CN107271668A

CN107271668A - 一种多信号检测真菌毒素的方法及试剂盒

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Publication number: CN107271668A
Application number: CN201710436564.3A
Authority: CN
Inventors: 韩逸陶; 张晓琳; 刘玉春; 汪洋; 赵晨; 张宏海
Original assignee: Academy of State Administration of Grain
Current assignee: Academy of State Administration of Grain
Priority date: 2017-06-12
Filing date: 2017-06-12
Publication date: 2017-10-20
Anticipated expiration: 2037-06-12
Also published as: CN107271668B

Abstract

本发明公开一种多信号检测真菌毒素的方法，包括：1)真菌毒素与核酸适体的结合作用：真菌毒素核酸适体与其互补序列反应后，加入待测样品，得到混合液A；2)酶切辅助信号放大作用：混合液A与限制性内切酶反应，得到混合液B；3)鸟嘌呤四聚体结构的制备：混合液B与末端脱氧核苷酸转移酶、脱氧核苷三磷酸反应后，与配体分子作用，得到混合液C；4)检测分析：混合液C与不同底物作用发生催化氧化反应，产生紫外、荧光和化学发光信号，根据各信号的响应强度与真菌毒素浓度的关系计算待测样品中真菌毒素的含量。本发明方法操作处理快速简单、检测时间短，具有免标记、低成本、高精准、高灵敏等特点。

Description

一种多信号检测真菌毒素的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物传感分析及食品和饲料安全检测技术领域。更具体地，涉及一种多信号检测真菌毒素的方法及试剂盒。

背景技术

许多食品和饲料在生产、储存、加工和流通过程中易遭受真菌污染，产生有毒次级代谢产物真菌毒素。据联合国粮农组织估算，全球每年约有1/4的粮食因受真菌毒素污染而失去营养和经济价值，较为常见的真菌毒素种类有赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素、黄曲霉毒素和伏马毒素等，其中部分种类已被证实具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致”作用。中国(GB 2761-2017)及世界各地已普遍制定了真菌毒素的限量标准，明确了真菌毒素防控在食品和饲料安全监管中的重要性。

目前真菌毒素的检测方法主要包括生物鉴定法、化学分析法、仪器分析法和免疫分析法，但上述传统检测方法普遍存在高效识别机制匮乏、批次差异大、检测成本高及大型仪器依赖性大等缺点。目前主导仲裁判定依据的仪器分析法虽准确度高、定量限低，但操作复杂，对设备要求高，并不适于真菌毒素的快速分析。已成功商业化推广的免疫分析法虽实现了便捷的检测需求，但在实际研究及应用中仍面临着抗体和抗原批次差异大，交叉反应普遍，存在一定假阳性等问题。近年，核酸适体代替抗体作为新型识别分子的生物传感技术为真菌毒素的高精准、便携式检测提供了新思路。但适体生物传感器检测多结合生物纳米材料，前期需要合成步骤或信号分子的标记及修饰，不仅操作复杂、增加成本，易对实际样本造成二次污染，而且体系中的纳米材料还可能发生复杂对象的非特异性吸附，造成靶向信号淬灭或非靶向信号放大。

因此，需要提供一种快速、便携、廉价、免标记检测不同类型真菌毒素的方法，且该方法能有效提高检测的精准性、灵敏度、选择性及通用性。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种多信号检测真菌毒素的快速、简便、免标记、高精准、高灵敏分析方法。

本发明的另一个目的在于提供一种多信号检测真菌毒素的试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种多信号检测真菌毒素的方法，包括如下步骤：

