CN108318479B - 一种高灵敏度的铅离子检测方法 - Google Patents

一种高灵敏度的铅离子检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明主要涉及生物技术领域，公开了一种高灵敏度的铅离子检测方法，包括：样品处理、引物制备、互补杂交、等温扩增、模拟酶制备、催化显色、铅离子浓度计算；操作简单，原理清晰，使用的各步反应条件成熟，易于控制，同时不需要标记荧光和金纳米基团，避免降低脱氧核酶的活性，无需使用昂贵的试剂和大型仪器，成本低廉，反应时间较快，总反应时间小于2h，同时对铅离子的检测较为灵敏，最低检测浓度为10nM，能够对水体进行严格监控，治理环境污染，保障人体安全，同时显色明显，肉眼可视，提供一种新的铅离子检测方法。

Description

一种高灵敏度的铅离子检测方法
技术领域
本发明主要涉及生物技术领域，尤其涉及一种高灵敏度的铅离子检测方法。
背景技术
铅离子在非常低的浓度下即可对人体产生危害，在极低的浓度下即可产生副作用，铅进入人体后，会对神经系统、血液循环系统、消化系统以及泌尿系统等带来多重损伤。世界卫生组织规定饮用水中铅含量不应超过10μg/L，空气中铅含量不能超过0.5μg/m3，一般人体中约含铅77mg，联合国粮农组织和世界卫生组织提出：每人每日铅允许摄人量约为420μg，铅中毒标准为小于100μg/L，当人体血铅含量大于或等于100μg/L，即为铅中毒，但血铅含量超过60μg/L即可导致儿童注意力不集中，多动，成绩下降，厌食和钙锌铁缺乏等。
目前金属元素的检测主要采用光谱法，包括原子（吸收、发射、荧光等）光谱、分光光度法等，电化学、声学等方法也有应用，但这些方法依赖于大型仪器和专人操作，在现场和野外检测中受到限制。以冠醚类、多胺类、杯芳烃类等有机小分子为代表的化学传感方法也有一定的发展，目前存在灵敏度低、可重复性差、检测在有机溶剂中进行等不足之处，检测的可靠性和实用性不高。因此迫切需要发展无污染的、简便快速、高灵敏度和高特异性的方法来满足微量金属检测的需要。
功能核酸是一类具有特定生物功能的核酸分子，包括核酸适配体aptamer、脱氧核酶DNAzyme和aptazyme（aptamer与DNAzyme的复合物）等，其功能远远超出传统核酸的遗传作用。近年来功能核酸已被广泛应用于生物传感等分子识别和应用研究领域，并对蛋白质、金属离子以及小分子等进行检测。在金属离子检测方面的功能核酸，包括荧光传感器、比色传感器和电化学传感器等生物传感器。
脱氧核酶（DNAzyme）是功能核酸的一种，是经过指数富集的配基系统进化技术（SELEX）筛选出来的一种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力，且大多数的脱氧核酶具有金属离子依赖性，只有在特定金属离子存在时才表现出催化活性，脱氧核酶由酶链和底物链组成，酶链与底物链杂交，底物链中部含有一切割位点，铅离子依赖性脱氧核酶以铅离子作为其催化反应的辅因子，在铅离子存在的条件下底物链被切割并与酶链分离，并且酶的活性与铅离子的浓度呈正相关。目前，人们已筛选出可用于识别Pb2+离子的脱氧核酶，活性依赖于Pb2+的脱氧核酶已被人们广泛用于Pb2+的检测。
基于脱氧核酶的这种特殊的性质，科学家们设计出了许多对Pb2+具有高度敏感性、专一性的荧光、比色传感器，利用荧光团标记、新材料（如金纳米颗粒）等将脱氧核酶对金属离子专一性转变为物理上可以检测到的信号，用于环境中的重金属离子Pb2+的检测。尽管这些方法在Pb2+检测方面做出了巨大的贡献，但是这些方法大多都基于对脱氧核酶的标记修饰，或者用到金纳米等较为昂贵材料，不仅实验成本高，实验操作复杂，而且标记还可能会对脱氧核酶的活性造成一定程度的损害，因此需要一种无需基团标记和金纳米材料、快速、灵敏的检测方法。
