CN114621957B - 多种真菌毒素智能化识别与传感体系构建 - Google Patents

多种真菌毒素智能化识别与传感体系构建 Download PDF

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Abstract

本发明公开了多种真菌毒素智能化识别与传感体系构建，该真菌毒素智能化识别与传感系统基于“AND‑INHIBIT”和“INHIBIT‑OR”分子逻辑门级联分子逻辑门实现多种真菌毒素的智能检测，能够准确的智能化检测待测样品中是否含有OTA、AFB1和ZEN，且特异性好，对于其他真菌毒素等类似物均不会产生假阳性。而且，本发明中的智能化真菌毒素检测方法灵敏度高，检出限可达100pM，相比于常规的检测技术更加灵敏智能。

Description

多种真菌毒素智能化识别与传感体系构建
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及多种真菌毒素智能化识别与传感体系构建。
背景技术
真菌毒素是由镰刀菌属、青霉属、曲霉属等真菌在适宜温、湿度条件下产生的次级代谢产物。目前常见的真菌毒素主要有黄曲霉毒素B1(aflatoxins B1,AFB1)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)、玉米赤霉烯酮毒素(zearalenone,ZEN)、T-2毒素(T-2toxin,T-2)和伏马毒素(fumonisin B1,FB)等。大多数真菌毒素可通过抑制动物体蛋白质和相关酶的合成，破坏细胞结构，损害动物体肝脏、肾脏、神经、造血等组织器官，具有致癌、致畸、致突变、生殖紊乱以及免疫抑制作用；且真菌毒素分布广泛、分子量小、结构以及化学性质一般均匀稳定，即使高温烹饪也无法使其分解。
农产品在被真菌毒素污染后，往往同时存在多种真菌毒素。而这些真菌毒素一旦通过食物链进入人体体内，将严重威胁人类健康。因此，开发出一种智能化检测农产品中的真菌毒素含量的方法显得尤为重要。
相关技术中，用于检测真菌毒素的方法主要包括：高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)和液相色谱串联质谱法(LC-MS)等。但这些方法均存在较为难以克服的缺陷性，如需要大型仪器检测，从而检测成本高昂，而且这些检测方法受到仪器本身的限制，相对耗时，无法满足其智能化高效检测的要求。因此，迫切需要开发分子逻辑门智能化检测真菌毒素新方法，以获得智能化的检测结果，从而切实有效的控制真菌毒素的危害。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种基于分子逻辑门的真菌毒素智能化识别与传感系统及其应用。该真菌毒素智能化识别与传感系统基于“AND-INHIBIT”和“INHIBIT-OR”分子逻辑门级联分子逻辑门实现多种真菌毒素的智能检测，检测效果稳定，检测精度高，检出限低，检测耗时短，具有极好的实际应用价值。
本发明的第一个方面，提供一种真菌毒素检测试剂。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述试剂中含有发夹探针组。
在本发明的一些优选实施方式中，所述发夹探针组包括发夹探针A、发夹探针B、发夹探针C、发夹探针F、发夹探针G和发夹探针H中的至少一种。
在本发明的一些优选实施方式中，所述发夹探针组包括发夹探针A、发夹探针B、发夹探针C、发夹探针F、发夹探针G和发夹探针H中的至少3种。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述发夹探针组为发夹探针A、发夹探针B和发夹探针C的组合，或发夹探针F、发夹探针G和发夹探针H的组合。
对于发夹探针A、发夹探针B和发夹探针C的组合，在本发明的一些优选实施方式中，所述发夹探针A中含有OTA核酸适体序列和互补序列1；所述发夹探针B中含有AFB1核酸适体序列和互补序列2；所述发夹探针C中含有ZEN核酸适体序列和互补序列3；所述互补序列1、所述互补序列2和所述互补序列3中的碱基相互之间均互补配对，且所述互补序列1、所述互补序列2与所述互补序列3之间的碱基互补配对数均大于所述互补序列1和所述互补序列2之间的碱基互补配对数。
对于发夹探针F、发夹探针G和发夹探针H的组合，在本发明的一些优选实施方式中，所述发夹探针F中含有OTA核酸适体序列和互补序列4；所述发夹探针G中含有AFB1核酸适体序列和互补序列5；所述发夹探针H中含有ZEN核酸适体序列和互补序列4；所述互补序列4和所述互补序列5中的碱基互补配对。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述发夹探针组中的各发夹探针的核苷酸序列分别为：
发夹探针A：
其中，加粗且下划线部分为OTA的核酸适体的序列。
发夹探针B：
