CN112391450A - 一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法 - Google Patents

一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，包括SEA‑PCRDNA或RNA检测法，以及SEA‑ITA恒温扩增DNA或RNA样品检测法；本发明建立SEA‑PCR检测和SEA‑ITA恒温扩增检测法，通过修饰底物dNTPαSe或dNTPαS，抑制了检测过程中非特异性产物的产生，增加了反应的特异性、灵敏度、抗干扰性和准确性，简化了引物的设计和实验条件的优化，建立了高效的扩增反应，通过特异性的提高，抑制了检测体系的非特异性扩增，尤其在低浓度核酸DNA或RNA靶标分子的情况下，提高了检测的灵敏度和准确性，从而在临床DNA或RNA样品检测上减少了假阳性率和假阴性率，增加了检测结果的可信度。

Description

一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法
技术领域
本发明涉及核酸检测方法领域，尤其涉及一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法。
背景技术
核酸检测是诊断传染病、遗传病和肿瘤等疾病的重要手段，如新冠病毒的检测和诊断，核酸检测方法主要有两大类：一类是传统基于变温的的聚合酶链式反应(PCR)，作为核酸检测的标准方法，其具有灵敏和准确的特点，另一类是反应温度恒定的等温扩增技术(Isothermal Amplification,ITA)，与PCR方法相比，它操作步骤简单，仪器便宜，不需要专业人员，不需要特殊设计检测场所，特别适合即时快速现场检测(point-of-caretesting,POCT)，也适合于经济条件差地区，因此近年来也受到高度关注。
为了有效实施聚合酶链式反应检测特定目标序列，引物序列的设计和反应条件的优化都是非常必要但又很繁琐的工作，而这些优化经常不能得到特异性的聚合酶链式反应扩增，从而导致经过多个循环后，PCR经常产生大量非特异性的DNA片段，进而降低了反应的扩增效率，现有的提高PCR反应特异性和稳定性的方法非常耗时耗力，而且当PCR反应涉及到多对引物时，如多重PCR，这些策略难以改善PCR反应特异性。而对于恒温扩增来说，因为没有温度辅助的准确退火配对过程，通常引物浓度较高，其扩增常常出现非特异性，无法很好地应用到临床检测中，因此，本发明提出一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法以解决现有技术中存在的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提出一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏DNA或RNA核酸检测方法，该方法建立SEA-PCR[Se-enhanced specific amplification-PCR(硒增强的PCR，简称硒PCR)或者S-enhanced specific amplification-PCR(硫增强的PCR，简称硫PCR)]和SEA-ITA恒温扩增[Se-enhanced specific isothermalamplification(硒增强的ITA，简称硒ITA)或者S-enhanced specific isothermalamplification(硫增强的ITA,简称硫ITA)]的检测方法，即是SEA-PCR检测法(变温策略)和SEA-ITA恒温扩增检测法(恒温策略；例如，环介导等温扩增反应，Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)；通过修饰底物dNTPαSe或者dNTPαS，抑制了检测过程中非特异性产物的产生，增加了反应的特异性、灵敏度、抗干扰性和准确性，简化了引物的设计和实验条件的优化；两类修饰底物dNTPαSe和dNTPαS可分别使用于DNA聚合反应(即单类独立使用)，也可以两类以任何方式混合使用于DNA聚合反应(包括RNA反转录)；本发明建立了高效的扩增反应，通过特异性的提高，抑制了低浓度模板下的非特异性扩增，提高了检测的灵敏度和准确性，从而在临床样品检测上减少了假阳性率和假阴性率，增加了检测结果的可信度。而且在ITA技术中，由于修饰底物提高了聚合反应特异性，故SEA-ITA可以在一定反应温度范围下进行，使其可以更好地应用到临床检测中。对DNA样品的检测可以通过DNA聚合酶的催化直接进行。然而，对RNA核酸样品的检测可以通过使用RNA反转录酶(也是一种DNA聚合酶)，来对RNA进行反转录，然后对得到的DNA进行放大检测。
为了实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案实现：一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，包括变温策略检测法和恒温策略检测法。
进一步改进在于：所述变温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
用dATPαSe、dCTPαSe、dGTPαSe、dTTPαSe、dUTPαSe和dATPαS、dCTPαS、dGTPαS、dTTPαS、dUTPαS其中的一种或多种，彻底或部分取代与之碱基相同的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA核酸检测反应体系
将PCR缓冲液、至少一个DNA聚合酶[例如DNA聚合酶和RNA反转录酶(也是一种DNA聚合酶)]、至少一个正向引物、至少一个反向引物、至少一个分子探针或至少一个核酸荧光染料、dNTP混合物、核酸靶标分子(待检核酸：DNA或RNA)配置成SEA-PCR反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应及产物分析
先将配置好的SEA-PCR反应体系放置于PCR仪，最后进行核酸扩增结果的分析。
进一步改进在于：所述恒温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
用dATPαSe、dCTPαSe、dGTPαSe、dTTPαSe、dUTPαSe和dATPαS、dCTPαS、dGTPαS、dTTPαS、dUTPαS其中的一种或多种，彻底或部分取代与之碱基相同的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA-ITA恒温扩增反应体系(例如，环介导等温扩增反应，Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)