发明内容
为了弥补已有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种新型可视化、超灵敏、简单快速的铅离子检测方法，用于水体中铅离子含量的检测。
一种高灵敏度的铅离子检测方法，包括以下步骤：
（1）样品处理：先将待测样品经0.22μm的超微滤膜过滤，再分别稀释10倍、20倍、50倍、100倍、500倍和1000倍，得样品稀释液；
（2）引物制备：将样品稀释液分别加入GR-5脱氧核酶中至体积为40μL，于25℃孵育切割3min，再加入5μL终止液，混合均匀，于4℃进行保存，得引物单链X；
（3）互补杂交：分别吸取3μL引物单链X、3μL摩尔浓度为1μM模板链X’-Y’、3μL摩尔浓度为2.5mM的dNTPs、15.2μL超纯水，混合均匀，先于95℃孵育5min，得杂交链；
（4）等温扩增：向杂交链中加入5.8μL复合酶溶液，于55℃孵育8min，再置于95℃保温10min，置于-20℃备用，得单链Y-G4-DNA；
（5）模拟酶制备：分别吸取10μL单链Y-G4-DNA、30μL酶活缓冲液、60μL血红素Hemin稀释溶液，混合均匀，于37℃保温反应30min，得模拟酶Hemin-G4；
（6）催化显色：向模拟酶Hemin-G4中加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色液50μL，混合均匀，于37℃恒温反应10min，再加入50μL摩尔浓度为2M的硫酸溶液，混合均匀，于450nm处检测吸光值，得450nm吸光值；
（7）铅离子浓度计算：将450nm吸光值带入线性回归方程，得铅离子浓度。
所述步骤（2）中的GR-5脱氧核酶的制备方法，包括以下步骤：分别取摩尔浓度为10μM的GR-5-底物链4μL，摩尔浓度为10μM的GR-5-酶链4μL，加入缓冲液和水至40μL，使缓冲液中NaHEPES摩尔浓度为50mM、NaCl摩尔浓度为50mM、MgCl2摩尔浓度为5mM，pH为7.26，于95℃加热15min，然后缓慢降至25℃，得GR-5脱氧核酶。
所述步骤（2）中的终止液，由以下摩尔浓度的原料制成：EDTA 0.2M、NaCl 2M、Tris0.5M。
所述步骤（4）中的复合酶溶液，由以下原料制成：8U/μL的Bst DNA聚合酶0.1μL、10×的聚合酶反应缓冲溶液3μL、活性为10U/μL的Nt.BstNBI切刻内切酶1.2μL、10×的Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液1.5μL。
所述步骤（5）中的酶活缓冲液，由以下摩尔浓度的原料制成：Tris 100mM、NaCl120mM、MgCl2 10mM、KCl 100mM，pH为8.4。
所述步骤（5）中的血红素Hemin稀释溶液，吸取2μL Hemin原液，加入所述的酶活缓冲液1mL，混合均匀，得血红素Hemin稀释溶液。
本发明的优点是：本发明提供的高灵敏度的铅离子检测方法，操作简单，原理清晰，使用的各步反应条件成熟，易于控制，同时不需要标记荧光和金纳米基团，避免降低脱氧核酶的活性，无需使用昂贵的试剂和大型仪器，成本低廉，反应时间较快，总反应时间小于2h，同时对铅离子的检测较为灵敏，最低检测浓度为10nM，能够对水体进行严格监控，治理环境污染，保障人体安全，同时显色明显，肉眼可视，提供一种新的铅离子检测方法。
附图说明
图1为本发明中铅离子浓度（0~10μM）与吸光值标准曲线图；
图2为本发明中铅离子浓度（0~15μM）与吸光值标准曲线图；
图3为本发明中铅离子浓度（0~20μM）与吸光值标准曲线图。
具体实施方式
下面用具体实施例说明本发明。
一种高灵敏度的铅离子检测方法，包括线性回归方程的建立和待测样品的检测。
所述线性回归方程的建立，包括以下步骤：
