CN107988323A - 一种基于铬的功能核酸的传感器及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了金属离子检测技术领域的一种基于铬的功能核酸的传感器及其应用。该传感器包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，所述分子识别元件包括铬离子脱氧核酶，铬离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；所述信号放大元件包括等温扩增体系和氯高铁血红素，等温扩增体系包括扩增模板；所述信号转换元件包括显色剂。该传感器基于铬离子脱氧核酶、等温指数放大反应和G‑四链体液相传感技术，在检测铬离子中简便快速、灵敏度高、特异性高、耐高盐，并可用于环境中铬离子的现场检测。

Description

一种基于铬的功能核酸的传感器及其应用
技术领域
本发明属于金属离子检测技术领域，具体涉及一种基于铬的功能核酸的传感器及其应用。
背景技术
铬是VIB族元素，既是必需元素，又是有害元素，其价态起决定性作用。铬在地壳中的平均含量为0.010％～0.011％，分布极不均匀，我国的铬资源不丰富，工业上主要用于制造各种优质合金，也广泛应用于皮革、印染、电镀等工业，一般以离子形式排入环境中。
铬是人体不可缺少的微量元素之一。成人每天约需500-700微克铬，而在一般饮食中每天仅能提供50-100微克。当铬缺乏时，易使人体患糖尿病，冠状动脉粥样硬化病，影响到体内脂肪代谢。但是，过多的铬也会产生污染。当空气中铬酸的浓度达0.15-0.31毫克/立方米时，会使人发生鼻中隔穿孔。如果过多地摄入铬，会使人铬中毒，致畸胎和致突变，对人体皮肤、呼吸道和消化系统都会产生较大危害。铬污染还会对地面水生物产生不良影响，也会在植物和鱼类骨骼中产生积累，从而影响到人类的食物链。
铬有多种价态，最常见的是三价铬和六价铬。铬的不同化学形态导致不同的环境毒害和生物效应，对人体健康有不同的影响。铬离子中六价铬的毒性更是三价铬的一百多倍，为剧毒致癌物质。肠道对三价铬的吸收仅为1％左右，而对六价铬的吸收是三价铬的3～5倍。六价铬在胃中可被胃酸还原为三价铬，六价铬一旦进入血液中也会马上还原为三价铬。另外，与生物大分子结合后的铬，例如酵母中存在的铬，肠道吸收率高达25％。吸收入血液中的铬是与白蛋白结合而存在的。铬的毒性主要是由六价铬所致，六价铬主要来源于工业生产，职业性铬中毒是由六价铬化合物所致，如重铬酸钾对皮肤有刺激和致敏作用，对肝和肾都有毒性，对婴幼儿可发生中枢神经系统症状。铬酸盐烟和铬酸对呼吸道有明显的损害。有研究指出，六价铬化合物的主要毒性是由六价铬在细胞内还原为三价铬的过程中的产物所引起。如果人体吸入或长时间接触六价铬，会发生肾功能衰竭、头痛、流鼻血、肝衰竭或其他器官衰竭，极易发生癌症。六价铬还会进入DNA遗传给下一代，因此各类产品中微量的六价铬的成因、检测与防治是当今中外皮革界关注的焦点之一。
现今常用检验六价铬离子的方法是IUC-18标准方法。该法容易受到颜色的干扰。在检测产品六价铬离子的含量时，往往会由于诸如染料本身颜色的干扰，而使检测限量的确切值无法给出，3mg/kg的参考值也很难达到，另外光谱法，包括原子(吸收、发射、荧光等)光谱、分光光度法等，电化学、声学等方法也有应用。但这些方法依赖于大型仪器和专人操作，在现场和野外检测中受到限制，检测的可靠性和实用性不高，因此迫切需要发展无污染的、简便快速、高灵敏度和高特异性的方法来满足微量铬金属的检测。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提出一种基于铬的功能核酸的传感器及其应用。具体技术方案如下：
本发明提供的一种基于铬的功能核酸的传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，
所述分子识别元件包括铬离子脱氧核酶；所述铬离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；
所述信号放大元件包括等温扩增体系和氯高铁血红素，所述等温扩增体系包括扩增模板；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：GTCACGAGTCACTATrAGGAAGATGGCGAAATTGGGGGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CAGTGCTCAGTGATATTGCTCATTTTTGAGCGTGGGTGGAAACTGGATACCGCTTT；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCACACCCACCCACAATGACCCACAACTGACTCCCCCCCAATTTCGCCATCTTCC；
所述信号转换元件包括显色剂。
所述等温扩增体系包括A体系和B体系；
所述A体系包括：扩增模板、dNTPs和铬离子脱氧核酶切割产物；
所述B体系包括：Bst DNA聚合酶及其缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液。
所述Bst DNA聚合酶反应缓冲液：20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,50mM KCl,2mMMgSO4,0.1％吐温20，0.1％牛血清白蛋白，pH 8.8；