其中，加粗且下划线部分为AFB1的核酸适体的序列。
发夹探针C：
其中，加粗且下划线部分为ZEN的核酸适体的序列。
发夹探针F：
其中，加粗且下划线部分为OTA的核酸适体的序列。
发夹探针G：
其中，加粗且下划线部分为AFB1的核酸适体的序列。
发夹探针H：
其中，加粗且下划线部分为ZEN的核酸适体的序列。
其中，所述发夹探针A与所述发夹探针F中的OTA核酸适体序列可以选择相同或者不同的序列。所述发夹探针B与所述发夹探针G中的AFB1核酸适体序列可以选择相同或者不同的序列。所述发夹探针C与所述发夹探针H中的ZEN核酸适体序列可以选择相同或者不同的序列。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述试剂中还含有发夹探针D和发夹探针E。
所述发夹探针D和发夹探针E需要与发夹探针A、发夹探针B和发夹探针C的组合，或发夹探针F、发夹探针G和发夹探针H的组合配合使用。
在本发明的一些实施方式中，所述发夹探针D和发夹探针E的核苷酸序列为：
发夹探针D：5'-GGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCCCATGTATCGAGCTCCCTTTACGCCTGTGT-3'(SEQ ID NO.4)；
发夹探针E：5'-TGTGTGTGTGTAAGGGAGCTCGATACATGGGCTCCCTTTACGCCCCATGTATCGA-3'(SEQ ID NO.5)。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述真菌毒素包括黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮毒素。
本发明的第二个方面，提供一种真菌毒素检测试剂盒。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒中包括本发明第一个方面所述的真菌毒素检测试剂、酶链和底物链。
在本发明的一些优选实施方式中，所述酶链的核苷酸序列为：酶链DNA1：5-ACACAGGCGTAGACTCCGAGCCGGACGAAGTTACCCACACCCC-3(SEQ ID NO.9)。
在本发明的一些优选实施方式中，所述底物链的核苷酸序列为：底物链DNA2：5-TCGATACATGGAACTrAGGTCACACACACACA-3(SEQ ID NO.10)。
在本发明的一些优选实施方式中，所述底物链中的rA代表核酸A修饰。
在本发明的一些优选实施方式中，所述底物链上修饰有荧光基团和猝灭基团，所述荧光基团和猝灭基团分别修饰于酶切位点的对立两侧。
在本发明的一些优选实施方式中，所述荧光基团修饰于所述底物链中的第19位碱基T(5’-3’)，所述猝灭基团修饰于所述底物链中的第9位碱基T(5’-3’)。
在本发明的实施例中，所述荧光基团为BHQ2，所述猝灭基团为TAMRA。
当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，将荧光基团TAMRA和猝灭基团BHQ2合理替换为其他荧光基团和猝灭基团，以实现荧光标记的效果。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述真菌毒素包括黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮毒素。
本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面所述的真菌毒素检测试剂或本发明第二个方面所述的真菌毒素检测试剂盒在食品安全检测中的应用。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述真菌毒素包括黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮毒素。
本发明的第四个方面，提供一种真菌毒素的检测方法，包括如下步骤：
(1)将本发明第一个方面中的发夹探针加热至92～95℃，然后冷却至室温，使其形成发夹结构；
(2)将检测样品、形成发夹结构的发夹探针、本发明第二个方面中的酶链DNA1和本发明第二个方面中的底物链DNA2在25±2℃条件下孵育90～95min，检测荧光信号。
在本发明的一些优选实施方式中，所述发夹探针组包括发夹探针A、发夹探针B、发夹探针C、发夹探针D、发夹探针E、发夹探针F、发夹探针G和发夹探针H中的至少5种。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述发夹探针组为发夹探针A、发夹探针B、发夹探针C、发夹探针D和发夹探针E的组合，或发夹探针F、发夹探针G、发夹探针H、发夹探针D和发夹探针E的组合。