将扩增缓冲液、至少一个引物(混合物)、至少一个分子探针或至少一个核酸荧光染料、dNTP混合物、至少一种DNA聚合酶[例如DNA聚合酶和RNA反转录酶(也是一种DNA聚合酶)]、核酸靶标分子(待检核酸：DNA或RNA)配置成反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应产物分析
先将配置好的反应体系放置于恒温仪中，接着在恒温环境下孵育1-600分钟，最后进行核酸扩增结果的分析。
进一步改进在于：所述变温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
用一种特定的dNTPαSe(或者dNTPαS)取代与之碱基相同的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA核酸检测反应体系
将PCR缓冲液、至少一个DNA聚合酶[例如DNA聚合酶和RNA反转录酶(也是一种DNA聚合酶)]、至少一个正向引物、至少一个反向引物、至少一个分子探针或至少一个核酸荧光染料、dNTP混合物、核酸靶标分子(待检核酸：DNA或RNA)配置成SEA-PCR反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应及产物分析
先将配置好的SEA-PCR反应体系放置于PCR仪，最后进行核酸扩增结果的分析。
进一步改进在于：所述变温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
用两种特定的dNTPαSe(或者dNTPαS)取代与它们碱基相同的dATP、dCTP、dGTP或dTTP，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA-PCR反应体系(变温策略)
将PCR缓冲液、至少一个DNA聚合酶、至少一个正向引物、至少一个反向引物、至少一个分子探针或至少一个核酸荧光染料、dNTP混合物、核酸DNA或RNA靶标分子，配置成SEA-PCR反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应及产物分析
先将配置好的SEA-PCR反应体系放置于PCR仪，最后进行核酸扩增结果的各种分析。
进一步改进在于：所述变温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
用三种特定的dNTPαSe(或者dNTPαS)取代与它们碱基相同的dATP、dCTP、dGTP或dTTP，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA-PCR反应体系(变温策略)
将PCR缓冲液、至少一个DNA聚合酶、至少一个正向引物、至少一个反向引物、至少一个分子探针或至少一个核酸荧光染料、dNTP混合物、核酸靶标分子(待检核酸：DNA或RNA)配置成SEA-PCR反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应及产物分析
先将配置好的SEA-PCR反应体系放置于PCR仪，最后进行核酸扩增结果的各种分析。
进一步改进在于：所述变温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
将dATPαSe、dCTPαSe、dGTPαSe和dTTPαSe(或者dATPαS、dCTPαS、dGTPαS和dTTPαS)按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA-PCR反应体系(变温策略)
将PCR缓冲液、至少一个DNA聚合酶、至少一个正向引物、至少一个反向引物、至少一个分子探针或至少一个核酸染料、dNTP混合物、核酸靶标分子(待检核酸：DNA或RNA)配置成SEA-PCR反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应及产物分析
先将配置好的SEA-PCR反应体系放置于PCR仪，最后进行核酸扩增结果的各种分析。
进一步改进在于：所述变温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
在dATP、dCTP、dGTP和dTTP四种底物中，额外加入一种特定的dNTPαSe(或者dNTPαS)，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA-PCR反应体系(变温策略)
将PCR缓冲液、至少一个DNA聚合酶、至少一个正向引物、至少一个反向引物、至少一个分子探针或至少一个核酸荧光染料、dNTP混合物、核酸靶标分子(待检核酸：DNA或RNA)配置成SEA-PCR反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应及产物分析
先将配置好的SEA-PCR反应体系放置于PCR仪，最后进行核酸扩增结果的各种分析。
进一步改进在于：所述变温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
在dATP、dCTP、dGTP和dTTP四种底物中，额外加入两种特定的dNTPαSe(或者dNTPαS)，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA-PCR反应体系(变温策略)
将PCR缓冲液、至少一个DNA聚合酶、至少一个正向引物、至少一个反向引物、至少一个分子探针或至少一个核酸荧光染料、dNTP混合物、核酸靶标分子(待检核酸：DNA或RNA)配置成SEA-PCR反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应及产物分析
先将配置好的SEA-PCR反应体系放置于PCR仪，最后进行核酸扩增结果的各种分析。
进一步改进在于：所述变温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
在dATP、dCTP、dGTP和dTTP四种底物中，额外加入三种特定的dNTPαSe(或者dNTPαS)，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA-PCR反应体系(变温策略)