所述Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲液：100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mMMgCl2,300μg/ml海藻糖，pH 7.9。
所述信号转换元件还包括终止剂，优选的，所述终止剂为硫酸；所述显色剂为TMB显色剂。
一种检测铬离子的方法，包括如下步骤：
制备铬离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度(OD值)关系的标准曲线；
按上述制备标准曲线的过程检测待测样品的G-四链体功能核酸显色光密度值，通过上述标准曲线计算铬离子的浓度；
其中，制备标准曲线的步骤包括：
(1)在铬离子脱氧核酶的底物链和酶链中加入不同浓度铬离子溶液，制备铬离子脱氧核酶切割产物；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：GTCACGAGTCACTATrAGGAAGATGGCGAAATTGGGGGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CAGTGCTCAGTGATATTGCTCATTTTTGAGCGTGGGTGGAAACTGGATACCGCTTT；
(2)将扩增模板，dNTPs，铬离子脱氧核酶切割产物和超纯水混合均匀，制备A体系；将Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液，Nt.BstNBI切刻内切酶和切刻内切酶的反应缓冲溶液混合均匀，制备B体系；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCACACCCACCCACAATGACCCACAACTGACTCCCCCCCAATTTCGCCATCTTCC；
(3)A体系先进行孵育，然后与B体系迅速进行混合，孵育扩增，终止反应后得到扩增产物；
(4)将扩增产物、酶活缓冲液和氯高铁血红素稀释溶液混匀并反应，形成G-四链体结构；
(5)向步骤(4)混合液中加入显色液，混匀并反应，反应结束后加入H2SO4，测定OD450值，得到OD450值随铬离子浓度变化的标准曲线。
步骤(1)的操作为：将铬离子脱氧核酶底物链和酶链用缓冲液稀释，95℃加热15min，然后缓慢降至25℃；加入待测铬离子溶液，25℃孵育6min，加入终止液，得到铬离子脱氧核酶切割产物。
步骤(3)的操作为：A体系于55℃孵育5min，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min，95℃保持10min以终止反应。
步骤(4)中反应温度为37℃，反应时间为30min；步骤(5)中反应温度为37℃，反应时间为10min。
一种检测铬离子的试剂盒，包括铬离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显示体系；
所述铬离子脱氧核酶体系包括底物链、酶链、缓冲液、铬离子标准溶液和终止液；
所述等温扩增体系包括扩增模板、dNTPs、超纯水、Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和切刻内切酶反应缓冲溶液；
所述显示体系包括：氯高铁血红素、酶活缓冲液、TMB显色剂和2MH2SO4；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：GTCACGAGTCACTATrAGGAAGATGGCGAAATTGGGGGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CAGTGCTCAGTGATATTGCTCATTTTTGAGCGTGGGTGGAAACTGGATACCGCTTT；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCACACCCACCCACAATGACCCACAACTGACTCCCCCCCAATTTCGCCATCTTCC。
所述缓冲液为终浓度25mMNaCl，50mM MES，pH 6.0；所述终止液为0.2M EDTA，2MNaCl，0.5M Tris；所述酶活缓冲液的配方为：100mM Tris，120mM NaCl，10mM MgCl2，100mMKCl，pH8.4。
利用所述的试剂盒检测铬离子的方法，包括如下步骤：
(1)制备铬离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线
将铬离子脱氧核酶的4μL底物链和4μL酶链用缓冲液稀释至35μL，95℃加热15min，然后缓慢降至25℃，加入5μL不同浓度铬离子溶液，25℃孵育6min，加入5μL终止液，制备铬离子脱氧核酶切割产物；
将6μL 1μM的扩增模板，3μL 2.5mM的dNTPs，6μL 1μM的铬离子脱氧核酶切割产物和9.2μL的超纯水混合均匀，制备A体系；将0.1μL 8U/μL的Bst DNA聚合酶，3μL 10×的聚合酶反应缓冲溶液，1.2μL 10U/μL的Nt.BstNBI切刻内切酶和1.5μL 10×的Nt.BstNBI切刻内切酶的反应缓冲溶液混合均匀，制备B体系；