根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述真菌毒素包括黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮毒素。
根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述检测样品为食品。
根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述检测方法执行“AND-INH IBIT”和“INHIBIT-OR”分子逻辑门。
在本发明的一些优选实施方式中，所述“AND-INHIBIT”分子逻辑门的检测体系为：
在本发明的一些更优选实施方式中，所述“AND-INHIBIT”分子逻辑门的检测体系为：
组分 终含量
检测样品 10μL
发夹探针A 250nM
发夹探针B 250nM
发夹探针C 250nM
发夹探针D 250nM
发夹探针E 500nM
酶链DNA1 250nM
底物链DNA2 250nM
氯化镁 10mM
ddH2O 补至100μL
所述“AND-INHIBIT”分子逻辑门的检测原理为：
当检测样品中含有赭曲霉毒素A(OTA)时，发夹探针A中的核酸适体序列会与OTA结合，释放出引发序列1(即图1中的序列sb1)。而检测样品中含有黄曲霉毒素B1(AFB1)时，发夹探针B中的核酸适体序列会与其结合，释放出引发序列2(即图1中的序列s*a2)。引发序列1中的s序列与引发序列2中的s*序列杂交形成OTA-A/AFB1-B复合物，执行“AND”逻辑功能。
而当检测样品中含有玉米赤霉烯酮毒素(ZEN)时，发夹探针C中的核酸适体序列会与其结合，释放出引发序列3(即图1中的序列b*a*3)。由于引发序列3中的b*序列和a*是引发序列1中的b序列和引发序列2中的a序列的互补片段，且互补碱基数量多于引发序列1中的s序列与引发序列2中的s*序列之间的互补碱基数量，因此，当体系中存在引发序列3时，引发序列1和引发序列2会优先结合引发序列3，且已经形成的OTA-A/AFB1-B复合物同样也会重新分离以形成OTA-A/ZEN-C和AFB1-B/ZEN-C复合物。产生“INHIBIT”逻辑功能。
而当检测样品中不含玉米赤霉烯酮毒素(ZEN)时，由于不会产生引发序列3，因此，体系中仅存在OTA-A/AFB1-B复合物。而OTA-A/AFB1-B复合物生成的序列ab会进一步启动发夹探针D、E介导的催发发夹组装，产生大量的双链DE复合物。DE复合物与酶链DNA1、底物链DNA2协同杂交形成超分子复合物[A/B/DNA1/DNA2]n。而当体系中存在镁离子时，超分子复合物[A/B/DNA1/DNA2]n会水解底物链DNA2，导致猝灭基团和荧光基团分离，产生荧光信号。
因此，对于“AND-INHIBIT”逻辑门，其对于毒素的智能化检测标准为：
当检测到强荧光时，说明检测样品中的存在(a)中的情况：
(a)检测样品中同时含有OTA和AFB1，且不含ZEN。
当未检测到强荧光时，说明检测样品中的存在(d)～(h)中任一种情况：
(b)检测样品仅含有OTA；
(c)检测样品仅含有AFB1；
(d)检测样品仅含有ZEN；
(e)检测样品同时含有AFB1和ZEN，不含OTA；
(f)检测样品中同时含有OTA和ZEN，不含AFB1；
(g)检测样品中同时含有OTA、AFB1和ZEN；
(h)检测样品不含真菌毒素(OTA、AFB1和ZEN)。
在本发明的一些优选实施方式中，所述“INHIBIT-OR”分子逻辑门的检测体系为：
在本发明的一些更优选实施方式中，所述“INHIBIT-OR”分子逻辑门的检测体系为：
组分 终含量
检测样品 10μL
发夹探针F 250nM
发夹探针G 250nM
发夹探针H 250nM
发夹探针D 250nM
发夹探针E 500nM
酶链DNA1 250nM
底物链DNA2 250nM
镁离子(氯化镁) 10mM
ddH2O 补至100μL
所述“INHIBIT-OR”分子逻辑门的检测原理为：
当检测样品中含有OTA时，发夹探针F的核酸适体序列会与OTA结合，释放出引发序列1(即图2中的序列ab1)。而检测样品中含有AFB1时，发夹探针G中的核酸适体序列会与其结合，释放出引发序列2(即图2中的序列a*b*2)。当体系中同时存在引发序列1和引发序列2时，两者会相互结合，从而无法引发后续的反应，执行“INHIBIT”逻辑功能。
而当检测样品中含有ZEN时，发夹探针H中的核酸适体序列会与其结合，释放出引发序列3(即图2中的序列ab3)。而在不含引发序列2的情况下，引发序列3或引发序列1中的序列ab均可以单独或共同进一步启动发夹探针D、E介导的催发发夹组装，产生大量的双链DE复合物。DE复合物与酶链DNA1、底物链DNA2协同杂交形成超分子复合物[F/H/DNA1/DNA2]n。而当体系中存在镁离子时，超分子复合物[F/H/DNA1/DNA2]n会水解底物链DNA2，导致猝灭基团和荧光基团分离，产生荧光信号。