（1）标准液制备：将醋酸铅溶液稀释为0~60μM的不同浓度，得标准液；
（2）引物制备：将标准液分别加入GR-5脱氧核酶中至体积为40μL，于25℃孵育切割3min，再加入5μL终止液，混合均匀，于4℃进行保存，得引物单链X；所述GR-5脱氧核酶的制备方法，包括以下步骤：分别取摩尔浓度为10μM的GR-5-底物链4μL，摩尔浓度为10μM的GR-5-酶链4μL，加入缓冲液和水至40μL，使缓冲液中NaHEPES摩尔浓度为50mM、NaCl摩尔浓度为50mM、MgCl2摩尔浓度为5mM，pH为7.26，于95℃加热15min，然后缓慢降至25℃，得GR-5脱氧核酶；所述终止液，由以下摩尔浓度的原料制成：EDTA 0.2M、NaCl 2M、Tris 0.5M；
（3）互补杂交：分别吸取3μL引物单链X、3μL摩尔浓度为1μM模板链X’-Y’、3μL摩尔浓度为2.5mM的dNTPs、15.2μL超纯水，混合均匀，先于95℃孵育5min，得杂交链；
（4）等温扩增：向杂交链中加入5.8μL复合酶溶液，于55℃孵育8min，再置于95℃保温10min，置于-20℃备用，得单链Y-G4-DNA；所述复合酶溶液，由以下原料制成：8U/μL的BstDNA聚合酶0.1μL、10×的聚合酶反应缓冲溶液3μL、10U/μL的Nt.BstNBI切刻内切酶1.2μL、10×的Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液1.5μL；
（5）模拟酶制备：分别吸取10μL单链Y-G4-DNA、30μL酶活缓冲液、60μL血红素Hemin稀释溶液，混合均匀，于37℃保温反应30min，得模拟酶Hemin-G4；所述酶活缓冲液，由以下摩尔浓度的原料制成：Tris 100mM、NaCl 120mM、MgCl2 10mM、KCl 100mM，pH为8.4；所述血红素Hemin稀释溶液，吸取2μL Hemin原液，加入所述的酶活缓冲液1mL，混合均匀，得血红素Hemin稀释溶液；
（6）催化显色：向模拟酶Hemin-G4中加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色液50μL，混合均匀，于37℃恒温反应10min，再加入50μL摩尔浓度为2M的硫酸溶液，混合均匀，于450nm处检测吸光值见表1，得450nm吸光值；
（7）线性回归方程建立：根据标准液中铅离子的浓度和450nm吸光值，在0~10μM建立线性回归方程为A=0.0289C+0.3014，相关系数R2=0.9976，得线性回归方程。
所述待测样品的检测，包括以下步骤：
先将待测样品经0.22μm的超微滤膜过滤，再分别稀释10倍、20倍、50倍、100倍、500倍和1000倍，得样品稀释液；再按照所述线性回归方程的建立中的步骤（2）~步骤（6）进行操作，得样品的450nm吸光值，将450nm吸光值带入线性回归方程为A=0.0289C+0.3014，在0~10μM的范围内，A为450nm吸光值，得到的C值即为样品稀释液中铅离子的浓度。
实施例的标准液中不同铅离子浓度与450nm吸光度数据见表1。
表1：铅离子浓度与吸光度数据
铅离子浓度/(μM) 450nm吸光度 铅离子浓度/(μM) 450nm吸光度
0 0.299812 10 0.579499
0.01 0.300146 12 0.616469
0.03 0.300711 15 0.653324
0.1 0.302798 17 0.675652
0.3 0.309172 20 0.719150
1 0.331487 30 0.811376
3 0.390631 40 0.841194
6 0.481949 50 0.897111
8 0.540961 60 0.916299
从表1的数据可得：线性回归方程为：
