CN108020532A - 一种基于镉的功能核酸的比色传感器及其应用 - Google Patents

一种基于镉的功能核酸的比色传感器及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了金属离子检测技术领域的一种基于镉的功能核酸的比色传感器及其应用。该比色传感器包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，所述分子识别元件包括镉离子脱氧核酶，镉离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；所述信号放大元件包括等温扩增体系，等温扩增体系包括扩增模板；所述信号转换元件包括硫代黄色素。本发明比色传感器基于镉离子脱氧核酶、等温指数放大反应和G‑四链体液相传感技术，分子识别元件识别镉离子，并将产生扩增产物，扩增产物在硫代黄色素作用下，形成G‑四链体结构，通过检测荧光强度，计算得出镉离子浓度，具备简便快速、灵敏度高、特异性高、耐高盐以及成本低等优点，可用于环境中镉离子的现场检测。

Description

一种基于镉的功能核酸的比色传感器及其应用
技术领域
本发明属于金属离子检测技术领域，具体涉及一种基于镉的功能核酸的比色传感器及其应用。
背景技术
镉是一种蓝白色的、重要的、过渡态重金属元素，有毒性，但由于其良好的柔韧性和抗氧化性，被广泛应用于工业生产中。20世纪60年代，镉中毒第一次在日本被报道，引起人们的高度重视。研究证明，镉可以通过呼吸道与消化道进入生物体，进入机体的镉可以对肝、肾、骨骼、脑和肺等一系列重要器官造成损害，也会引起神经、生殖和免疫等系统的损伤。
肝脏和肾脏是镉中毒最主要的靶器官，且镉对肝、肾的毒性呈现明显的时间-浓度依赖性。高浓度或者急性镉中毒主要造成肝损伤。镉的肝损伤主要是由于镉通过与肝脏抗氧化酶中的金属辅基发生竞争性替换，抑制这些酶的活性，造成肝脏自由基清除能力下降，细胞发生脂质过氧化反应和氧化应激。镉大量消耗肝细胞金属硫蛋白(Metallothionein,MT)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)等抗氧化蛋白、多肽，造成细胞氧自由基清除能力下降，细胞活性氧类(Reactive oxygen species,ROS)含量剧增，细胞经历氧化损伤，线粒体等细胞器结构和功能遭受破坏。低浓度或慢性镉中毒主要引起肾损伤。进入机体的镉一部分以Cd-MT结合态形式存在，Cd-MT很难被大多数器官吸收，但可以被近曲小管上皮细胞吸收。随血液到达肾脏的镉被肾小球滤过，后几乎全部被近曲小管上皮细胞重吸收。当肾镉含量超出细胞的镉螯合能力，肾小球功能会遭到严重破坏，机体出现多尿、高磷酸盐尿、氨基酸鸟、糖尿和β2-微球蛋白低分子量蛋白尿等一系列症状。另外，镉对细胞具有强烈的毒性作用，短暂镉接触可以引起细胞凋亡、坏死；长期镉暴露则会诱导细胞癌变，导致肿瘤。
中国是世界上第一大镉储量和开发国，同时也是第一大镉消费国。近年来，伴随着人们对镉的进一步开发利用，环境镉污染越来越严重，关于人和动物镉中毒的报道也不断出现。镉中毒已经变为严重威胁人类健康的又一大隐患，因此，对于镉的检测与鉴定工作十分重要。
目前，重金属镉的检测方法主要有火焰原子吸收法、石墨炉原子吸收法、电感耦合等离子体质谱法、电感耦合等离子体质谱法以及阳极溶出伏安法等。具体来看，火焰原子吸收法操作简单、分析速度快、测定高浓度元素时干扰小、信号稳定。石墨炉原子吸收法灵敏、准确、选择性好，但在线检测方法基体干扰严重，不适合多种元素分析。电感耦合等离子体质谱法灵敏度高，选择性好，能同时分析多种元素，但价格昂贵度，易受污染。电感耦合等离子体质谱法简便、快速、灵敏仪器简单、价格低廉，容易普及，但干扰因素选择性较差。阳极溶出伏安法灵敏度高、分辨仪器价格低廉，可同时测定几种元素。但这些方法依赖于大型仪器和专人操作，在现场和野外检测中受到限制。以醚类、多胺类、环芳烃类等有机小分子为代表的化学传感方法也有一定的发展，但目前存在灵敏度低、可重复性差、检测需在有机溶剂中进行等不足之处，检测的可靠性和实用性不高。因此迫切需要发展无污染的、简便快速、高灵敏度和高特异性的方法来满足微量镉金属的检测。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提出一种基于镉的功能核酸的比色传感器及其应用。具体技术方案如下：
一种基于镉的功能核酸的比色传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，
所述分子识别元件包括镉离子脱氧核酶；所述镉离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；
所述信号放大元件包括等温扩增体系，所述等温扩增体系包括扩增模板；
