CN112626181B - 用于核桃源成分检测的lmcp引物组、检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物分子检测技术领域，具体涉及一种用于核桃源成分检测的LMCP引物组、检测方法及其应用。本发明的引物组具有良好的灵敏度，能快速、方便、高效的检测样品中是否含有核桃源成分，有助于核桃食品的快速准确检测，同时为核桃油的真实性认证提供技术与方法支撑。
Description
技术领域
本发明属于生物分子检测技术领域，具体涉及一种用于核桃源成分检测的LMCP引物组、检测方法及其应用。
背景技术
核桃，又称胡桃、羌桃，是胡桃科植物，与扁桃、腰果、榛子并称为世界著名的“四大干果”。核桃仁含有丰富的营养素，每百克含蛋白质15～20克，脂肪较多，碳水化合物10克，并含有人体必需的钙、磷、铁等多种微量元素和矿物质，以及胡萝卜素、核黄素等多种维生素。随着我国人民生活水平的不断提高，核桃食品的需求也在不断增加，但核桃一旦经过深加工，尤其是核桃油，就很难测定核桃类食品的真实性。食品质量安全问题从生产到加工再到运输再到贩卖，每一步处理不当都有可能产生安全隐患，目前常见的质量安全问题是掺杂掺假，将价格便宜的核桃油、花生油冒充核桃油或掺入到核桃油中，损害消费者利益。
发明内容
本发明提供一种用于核桃源成分检测的LMCP引物组，该LMCP引物组(梯度熔解曲线核酸等温扩增，Isothermal Amplification of Nucleic Acids with Ladder-shapeMelting Curve，缩写为LMCP；梯度熔解曲线核酸等温扩增的扩增原理详见CN202011105405.3或PCT/CN2020/133584)可用于样品中是否含有核桃源成分的检测。
本发明的第二目的在于提供一种用于核桃源成分检测的试剂。
本发明的第三目的在于提供一种用于核桃源成分检测的反应体系。
本发明的第四目的在于提供一种用于核桃源成分检测的试剂盒。
本发明的第五目的在于提供一种用于核桃源成分检测的方法。
本发明的目的还在于提供了所述引物组、试剂、反应体系和试剂盒的应用。
本发明的用于核桃源成分检测的LMCP引物组采用如下技术方案：用于核桃源成分检测的LMCP引物组，所述引物组的核苷酸序列为：
P：5`-GTTTCCGGGGCGTTTTTTAAACAAGGAGTAACCACGGG-3`
D：5`-CGGAAACGGTGTGCTTTTGGTAAAGATGTCACCAACAACG-3`
本发明的用于核桃源成分检测的试剂采用如下技术方案：用于核桃源成分检测的试剂，所述试剂包括如上所述的引物组。
本发明的用于核桃源成分检测的反应体系采用如下技术方案：用于核桃源成分检测的反应体系，所述反应体系包括如上所述的引物组或如上所述的试剂。
作为进一步优选的技术方案，所述反应体系还包括耐热DNA聚合酶(大片段)、BstDNA Polymerase Buffer、核酸模板、甜菜碱、DMSO、dNTP、MgSO4、荧光染料或Nuclease-freewater中的至少一种或任意几种的组合。其中，耐热DNA聚合酶(大片段)包括但不限于BstDNA Polymerase或Bsu DNA Polymerase或Bsm DNA Polymerase或DNA polymerase或Pfu DNA Plolymerase(large fragement)中的任意一种。
作为进一步优选的技术方案，所述荧光染料为EvaGreen、SBYR GreenI或本领域其他常用荧光染料；所述耐热DNA聚合酶(大片段)为Bst DNA Polymerase(大片段)；所述反应体系为10μL反应体系，包括8U/μL Bst DNA Polymerase(大片段)0.4μL、10X Bst DNAPolymerase Buffer 1.0μL、核酸模板1.0μL、甜菜碱终浓度≥1.0M、DMSO体积浓度4-6％、dNTP 1.0-1.5mM、MgSO4 4-6mM和EvaGreen 0.2-1.2×。
本发明的用于核桃源成分检测的试剂盒采用如下技术方案：用于核桃源成分检测的试剂盒，包括如上所述的引物组、如上所述的试剂或如上述任意一项所述的反应体系。
本发明的用于核桃源成分检测的方法采用如下技术方案：用于核桃源成分检测的方法，采用如上所述的引物组、如上所述的试剂、如上述任意一项所述的反应体系或如上所述的试剂盒来检测样品中是否含有核桃源成分。