因此，对于“INHIBIT-OR”逻辑门，其对于毒素的智能化检测标准为：
当检测到强荧光时，说明检测样品中的存在(a)～(d)中任一种情况：
(a)检测样品仅含有OTA；
(b)检测样品仅含有ZEN；
(c)检测样品同时含有OTA和ZEN，且不含AFB1；
(d)检测样品中同时含有OTA、AFB1和ZEN。
当未检测到强荧光时，说明检测样品中的存在(e)～(h)中任一种情况：
(e)检测样品中同时含有OTA和AFB1；
(f)检测样品中同时含有AFB1和ZEN；
(g)检测样品中仅含有AFB1；
(h)检测样品不含真菌毒素(OTA、AFB1和ZEN)。
结合“AND-INHIBIT”和“INHIBIT-OR”两种逻辑门的结果，可以得到：
当“AND-INHIBIT”检测到强荧光，而“INHIBIT-OR”未检测到强荧光时，说明检测样品中的存在(a)中的情况：
(a)检测样品中同时含有OTA和AFB1，且不含ZEN。
当“AND-INHIBIT”未检测到强荧光，而“INHIBIT-OR”检测到强荧光时，说明检测样品中的存在(b)～(e)中任一种情况：
(b)检测样品仅含有OTA；
(c)检测样品仅含有ZEN；
(d)检测样品同时含有OTA和ZEN，且不含AFB1；
(e)检测样品中同时含有OTA、AFB1和ZEN。
当“AND-INHIBIT”未检测到强荧光，而“INHIBIT-OR”也未检测到强荧光时，说明检测样品中的存在(f)～(h)中任一种情况：
(f)检测样品中仅含有AFB1；
(g)检测样品中同时含有AFB1和ZEN，且不含OTA；
(h)检测样品不含真菌毒素(OTA、AFB1和ZEN)。
当“AND-INHIBIT”检测到强荧光，而“INHIBIT-OR”也检测到强荧光时，则需要重新进行检测。
在本发明的一些优选实施方式中，所述真菌毒素的检测方法的具体步骤为：
(1)将发夹探针组(发夹探针A-E或发夹探针D-H)在Tris-HCl缓冲液(pH 8.0，120mM NaCl,10mM MgCl2,5mM KCl,20mM CaCl2)中加热至95℃，持续5min，然后冷却至室温，即可得到具有发夹结构的发夹探针组。
(2)将检测样品、形成发夹结构的发夹探针组、酶链和底物链在25±2℃条件下孵育90～95min，检测荧光信号。
本发明的有益效果是：
1.本发明提供了一种真菌毒素智能化检测试剂及检测试剂盒，其可以检测的真菌毒素包括OTA、AFB1和ZEN。该检测试剂盒检测试剂盒基于催化发夹组装驱动的DNAzyme和逻辑门，能够准确的智能化检测待测样品中是否含有OTA、AFB1和ZEN，且特异性好，对于其他真菌毒素等类似物均不会产生假阳性。
2.本发明中的智能化真菌毒素检测方法灵敏度高，检出限可达100pM，相比于常规的检测技术更加灵敏智能。
附图说明
图1为本发明实施例中的“AND-INHIBIT”逻辑门原理示意图。
图2为本发明实施例中的“INHIBIT-OR”逻辑门原理示意图。
图3为本发明实施例中的“AND-INHIBIT”逻辑门对于10nM的OTA、AFB1和ZEN的实际检测结果。
图4为对应“AND-INHIBIT”逻辑门检测结果的凝胶电泳验证结果图。
图5为本发明实施例中的“INHIBIT-OR”逻辑门对于10nM的OTA、AFB1和ZEN的实际检测结果。
图6为对应“INHIBIT-OR”逻辑门检测结果的凝胶电泳验证结果图。
图7为含有不同浓度(0、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM和100nM)的AFB1的葡萄酒样品检测结果。
图8为含有不同浓度(0，2×103，4×103，6×103，8×103和1×104pM)的AFB1样品检测的荧光曲线。
图9为含有不同浓度(0，2×103，4×103，6×103，8×103和1×104pM)的AFB1样品检测统计结果。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
一种真菌毒素智能化识别与传感系统
在本实施例中的真菌毒素智能化识别与传感系统，其主要基于两套催化发夹组装驱动的DNAzyme构建了“AND-INHIBIT”和“INHIBIT-OR”分子逻辑门，从而实现多种真菌毒素的快速、高灵敏、智能检测。
本实施例中的真菌毒素智能化识别与传感系统主要包括：两套发夹探针组(第一套发夹探针组由5个发夹探针A-E组成，第二套发夹探针组也由5个发夹探针D-H组成)、酶链组(DNA1)和底物链组(DNA2)。
其中，发夹探针组(发夹探针A、发夹探针B、发夹探针C、发夹探针D、发夹探针E、发夹探针F、发夹探针G和发夹探针H)中的的核苷酸序列如下所示：
发夹探针A：
其中，加粗且下划线部分为OTA的核酸适体的序列。
发夹探针B：
其中，加粗且下划线部分为AFB1的核酸适体的序列。
发夹探针C：
其中，加粗且下划线部分为ZEN的核酸适体的序列。