1)真菌毒素与核酸适体的结合作用：使真菌毒素核酸适体及其互补序列反应，形成杂交双链后，加入待测样品，使其与核酸适体结合，双链解旋，释放互补序列，得到混合液A；

2)酶切辅助信号放大：混合液A与限制性内切酶反应，杂交双链被剪切，暴露出3'-OH，而真菌毒素与适体的结合产物及互补序列单链DNA不发生酶切，得到混合液B；

3)鸟嘌呤四聚体结构的制备：混合液B与末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和脱氧核苷三磷酸(dNTPs)反应，被剪切的杂交双链3'-OH端可随机聚合富含鸟嘌呤的长链DNA，形成多个连续的鸟嘌呤四聚体结构(G4结构)，之后与配体分子作用，构成具有过氧化物酶活性的脱氧核酶(DNAzyme)，得到混合液C；

4)检测体系：混合液C与不同底物作用发生催化氧化反应，产生紫外、荧光和化学发光信号，根据各信号的响应强度与真菌毒素浓度的关系计算待测样品中真菌毒素的含量。

本发明所述真菌毒素包括但不限于赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、T-2毒素、黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、伏马毒素B1和伏马毒素B2。

本发明所述真菌毒素核酸适体为可与真菌毒素发生结合作用的DNA，不同真菌毒素种类对应不同DNA序列。

在本发明优选的实施方式中，不同真菌毒素适体序列可以为但不限于：所述赭曲霉毒素A核酸适体如序列表SEQ ID No.1所示；所述玉米赤霉烯酮核酸适体如序列表SEQ IDNo.2所示；所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体如序列表SEQ ID No.3所示；所述T-2毒素核酸适体如序列表SEQ ID No.4所示；所述黄曲霉毒素M1核酸适体如序列表SEQ ID No.5所示；所述黄曲霉毒素B1核酸适体如序列表SEQ ID No.6所示；所述黄曲霉毒素B2核酸适体如序列表SEQ ID No.7所示；所述伏马毒素B1核酸适体如序列表SEQ ID No.8所示；所述伏马毒素B2核酸适体如序列表SEQ ID No.9所示。

所述核酸适体互补序列为与上述真菌毒素核酸适体DNA碱基互补的单链DNA，互补比例大于适体长度的1/3。

所述的真菌毒素核酸适体与其互补序列的3'端均用磷酸化进行封闭处理。

进一步，所述互补序列浓度大于真菌毒素适体浓度。

在本发明优选的实施方式中，步骤1)中所述反应是在Tris-HCl缓冲液(20mMTris-HCl,pH 7.5)中反应1-10min。

进一步，所述限制性内切酶为可切刻相应杂交双链的酶类，包括但不限于Hpy188I、MseI或BaeGI。

在本发明优选的实施方式中，步骤2)中所述反应是混合液A与2-10个单位的限制性内切酶于反应缓冲液(20mM Tris-Ac,10mM Mg(Ac)₂,50mM KAc,pH 7.9)中孵育40-120min后，加热至65-80℃，保持20min终止反应。

进一步，dNTPs中各组分的摩尔浓度比为dGTP 50％-100％，dATP 0％-50％，dTTP0％-50％。

在本发明优选的实施方式中，步骤3)中所述反应是混合液B与2-10个单位TdT和1mM dNTPs于反应缓冲液(1M二甲胂酸钾,125mM Tris,0.05％Triton X-100,5mM CoCl₂,pH7.2)中37℃下孵育40-120min，之后于70℃水浴10min终止反应。

进一步，所述配体分子为血红素。

进一步，本发明产生信号的不同，所述底物有所不同：

当产生紫外信号时，所述底物为过氧化酶比色底物，所述过氧化酶比色底物包括但不限于2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS^2-)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、邻苯二胺(OPD)或氧化耦联色原底物对；

当产生荧光信号时，所述底物为荧光有机染料或过氧化酶荧光底物，所述荧光有机染料可与G4结构特异性结合，包括但不限于硫磺素T、结晶紫或噻唑橙，所述过氧化酶荧光底物包括但不限于Amplex Red；

当产生化学发光信号时，所述底物为过氧化酶化学发光底物，所述过氧化酶化学发光底物包括但不限于鲁米诺(Luminol)、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯、吖啶酰胺类或过氧化草酸酯类。