作为进一步优选的技术方案，使包括样品核酸模板和所述LMCP引物组的反应体系在49-52℃条件下等温扩增30-60min，根据扩增结果即可判断样品中是否含有核桃源成分。例如，对核酸扩增反应液进行电泳凝胶检测，若电泳结果中出现特异梯度条带则表明样品中含有核桃源成分；反之，则不含核桃源成分。
作为进一步优选的技术方案，所述等温扩增在实时荧光定量PCR系统中进行，若扩增结果图中出现指数曲线，则所述样品中含有核桃源成分(样品核酸模板中含有核桃rRNA基因片段)；反之，则样品中不含核桃源成分。所述等温扩增的温度为50℃，扩增时间为60min。
如上所述的引物组、如上所述的试剂、如上述任意一项所述的反应体系或如上所述的试剂盒在检测样品中是否含有核桃源成分中的应用；所述应用包括但不限于检测应当含有核桃源成分的制品中是否确实含有核桃源成分或检测未明确标明含有核桃源成分的产品中是否含有核桃源成分(可用于第三方检测样品中是否有掺假的情况等，为产品质量监管提供技术支撑)。其中，“应当含有核桃源成分的制品”包括但不限于核桃油(或含有核桃油的调和油)、核桃露(饮料)、核桃粉、含有核桃成分的糕点、代餐粉、核桃多肽粉、核桃分心木等，通过对上述样品中是否含有核桃源成分的检测，可辅助判断产品中是否完全或部分采用非核桃源成分替代核桃源成分；“未明确标明含有核桃源成分的产品”包括但不限于奶制品(用于检测奶制品中是否采用核桃源成分掺杂等)等，通过采用本发明的引物组对“未明确标明含有核桃源成分的产品”进行检测，可有效辨别“未明确标明含有核桃源成分的产品”中是否掺杂有核桃源成分。
本发明的有益效果是：本发明的引物组可用于特异性检测样品中是否含有核桃源成分，在等温的条件下即可实现。
本发明的LMCP引物组对核桃源成分检测的灵敏度可达10pg，检测的灵敏度高。
本发明的引物组、试剂、反应体系、试剂盒和检测方法可用于产品质量的监管，为产品质量监管提供有效保障。例如，可用于鉴别食品中核桃成分的真实性认证。进一步的，可用于检测食用油中是否含有核桃源成分等。
本发明的检测方法在1小时内即可实现样品中是否含有核桃源成分的检测，检测速度快。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：核酸靶序列的Tm值曲线图。
图2：LMCP扩增温度优化的扩增结果图(Graph type:Line)；
图3：LMCP扩增温度优化的扩增结果图(Graph type:Log)；
图4：LMCP扩增温度优化扩增产物的熔解曲线；
图5：LMCP扩增灵敏度测定的扩增结果图(Graph type:Line)；
图6：LMCP扩增灵敏度测定的扩增结果图(Graph type:Log)；
图7：LMCP扩增灵敏度测定扩增产物的熔解曲线图；
图8：LMCP特异性测定的扩增结果图(Graph type:Line)；
图9：LMCP特异性测定的扩增结果图(Graph type:Log)；
图10：LMCP特异性测定的扩增产物熔解曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
(1)引物设计
以核桃rRNA(GenBank ID:HE574824)为靶标，用Primer3Plus软件设计得到引物P和引物D，如表1所示。引物P和引物D所对应的靶标的长度为64bp，靶标的Tm值曲线如图1(采用oligo引物设计软件获取，该Tm值曲线的横坐标为碱基，纵坐标为熔解温度)所示。
表1.引物序列表
| 引物名称 | 序列(5’-3’) |
| P-SEQIDNo.1 | GTTTCCGGGGCGTTTTTTAAACAAGGAGTAACCACGGG |
| D-SEQIDNo.2 | CGGAAACGGTGTGCTTTTGGTAAAGATGTCACCAACAACG |
该用于植物源成分检测的LMCP引物组的扩增原理与专利文献CN202011105405.3中记载的靶标核酸的Tm值曲线呈半人字梯型时的扩增原理(包括指数扩增的初始结构的产生和指数扩增2个阶段，详见专利文献CN202011105405.3说明书附图图2、图4)相同。
(2)反应体系(反应总体积为10μl)
反应总体积为10μl，各成分及配比如表2所示。
表2.梯型Tm值曲线核酸等温扩增反应体系
| 成分 | 反应体系(10μl) |