将PCR缓冲液、至少一个DNA聚合酶、至少一个正向引物、至少一个反向引物、至少一个分子探针或至少一个核酸荧光染料、dNTP混合物、核酸靶标分子(待检核酸：DNA或RNA)配置成SEA-PCR反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应及产物分析
先将配置好的SEA-PCR反应体系放置于PCR仪，最后进行核酸扩增结果的各种分析。
进一步改进在于：所述变温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
在dATP、dCTP、dGTP和dTTP四种底物中，额外加入四种特定的dNTPαSe(或者dNTPαS)，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA-PCR反应体系(变温策略)
将PCR缓冲液、至少一个DNA聚合酶、至少一个正向引物、至少一个反向引物、至少一个分子探针或至少一个核酸荧光染料、dNTP混合物、核酸靶标分子(待检核酸：DNA或RNA)配置成SEA-PCR反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应及产物分析
先将配置好的SEA-PCR反应体系放置于PCR仪，最后进行核酸扩增结果的各种分析。
进一步改进在于：所述恒温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
用一种特定的dNTPαSe(或者dNTPαS)取代与之碱基相同的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA-ITA恒温扩增反应体系(例如，环介导等温扩增反应，Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)
将扩增缓冲液、至少一个引物(混合物)、至少一个分子探针或至少一个核酸荧光染料、dNTP混合物、至少一种DNA聚合酶[例如DNA聚合酶和RNA反转录酶(也是一种DNA聚合酶)]、核酸靶标分子(待检核酸：DNA或RNA)配置成反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应产物分析
先将配置好的反应体系放置于恒温仪中，接着在恒温环境下孵育1-600分钟，最后进行核酸扩增结果的分析。
进一步改进在于：所述恒温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
用两种特定的dNTPαSe(或者dNTPαS)取代与它们碱基相同的dATP、dCTP、dGTP或dTTP，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA-ITA恒温扩增反应体系(恒温策略)
将扩增缓冲液、至少一个引物(混合物)、至少一个分子探针或至少一个核酸荧光染料、dNTP混合物、至少一种DNA聚合酶、核酸靶标分子(待检核酸：DNA或RNA)配置成反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应产物分析
先将配置好的反应体系放置于恒温仪中，接着在恒温环境下孵育1-600分钟，最后进行核酸扩增结果的各种分析。
进一步改进在于：所述恒温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
用三种特定的dNTPαSe(或者dNTPαS)取代与它们碱基相同的dATP、dCTP、dGTP或dTTP，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA-ITA恒温扩增反应体系(例如，环介导等温扩增反应，Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)
将扩增缓冲液、引物混合物、至少一个分子探针或至少一个核酸荧光染料、dNTP混合物、至少一种DNA聚合酶、核酸靶标分子(待检核酸：DNA或RNA)配置成反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应产物分析
先将配置好的反应体系放置于恒温仪中，接着在恒温环境下孵育1-600分钟，最后进行核酸扩增结果的各种分析。
进一步改进在于：所述恒温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
将dATPαSe、dCTPαSe、dGTPαSe和dTTPαSe(或者dATPαS、dCTPαS、dGTPαS和dTTPαS)按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA-ITA恒温扩增反应体系(恒温策略)
将扩增缓冲液、引物混合物、至少一个分子探针或至少一个核酸荧光染料、dNTP混合物、至少一种DNA聚合酶、核酸靶标分子(待检核酸：DNA或RNA)配置成反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应产物分析
先将配置好的反应体系放置于恒温仪中，接着在恒温环境下孵育1-600分钟，最后进行核酸扩增结果的各种分析。
进一步改进在于：所述恒温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
在dATP、dCTP、dGTP和dTTP四种底物中，额外加入一种特定的dNTPαSe(或者dNTPαS)，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA-ITA恒温扩增反应体系(恒温策略)
将扩增缓冲液、引物混合物、至少一个分子探针或至少一个核酸荧光染料、dNTP混合物、至少一种DNA聚合酶、核酸靶标分子(待检核酸：DNA或RNA)配置成反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应产物分析
先将配置好的反应体系放置于恒温仪中，接着在恒温环境下孵育1-600分钟，最后进行核酸扩增结果的各种分析。
进一步改进在于：所述恒温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
在dATP、dCTP、dGTP和dTTP四种底物中，额外加入两种特定的dNTPαSe(或者dNTPαS)，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA-ITA恒温扩增反应体系(恒温策略)
将扩增缓冲液、引物混合物、至少一个分子探针或至少一个核酸荧光染料、dNTP混合物、至少一种DNA聚合酶、核酸靶标分子(待检核酸：DNA或RNA)配置成反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应产物分析