所述信号转换元件包括硫代黄色素；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CTCACTATArAGGAAGAGATGCGGCCGGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CATCTCATCTAACAGCGTTCCGAAATAGC；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCAACCCGCCCTACCCCCCAACCCGCCCTACCCAACTGACTCCCCGGCCGCATCTCTTC。
所述等温扩增体系包括A体系和B体系；
所述A体系包括：扩增模板、dNTPs、脱氧核酶切割产物及超纯水；
所述B体系包括：Bst DNA聚合酶及其缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液。
所述Bst DNA聚合酶反应缓冲液：20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,50mM KCl,2mMMgSO4,0.1％吐温20，0.1％牛血清白蛋白，pH 8.8；
所述Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲液：100mM NaCl,50mM Tris-HCl，10mMMgCl2,300μg/ml海藻糖，pH 7.9。
所述传感器在检测镉离子中的应用。
利用所述传感器检测镉离子的方法，包括如下步骤：
制备镉离子浓度和G-四链体功能核酸荧光强度关系的标准曲线；
按上述制备标准曲线的过程进行待测样品的检测，得到待测样品的G-四链体功能核酸荧光强度值，通过上述标准曲线计算镉离子的浓度；
其中，制备标准曲线的步骤包括：
(1)在镉离子脱氧核酶的底物链和酶链中加入不同浓度镉离子溶液，制备镉离子脱氧核酶切割产物；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CTCACTATArAGGAAGAGATGCGGCCGGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CATCTCATCTAACAGCGTTCCGAAATAGC；
(2)将扩增模板，dNTPs，切割产物和超纯水混合均匀，制备A体系；将Bst DNA聚合酶及其缓冲溶液，Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液混合均匀，制备B体系；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCAACCCGCCCTACCCCCCAACCCGCCCTACCCAACTGACTCCCCGGCCGCATCTCTTC；
(3)A体系先进行孵育，然后与B体系迅速进行混合，孵育扩增，终止反应后得到扩增产物；
(4)将扩增产物、硫代黄色素原液、显色缓冲液与超纯水混匀并反应，形成G-四链体结构；
(5)测定步骤(4)的反应混合液的荧光强度，得到荧光强度随镉离子浓度变化的标准曲线。
步骤(1)的步骤为：将镉离子脱氧核酶的底物链和酶链用缓冲液稀释，95℃加热15min，然后缓慢降至25℃；加入待测镉离子溶液，25℃孵育6min，加入终止液，得到镉离子脱氧核酶切割产物。
步骤(3)的步骤为：A体系于55℃孵育5min，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min，95℃保持10min以终止反应，得到扩增产物。
步骤(4)中反应温度为25℃，反应时间为20min。
本发明同时也提供了一种检测镉离子的试剂盒，包括镉离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显色体系；
所述镉离子脱氧核酶体系包括底物链、酶链、缓冲液、镉离子标准溶液和终止液；所述缓冲液为终浓度25mM HEPES buffer，pH 7.6；所述终止液为0.2M EDTA，2M NaCl，0.5MTris；
所述等温扩增体系包括扩增模板、dNTPs、超纯水、Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；
所述显色体系包括：硫代黄色素原液和显色缓冲液；所述显色缓冲液的配方为：50mM Tris-HCl，50mMKCl，pH7.2；所述硫代黄色素原液由0.1mol硫代黄色素干粉与1mL显色缓冲液混合得到。
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CTCACTATArAGGAAGAGATGCGGCCGGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CATCTCATCTAACAGCGTTCCGAAATAGC；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCAACCCGCCCTACCCCCCAACCCGCCCTACCCAACTGACTCCCCGGCCGCATCTCTTC。