发夹探针D：5'-GGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCCCATGTATCGAGCTCCCTTTACGCCTGTGT-3'(SEQ ID NO.4)。
发夹探针E：5'-TGTGTGTGTGTAAGGGAGCTCGATACATGGGCTCCCTTTACGCCCCATGTATCGA-3'(SEQ ID NO.5)。
发夹探针F：
其中，加粗且下划线部分为OTA的核酸适体的序列。
发夹探针G：
其中，加粗且下划线部分为AFB1的核酸适体的序列。
发夹探针H：
其中，加粗且下划线部分为ZEN的核酸适体的序列。
酶链组由1条酶链(DNA1)组成，其核苷酸序列为：
酶链DNA1：5'-ACACAGGCGTAGACTCCGAGCCGGACGAAGTTACCCACACCCC-3'(SEQ IDNO.9)。
底物链组由1条底物链(DNA2)组成，其核苷酸序列为：
底物链DNA2：5'-TCGATACATGGAACT(BHQ2)rAGGT(TAMRA)CACACACACACA-3'(SEQ IDNO.10)。
其中，底物链中，T(BHQ2)为T碱基上修饰猝灭基团BHQ2；rA代表核酸A修饰，为酶切位点；T(TAMRA)为T碱基上修饰荧光基团TAMRA。
真菌毒素智能化识别与传感系统
上述实施例中的真菌毒素智能化识别与传感系统可基于“AND-INHIBIT”和“INHIBIT-OR”两种逻辑门单独或组合对样品进行检测，具体检测步骤如下：
(1)试验材料的准备与前处理：
将两套发夹探针组(发夹探针A-E和发夹探针D-H)在Tris-HCl缓冲液(pH 8.0，120mM NaCl,10mM MgCl2,5mM KCl,20mM CaCl2)中加热至95℃，持续5min，然后冷却至室温，即可得到具有发夹结构的发夹探针组。
(2)真菌毒素的智能化检测：
在本实施例中，真菌毒素的智能检测是基于两种逻辑门(“AND-INHIBIT”和“INHIBIT-OR”)单独或结合的方式实现的。
各逻辑门的具体构建方法如下：
(2.1)使用“AND-INHIBIT”逻辑门对检测样品进行检测，具体检测方法为：
将检测样品、上述发夹探针组(发夹探针A-E)、酶链组、底物链在室温(25±2℃)下孵育90min(反应体系如表1所示)，记录585nm波长下的荧光信号，根据荧光信号实现智能化检测样品中的真菌毒素。
表1
“AND-INHIBIT”逻辑门的原理示意图如图1所示。
当检测样品中含有赭曲霉毒素A(OTA)时，发夹探针A中的核酸适体序列会与OTA结合，释放出引发序列1(即图1中的序列sb1)。而检测样品中含有黄曲霉毒素B1(AFB1)时，发夹探针B中的核酸适体序列会与其结合，释放出引发序列2(即图1中的序列s*a2)。引发序列1中的s序列与引发序列2中的s*序列杂交形成OTA-A/AFB1-B复合物，执行“AND”逻辑功能。
而当检测样品中含有玉米赤霉烯酮毒素(ZEN)时，发夹探针C中的核酸适体序列会与其结合，释放出引发序列3(即图1中的序列b*a*3)。由于引发序列3中的b*序列和a*是引发序列1中的b序列和引发序列2中的a序列的互补片段，且互补碱基数量多于引发序列1中的s序列与引发序列2中的s*序列之间的互补碱基数量，因此，当体系中存在引发序列3时，引发序列1和引发序列2会优先结合引发序列3，且已经形成的OTA-A/AFB1-B复合物同样也会重新分离以形成OTA-A/ZEN-C和AFB1-B/ZEN-C复合物。产生“INHIBIT”逻辑功能。
而当检测样品中不含玉米赤霉烯酮毒素(ZEN)时，由于不会产生引发序列3，因此，体系中仅存在OTA-A/AFB1-B复合物。而OTA-A/AFB1-B复合物生成的序列ab会进一步启动发夹探针D、E介导的催发发夹组装，产生大量的双链DE复合物。DE复合物与酶链DNA1、底物链DNA2协同杂交形成超分子复合物[A/B/DNA1/DNA2]n。而当体系中存在镁离子时，超分子复合物[A/B/DNA1/DNA2]n会水解底物链DNA2，导致猝灭基团和荧光基团分离，产生荧光信号。
因此，对于“AND-INHIBIT”逻辑门，其对于毒素的智能化检测标准为：
当检测到强荧光时，说明检测样品中的存在(a)中的情况：
(a)检测样品中同时含有OTA和AFB1，且不含ZEN。
当未检测到强荧光时，说明检测样品中的存在(b)～(h)中任一种情况：
(b)检测样品仅含有OTA；
(c)检测样品仅含有AFB1；
(d)检测样品仅含有ZEN；
(e)检测样品同时含有AFB1和ZEN，不含OTA；
(f)检测样品中同时含有OTA和ZEN，不含AFB1；
(g)检测样品中同时含有OTA、AFB1和ZEN；
(h)检测样品不含真菌毒素(OTA、AFB1和ZEN)。
(2.2)使用“INHIBIT-OR”逻辑门对检测样品进行检测，具体检测方法为：