进一步，所述的催化氧化反应利用双氧水(H₂O₂)触发。

本发明还公开了一种多信号检测真菌毒素的试剂盒，包括：真菌毒素核酸适体，真菌毒素核酸适体互补序列，酶切辅助信号放大体系，G4结构制备体系，比色、荧光及化学发光检测体系。

本发明所述真菌毒素包括但不限于赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素、黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、伏马毒素B1和伏马毒素B2。

进一步，所述酶切辅助信号放大体系包括限制性内切酶和反应缓冲液，所述的限制性内切酶为可切刻杂交双链的酶类，包括但不限于Hpy188I、MseI或BaeGI；优选的，所述的缓冲液为20mM Tris-Ac,10mM Mg(Ac)₂,50mM KAc,pH 7.9。

进一步，所述的G4结构制备体系包括TdT、dNTPs、反应缓冲液及配体分子，所述的dNTPs中各组分的浓度比为dGTP 50％-100％，dATP 0％-50％，dTTP 0％-50％，优选地，所述反应缓冲液为1M二甲胂酸钾,125mM Tris,0.05％Triton X-100,5mM CoCl₂,pH 7.2，所述配体分子为血红素。

进一步，所述的比色检测体系包括过氧化酶比色底物和H₂O₂，所述的过氧化酶比色底物包括但不限于2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS^2-)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、邻苯二胺(OPD)及氧化耦联色原底物对，利用H₂O₂可触发催化氧化反应。

进一步，所述的荧光检测体系包括荧光有机染料分子或过氧化酶荧光底物及H₂O₂，所述的荧光染料包括但不限于硫磺素T、结晶紫或噻唑橙，所述的过氧化酶荧光底物包括但不限于Amplex Red，利用H₂O₂可触发催化氧化反应。

进一步，所述的化学发光检测体系包括过氧化酶化学发光底物和H₂O₂，所述的过氧化酶化学发光底物包括但不限于鲁米诺(Luminol)或异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯和吖啶酰胺类或过氧化草酸酯类，利用H₂O₂可触发催化氧化反应。

本发明检测的原理为：检测系统由两条DNA构成，一条为真菌毒素的核酸适体，一条为与其互补的序列单链DNA。上述两条DNA的3'末端均用磷酸化进行封闭处理，杂交成双链后用相应的限制性内切酶进行切刻，从而将3'-OH暴露出来。接下来，利用TdT调配底物池dNTPs的组成及比例，在3'-OH末端聚合获得随机排列的富含鸟嘌呤DNA长链，从而构成连续多个G4结构，利用其高效的脱氧核酶(DNAzyme)活性和特异性结合荧光染料的性质，同时输出比色可视、荧光和化学发光等多重信号。当有真菌毒素存在时，由于其与核酸适体的高亲和作用，杂交双链解旋，没有3'-OH产生，导致TdT随机合成鸟嘌呤序列受阻，无法形成G4结构而信号降低，以此建立紫外、荧光和化学发光多元响应的真菌毒素传感检测方法。

本发明合理利用核酸适体与真菌毒素结合前后的DNA杂交行为、适体诱导变构作用等，不仅无需标记修饰、操作简单，而且还可极大地丰富真菌毒素识别方法及信号转化与放大模式，显著提升分析的精准性、特异性、灵敏性及选择性，另外，该策略更适用于具有较长适体的底物类型，对多种不同真菌毒素均具有通用性及普适性。

