CN107976435A - 一种基于功能核酸的传感器及其在钠离子检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了金属离子检测技术领域的一种基于功能核酸的传感器及其在钠离子检测中的应用。该传感器包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，所述分子识别元件包括钠离子脱氧核酶；所述钠离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；所述信号放大元件包括等温扩增体系和氯高铁血红素，所述等温扩增体系包括扩增模板；所述信号转换元件包括显色剂。该传感器基于钠离子核酶、等温指数放大反应和G‑四链体液相传感技术构建，可用于环境中钠离子的现场检测，具备简便快速、灵敏度高、特异性高以及成本低等优点，特别是能够实现可视化检测。

Description

一种基于功能核酸的传感器及其在钠离子检测中的应用
技术领域
本发明属于金属离子检测技术领域，具体涉及一种基于功能核酸的传感器及其在钠离子检测中的应用。
背景技术
钠是一种金属元素，在周期表中位于第3周期第IA族，是碱金属元素的代表，质地柔软，能与水反应生成氢氧化钠，放出氢气，化学性质较活泼。钠元素以盐的形式广泛的分布于陆地和海洋中，钠也是人体肌肉组织和神经组织中的重要成分之一。钠污染主要来源于凝汽器泄露，由于凝结器中循环冷却水中钠的成份很高，一旦凝汽器稍有泄漏，凝结水就会受到污染，进入到水、汽循环系统，加速热力设备的腐蚀、结垢和积盐，严重时可能造成事故。
人体中钠的摄取主要是通过食物食盐摄取，缺了它就会饮食无味，还觉得软弱无力；但若长期摄入过多，则很容易影响健康，诱发疾病，例如使尿液中的蛋白质含量升高，引起肾上腺和脑组织释放一种使细胞兴奋性增加的因子，导致动脉收缩，血压升高。血压升高是导致心血管疾病的主要原因，大约62％的中风和49％的冠状动脉心脏病的主要病因是高血压。研究发现，每天的食盐摄入量超过4克(以钠的量计算)，中风的几率明显高于每天吃食盐少于1.5克的人，而且，每天食盐摄入每增加0.5克，中风的风险就增加17％。同样，有前瞻性研究分析了食盐摄入量与心血管疾病的关系，研究者对2436名芬兰人进行了钠含量测定，结果发现，当每天的食盐摄入增加6克，因得冠心病死亡的人数增加了56％，得心脏病死亡的患者增加36％。长期的高钠膳食会增加患高血压的风险，进而还会使得人们更容易患中风和冠状动脉心脏病等心血管疾病。
目前，国内外检测钠离子含量的方法很多，如离子色谱法、火焰原子发射光谱法、火焰原子收法、流动注射技术和离子选择性电极相结合的方法等。应用这些方法测定钠离子含量的研究成果也有相应的报导，但运用这些检测方法直接测量往往满足不了要求，除非将大量的样品浓缩到分析技术可检测的范围，这不但费时、费工，而且会因浓缩过程而引入严重误差，不能满足监测的要求，因此采用新的高灵敏度、高准确性和快速的分析方法和检测技术将成为必然。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提出一种基于功能核酸的传感器及其在钠离子检测中的应用。具体技术方案如下：
一种基于功能核酸的传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，
所述分子识别元件包括钠离子脱氧核酶；所述钠离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；
所述信号放大元件包括等温扩增体系和氯高铁血红素，所述等温扩增体系包括扩增模板；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CTCTATCTATrAGGAAGTACCGCCGCGGAGGCGGA；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：GCGGCGGTACCAGGTCAAAGGTGGGTGAGGGGACGCCAAGAGTCCCCGCGGTTAGATAGAG；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：ACCCACAATGACCCACCCACACCCACCCACAATGACCCACAACTGACTCTCCGCCTCCGCGGCGGTACTTCC；
所述信号转换元件包括显色剂。
所述等温扩增体系包括A体系和B体系；
所述A体系包括：扩增模板、dNTPs和钠离子脱氧核酶切割产物；
所述B体系包括：Bst DNA聚合酶及其缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液。
所述Bst DNA聚合酶反应缓冲液：20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,50mM KCl,2mMMgSO4,0.1％吐温20，0.1％牛血清白蛋白，pH 8.8；