将检测样品、上述发夹探针组(发夹探针D～H)、酶链组、底物链组在室温(25±2℃)下孵育90min(反应体系如表2所示)，记录585nm波长下的荧光信号，根据荧光信号实现智能化检测样品中的真菌毒素。
表2
组分 终含量
检测样品 10μL
发夹探针F 250nM
发夹探针G 250nM
发夹探针H 250nM
发夹探针D 250nM
发夹探针E 500nM
酶链DNA1 250nM
底物链DNA2 250nM
镁离子(氯化镁) 10mM
ddH2O 补至100μL
“INHIBIT-OR”逻辑门的原理示意图如图2所示。
当检测样品中含有OTA时，发夹探针F的核酸适体序列会与OTA结合，释放出引发序列1(即图2中的序列ab1)。而检测样品中含有AFB1时，发夹探针G中的核酸适体序列会与其结合，释放出引发序列2(即图2中的序列a*b*2)。当体系中同时存在引发序列1和引发序列2时，两者会相互结合，从而无法引发后续的反应，执行“INHIBIT”逻辑功能。
而当检测样品中含有ZEN时，发夹探针H中的核酸适体序列会与其结合，释放出引发序列3(即图2中的序列ab3)。而在不含引发序列2的情况下，引发序列3或引发序列1中的序列ab均可以单独或共同进一步启动发夹探针D、E介导的催发发夹组装，产生大量的双链DE复合物。DE复合物与酶链DNA1、底物链DNA2协同杂交形成超分子复合物[F/H/DNA1/DNA2]n。而当体系中存在镁离子时，超分子复合物[F/H/DNA1/DNA2]n会水解底物链DNA2，导致猝灭基团和荧光基团分离，产生荧光信号。
因此，对于“INHIBIT-OR”逻辑门，其对于毒素的智能化检测标准为：
当检测到强荧光时，说明检测样品中的存在(a)～(d)中任一种情况：
(a)检测样品仅含有OTA；
(b)检测样品仅含有ZEN；
(c)检测样品同时含有OTA和ZEN，且不含AFB1；
(d)检测样品中同时含有OTA、AFB1和ZEN。
当未检测到强荧光时，说明检测样品中的存在(e)～(h)中任一种情况：
(e)检测样品中同时含有OTA和AFB1；
(f)检测样品中同时含有AFB1和ZEN；
(g)检测样品中仅含有AFB1；
(h)检测样品不含真菌毒素(OTA、AFB1和ZEN)。
结合“AND-INHIBIT”和“INHIBIT-OR”两种逻辑门的结果，可以得到：
当“AND-INHIBIT”检测到强荧光，而“INHIBIT-OR”未检测到强荧光时，说明检测样品中的存在(a)中的情况：
(a)检测样品中同时含有OTA和AFB1，且不含ZEN。
当“AND-INHIBIT”未检测到强荧光，而“INHIBIT-OR”检测到强荧光时，说明检测样品中的存在(b)～(e)中任一种情况：
(b)检测样品仅含有OTA；
(c)检测样品仅含有ZEN；
(d)检测样品同时含有OTA和ZEN，且不含AFB1；
(e)检测样品中同时含有OTA、AFB1和ZEN。
当“AND-INHIBIT”未检测到强荧光，而“INHIBIT-OR”也未检测到强荧光时，说明检测样品中的存在(f)～(h)中任一种情况：
(f)检测样品中仅含有AFB1；
(g)检测样品中同时含有AFB1和ZEN，且不含OTA；
(h)检测样品不含真菌毒素(OTA、AFB1和ZEN)。
当“AND-INHIBIT”检测到强荧光，而“INHIBIT-OR”也检测到强荧光时，则需要重新进行检测。
真菌毒素智能化识别与传感系统的实际检测效果验证
发明人分别添加不同的真菌毒素样品来对上述真菌毒素智能化识别与传感系统进行检测验证。
在本实施例中，真菌毒素样品分别为10nM的OTA、AFB1和ZEN。
根据上述实施例中的真菌毒素智能化识别与传感系统的使用方法，分别将10nM的OTA、AFB1和ZEN作为样品进行检测。
具体检测步骤为：
(1)对样品执行“AND-INHIBIT”逻辑门的检测效果：
按照上述实施例中的“AND-INHIBIT”逻辑门检测体系对10nM的OTA、AFB1和ZEN进行检测，检测波长设置为585nm。
结果如图3和表3所示。
表3为不同样品输入和荧光结果输出结果，其中，0和1均为二进制表示法，1表示有(基于不同的情况，可以表示添加或有荧光)，0表示未无(基于不同的情况，可以表示未添加或无荧光)。A表示OTA，B表示AFB1，C表示ZEN。
表3
从图3和表3中可以发现，以特定检测波长为阈值(585nm)，仅(1,1,0)组能够显示出荧光信号，对应其结果，可以知晓检测样品中可能存在以下情况：检测样品中同时含有OTA和和AFB1，且不含ZEN。对应实际投放情况以及凝胶电泳验证结果(图4)，可以发现上述实施例中的检测方法检测准确。
(2)对样品执行“INHIBIT-OR”逻辑门的检测效果：
按照上述实施例中的“INHIBIT-OR”逻辑门检测体系对10nM的OTA、AFB1和ZEN进行检测，检测波长设置为585nm。
结果如图5和表4所示。
表4为不同样品输入和荧光结果输出结果，其中，0和1均为二进制表示法，1表示有(基于不同的情况，可以表示添加或有荧光)，0表示未无(基于不同的情况，可以表示未添加或无荧光)。A表示OTA，B表示AFB1，C表示ZEN。