本发明的有益效果如下：

本发明中构建的这种多信号输出体系，首次利用TdT无模板随机聚合生成G4结构对真菌毒素进行检测分析，与传统方法相比，具有多个优点：

第一，该策略无模板随机生成，无需合成纳米材料，且不受传统G4结构对于序列的精确要求限制，免标记、过程简单、快速，有效降低检测成本；

第二，该方法实现了在同一探针单元中的多元信号提取，通过紫外、荧光和化学发光多重信号的协同比照分析，可显著提升检测的可靠性与精准性，降低假阳性信号的产生；

第三，随机合成的连续G4结构，构成多个信号分子，可级联放大响应信号值，另外本体系最开始没有已存在的DNAzyme序列，信号背景很低，因此可显著提高灵敏度、选择性与检测范围，从发明效果来看，最低检测限显著低于国标的限量标准；

第四，通过引入内切酶切刻磷酸根保护的3'末端双链DNA，可对适体较长的真菌毒素种类进行有效分析，因此该方法对多种不同真菌毒素的检测具有普适性与通用性，仅通过改变不同真菌毒素与之亲和的引物适体，即可实现不同毒素分析；

第五，该比色体系可实现真菌毒素不同浓度的可视化半定量分析，为裸眼检测真菌毒素提供了有力手段。

因此，本发明方法操作处理快速简单、检测时间短，具有免标记、低成本、高精准、高灵敏等特点。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出本发明检测真菌毒素的方法步骤示意图。

图2比色法检测OTA。基于TdT延伸产生的G4结构加入1ppb OTA前后的吸收光谱(A)与在415nm处吸收值的归一化柱状图(B)。检测不同浓度OTA(0-2ppb)的可视化成像图(C)。

图3示出荧光法检测OTA。基于TdT延伸产生的G4结构加入0.1ppb OTA前后的荧光光谱(A)与在485nm处荧光发射值的归一化柱状图(B)。检测不同浓度OTA(0-0.5ppb)的荧光成像图(C)。激发波长为425nm，发射波长范围为460-520nm，激发和发射狭缝为5nm。

图4示出化学发光法检测OTA。基于TdT延伸产生的G4结构加入1ppb OTA前后的在425nm处化学发光响应值的归一化柱状图。

图5示出比色法、荧光法及化学发光法检测ZEN。基于TdT延伸产生的G4结构加入1ppb ZEN前后在450nm处吸收值(A)、在590nm处荧光发射值(B)及在445nm处化学发光响应值(C)的归一化柱状图。激发波长为550nm，发射波长范围为570-700，激发和发射狭缝为5nm。

图6示出比色法、荧光法及化学发光法检测DON。基于TdT延伸产生的G4结构加入2ppb DON前后在492nm处吸收值(A)与在630nm处荧光发射值(B)及在425nm处化学发光响应值(C)的归一化柱状图。激发波长为580nm，发射波长范围为600-680nm，激发和发射狭缝为5nm。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部分以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

本发明不同真菌毒素种类对应不同核酸适体，其中，所述真菌毒素核酸适体序列如表1：

表1不同真菌毒素的核酸适体

实施例1一种多信号检测赭曲霉毒素A(OTA)的方法

一种多信号检测OTA的方法，具体操作步骤过程如下(具体步骤如图1所示)：

将100nM磷酸化进行封闭处理后的OTA核酸适体(5′-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-PO₄ ^3--3′)与1μM磷酸化进行封闭处理后的适体互补序列(5′-TGTCCGATGCTCCCTTTACGCCACCCACAC-PO₄ ^3--3′)及0-200ppb OTA于Tris-HCl缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 7.5)的中反应2min。

将上述溶液与8单位的Hpy188I加入于反应缓冲液(20mM Tris-Ac,10mM Mg(Ac)₂,50mM KAc,pH 7.9)中孵育60min，随后溶液加热至65℃，保持20min终止反应。

上述溶液中加入5个单位的TdT和1mM dNTPs(dGTP 50％，dATP 40％，dTTP 10％)，于反应缓冲液(1M二甲胂酸钾,125mM Tris,0.05％Triton X-100,5mM CoCl₂,pH 7.2)中37℃下孵育2h，之后于70℃水浴10min终止反应，作为混合液①。