A体系于55℃孵育5min，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min，95℃保持10min以终止反应，得到扩增产物；
将10μL扩增产物，80μL酶活缓冲液和10μL氯高铁血红素稀释溶液混匀，并于37℃反应30min，形成G-四链体结构；
所述氯高铁血红素稀释溶液按照2μL氯高铁血红素原液与1mL酶活缓冲液混合得到；
加入50μL TMB显色液，混匀并于37℃反应10min，反应结束后加入50μL2MH2SO4，酶标仪测定OD450，得到OD450值随铬离子浓度变化的标准曲线；
(2)按上述制备标准曲线的过程进行待测样品的检测，通过上述标准曲线计算铬离子的浓度。
一种铬离子脱氧核酶，所述铬离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：GTCACGAGTCACTATrAGGAAGATGGCGAAATTGGGGGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CAGTGCTCAGTGATATTGCTCATTTTTGAGCGTGGGTGGAAACTGGATACCGCTTT。
本发明的有益效果为：
1、本发明的传感器及铬离子检测方法基于铬离子脱氧核酶由底物链与酶链两条寡核苷酸链组成、形成特定的二级结构；痕量铬离子能够特异性识别铬离子脱氧核酶，结合脱氧核酶的酶链，并激活脱氧核酶，切割脱氧核酶的底物链；有且只有切割产物存在时，促发等温指数放大反应(EXPAR)，产生信号的一级放大和转化，并生成大量富含鸟嘌呤的寡核苷酸序列；该序列在氯高铁血红素诱导下形成G-四链体结构，催化过氧化氢与四甲基联苯胺显绿色，硫酸终止反应后显黄色，从而产生二级放大与转化，转化成可视化的信号，可以进行定性的判断。
2、经过两次信号的转化，通过手持式光谱检测仪就可以进行定量检测铬离子，并可用于环境中铬离子的现场检测，简便快速、灵敏度高、特异性高以及成本低。
3、本发明的传感器能够抵抗高盐浓度的干扰，实现高盐环境中铬离子的定性和定量分析，并保持较高的特异性和灵敏度。
附图说明
图1为铬离子脱氧核酶的制备及切割产物的验证，其中，Lane1-Marker；Lane2-阴性对照：脱氧核酶底物链；Lane3,4,5-阳性样品：在脱氧核酶底物链与脱氧核酶酶链的体系中分别均添加20nM的氯化铬。
图2为等温指数放大反应中扩增产物的变化图，其中，Lane1-Marker；Lane2-扩增模板；Lane 3-阳性样品；Lane4-阳性对照：扩增产物。
图3为OD450值随铬离子浓度的标准曲线。
具体实施方式
以下实施例便于更好地理解本发明。实施例中实验材料如无特殊说明均可通过商业途径获得，实验方法如无特殊说明均为常规方法。
本发明基于铬离子脱氧核酶、等温指数放大反应(EXPAR)和G-四链体液相传感技术，构建一种传感器。铬离子脱氧核酶由底物链与酶链两条寡核苷酸链组成、形成特定的二级结构；痕量铬离子能够特异性识别铬离子脱氧核酶，结合脱氧核酶的酶链，并激活脱氧核酶，切割脱氧核酶的底物链；有且只有切割产物存在时，促发EXPAR放大信号、并生成大量富含鸟嘌呤的寡核苷酸序列；该序列在氯高铁血红素诱导下形成G-四链体结构，发挥类辣根过氧化物酶(HRP)活性，催化过氧化氢与四甲基联苯胺显绿色，通过手持式光谱检测仪进行检测与定量。
实施例1：基于铬的功能核酸的传感器的构建方法
1、实验材料
一水吗啉乙磺酸(MES)，氯化钾，氯化钠，氯化镁，磷酸氢钾，乙二胺四乙酸二钠，硫酸，四甲基联苯胺，氯高铁血红素，氯化铬，尿素，Nt.BstNBI切刻内切酶，Bst DNA聚合酶等。
2、序列设计
设计并合成铬离子脱氧核酶底物链、脱氧核酶酶链和扩增模板。扩增模板中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列，序列前四个碱基对处(C和A之间)即是合成链切割位点。脱氧核酶底物链末端TTGGGGGG序列是为了增加与扩增模板结合Tm值而增加的；铬离子切割位点在脱氧核酶底物链A的rA之后。
3、构建方法
基于铬的功能核酸的传感器的构建方法，包括如下步骤：
(1)将4μL脱氧核酶底物链(10μM母液)与4μL脱氧核酶酶链(10μM母液)用缓冲液(终浓度为25mMNaCl and 50mM MES，pH 6.0)稀释至35μL，95℃加热15min，然后缓慢降至25℃，大约耗时45min。加入5μL待测铬离子溶液，形成40μL体系，25℃孵育6min，加入5μL终止液(浓度为0.2M EDTA，2M NaCl，0.5M Tris)，得到铬离子脱氧核酶切割产物。用20％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，结果如图1，证明铬离子脱氧核酶的制备与切割成功。
铬离子脱氧核酶切割产物的序列(5’-3’)为：GGAAGATGGCGAAATTGGGGGG。
(2)配制扩增反应体系
反应体系为30μL，由A部分和B部分组成。
A体系组成(24.2μL)
B体系组成(5.8μL)
本发明的“×”如无特殊限定，则为体积倍量。
本发明的“终浓度”无特殊限定，则为物质混合后的在总的反应体系的浓度。如1μM扩增模板母液6μL，终浓度为0.2μM，指的扩增模板在等温扩增体系中的浓度。