Y=0.0289X+0.3014，相关系数R2=0.9976，X=0~10μM；
Y=0.0257X+0.306， 相关系数R2=0.9841，X=0~15μM；
Y=0.0226X+0.3146，相关系数R2=0.9718，X=0~20μM；
可见，在铅离子浓度为0~10μM时，铅离子浓度与450nm吸光度的关系呈线性最好。

Claims (6)

1.一种高灵敏度的铅离子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）样品处理：先将待测样品经0.22μm的超微滤膜过滤，再分别稀释10倍、20倍、50倍、100倍、500倍和1000倍，得样品稀释液；
（2）引物制备：将样品稀释液分别加入GR-5脱氧核酶中至体积为40μL，于25℃孵育切割3min，再加入5μL终止液，混合均匀，于4℃进行保存，得引物单链X；
（3）互补杂交：分别吸取3μL引物单链X、3μL摩尔浓度为1μM模板链X’-Y’、3μL摩尔浓度为2.5mM的dNTPs、15.2μL超纯水，混合均匀，先于95℃孵育5min，得杂交链；
（4）等温扩增：向杂交链中加入5.8μL复合酶溶液，于55℃孵育8min，再置于95℃保温10min，置于-20℃备用，得单链Y-G4-DNA；
（5）模拟酶制备：分别吸取10μL单链Y-G4-DNA、30μL酶活缓冲液、60μL血红素Hemin稀释溶液，混合均匀，于37℃保温反应30min，得模拟酶Hemin-G4；
（6）催化显色：向模拟酶Hemin-G4中加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）显色液50μL，混合均匀，于37℃恒温反应10min，再加入50μL摩尔浓度为2M的硫酸溶液，混合均匀，于450nm处检测吸光值，得450nm吸光值；
（7）铅离子浓度计算：将450nm吸光值带入线性回归方程，得铅离子浓度。
2.根据权利要求1所述高灵敏度的铅离子检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中的GR-5脱氧核酶的制备方法，包括以下步骤：分别取摩尔浓度为10μM的GR-5-底物链4μL，摩尔浓度为10μM的GR-5-酶链4μL，加入缓冲液和水至40μL，使缓冲液中NaHEPES摩尔浓度为50mM、NaCl摩尔浓度为50mM、MgCl2摩尔浓度为5mM，pH为7.26，于95℃加热14~16min，然后缓慢降至24~26℃，得GR-5脱氧核酶。
3.根据权利要求1所述高灵敏度的铅离子检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中的终止液，由以下摩尔浓度的原料制成：EDTA 0.2M、NaCl 2M、Tris 0.5M。
4.根据权利要求1所述高灵敏度的铅离子检测方法，其特征在于，所述步骤（4）中的复合酶溶液，由以下原料制成：8U/μL的Bst DNA聚合酶0.1μL、10×的聚合酶反应缓冲溶液3μL、10U/μL的Nt.BstNBI切刻内切酶1.2μL、10×的Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液1.5μL。
5. 根据权利要求1所述高灵敏度的铅离子检测方法，其特征在于，所述步骤（5）中的酶活缓冲液，由以下摩尔浓度的原料制成：Tris 100mM、NaCl 120mM、MgCl2 10mM、KCl 100mM，pH为8.4。
6.根据权利要求1所述高灵敏度的铅离子检测方法，其特征在于，所述步骤（5）中的血红素Hemin稀释溶液，吸取2μL Hemin原液，加入所述的酶活缓冲液1mL，混合均匀，得血红素Hemin稀释溶液。
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