先将配置好的反应体系放置于恒温仪中，接着在恒温环境下孵育1-600分钟，最后进行核酸扩增结果的各种分析。
进一步改进在于：所述恒温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
在dATP、dCTP、dGTP和dTTP四种底物中，额外加入三种特定的dNTPαSe(或者dNTPαS)，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA-ITA恒温扩增反应体系(恒温策略)
将扩增缓冲液、引物混合物、至少一个分子探针或至少一个核酸荧光染料、dNTP混合物、至少一种DNA聚合酶、核酸靶标分子(待检核酸：DNA或RNA)配置成反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应产物分析
先将配置好的反应体系放置于恒温仪中，接着在恒温环境下孵育1-600分钟，最后进行核酸扩增结果的各种分析。
进一步改进在于：所述恒温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
在dATP、dCTP、dGTP和dTTP四种底物中，额外加入四种特定的dNTPαSe(或者dNTPαS)，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA-ITA恒温扩增反应体系(恒温策略)
将扩增缓冲液、引物混合物、至少一个分子探针或至少一个核酸荧光染料、dNTP混合物、至少一种DNA聚合酶、核酸靶标分子(待检核酸：DNA或RNA)配置成反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应产物分析
先将配置好的反应体系放置于恒温仪中，接着在恒温环境下孵育1-600分钟，最后进行核酸扩增结果的各种分析。
进一步改进在于：所述变温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
将dATPαSe、dCTPαSe、dGTPαSe、dTTPαSe四种dNTP，或者dATPαS、dCTPαS、dGTPαS、dTTPαS四种dNTP按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA-PCR变温扩增反应体系(变温策略)
将混合有缓冲液、SYBR Green I染料和DNA聚合酶的混合液与正向引物、反向引物、dNTP混合物、待测DNA配置成SEA-PCR反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应产物分析
将配置好的SEA-PCR反应体系放置于荧光PCR仪，接着在SYBR GREEN I通道采集荧光信号，再将反应产物在2％的琼脂糖凝胶中电泳并分析，最后通过分析得出检测结果。
进一步改进在于：所述变温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
将dATPαSe、dCTPαSe、dGTPαSe、dTTPαSe四种dNTP，或者dATPαS、dCTPαS、dGTPαS、dTTPαS四种dNTP按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA-PCR变温扩增反应体系(变温策略)
将混合有缓冲液、SYBR Green I染料、DNA聚合酶和RNA反转录酶的混合液与正向引物、反向引物、dNTP混合物、待测RNA配置成SEA-PCR反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应产物分析
将配置好的SEA-PCR反应体系放置于荧光PCR仪，接着在SYBR GREEN I通道采集荧光信号，再将反应产物在2％的琼脂糖凝胶中电泳并分析，最后通过分析得出检测结果。
进一步改进在于：所述恒温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
将dATPαSe、dCTPαSe、dGTPαSe、dTTPαSe四种dNTP，或者dATPαS、dCTPαS、dGTPαS、dTTPαS四种dNTP按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA-ITA恒温扩增反应体系(恒温策略；例如，环介导等温扩增反应，Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)
将混合有缓冲液、SYBR Green I染料、DNA聚合酶与正向引物、反向引物、dNTP混合物、待测DNA配置成SEA-LAMP反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应产物分析
将配置好的SEA-LAMP反应体系放置于荧光恒温仪，接着在SYBR GREEN I通道采集荧光信号，分析核酸检测结果。
进一步改进在于：所述恒温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先按照LAMP扩增原理和待测靶分子序列进行引物设计并合成，并配置成固定浓度的引物混合物，所述引物混合物包括0.1-100microM的正向内部引物、0.1-100microM的反向内部引物、0.1-100microM的正向外部引物和0.1-100microM的反向外部引物；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
在dATP、dCTP、dGTP和dTTP四种底物中，额外加入四种特定的dNTPαSe(或者dNTPαS)，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA-ITA恒温扩增反应体系(恒温策略；例如，环介导等温扩增反应，Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)
将扩增缓冲液、引物混合物、dNTP混合物、DNA聚合酶和RNA反转录酶混合液和待测RNA核酸样品配置成反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应产物分析
先将配置好的SEA-LAMP反应体系放置于荧光恒温仪中，接着在10-98℃恒温环境下孵育1-600分钟，并实时监测反应体系的荧光变化，然后SEA-LAMP对待测靶分子进行扩增，之后将扩增产物进行凝胶电泳分析，最后通过分析得出检测结果。