将混合液①中加入0.125□M血红素，于MES缓冲液(20mM MES-Tris,40mM KCl,and0.05％Triton X-100,pH 5.5)中反应，之后再加入20mM ABTS^2-与20mM H₂O₂引发变色，在波长范围为400nm到700nm进行紫外吸收检测。

将混合液①中加入2□M硫磺素T，于Tris-HCl缓冲液(10mM Tris-HCl,50mM KCl,pH 7.2)中反应后，检测荧光光谱。激发波长为425nm，发射波长范围为460-520nm，激发和发射狭缝为5nm。

将混合液①中加入0.125□M血红素，于Hepes缓冲液(25mM Hepes,20mM KCl and50mM NaCl,pH 9.0)反应，之后再加入10mM Luminol和20mM H₂O₂，在波长范围为300nm到600nm进行化学发光值的检测。

结果显示：利用新型随机排列富含鸟嘌呤序列的无模板制备策略及酶切辅助信号放大方法，可形成G4结构，构成比色可视化、荧光及化学发光响应体系(图2A、图3A和图4，G4)。当1ppb的OTA存在时，比色、荧光及化学发光系统信号均有明显下降(图2A、图3A和图4，G4-OTA)。在比色体系中，与G4相比，415nm处信号下降约6.8倍(图2B)，最低检测限为0.005ppb，裸眼可视化区分最低浓度为0.01ppb，线性范围为0.01-2ppb(图2C)；在荧光体系中，与G4相比，波长425nm激发后，在485nm处信号下降约12倍(图3B)，最低检测限为0.001ppb，线性范围为0.005-0.5ppb(图3C)；在化学发光体系中，最低检测限为0.008ppb，线性范围为0.01-2ppb(图4)。通过紫外、荧光及化学发光多信号的比照分析，误差在2％以内；利用竞争抑制实验S＝y/Z×100％(S：交叉反应率；y：OTA的IC₅₀；Z：其它真菌毒素及OTA结构类似物等小分子的IC₅₀；IC₅₀：半抑制浓度)计算交叉反应1％以内，该方法对OTA检测具有较强的特异性、选择性，对其它物质有较好的抗干扰能力。

实施例2一种多信号检测OTA的试剂盒

一种多信号检测OTA的试剂盒，包括：

OTA核酸适体，适体互补序列，酶切辅助信号放大体系，G4结构制备体系，比色、荧光及化学发光检测体系。

磷酸化进行封闭处理后的OTA核酸适体为5′-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-PO₄ ^3--3′。

磷酸化进行封闭处理后的适体互补序列为5′-TGTCCGATGCTCCCTTTACGCCACCCACAC-PO₄ ^3--3′。

酶切辅助信号放大体系包括Hpy188I及反应缓冲液(20mM Tris-Ac,10mM Mg(Ac)₂,50mM KAc,pH 7.9)。

G4结构制备体系包括TdT、dNTPs(GTP 50％，dATP 40％，dTTP 10％)、反应缓冲液(1M二甲胂酸钾,125mM Tris,0.05％Triton X-100,5mM CoCl₂,pH 7.2)。

比色检测体系包括血红素、ABTS^2-、H₂O₂及MES缓冲液(20mM MES-Tris,40mM KCl,and 0.05％Triton X-100,pH 5.5)。

荧光检测体系包括硫磺素T及Tris-HCl缓冲液(10mM Tris-HCl,50mM KCl,pH7.2)。

化学发光检测体系包括血红素、Luminol、H₂O₂及Hepes缓冲液(25mM Hepes 20mMKCl and 50mM NaCl,pH 9.0)。

实施例3一种多信号检测玉米赤霉烯酮(ZEN)的方法

一种多信号检测ZEN的方法，具体操作步骤过程如下：

将10nM磷酸化进行封闭处理后的ZEN核酸适体(5′-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTGGGGATGGGAGGTTGTTACGCAGGAGATGTTAATCGTGTGAAGTGC-PO₄ ^3--3′)与100nM磷酸化进行封闭处理后的适体互补序列(5′-GCACTTCACACGATTAACATCTCCTGCGTA-PO₄ ^3--3′)及0-500ppb ZEN于Tris-HCl缓冲液(20mMTris-HCl,pH 7.5)的中反应5min。