所述Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲液：100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mMMgCl2,300μg/ml海藻糖，pH 7.9。
所述信号转换元件还包括终止剂，优选的，所述终止剂为硫酸；所述显色剂为TMB显色剂。
一种检测钠离子的方法，包括如下步骤：
制备钠离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度(OD值)关系的标准曲线；
按上述制备标准曲线的过程进行待测样品的检测，得到待测样品的G-四链体功能核酸显色光密度值，通过上述标准曲线计算钠离子的浓度；
其中，钠离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线的步骤包括：
(1)在钠离子脱氧核酶的底物链和酶链中加入不同浓度钠离子溶液，制备钠离子脱氧核酶切割产物；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CTCTATCTATrAGGAAGTACCGCCGCGGAGGCGGA；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：GCGGCGGTACCAGGTCAAAGGTGGGTGAGGGGACGCCAAGAGTCCCCGCGGTTAGATAGAG；
(2)将扩增模板，dNTPs，钠离子脱氧核酶切割产物和超纯水混合均匀，制备A体系；将Bst DNA聚合酶及其缓冲溶液，Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液混合均匀，制备B体系；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：ACCCACAATGACCCACCCACACCCACCCACAATGACCCACAACTGACTCTCCGCCTCCGCGGCGGTACTTCC；
(3)A体系先进行孵育，然后与B体系迅速进行混合，孵育扩增，终止反应后得到扩增产物；
(4)将扩增产物、酶活缓冲液和氯高铁血红素稀释溶液混匀并反应，形成G-四链体结构；
(5)向步骤(4)混合液中加入TMB显色液，混匀并反应，反应结束后加入H2SO4，酶标仪测定OD450，得到OD450值随钠离子浓度变化的标准曲线。
步骤(1)的操作为：将钠离子脱氧核酶底物链和酶链用缓冲液稀释，95℃加热15min，然后缓慢降至25℃；加入待测钠离子溶液，25℃孵育6min，加入终止液，得到钠离子脱氧核酶切割产物。
步骤(3)的操作为：A体系于55℃孵育5min，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min，95℃保持10min以终止反应。
步骤(4)中反应温度为37℃，反应时间为30min；步骤(5)中反应温度为37℃，反应时间为10min。
本发明同时提供一种检测钠离子的试剂盒，包括钠离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显示体系；
所述钠离子脱氧核酶体系包括底物链、酶链、缓冲液、钠离子标准溶液和终止液；
所述等温扩增体系包括扩增模板、dNTPs、超纯水、Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；
所述显体系包括：氯高铁血红素、酶活缓冲液、TMB显色剂和2MH2SO4；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CTCTATCTATrAGGAAGTACCGCCGCGGAGGCGGA；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：GCGGCGGTACCAGGTCAAAGGTGGGTGAGGGGACGCCAAGAGTCCCCGCGGTTAGATAGAG；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：ACCCACAATGACCCACCCACACCCACCCACAATGACCCACAACTGACTCTCCGCCTCCGCGGCGGTACTTCC。
根据所述的试剂盒，所述缓冲液为终浓度25mMNaCl，50mM MES，pH 6.0；所述终止液为0.2M EDTA，2M NaCl，0.5M Tris；所述酶活缓冲液为100mM Tris、120mM NaCl、10mMMgCl2、100mM KCl，pH8.4。
利用所述的试剂盒检测钠离子的方法，包括如下步骤：
(1)制备钠离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线
将钠离子脱氧核酶的4μL底物链和4μL酶链用缓冲液稀释至35μL，95℃加热15min，然后缓慢降至25℃，加入5μL不同浓度钠离子溶液，25℃孵育6min，加入5μL终止液，制备钠离子脱氧核酶切割产物；