本发明的有益效果为：本发明建立SEA-PCR和SEA-ITA的核酸检测方法，通过修饰底物dNTPαSe或dNTPαS，抑制了检测过程中非特异性产物的产生，增加了反应的特异性，建立了高特异性的扩增反应，再通过特异性的提高，抑制了检测体系的非特异性扩增，尤其在低浓度DNA或RNA核酸靶标分子的情况下，特高了检测的灵敏度，从而在临床样品检测上减少了假阳性率和假阴性率，而在ITA技术中，由于修饰底物提高了聚合反应特异性，故SEA-ITA可以在一定反应温度范围下进行，使其可以很好地应用到临床检测中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的SEA-PCR检测法流程图；
图2.是本发明的硒原子修饰dNTPs为底物的高特异性PCR示意图。
图中：A和B分别是dNTPαSe取代策略和额外补加策略。A，每一种dNTPαSe分别取代其相应的天然的dNTPs反应底物。B，四种dNTPαSe额外补加到含天然dNTPs的PCR反应中。C，dNTPαSe取代策略(dNTPαSe是dCTPαSe，除了LATaq用dATPαSe和dCTPαSeA之外)，以改善高保真聚合酶的PCR反应特异性。
图3是本发明的SEA-PCR简化反应组分优化图；
图中：A，不同浓度的PCR引物，从左至有引物浓度依次为0.1,0.2,0.3,0.4,0.6,0.8,1.0microM。B，不同组分浓度(包括引物，模板，Taq DNA聚合酶以及反应底物dNTPs)的PCR反应。特异性产物已用箭头标出。
图4是本发明的SEA-PCR简化反应温度条件优化示意图；
图中：(A)和(B)，不同退火温度(Ta)和延伸温度(Te)对以天然dNTPs为反应底物的PCR反应特异性的影响；(C)和(D)，不同Ta和Te对以四种天然dNTPs和dNTPαSe(比例为1:1)为反应底物的PCR反应特异性的影响。特异性产物已用箭头标出。
图5是本发明的SEA-PCR简化引物设计示意图；
图中：“N”表示以天然dNTPs为反应底物的PCR反应，“Se”表示以dCTPαSe和其他三种天然dNTPs为反应底物的PCR反应。在完全以天然dNTPs为底物的PCR反应中，20对引物中仅有6对引物能特异性扩增目的片段，即引物成功率为30％。然而存在dCTPαSe的PCR反应中，20对引物中有19对能够特异性扩增目的片段，即引物成功率达到了95％。
图6是本发明的SEA-PCR简化多重PCR实验建立示意图；
图中：以dCTPαSe和其他三种天然dNTPs为反应底物的多重PCR。A，5,10,15重PCR反应；B，20和25重PCR反应。
图7是本发明的SEA-PCR改善PCR检测HPV病毒的灵敏度示意图；
图中：(A)qPCR扩增曲线；反应检测到单个数量级的靶标分子。(B)在qPCR反应(SYBR Green I为染料分子)中ΔCt和病毒DNA拷贝数的关系；ΔCt是qPCR反应中背景组和样本组之间Ct值(qPCR反应中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数)的差异；ΔCt<1是指阴性结果。(C)在图A中的反应产物的高分辨率溶解曲线；(D)在图A中的反应产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
图8是本发明的SEA-PCR用于提高通用试剂盒检测COVID-19灵敏度的示意图；
图中：在背景人RNA存在的情况下，展示RT-qPCR商品化试剂盒(SYBR Green I法)检测病毒RNA；ΔCt是不同背景和样品PCR Ct值差异；ΔCt<1被定义为负的检测结果。(A)在RT-qPCR中ΔCt和病毒RNA拷贝数的关系；结果表明，dNTPαS的灵敏度大约是标准dNTP的50倍；(B)A中反应的扩增曲线；(C)和(D)对A中相应反应产物进行高分辨率熔解曲线分析，分别含有补加的H2O和dNTP和dNTPαS；(E)C、D中反应产物琼脂糖凝胶分析。
图9是本发明的SEA-PCR用于提高COVID-19检测试剂盒灵敏度的示意图；
图中：反应中包括背景人总RNA。(A)在基于TaqMan探针的一步RT-qPCR检测病毒N基因中，ΔCt和病毒RNA拷贝数之间的关系；(B)A中反应的扩增及检测曲线；(C)检测临床样本(COVID-19RNA病毒)。
图10是本发明的SEA-ITA检测法流程图；
图11是本发明的SEA-LAMP在高浓度背景DNA的情况下扩增检测HPV病毒的示意图；
图中：(A)实时荧光扩增曲线图。即使在含有高浓度背景DNA的情况下，其阳性对照仍然扩增良好，其阴性对照仍然在120分钟内无明显扩增。(B)将图A中的扩增产物进行凝胶电泳分析，可见阳性对照呈现为阶梯样的特异性扩增产物，阴性对照无明显扩增产物。
图12是本发明的检测HPV病毒SEA-LAMP的灵敏度示意图；
图中：(A)无背景DNA的情况下，传统LAMP的灵敏度。(B)无背景DNA的情况下，SEA-LAMP的灵敏度。(C)有背景DNA的情况下，传统LAMP的灵敏度。(D)有背景DNA的情况下，SEA-LAMP的灵敏度。
图13是本发明的SEA-LAMP检测COVID-19病毒RNA示意图.
图中：(A)通过使用Bst 3.0DNA聚合酶(具有逆转录酶活性),SEA-LAMP能高效地一步法检测RNA.(B)SEA-LAMP检测COVID-19RNA(5,10,100and 1000copies，含有10ng的人源背景RNA。(C)SEA-LAMP检测COVID-19RNA。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下，所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
实施例一(SEA-PCR增加反应特异性)
参见图1、2，本实施例提供了一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子通过在线软件对引物进行设计，设计的引物包括正向引物和反向引物，再根据引物的设计合成出引物，并采用dd H2O将合成的引物配置成10microM的使用浓度；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
先将dATP、dTTP、dCTP和dGTP按规定浓度混合成dNTP混合物，再将dATPαSe、dTTPαSe、dCTPαSe和dGTPαSe按规定浓度配制成dNTPαSe混合物，接着根据试验需要向反应中加入规定量的dNTP混合物和dNTPαSe混合物，所述dNTP混合物中dATP、dTTP、dCTP和dGTP的终浓度均为2.5mM，所述dNTPαSe混合物中dATPαSe、dTTPαSe、dCTPαSe和dGTPαSe的终浓度为2.5mM；