将上述溶液与2个单位的MseI加入反应缓冲液(20mM Tris-Ac,10mM Mg(Ac)₂,50mM KAc,pH 7.9)中孵育45min，随后溶液加热至65℃，保持20min终止反应。

上述溶液中加入2个单位的TdT和1mM dNTPs(dGTP 60％，dATP 40％，)，于反应缓冲液(1M二甲胂酸钾,125mM Tris,0.05％Triton X-100,5mM CoCl₂,pH 7.2)中，37℃下孵育60min，之后于70℃水浴10min终止反应，作为混合液①。

将混合液①中加入0.1□M血红素，于缓冲液(100mM柠檬酸,200mM NaAc,pH 5.4)中反应，之后再加入20mM TMB与20mM H₂O₂引发变色，在波长范围为300nm到600nm进行紫外吸收检测。

将混合液①中加入0.1□M血红素，于Tris-Ac缓冲液(10mM Tris-Ac,20mM KCl,and 0.05％Triton X-100,pH 7.4)中反应，再加入1mM Amplex Red和20mM H₂O₂后，检测荧光光谱。激发波长为550nm，发射波长范围为570-700nm，激发和发射狭缝为5nm。

将混合液①中加入0.1□M血红素，于缓冲液(20mM MES-Tris,20mM KCl,pH 5.0)中反应，之后再加10mM吖啶酯和20mM H₂O₂，在波长范围为300nm到600nm进行化学发光值的检测。

结果显示：检测ZEN时，比色体系中，最低检测限为0.008ppb，线性范围为0.08-8ppb(图5A)；荧光体系中，最低检测限为0.005ppb，线性范围为0.01-2ppb(图5B)；化学发光体系中，最低检测限为0.008ppb，线性范围为0.02-4ppb(图5C)；误差在2％以内，交叉反应1％以内。

实施例4一种多信号检测ZEN的试剂盒

一种多信号检测ZEN的试剂盒，包括：

ZEN核酸适体，适体互补序列，酶切辅助信号放大体系，G4结构制备体系，比色、荧光及化学发光检测体系。

磷酸化进行封闭处理后的ZEN核酸适体为5′-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTGGGGATGGGAGGTTGTTACGCAGGAGATGTTAATCGTGTGAAGTGC-PO₄ ^3--3′。

磷酸化进行封闭处理后的适体互补序列为5′-GCACTTCACACGATTAACATCTCCTGCGTA-PO₄ ^3--3′。

酶切辅助信号放大体系包括MseI及反应缓冲液(20mM Tris-Ac,10mM Mg(Ac)₂,50mM KAc,pH 7.9)。

G4结构制备体系包括TdT、dNTPs(GTP 60％，dATP 40％)及反应缓冲液(1M二甲胂酸钾,125mM Tris,0.05％Triton X-100,5mM CoCl₂,pH 7.2)。

比色检测体系包括血红素、TMB、H₂O₂及缓冲液(100mM柠檬酸,200mM NaAc,pH5.4)。

荧光检测体系包括血红素、Amplex Red、H₂O₂及Tris-Ac缓冲液(10mM Tris-Ac,20mM KCl,and 0.05％Triton X-100,pH 7.4)。