(3)A部分体系在55℃孵育5min后，然后与B部分体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min；95℃保持10min，以终止反应，得到扩增产物。放入-20℃备用。利用20％的聚丙烯酰胺凝胶电泳验证扩增产物的扩增，结果如图2。
扩增产物的序列(5’-3’)为：GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG
(4)将10μL扩增产物、80μL酶活缓冲液和10μL氯高铁血红素稀释溶液混匀，37℃反应30min，使扩增产物结合氯高铁血红素形成G-四链体结构；
酶活缓冲液：100mM Tris、120mM NaCl、10mM MgCl2、100mM KCl，pH8.4。
氯高铁血红素稀释溶液：2μL氯高铁血红素原液与1mL酶活缓冲液混合。
(5)向步骤(4)混合液中加入50μL TMB显色液，混匀，37℃反应10min，加入50μL 2MH2SO4，混匀，酶标仪测定OD450。
实施例2：铬离子的检测
铬离子浓度的检测，具体步骤如下：
(1)制备OD450随铬离子浓度变化的标准曲线
采用实施例1中3的构建方法，待测铬离子溶液为不同浓度氯化铬溶液(1M NaCl为溶解环境)，氯化铬浓度取0μM、0.01μM、0.025μM、0.05μM和0.08μM，制备OD450随铬离子浓度变化的标准曲线(图3)，标准曲线为y＝3.5406x+0.0344，R2＝0.9823。
(2)本实施例中待测铬离子溶液为氯化铬溶液(NaCl为溶解环境)
采用实施例1中3的构建方法，酶标仪测定待测铬离子溶液的OD450，代入标准曲线y＝3.5406x+0.0344，得到铬离子浓度。结果如表1。
表1
实施例3：一种检测铬离子的试剂盒
一种检测铬离子的试剂盒，包括铬离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显示体系；
铬离子脱氧核酶体系包括底物链、酶链、缓冲液、铬离子标准溶液和终止液；
等温扩增体系包括扩增模板、dNTPs、超纯水、Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和切刻内切酶反应缓冲溶液；
显示体系包括：氯高铁血红素、酶活缓冲液、TMB显色剂和2MH2SO4。
脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：GTCACGAGTCACTATrAGGAAGATGGCGAAATTGGGGGG；
脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CAGTGCTCAGTGATATTGCTCATTTTTGAGCGTGGGTGGAAACTGGATACCGCTTT；
扩增模板的序列(5’-3’)为：CCACACCCACCCACAATGACCCACAACTGACTCCCCCCCAATTTCGCCATCTTCC。
缓冲液为终浓度25mMNaCl，50mM MES，pH 6.0；
终止液为0.2M EDTA，2M NaCl，0.5M Tris；
酶活缓冲液的配方为：100mM Tris，120mM NaCl，10mM MgCl2，100mM KCl，pH8.4。
Bst DNA聚合酶反应缓冲液：20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,50mM KCl,2mMMgSO4,0.1％吐温20，0.1％牛血清白蛋白，pH 8.8；
Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲液：100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,300μg/ml海藻糖，pH 7.9。

Claims (10)

1.一种基于铬的功能核酸的传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，其特征在于，
所述分子识别元件包括铬离子脱氧核酶；所述铬离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；
所述信号放大元件包括等温扩增体系和氯高铁血红素，所述等温扩增体系包括扩增模板；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：GTCACGAGTCACTATrAGGAAGATGGCGAAATTGGGGGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CAGTGCTCAGTGATATTGCTCATTTTTGAGCGTGGGTGGAAACTGGATACCGCTTT；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCACACCCACCCACAATGACCCACAACTGACTCCCCCCCAATTTCGCCATCTTCC；
所述信号转换元件包括显色剂。
2.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述等温扩增体系包括A体系和B体系；
所述A体系包括：扩增模板、dNTPs和铬离子脱氧核酶切割产物；
所述B体系包括：Bst DNA聚合酶及其缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液。