步骤三：配置SEA-PCR反应体系
将不同DNA聚合酶及其对应的缓冲液、正向引物、反向引物、模板DNA、dNTP混合物和dNTPαSe混合物配置成SEA-PCR反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照，所述SEA-PCR反应体系中的正向引物为0.2microM、反向引物为0.2microM、dNTP混合物和dNTPαSe混合物均为200microM；
步骤四：反应及产物分析
先将配置好的SEA-PCR反应体系放置于PCR仪进行反应，再将反应产物在琼脂糖凝胶中电泳并分析，最后通过分析得出检测结果，PCR循环参数设置为DNA在94℃下预变性3分钟，之后是30个循环反应，所述循环反应包括94℃预变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒或者150秒，最后是72℃终延伸5分钟。
实施例二(SEA-PCR简化引物设计和反应条件优化)
参见图1、3、4、5、6，本实施例提供了一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子通过在线软件对引物进行设计，设计的引物包括正向引物和反向引物，再根据引物的设计合成出引物，并采用dd H2O将合成的引物配置成10microM的使用浓度；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
先将dATP、dTTP、dCTP和dGTP按规定浓度混合成dNTP混合物，再将dATPαSe、dTTPαSe、dCTPαSe和dGTPαSe按规定浓度配制成dNTPαSe混合物，接着根据试验需要向反应中加入规定量的dNTP混合物和dNTPαSe混合物，所述dNTP混合物中dATP、dTTP、dCTP和dGTP的终浓度均为2.5mM，所述dNTPαSe混合物中dATPαSe、dTTPαSe、dCTPαSe和dGTPαSe的终浓度为2.5mM；
步骤三：配置SEA-PCR反应体系
将Taq缓冲液、DNA聚合酶、正向引物、反向引物、模板DNA、dNTP混合物和dNTPαSe混合物配置成SEA-PCR反应体系；
步骤四：反应及产物分析
先将配置好的SEA-PCR反应体系放置于PCR仪进行反应，再将反应产物在琼脂糖凝胶中电泳并分析，最后通过分析得出检测结果，PCR循环参数设置为DNA在94℃下预变性3分钟，之后是30个循环反应，所述循环反应包括94℃预变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒或者150秒，最后是72℃终延伸5分钟。
实施例三(以硒修饰SEA-PCR检测HPV16-DNA为例)
参见图1、7，本实施例提供了一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子通过在线软件对引物进行设计，设计的引物包括正向引物和反向引物，再根据引物的设计合成出引物，并采用dd H2O将合成的引物配置成10microM的使用浓度，；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
先将dATP、dTTP、dCTP和dGTP按规定浓度混合成dNTP混合物，再将dATPαSe、dTTPαSe、dCTPαSe和dGTPαSe按规定浓度配制成dNTPαSe混合物，接着根据试验需要向反应中加入规定量的dNTP混合物和dNTPαSe混合物，所述dNTP混合物中dATP、dTTP、dCTP和dGTP的终浓度均为2.5mM，所述dNTPαSe混合物中dATPαSe、dTTPαSe、dCTPαSe和dGTPαSe的终浓度为2.5mM；
步骤三：配置SEA-PCR反应体系
将TB GreenTMPremix Ex TaqTMII、正向引物、反向引物、dNTP混合物和dNTPαSe混合物配置成SEA-PCR反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照，所述SEA-PCR反应体系中的TB GreenTMPremix Ex TaqTMII为10μL、正向引物为0.4μL、反向引物为0.4μL、dNTP混合物和dNTPαSe混合物均为1.6μL；
步骤四：反应及产物分析
先将配置好的SEA-PCR反应体系放置于荧光PCR仪，接着在SYBR GREEN I通道采集荧光信号，再将反应产物在2％的琼脂糖凝胶中电泳并分析，最后通过分析得出检测结果，采集荧光信号的过程中PCR循环参数设置为DNA在95℃下预变性30秒，之后是40个循环反应，所述循环反应包括95℃预变性5秒，56℃退火20秒，72℃延伸20秒并采集荧光信号。
实施例四(以硫修饰SEA-PCR改进通用RT-PCR试剂盒的检测COVID-19灵敏度为例)
参见图1、8，本实施例提供了一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测靶分子通过在线软件对引物进行设计，设计的引物包括正向引物和反向引物，再根据引物的设计合成出引物，并采用dd H2O将合成的引物配置成10microM的使用浓度；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
先将dATP、dTTP、dCTP和dGTP按规定浓度混合成dNTP混合物，再将dATPαS、dTTPαS、dCTPαS和dGTPαS按规定浓度配制成dNTPαS混合物，接着根据试验需要向反应中加入规定量的dNTP混合物和dNTPαSe混合物，所述dNTP混合物中dATP、dTTP、dCTP和dGTP的终浓度均为2.5mM，所述dNTPαSe混合物中dATPαS、dTTPαS、dCTPαS和dGTPαS的终浓度为2.5mM；
步骤三：配置SEA-PCR反应体系
将One Step TB
Figure BDA0002788905570000291
PrimeScriptTM RT-PCR Kit(SYBR Green I,宝日医生物技术有限公司)、正向引物、反向引物、dNTP混合物和dNTPαSe混合物配置成SEA-PCR反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照，所述SEA-PCR反应体系中的2X One Step TB-GreenRT-PCR BufferⅢ为10μL、TaKaRa Ex TaqHS为0.4μL、PrimeScriptRT Enzyme MixⅡ为0.4μL、正向引物为0.4μL、反向引物为0.4μL、dNTP混合物或dNTPαSe混合物1.6μL，模板RNA 1μL；