将6μL 1μM的扩增模板，3μL 2.5mM的dNTPs，6μL 1μM的钠离子脱氧核酶切割产物和9.2μL的超纯水混合均匀，制备A体系；将0.1μL 8U/μL的Bst DNA聚合酶，3μL 10×的聚合酶反应缓冲溶液，1.2μL 10U/μL的Nt.BstNBI切刻内切酶和1.5μL 10×的Nt.BstNBI切刻内切酶的反应缓冲溶液混合均匀，制备B体系；
A体系于55℃孵育5min，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min，95℃保持10min以终止反应，得到扩增产物；
将10μL扩增产物，80μL酶活缓冲液和10μL氯高铁血红素稀释溶液混匀，并于37℃反应30min，形成G-四链体结构；
所述氯高铁血红素稀释溶液按照2μL氯高铁血红素原液与1mL酶活缓冲液混合得到；
加入50μL TMB显色液，混匀并于37℃反应10min，反应结束后加入50μL2MH2SO4，酶标仪测定OD450，得到OD450值随钠离子浓度变化的标准曲线；
(2)按上述制备标准曲线的过程进行待测样品的检测，通过上述标准曲线计算钠离子的浓度。
本发明还提供一种钠离子脱氧核酶，所述钠离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CTCTATCTATrAGGAAGTACCGCCGCGGAGGCGGA；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：GCGGCGGTACCAGGTCAAAGGTGGGTGAGGGGACGCCAAGAGTCCCCGCGGTTAGATAGAG。
本发明的有益效果为：
1、本发明传感器基于钠离子脱氧核酶由底物链与酶链两条寡核苷酸链组成，形成特定的二级结构；痕量钠离子能够特异性识别钠离子脱氧核酶，结合脱氧酶的酶链，并激活脱氧核酶，切割脱氧核酶的底物链；有且只有切割产物存在时，促发等温指数放大反应(EXPAR)，产生信号的一级放大和转化，并生成大量富含鸟嘌呤的寡核苷酸序列；该序列在氯高铁血红素诱导下形成G-四链体结构，催化过氧化氢与四甲基联苯胺显绿色，硫酸终止反应后显黄色，从而产生二级放大与转化，转化成可视化的信号。
2、经过两次信号的转化，通过手持式光谱检测仪就可以进行定量检测钠离子，并可用于环境中钠离子的现场检测，简便快速、灵敏度高、特异性高、成本低。
附图说明
图1为钠离子脱氧核酶的制备及切割产物的验证，其中，Lane1-Marker；Lane2-阴性对照：脱氧核酶底物链与酶链，不加入钠离子；Lane3,4,5-阳性样品：在脱氧核酶底物链与酶链的体系中分别均添加20nM的氯化钠。
图2为等温指数放大反应中扩增产物的变化图，其中，Lane1-Marker；Lane2-扩增模板；Lane 3-阳性样品；Lane4-阳性对照：扩增产物。
图3为OD450值随钠离子浓度的标准曲线。
具体实施方式
以下实施例便于更好地理解本发明。实施例中实验材料如无特殊说明均可通过商业途径获得。
本发明基于钠离子脱氧核酶、等温指数放大反应(EXPAR)和G-四链体液相传感技术，构建一种可视化传感器。钠离子脱氧核酶由底物链与酶链两条寡核苷酸链组成，形成特定的二级结构；痕量钠离子能够特异性识别钠离子脱氧核酶，结合脱氧核酶的酶链，并激活脱氧核酶，切割脱氧核酶的底物链；有且只有切割产物存在时，促发EXPAR放大信号，并生成大量富含鸟嘌呤的寡核苷酸序列；该序列在氯高铁血红素诱导下形成G-四链体结构，发挥类辣根过氧化物酶(HRP)活性，催化过氧化氢与四甲基联苯胺显绿色，通过手持式光谱检测仪进行检测与定量。
实施例1：基于功能核酸的传感器的构建
1、实验材料
一水吗啉乙磺酸(MES)，氯化钾，氯化钠，氯化镁，磷酸氢钾，乙二胺四乙酸二钠，硫酸，四甲基联苯胺，氯高铁血红素，氯化钠，尿素，Nt.BstNBI切刻内切酶，Bst DNA聚合酶等
2、序列设计
设计并合成钠离子脱氧核酶底物链、脱氧核酶酶链和扩增模板。扩增模板中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列，序列前四个碱基对处(C和A之间)即是合成链切割位点；核酶底物链A末端GGAGGCGGA序列是为了增加与模板结合Tm值而增加的；钠离子切割位点在核酶底物链A的rA之后。
3、构建方法
基于功能核酸的传感器的构建方法，包括如下步骤：
(1)将4μL脱氧核酶底物链(10μM母液)与4μL脱氧核酶酶链(10μM母液)用缓冲液(终浓度为25mMNaCl and 50mM MES，pH 6.0)稀释至35μL，95℃加热15min，然后缓慢降至25℃，大约耗时45min。加入5μL待测钠离子溶液，形成40μL体系，25℃孵育6min，加入5μL终止液(浓度为0.2M EDTA，2M NaCl，0.5M Tris)，得到切割产物。用20％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，证明钠离子脱氧核酶的制备与切割成功，如图1.