表4
从图5和表4中可以发现，以特定检测波长为阈值(585nm)，仅(0,0,1)、(1,0,0)、(1,0,1)和(1,1,1)组能够显示出荧光信号，对应其结果，可以知晓检测样品中可能存在以下几种情况：(a)检测样品仅含有OTA；(b)检测样品仅含有ZEN；(c)检测样品同时含有OTA和ZEN，且不含AFB1；(d)检测样品中同时含有OTA、AFB1和ZEN。对应实际投放情况以及凝胶电泳验证结果(图6)，可以发现上述实施例中的检测方法检测准确。
为了能够更加真实的体现出上述真菌毒素智能化识别与传感系统在实际使用中的有效性，在本实施例中，发明人以市售白葡萄酒(购自中国广州的当地超市中)作为基础材料，先加入等量等浓度(10nM)的OTA，然后将不同浓度(0、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM和100nM)的AFB1加入至葡萄酒样品中，分别使用上述实施例中的真菌毒素智能化识别与传感系统进行检测。
具体检测步骤为：
将发夹探针组(发夹探针A-E)在Tris-HCl缓冲液(pH 8.0，120mM NaCl,10mMMgCl2,5mM KCl,20mM CaCl2)中加热至95℃，持续5min，然后冷却至室温，即可得到具有发夹结构的发夹探针组。将检测样品分别与上述发夹探针组、酶链组、底物链在室温(25±2℃)下孵育90min(反应体系如表1所示)，记录570～700nm波长(Ex＝545nm，Em＝585nm)下的荧光信号。
结果如图7所示。
可以发现，使用上述实施例中的真菌毒素智能化识别与传感系统均能产生强荧光信号，说明本发明实施例中的真菌毒素智能化识别与传感系统对于实际样品中的毒素检测有较高的灵敏度。
为了进一步验证上述真菌毒素智能化识别与传感系统的检测有效性，发明人以不同浓度的AFB1-OTA混合稀释液(稀释液采用上述实施例中的Tris-HCl缓冲液，溶液中的AFB1终浓度为0，2×103，4×103，6×103，8×103和1×104pM，OTA终浓度均为1×104pM)为检测对象使用真菌毒素智能化识别与传感系统进行检测。
具体检测步骤为：
将发夹探针组(发夹探针A-E)在上述实施例中的Tris-HCl缓冲液中加热至95℃，持续5min，然后冷却至室温，即可得到具有发夹结构的发夹探针组。将不同浓度的玉米赤霉烯酮稀释液作为检测样品分别与上述发夹探针组、酶链组、底物链在室温(25±2℃)下孵育90min(反应体系如表1所示)，记录570～700nm波长(Ex＝545nm，Em＝585nm)下的荧光信号。
结果如图8～9所示。
可以发现，上述真菌毒素智能化识别与传感系统对于不同浓度的AFB1-OTA混合稀释液均能显示出阳性反应，且荧光强度与溶液中的AFB1 Lg浓度值关系呈现正相关关系。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省科学院生态环境与土壤研究所
<120> 多种真菌毒素智能化识别与传感体系构建
<130>
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggacagctc cctttacaaa aaaaaaaa 58
<210> 2
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccaca tttttttttt 60
gccacccaca ctgcccaac 79
<210> 3
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcatctatct atggtacatt actatctgta atgtgatatg gtgtgggtgg cgtaaaggga 60
gcatagatg 69
<210> 4
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggggtgtggg tggcgtaaag ggagcccatg tatcgagctc cctttacgcc tgtgt 55
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgtgtgtgtg taagggagct cgatacatgg gctcccttta cgccccatgt atcga 55
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggacagctc cctttacgcc acccacac 58
<210> 7
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccaca gtgtgggtgg 60
cgtaaaggga gc 72
<210> 8