本发明还提供了一种镉离子脱氧核酶，所述镉离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CTCACTATArAGGAAGAGATGCGGCCGGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CATCTCATCTAACAGCGTTCCGAAATAGC。
本发明的有益效果为：
1、本发明提供了一种基于镉的功能核酸的比色传感器和镉离子检测方法，镉离子脱氧核酶由底物链与酶链两条寡核苷酸链组成，形成特定的二级结构；痕量镉离子能够特异性识别镉离子脱氧核酶，结合脱氧核酶的酶链，并激活脱氧核酶，切割脱氧核酶的底物链，产生切割产物；有且只有切割产物存在时，促发等温指数放大反应(EXPAR)，产生信号的放大和转化，并生成大量富含鸟嘌呤的寡核苷酸序列，该序列在硫代黄色素诱导下形成G-四链体结构，在425nm的激发光激发下发出荧光，最大发射波长在485nm，转化成可视化的信号，可以进行定性的判断。
2、经过信号的放大和转化，通过手持式光谱检测仪就可以进行定量检测镉离子，具备简便快速、灵敏度高、特异性高、耐高盐以及成本低等优点，并可用于环境中镉离子的现场检测。
3、本发明传感器能够抵抗高盐的干扰，实现高盐环境中锌离子的检测，并可保持较高的特异性和灵敏度。
附图说明
图1为镉离子脱氧核酶的制备及切割产物的验证，其中，Lane1-Marker；Lane2-阴性对照：脱氧核酶酶链；Lane 3-阴性对照ⅱ：脱氧核酶底物链与脱氧核酶酶链，无镉离子；Lane4,5,6-阳性样品：在脱氧核酶底物链与脱氧核酶酶链的体系中分别添加15uM、30uM、45uM的氯化镉。
图2为扩增产物的扩增，其中，Lane1-Marker；Lane 2-扩增模板；Lane 3-阳性样品；Lane4-阳性对照：扩增产物。
图3为荧光强度随镉离子浓度变化的标准曲线。
具体实施方式
以下实施例便于更好地理解本发明。实施例中实验材料如无特殊说明均可通过商业途径获得，实验方法如无特殊说明均为常规方法。
本发明基于镉离子脱氧核酶、等温指数放大反应(EXPAR)和G-四链体液相传感传感技术，构建一种比色传感器。镉离子脱氧核酶由底物链与酶链两条寡核苷酸链组成，形成特定的二级结构；痕量镉离子能够特异性识别镉离子脱氧核酶，结合脱氧核酶的酶链，并激活脱氧核酶，切割脱氧核酶的底物链；有且只有切割产物存在时，促发EXPAR放大信号，并生成大量富含鸟嘌呤的寡核苷酸序列；该序列在硫代黄色素诱导下形成G-四链体结构，在425nm的激发光激发下发出荧光，最大发射波长在485nm，通过手持式光谱检测仪进行检测与定量。
实施例1：基于功能核酸的比色传感器的构建方法
1、实验材料
氯化钾，氯化钠，氯化镁，磷酸氢钾，乙二胺四乙酸二钠，硫代黄色素，三羟甲基氨基甲烷，氯化镉，尿素，Nt.BstNBI切刻内切酶，Bst DNA聚合酶，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，氢氧化钠，磷酸氢二钠。
2、序列设计
设计并合成脱氧核酶底物链，脱氧核酶酶链和扩增模板。扩增模板中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列，序列前四个碱基对处(C和A之间)即是合成链切割位点；脱氧核酶底物链末端CGGCCGGG序列是为了增加与扩增模板的结合Tm值；镉离子切割位点在脱氧核酶底物链的rA之后。
3、构建方法
基于镉的功能核酸的比色传感器的构建方法，包括如下步骤：
(1)将4μL脱氧核酶底物链(10μM母液)和4μL脱氧核酶酶链(10μM母液)用HEPES缓冲液(终浓度为50mM HEPES buffer，pH 7.0)稀释至35μL，95℃加热15min，然后缓慢降至25℃，大约耗时45min。加入5μL待测镉离子溶液，形成40μL体系，25℃孵育6min，加入5μL终止液(0.2M EDTA，2M NaCl，0.5M Tris)，得到镉离子脱氧核酶切割产物。用20％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，结果如图1，证明镉离子脱氧核酶的制备与切割成功。
切割产物的序列(5’-3’)为：GAAGAGATGCGGCCGGG。
(2)配制扩增反应体系
反应体系为30μL，由A部分和B部分组成。
A体系组成(24.2μL)
B体系组成(5.8μL)
Bst DNA聚合酶(8U/μL母液)0.1μL(终浓度0.02U/μL)
聚合酶反应缓冲溶液(10×母液)3μL(终浓度1×)
Nt.BstNBI切刻内切酶(10U/μL母液)1.2μL(终浓度0.37U/μL)
切刻内切酶的反应缓冲溶液(10×母液)1.5μL(终浓度0.5×)
本发明的“×”如无特殊限定，则为体积倍量。
本发明的“终浓度”无特殊限定，则为物质混合后的在总的反应体系的浓度。如1μM扩增模板母液6μL，终浓度为0.2μM，指的扩增模板在等温扩增体系中的浓度。