钠离子脱氧核酶切割产物的序列(5’-3’)为：GGAAGTACCGCCGCGGAGGCGGA
(2)配制扩增反应体系
反应体系为30μL，由A部分和B部分组成。
A体系组成(24.2μL)
B体系组成(5.8μL)
本发明的“×”如无特殊限定，则为体积倍量。
本发明的“终浓度”无特殊限定，则为物质混合后的在总的反应体系的浓度。如1μM扩增模板母液6μL，终浓度为0.2μM，指的扩增模板在等温扩增体系中的浓度。
(3)A体系在55℃孵育5min后，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min；95℃保持10min，以终止反应，得到扩增产物。放入-20℃备用。利用20％的聚丙烯酰胺凝胶电泳验证扩增产物，结果如图2。
扩增产物的序列(5’-3’)为：GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGGGTGGGTCATTGTGGGT
(4)将10μL扩增产物、80μL酶活缓冲液和10μL氯高铁血红素稀释溶液混匀，37℃反应30min，使扩增产物结合氯高铁血红素形成G-四链体结构；
酶活缓冲液：100mM Tris、120mM NaCl、10mM MgCl2、100mM KCl，pH8.4。
氯高铁血红素稀释溶液：2μL氯高铁血红素原液与1mL酶活缓冲液混合。
(5)向步骤(4)混合液中加入50μL TMB显色液，混匀，37℃反应10min，加入50μL 2MH2SO4，混匀，酶标仪测定OD450。
实施例2：钠离子的检测
待测钠离子溶液为氯化钠溶液(KCl为溶解环境)，具体步骤如下：
(1)制备OD450随钠离子浓度变化的标准曲线
采用实施例1中3的构建方法，待测钠离子溶液为不同浓度氯化钠溶液(2M KCl为溶解环境)，氯化钠浓度取25nM、50nM、75nM、100nM和125nM，制备OD450随钠离子浓度变化的标准曲线(图3)，标准曲线为y＝0.008x+0.2201，R2＝0.9996。
(2)采用实施例1中3的构建方法，酶标仪测定待测钠离子溶液的OD450，带入标准曲线y＝0.008x+0.2201,得到钠离子浓度。结果如表1.
表1
实施例3：一种检测钠离子的试剂盒
一种检测钠离子的试剂盒，包括钠离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显示体系；
钠离子脱氧核酶体系包括底物链、酶链、缓冲液、钠离子标准溶液和终止液；
等温扩增体系包括扩增模板、dNTPs、超纯水、Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；
显体系包括：氯高铁血红素、酶活缓冲液、TMB显色剂和2MH2SO4。
脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CTCTATCTATrAGGAAGTACCGCCGCGGAGGCGGA；
脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：GCGGCGGTACCAGGTCAAAGGTGGGTGAGGGGACGCCAAGAGTCCCCGCGGTTAGATAGAG；
扩增模板的序列(5’-3’)为：ACCCACAATGACCCACCCACACCCACCCACAATGACCCACAACTGACTCTCCGCCTCCGCGGCGGTACTTCC。
缓冲液为终浓度25mMNaCl，50mM MES，pH 6.0；
终止液为0.2M EDTA，2M NaCl，0.5M Tris；
酶活缓冲液为100mM Tris，120mM NaCl，10mM MgCl2，100mM KCl，pH8.4。
Bst DNA聚合酶反应缓冲液：20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,50mM KCl,2mMMgSO4,0.1％吐温20，0.1％牛血清白蛋白，pH 8.8；Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲液：100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,300μg/ml海藻糖，pH 7.9。

Claims (10)

1.一种基于功能核酸的传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，其特征在于，
所述分子识别元件包括钠离子脱氧核酶；所述钠离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；
所述信号放大元件包括等温扩增体系和氯高铁血红素，所述等温扩增体系包括扩增模板；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CTCTATCTATrAGGAAGTACCGCCGCGGAGGCGGA；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：GCGGCGGTACCAGGTCAAAGGTGGGTGAGGGGACGCCAAGAGTCCCCGCGGTTAGATAGAG；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：ACCCACAATGACCCACCCACACCCACCCACAATGACCCACAACTGACTCTCCGCCTCCGCGGCGGTACTTCC；
所述信号转换元件包括显色剂。
2.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述等温扩增体系包括A体系和B体系；