| Bst DNA Polymerase Buffer(10X) | 1.0μl |
| DNA模板 | 1.0μl |
| 引物P | 0.8μM左右 |
| 引物D | 0.8μM左右 |
| 甜菜碱(betaine) | 1.0M以上 |
| DMSO | 5％左右(体积浓度) |
| dNTP | 1.2mM左右 |
| MgSO4 | 4-6mM |
| EvaGreen | 1×左右 |
| Bst DNA Polymerase(8U/μl) | 0.4μl |
| Nuclease-free water | to 10μl |
(3)温度优化
采用表2的反应体系，以核桃仁中提取的DNA为阳性对照，模板加入量为1ng，以H2O为阴性对照，每个反应设置两个重复，StepOnePlus实时荧光定量PCR系统设置温度梯度49℃、50℃、51℃、52℃，在四个不同温度下等温扩增60分钟，并测定熔解曲线。从熔解曲线判断，四个温度下均不存在引物二聚体引起的非特异性扩增，但50℃相对其他三个温度扩增效率最高，36分钟左右进入指数扩增阶段(扩增结果如图2、图3和图4所示)，因此选50℃进行灵敏度测定。
(4)灵敏度测定
将核桃基因组DNA分别稀释为1ng、100pg、10pg、和1pg测定所建方法的灵敏度，采用表2的反应体系，以H2O为阴性对照，在StepOnePlus实时荧光定量PCR系统中50℃加热60分钟，并测定熔解曲线。结果如图5、图6和图7所示，所建方法的灵敏度为10pg，因此所建的核桃源性成分的LMCP检测方法具有较高的灵敏度。
(5)特异性测定
采用花生、棉籽、葵花、菜籽、大豆、芝麻、核桃的基因组DNA测定所建方法的特异性，基因组DNA的加入量均为1ng，采用表2的反应体系，以H2O为阴性对照，每个反应设置两个重复，在StepOnePlus实时荧光定量PCR系统中50℃加热60分钟，并测定熔解曲线。结果如图8、图9和图10所示，只有加入核桃基因组DNA的反应为阳性，其他反应均为阴性，因此，所建的核桃源性成分的LMCP检测方法具有较高的特异性。
最后应说明的是：以上实施例仅用于说明而非限制本发明，本领域的技术人员应当理解：在不脱离本发明的精神和范围内的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的权利要求保护范围内。
序列表
<110> 许昌学院
<120> 用于核桃源成分检测的LMCP引物组、检测方法及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggaaacggt gtgcttttgg taaagatgtc accaacaacg 40
Claims (4)
1.用于核桃源成分检测的方法，其特征在于，采用包含引物组的反应体系进行核酸等温扩增来检测样品中是否含有核桃源成分；
所述反应体系在49-52℃条件下等温扩增30-60min，根据扩增结果即可判断样品中是否含有核桃源成分；
所述等温扩增在实时荧光定量PCR系统中进行，若扩增结果图中出现指数曲线，则所述样品中含有核桃源成分；
所述引物组的核苷酸序列为：
P：5`-GTTTCCGGGGCGTTTTTTAAACAAGGAGTAACCACGGG-3`
D：5`-CGGAAACGGTGTGCTTTTGGTAAAGATGTCACCAACAACG-3` 。
2.根据权利要求1所述的用于核桃源成分检测的方法，其特征在于，所述反应体系还包括耐热DNA聚合酶大片段、Bst DNA Polymerase Buffer、核酸模板、甜菜碱、DMSO、dNTP、MgSO4、荧光染料或Nuclease-free water中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的用于核桃源成分检测的方法，其特征在于，所述荧光染料为EvaGreen或SBYR GreenI；所述耐热DNA聚合酶大片段为Bst DNA Polymerase大片段。
4.根据权利要求1所述的用于核桃源成分检测的方法，其特征在于，所述等温扩增的温度为50℃，扩增时间为60min。
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2020
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