(3)A体系在55℃孵育5min后，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min；95℃保持10min，以终止反应，得到扩增产物。放入-20℃备用。利用20％的聚丙烯酰胺凝胶电泳验证扩增产物，结果如图2。
扩增产物的序列(5’-3’)为：GGGTAGGGCGGGTTGGGGGGTAGGGCGGGTTGGG
(4)将10μL扩增产物、50μL显色缓冲液、2μL硫代黄色素原液与38μL超纯水混匀，25℃反应20min，使扩增产物结合硫代黄色素形成G-四链体结构；
显色缓冲液的配方为：50mM Tris-HCl，50mMKCl，pH7.2。
硫代黄色素原液由0.1mol硫代黄色素干粉与1mL显色缓冲液混合。
(5)用酶标仪设定激发波长425nm，激发步骤(4)的反应混合液，测定波长485nm下的荧光强度。
实施例2：镉离子的检测
镉离子浓度的检测，具体步骤如下：
(1)制备荧光强度随镉离子浓度变化的标准曲线
采用实施例1中3的构建方法，待测镉离子溶液为氯化镉标准溶液(1M NaCl为溶解环境)，氯化镉浓度取30pM、4560pM、75pM、90pM和115pM，设定激发波长425nm，制备波长485nm下荧光强度(FL)随镉离子浓度变化的标准曲线(图3)，标准曲线为y＝108.10-773.10，R2＝0.9998。
(2)本实施例中待测镉离子溶液为不同浓度氯化镉溶液(NaCl为溶解环境)
采用实施例1中3的构建方法，测定待测镉离子溶液的荧光强度，代入标准曲线y＝108.10-773.10，得到镉离子浓度。结果如表1。
表1
实施例3：一种检测镉离子的试剂盒
一种检测镉离子的试剂盒，包括镉离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显色体系；
镉离子脱氧核酶体系包括底物链、酶链、缓冲液、镉离子标准溶液和终止液；
等温扩增体系包括扩增模板、dNTPs、超纯水、Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；
显色体系包括：硫代黄色素原液和显色缓冲液。
脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CTCACTATArAGGAAGAGATGCGGCCGGG；
脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CATCTCATCTAACAGCGTTCCGAAATAGC；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCAACCCGCCCTACCCCCCAACCCGCCCTACCCAACTGACTCCCCGGCCGCATCTCTTC。
缓冲液为终浓度25mM HEPES buffer，pH 7.6；
终止液为0.2M EDTA，2M NaCl，0.5M Tris；
显色缓冲液的配方为：50mM Tris-HCl，50mMKCl，pH7.2；
硫代黄色素原液由0.1mol硫代黄色素干粉与1mL显色缓冲液混合得到。
Bst DNA聚合酶反应缓冲液：20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,50mM KCl,2mMMgSO4,0.1％吐温20，0.1％牛血清白蛋白，pH 8.8；
Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲液：100mM NaCl,50mM Tris-HCl，10mM MgCl2,300μg/ml海藻糖，pH 7.9。

Claims (10)

1.一种基于镉的功能核酸的比色传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，其特征在于，
所述分子识别元件包括镉离子脱氧核酶；所述镉离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；
所述信号放大元件包括等温扩增体系，所述等温扩增体系包括扩增模板；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CTCACTATArAGGAAGAGATGCGGCCGGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CATCTCATCTAACAGCGTTCCGAAATAGC；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCAACCCGCCCTACCCCCCAACCCGCCCTACCCAACTGACTCCCCGGCCGCATCTCTTC；
所述信号转换元件包括硫代黄色素。
2.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述等温扩增体系包括A体系和B体系；
所述A体系包括：扩增模板、dNTPs、脱氧核酶切割产物及超纯水；