步骤四：反应及产物分析
先将配置好的SEA-PCR反应体系放置于荧光PCR仪，接着在SYBR GREEN I通道采集荧光信号，再将反应产物在2％的琼脂糖凝胶中电泳并分析，最后通过分析得出检测结果，采集荧光信号的过程中PCR循环参数设置为42℃逆转录孵育5分钟，95℃初始变性10秒，之后是40个循环反应，所述循环反应包括95℃预变性5秒，60℃延伸45秒并采集荧光信号。之后是高分辨率溶解分析:95℃,60秒,40℃ 60秒,65℃ 1秒,熔解从65℃到97℃ 0.07℃/秒的斜率和15次/秒的检测频率。然后对产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
实施例五(以硫修饰SEA-PCR改进新冠检测试剂盒的检测灵敏度为例)
参见图1、9，本实施例提供了一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：配置脱氧核苷三磷酸混合物
先将dATP、dTTP、dCTP和dGTP按规定浓度混合成dNTP混合物，再将dATPαS、dTTPαS、dCTPαS和dGTPαS按规定浓度配制成dNTPαS混合物，接着根据试验需要向反应中加入规定量的dNTP混合物和dNTPαSe混合物，所述dNTP混合物中dATP、dTTP、dCTP和dGTP的终浓度均为2.5mM，所述dNTPαSe混合物中dATPαS、dTTPαS、dCTPαS和dGTPαS的终浓度为2.5mM；
步骤二：配置SEA-PCR反应体系
将市售的某种COVID-19检测试剂盒、正向引物、反向引物、dNTP混合物和dNTPαSe混合物配置成SEA-PCR反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照，所述SEA-PCR反应体系中试剂按照试剂盒说明书添加、然后添加dNTP混合物或dNTPαS混合物3.2μL，人总RNA(5ng/反应)和RNA样本(图4A，4B中为转录病毒RNA；图4C中为临床COVID-19样品)；
步骤三：反应及产物分析
先将配置好的SEA-PCR反应体系放置于荧光PCR仪，接着在VIC通道采集荧光信号，再将反应产物在2％的琼脂糖凝胶中电泳并分析，最后通过分析得出检测结果，采集荧光信号的过程中PCR循环参数设置为55℃逆转录孵育30分钟，95℃初始变性30秒，之后是45个循环反应，所述循环反应包括95℃预变性15秒，60℃延伸45秒并采集荧光信号。然后对产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
实施例六(以硒修饰SEA-LAMP检测HPV16-DNA为例)
参见图10、11、12，本实施例提供了一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物混合物
先按照LAMP扩增原理并针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物并配置成固定浓度的引物混合物，通过在线软件对待测靶分子进行引物设计，所述引物混合物包括16microM的正向内部引物、16microM的反向内部引物、2microM的正向外部引物和2microM的反向外部引物；
步骤二：配置混合物
将dATP、dTTP、dCTP、dGTP和dATPαSe、dTTPαSe、dCTPαSe、dGTPαSe按规定比例一一对应配置成混合物，其中dATP和dATPαSe的混合物、dTTP和dTTPαSe的混合物、dCTP和dCTPαSe的混合物以及dGTP和dGTPαSe的混合物的两种dNTP的浓度之和均为2.5mM；
步骤三：配置SEA-LAMP反应体系
将2×SEA-LAMP扩增缓冲液、引物混合物、Bst 2.0DNA聚合酶和样本DNA配置成SEA-LAMP反应体系，再补充dd H2O至20μL，并同时设置阳性对照和阴性对照，所述SEA-LAMP扩增缓冲液由40mM的Tris-HCl、20mM的(NH4)2SO4、100mM的KCl、16mM的MgSO4、1％的Tween20、2.5mM的dNTP/dNTPαSe混合物、1.6M的甜菜碱和2×SYBR Green I组成；
步骤四：反应及产物分析
先将配置好的SEA-LAMP反应体系放置于荧光恒温仪中，接着在65℃恒温环境下孵育60-120分钟，并实时监测反应体系的荧光变化，然后SEA-LAMP对待测靶分子进行扩增，之后将扩增产物进行凝胶电泳分析，最后通过分析得出检测结果。
实施例七(以硒修饰SEA-LAMP检测COVID-19-RNA为例)
参见图10、13，本实施例提供了一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物混合物
先按照LAMP扩增原理并针对待测靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物并配置成固定浓度的引物混合物，通过在线软件对待测靶分子进行引物设计，所述引物混合物包括16microM的正向内部引物、16microM的反向内部引物、2microM的正向外部引物和2microM的反向外部引物；
步骤二：配置混合物
将dATP、dTTP、dCTP、dGTP和dATPαSe、dTTPαSe、dCTPαSe、dGTPαSe按规定比例一一对应配置成混合物，其中dATP和dATPαSe的混合物、dTTP和dTTPαSe的混合物、dCTP和dCTPαSe的混合物以及dGTP和dGTPαSe的混合物的两种dNTP的浓度之和均为2.5mM；
步骤三：配置SEA-LAMP反应体系
将2×SEA-LAMP扩增缓冲液、引物混合物、Bst 2.0DNA聚合酶和样本RNA配置成SEA-LAMP反应体系，再补充dd H2O至20μL，并同时设置阳性对照和阴性对照，所述SEA-LAMP扩增缓冲液由40mM的Tris-HCl、20mM的(NH4)2SO4、100mM的KCl、16mM的MgSO4、1％的Tween20、2.5mM的dNTP/dNTPαSe混合物、1.6M的甜菜碱和2×SYBR Green I组成；
步骤四：反应及产物分析
先将配置好的SEA-LAMP反应体系放置于荧光恒温仪中，接着在65℃恒温环境下孵育60-120分钟，并实时监测反应体系的荧光变化，然后SEA-LAMP对待测靶分子进行扩增，之后将扩增产物进行凝胶电泳分析，最后通过分析得出检测结果。