所述A体系包括：扩增模板、dNTPs和钠离子脱氧核酶切割产物；
所述B体系包括：Bst DNA聚合酶及其缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液。
3.根据权利要求1或2所述的传感器，其特征在于，所述信号转换元件还包括终止剂，优选的，所述终止剂为硫酸；所述显色剂为TMB显色剂。
4.一种检测钠离子的方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备钠离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线；
按上述制备标准曲线的过程进行待测样品的检测，得到待测样品的G-四链体功能核酸显色光密度值，通过上述标准曲线计算钠离子的浓度；
其中，钠离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线的步骤包括：
(1)在钠离子脱氧核酶的底物链和酶链中加入不同浓度钠离子溶液，制备钠离子脱氧核酶切割产物；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CTCTATCTATrAGGAAGTACCGCCGCGGAGGCGGA；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：GCGGCGGTACCAGGTCAAAGGTGGGTGAGGGGACGCCAAGAGTCCCCGCGGTTAGATAGAG；
(2)将扩增模板，dNTPs，钠离子脱氧核酶切割产物和超纯水混合均匀，制备A体系；将Bst DNA聚合酶及其缓冲溶液，Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液混合均匀，制备B体系；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：ACCCACAATGACCCACCCACACCCACCCACAATGACCCACAACTGACTCTCCGCCTCCGCGGCGGTACTTCC；
(3)A体系先进行孵育，然后与B体系迅速进行混合，孵育扩增，终止反应后得到扩增产物；
(4)将扩增产物、酶活缓冲液和氯高铁血红素稀释溶液混匀并反应，形成G-四链体结构；
(5)向步骤(4)混合液中加入TMB显色液，混匀并反应，反应结束后加入H2SO4，酶标仪测定OD450，得到OD450值随钠离子浓度变化的标准曲线。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)的操作为：将钠离子脱氧核酶底物链和酶链用缓冲液稀释，95℃加热15min，然后缓慢降至25℃；加入待测钠离子溶液，25℃孵育6min，加入终止液，得到钠离子脱氧核酶切割产物。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)的操作为：A体系于55℃孵育5min，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min，95℃保持10min以终止反应。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)中反应温度为37℃，反应时间为30min；步骤(5)中反应温度为37℃，反应时间为10min。
8.一种检测钠离子的试剂盒，其特征在于，包括钠离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显示体系；
所述钠离子脱氧核酶体系包括底物链、酶链、缓冲液、钠离子标准溶液和终止液；
所述等温扩增体系包括扩增模板、dNTPs、超纯水、Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；
所述显体系包括：氯高铁血红素、酶活缓冲液、TMB显色剂和2MH2SO4；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CTCTATCTATrAGGAAGTACCGCCGCGGAGGCGGA；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：GCGGCGGTACCAGGTCAAAGGTGGGTGAGGGGACGCCAAGAGTCCCCGCGGTTAGATAGAG；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：ACCCACAATGACCCACCCACACCCACCCACAATGACCCACAACTGACTCTCCGCCTCCGCGGCGGTACTTCC。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为终浓度25mMNaCl，50mMMES，pH 6.0；所述终止液为0.2M EDTA，2M NaCl，0.5M Tris；所述酶活缓冲液为100mMTris，120mM NaCl，10mM MgCl2，100mM KCl，pH8.4。
10.一种钠离子脱氧核酶，其特征在于，所述钠离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CTCTATCTATrAGGAAGTACCGCCGCGGAGGCGGA；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：GCGGCGGTACCAGGTCAAAGGTGGGTGAGGGGACGCCAAGAGTCCCCGCGGTTAGATAGAG。
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