所述B体系包括：Bst DNA聚合酶及其缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液。
3.权利要求1或2所述传感器在镉离子检测中的应用。
4.一种检测镉离子的方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备镉离子浓度和G-四链体功能核酸荧光强度关系的标准曲线；
按上述制备标准曲线的过程进行待测样品的检测，得到待测样品的G-四链体功能核酸荧光强度值，通过上述标准曲线计算镉离子的浓度；
其中，制备标准曲线的步骤包括：
(1)在镉离子脱氧核酶的底物链和酶链中加入不同浓度镉离子溶液，制备镉离子脱氧核酶切割产物；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CTCACTATArAGGAAGAGATGCGGCCGGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CATCTCATCTAACAGCGTTCCGAAATAGC；
(2)将扩增模板，dNTPs，切割产物和超纯水混合均匀，制备A体系；将Bst DNA聚合酶及其缓冲溶液，Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液混合均匀，制备B体系；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCAACCCGCCCTACCCCCCAACCCGCCCTACCCAACTGACTCCCCGGCCGCATCTCTTC；
(3)A体系先进行孵育，然后与B体系迅速进行混合，孵育扩增，终止反应后得到扩增产物；
(4)将扩增产物、硫代黄色素原液、显色缓冲液与超纯水混匀并反应，形成G-四链体结构；
(5)测定步骤(4)的反应混合液的荧光强度，得到荧光强度随镉离子浓度变化的标准曲线。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)的步骤为：将镉离子脱氧核酶的底物链和酶链用缓冲液稀释，95℃加热15min，然后缓慢降至25℃；加入待测镉离子溶液，25℃孵育6min，加入终止液，得到镉离子脱氧核酶切割产物。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)的步骤为：A体系于55℃孵育5min，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min，95℃保持10min以终止反应，得到扩增产物。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)中反应温度为25℃，反应时间为20min。
8.一种检测镉离子的试剂盒，其特征在于，包括镉离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显色体系；
所述镉离子脱氧核酶体系包括底物链、酶链、缓冲液、镉离子标准溶液和终止液；
所述等温扩增体系包括扩增模板、dNTPs、超纯水、Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；
所述显色体系包括：硫代黄色素原液和显色缓冲液；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CTCACTATArAGGAAGAGATGCGGCCGGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CATCTCATCTAACAGCGTTCCGAAATAGC；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCAACCCGCCCTACCCCCCAACCCGCCCTACCCAACTGACTCCCCGGCCGCATCTCTTC。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为终浓度25mM HEPESbuffer，pH 7.6；所述终止液为0.2M EDTA，2M NaCl，0.5M Tris；所述显色缓冲液的配方为：50mM Tris-HCl，50mMKCl，pH7.2；所述硫代黄色素原液由0.1mol硫代黄色素干粉与1mL显色缓冲液混合得到。
10.一种镉离子脱氧核酶，其特征在于，所述镉离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CTCACTATArAGGAAGAGATGCGGCCGGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CATCTCATCTAACAGCGTTCCGAAATAGC。
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