化学发光检测体系包括血红素、吖啶酯、H₂O₂及缓冲液(20mM MES-Tris,20mM KCl,pH 5.0)。

实施例5一种多信号检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)方法

一种多信号检测DON方法，具体操作步骤过程如下：

将1μM磷酸化进行封闭处理后的DON核酸适体(5′-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTAGGGGGGATCGTTAAGGAAGTGCCCGGAGGCGGTATCGTGTGAAGTGC-PO₄ ^3--3′)与10μM磷酸化进行封闭处理后的适体互补序列(5′-GCACTTCACACGATACCGCCTCCGGGCACT-PO₄ ^3--3′)及0-1000ppb DON于Tris-HCl缓冲液(20mMTris-HCl,pH 7.5)的中反应10min。

将上述溶液与10个单位的BaeGI加入于反应缓冲液(20mM Tris-HCl,10mM MgCl₂,50mM NaCl,pH 7.9)中孵育120min，随后溶液加热至80℃，保持20min终止反应。

上述溶液中加入10个单位的TdT和1mM dNTPs(dGTP 70％，dATP 30％)于反应缓冲液(1M二甲胂酸钾,125mM Tris,0.05％Triton X-100,5mM CoCl₂,pH 7.2)中，37℃下孵育45min，之后于70℃水浴10min终止反应，作为混合液①。

将混合液①中加入0.5□M血红素，于缓冲液(100mM柠檬酸,200mM Na₂HPO₄,pH5.0)中反应，再加入20mM OPD与20mM H₂O₂引发变色，之后利用1M H₂SO₄终止反应，在波长范围为400nm到700nm进行紫外吸收检测。

将混合液①中加入2□M结晶紫，于Tris-HCl缓冲液(10mM Tris-HCl,20mM KCl,20mM KCl，pH 7.2)中反应后，检测荧光光谱。激发波长为580nm，发射波长范围为600-680nm，激发及发射狭缝均为5nm。

将混合液①中加入0.5□M血红素，于Hepes缓冲液(25mM Hepes,20mM KCl and50mM NaCl,pH 9.0)反应，之后再加10mM Luminol和20mM H₂O₂，在波长范围为300nm到600nm进行化学发光值的检测。

结果显示：检测DON时，比色体系中，最低检测限为0.01ppb，线性范围为0.05-10ppb(图6A)；荧光体系中，最低检测限为0.005ppb，线性范围为0.01-1ppb(图6B)；化学发光体系中，最低检测限为0.01ppb，线性范围为0.05-5ppb(图6C)；误差在2％以内，交叉反应1％以内。

实施例6一种多信号检测DON的试剂盒

一种多信号检测DON的试剂盒，包括：

DON核酸适体，适体互补序列，酶切辅助信号放大体系，G4结构制备体系，比色、荧光及化学发光检测体系。

磷酸化进行封闭处理后的DON核酸适体为5′-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTAGGGGGGATCGTTAAGGAAGTGCCCGGAGGCGGTATCGTGTGAAGTGC-PO₄ ^3--3′。

磷酸化进行封闭处理后的适体互补序列为5′-GCACTTCACACGATACCGCCTCCGGGCACT-PO₄ ^3--3′。

酶切辅助信号放大体系包括BaeGI及反应缓冲液(20mM Tris-Ac,10mM Mg(Ac)₂,50mM KAc,pH 7.9)。

G4结构制备体系包括TdT、dNTPs(GTP 70％，dATP 30％)、反应缓冲液(1M二甲胂酸钾,125mM Tris,0.05％Triton X-100,5mM CoCl₂,pH 7.2)。

比色检测体系包括血红素、OPD、H₂O₂、H₂SO₄及缓冲液(100mM柠檬酸,200mMNa₂HPO₄,pH 5.0)。

荧光检测体系包括结晶紫及Tris-HCl缓冲液(10mM Tris-HCl,20mM KCl,20mMKCl，pH 7.2)。

化学发光检测体系包括血红素、Luminol、H₂O₂及Hepes缓冲液(25mM Hepes,20mMKCl and 50mM NaCl,pH 9.0)。

从上述实施例中看出：OTA、ZEN及DON最低检测限均显著低于我国GB2761-2017《食品中真菌毒素限量》中的限量标准。因此本发明构建的新型随机排列鸟嘌呤四聚体的紫外、荧光及化学发光多重响应信号检测策略，可实现对多种真菌毒素的快速、便捷、免标记分析，同时显著提升检测的可靠性、精准度和灵敏性。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

