする、植物由来DNA検出用プローブ。
- MGBプローブである、請求項10に記載の植物由来DNA検出用プローブ。
- 配列番号4で表される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号5で表される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号7で表される塩基配列を有しており、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端が消光物質で修飾されているプローブと、
を備える、植物由来DNA検出用キット。
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