3.根据权利要求1或2所述的传感器，其特征在于，所述信号转换元件还包括终止剂，优选的，所述终止剂为硫酸；所述显色剂为TMB显色剂。
4.一种检测铬离子的方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备铬离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线；
按上述制备标准曲线的过程测定待测样品的G-四链体功能核酸显色光密度值，通过上述标准曲线计算铬离子的浓度；
其中，制备标准曲线的步骤包括：
(1)在铬离子脱氧核酶的底物链和酶链中加入不同浓度铬离子溶液，制备铬离子脱氧核酶切割产物；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：GTCACGAGTCACTATrAGGAAGATGGCGAAATTGGGGGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CAGTGCTCAGTGATATTGCTCATTTTTGAGCGTGGGTGGAAACTGGATACCGCTTT；
(2)将扩增模板，dNTPs，铬离子脱氧核酶切割产物和超纯水混合均匀，制备A体系；将Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液，Nt.BstNBI切刻内切酶和切刻内切酶的反应缓冲溶液混合均匀，制备B体系；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCACACCCACCCACAATGACCCACAACTGACTCCCCCCCAATTTCGCCATCTTCC；
(3)A体系先进行孵育，然后与B体系迅速进行混合，孵育扩增，终止反应后得到扩增产物；
(4)将扩增产物、酶活缓冲液和氯高铁血红素稀释溶液混匀并反应，形成G-四链体结构；
(5)向步骤(4)混合液中加入显色液，混匀并反应，反应结束后加入H2SO4，测定OD450值，得到OD450值随铬离子浓度变化的标准曲线。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)的操作为：将铬离子脱氧核酶底物链和酶链用缓冲液稀释，95℃加热15min，然后缓慢降至25℃；加入待测铬离子溶液，25℃孵育6min，加入终止液，得到铬离子脱氧核酶切割产物。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)的操作为：A体系于55℃孵育5min，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min，95℃保持10min以终止反应。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)中反应温度为37℃，反应时间为30min；步骤(5)中反应温度为37℃，反应时间为10min。
8.一种检测铬离子的试剂盒，其特征在于，包括铬离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显示体系；
所述铬离子脱氧核酶体系包括底物链、酶链、缓冲液、铬离子标准溶液和终止液；
所述等温扩增体系包括扩增模板、dNTPs、超纯水、Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和切刻内切酶反应缓冲溶液；
所述显示体系包括：氯高铁血红素、酶活缓冲液、TMB显色剂和2MH2SO4；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：GTCACGAGTCACTATrAGGAAGATGGCGAAATTGGGGGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CAGTGCTCAGTGATATTGCTCATTTTTGAGCGTGGGTGGAAACTGGATACCGCTTT；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCACACCCACCCACAATGACCCACAACTGACTCCCCCCCAATTTCGCCATCTTCC。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为终浓度25mMNaCl，50mMMES，pH 6.0；所述终止液为0.2M EDTA，2M NaCl，0.5M Tris；所述酶活缓冲液的配方为：100mM Tris，120mM NaCl，10mM MgCl2，100mM KCl，pH8.4。
10.一种铬离子脱氧核酶，其特征在于，所述铬离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：GTCACGAGTCACTATrAGGAAGATGGCGAAATTGGGGGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CAGTGCTCAGTGATATTGCTCATTTTTGAGCGTGGGTGGAAACTGGATACCGCTTT。
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