SEQUENCE LISTING

<110> 国家粮食局科学研究院

<120> 一种多信号检测真菌毒素的方法及试剂盒

<130> JLC17I0290E

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成赭曲霉毒素A核酸适体序列

<400> 1

gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成玉米赤霉烯酮核酸适体序列

<400> 2

gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36

<210> 3

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工合成脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体序列

<400> 3

gcatcactac agtcattacg catcgtgggg atgggaggtt gttacgcagg agatgttaat 60

cgtgtgaagt gc 72

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成T-2毒素核酸适体序列

<400> 4

gtatatcaag catcgcgtgt ttacacatgc gagaggtgaa 40

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成黄曲霉毒素M1核酸适体序列

<400> 5

actgctagag attttccaca t 21

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成黄曲霉毒素B1核酸适体序列

<400> 6

gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccaca 50

<210> 7

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工合成黄曲霉毒素B2核酸适体序列

<400> 7

agcagcacag aggtcagatg ctgacaccct ggaccttgga ttccggaagt tttccggtac 60

ctatgcgtgc taccgt 76

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成伏马毒素B1核酸适体序列

<400> 8

cgatctggat attatttttg ataccccttt ggggagacat 40

<210> 9

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工合成伏马毒素B2核酸适体序列

<400> 9

gcatcactac agtcattacg catctacgtg acgagggtga ctatggcggt ggcgtctgtg 60

agcacgtgtg aagtgctgtc cc 82

Claims

1.一种多信号检测真菌毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)真菌毒素与核酸适体的结合作用：真菌毒素核酸适体与其互补的序列反应后，加入待测样品，得到混合液A；

2)酶切辅助信号放大作用：混合液A与限制性内切酶反应，得到混合液B；

3)鸟嘌呤四聚体结构的制备：混合液B与末端脱氧核苷酸转移酶、脱氧核苷三磷酸反应后，与配体分子作用，得到混合液C；

4)检测分析：混合液C与不同底物作用发生催化氧化反应，产生紫外、荧光和化学发光信号，根据各信号的响应强度与真菌毒素浓度的关系计算待测样品中真菌毒素的含量。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述真菌毒素为赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素、黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、伏马毒素B1或伏马毒素B2。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述核酸适体互补序列为与真菌毒素核酸适体DNA碱基互补的单链DNA。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述真菌毒素核酸适体与其互补序列的3'端均用磷酸化进行封闭处理。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述限制性内切酶为可切刻杂交双链的酶类。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述脱氧核苷三磷酸中各组分的摩尔浓度比为dGTP 50％-100％，dATP 0％-50％，dTTP 0％-50％。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述配体分子为血红素。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于：

当产生紫外信号时，所述底物为过氧化酶比色底物，所述过氧化酶比色底物为2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐、3,3',5,5'-四甲基联苯胺、邻苯二胺或氧化耦联色原底物对；

当产生荧光信号时，所述底物为荧光有机染料或过氧化酶荧光底物，所述荧光有机染料为硫磺素T、结晶紫或噻唑橙，所述过氧化酶荧光底物为AmplexRed；

当产生化学发光信号时，所述底物为过氧化酶化学发光底物，所述过氧化酶化学发光底物为鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯、吖啶酰胺类或过氧化草酸酯类。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述的催化氧化反应利用双氧水触发。

10.一种多信号检测真菌毒素的试剂盒，其特征在于，包括：真菌毒素核酸适体，真菌毒素核酸适体互补序列，酶切辅助信号放大体系，鸟嘌呤四聚体结构制备体系，比色、荧光及化学发光检测体系。