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcatctatct atggtacatt actatctgta atgtgatatg gctcccttta cgccacccac 60
acgatag 67
<210> 9
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
acacaggcgt agactccgag ccggacgaag ttacccacac ccc 43
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tcgatacatg gaactaggtc acacacacac a 31

Claims (4)

1.一种真菌毒素检测试剂盒，其特征在于，所述真菌毒素检测试剂盒中含有真菌毒素检测试剂、酶链和底物链；
所述真菌毒素检测试剂中含有发夹探针组；
所述发夹探针组由发夹探针A、发夹探针B、发夹探针C、发夹探针D、发夹探针E组成；或由发夹探针F、发夹探针G、发夹探针H、发夹探针D、发夹探针E组成；
所述发夹探针A中含有OTA核酸适体序列和互补序列1；
所述发夹探针B中含有AFB1核酸适体序列和互补序列2；
所述发夹探针C中含有ZEN核酸适体序列和互补序列3；
所述互补序列1、所述互补序列2和所述互补序列3中的碱基相互之间均互补配对，且所述互补序列1、所述互补序列2与所述互补序列3之间的碱基互补配对数均大于所述互补序列1和所述互补序列2之间的碱基互补配对数；
所述发夹探针F中含有OTA核酸适体序列和互补序列4；
所述发夹探针G中含有AFB1核酸适体序列和互补序列5；
所述发夹探针H中含有ZEN核酸适体序列和互补序列4；
所述互补序列4和所述互补序列5中的碱基互补配对；
所述发夹探针组中的各发夹探针的核苷酸序列分别为：
发夹探针A：5'-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAGCTCCCTTTACAAAAAAAAAAA-3'；
发夹探针B：5'-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACATTTTTTTTTTGCCACCCACACTGCCCAAC-3'；
发夹探针C：5'-TCATCTATCTATGGTACATTACTATCTGTAATGTGATATGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATAGATG-3'；
发夹探针D：5'-GGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCCCATGTATCGAGCTCCCTTTACGCCTGTGT-3'；
发夹探针E：5'-TGTGTGTGTGTAAGGGAGCTCGATACATGGGCTCCCTTTACGCCCCATGTATCGA-3'；
发夹探针F：5'-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAGCTCCCTTTACGCCACCCACAC-3'；
发夹探针G：5'-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACAGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGC-3'；
发夹探针H：5'-TCATCTATCTATGGTACATTACTATCTGTAATGTGATATGGCTCCCTTTACGCCACCCACACGATAG-3'；
所述酶链的核苷酸序列为：
酶链DNA1：5'- ACACAGGCGTAGACTCCGAGCCGGACGAAGTTACCCACACCCC-3'；
所述底物链的核苷酸序列为：
底物链DNA2：5'-TCGATACATGGAACTrAGGTCACACACACACA-3'；
其中，rA代表核酸A修饰；
所述底物链上修饰有荧光基团和猝灭基团，所述荧光基团和猝灭基团分别修饰于酶切位点的对立两侧。
2.根据权利要求1所述的真菌毒素检测试剂盒，其特征在于，所述真菌毒素包括黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮毒素。
3.权利要求1~2任一项所述的真菌毒素检测试剂盒在食品安全检测中的应用。
4.一种真菌毒素的检测方法，包括如下步骤：
（1）将权利要求1中的发夹探针组加热至92~95℃，然后冷却至室温，使其形成发夹结构；
（2）将检测样品、上述形成发夹结构的发夹探针、权利要求1中的酶链DNA1和底物链DNA2在25±2℃条件下孵育90~95 min，检测荧光信号；
所述检测样品为食品。
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