该基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法建立SEA-PCR和SEA-LAMP的检测方法，通过修饰底物dNTPαSe(或者dNTPαS)，抑制了检测过程中非特异性产物的产生，增加了反应的特异性，建立了高特异性的扩增反应，再通过特异性的提高，抑制了低浓度模板下的非特异性扩增，提高了检测的灵敏度，从而在临床样品检测上减少了假阳性率和假阴性率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：包括变温策略检测法和恒温策略检测法。
2.根据权利要求1所述的一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：所述变温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测DNA或RNA靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
用至少一种dNTPαSe或至少一种dNTPαS，彻底或部分取代与之碱基相同的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA核酸检测反应体系
将PCR缓冲液、至少一个荧光染料或至少一个分子探针、至少一个DNA聚合酶、至少一个正向引物、至少一个反向引物、dNTP混合物、核酸DNA或RNA靶标分子配置成SEA-PCR反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应及产物分析
先将配置好的SEA-PCR反应体系放置于PCR仪，最后进行核酸扩增结果的分析。
3.根据权利要求2所述的一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：在所述变温策略检测法的步骤二中：用dATPαSe、dCTPαSe、dGTPαSe、dTTPαSe、dUTPαSe和dATPαS、dCTPαS、dGTPαS、dTTPαS、dUTPαS其中的一种或多种，来彻底或部分取代与之碱基相同的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物。
4.根据权利要求1所述的一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：所述恒温策略检测法包括以下步骤：
步骤一：合成并配置引物
先针对待测DNA或RNA靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，并配置成引物混合物，使其添加到反应体系后的反应浓度为0.01-100microM；
步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物
用至少一种dNTPαSe或至少一种dNTPαS，彻底或部分取代与之碱基相同的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；
步骤三：配置SEA-ITA恒温扩增反应体系
将扩增缓冲液、引物混合物、至少一个荧光染料或至少一个荧光探针、dNTP混合物、至少一个DNA聚合酶和核酸靶标分子配置成反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；
步骤四：反应产物分析
先将配置好的反应体系放置于恒温仪中，接着在恒温环境下孵育1-600分钟，最后进行核酸扩增结果的分析。
5.根据权利要求4所述的一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：在所述恒温策略检测法中的步骤二中：用dATPαSe、dCTPαSe、dGTPαSe、dTTPαSe、dUTPαSe和dATPαS、dCTPαS、dGTPαS、dTTPαS、dUTPαS其中的一种或多种，彻底或部分取代与之碱基相同的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物。
6.根据权利要求2所述的一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：所述变温策略检测法，在步骤一中，通过在线软件对引物进行设计，设计的引物包括正向引物和反向引物。
7.根据权利要求2所述的一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：在所述变温策略检测法的步骤二中，所述dNTP混合物的浓度均为0.01-100mM。
8.根据权利要求2所述的一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：在所述变温策略检测法的步骤三中，核酸检测反应体系中的正向引物终浓度为0.01-100microM、反向引物终浓度为0.01-100microM、dNTP混合物和dNTPαSe或dNTPαS混合物终浓度为0.001-100mM。
9.根据权利要求2所述的一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：在所述变温策略检测法的步骤四中，采集荧光信号的过程中PCR循环参数设置为90-98℃下预变性0-300秒，之后是20-100个循环反应，所述循环反应包括90-98℃预变性1-300秒，40-74℃退火1-300秒，55-74℃延伸1-300秒并采集荧光信号。
10.根据权利要求4所述的一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：在恒温策略检测法的步骤一中，通过在线软件对待测靶分子进行引物设计，所述引物混合物包括至少一个引物，其浓度为0.1-100microM。
11.根据权利要求4所述的一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：在恒温策略检测法的步骤三中，所述扩增缓冲液由1-100mM的Tris-盐酸、1-100mM的硫酸铵、1-1000mM的氯化钾、1-100mM的硫酸镁、0-5％的吐温20、0.01-5mM的dNTP混合物、0-3M的甜菜碱和0.1-5×核酸荧光染料组成。
12.根据权利要求4所述的一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：在所述恒温策略DNA或RNA检测法的步骤四中，采集荧光信号的过程中恒温扩增设置温度为10-98℃，孵育1-600min。
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