CN112941152B - 一种基于纯dna功能水凝胶的有害金属离子检测方法 - Google Patents

一种基于纯dna功能水凝胶的有害金属离子检测方法 Download PDF

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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明公开了一种基于纯DNA功能水凝胶的有害金属离子免标记检测方法，包括：步骤1：设计两条DNA单体序列，分别包含目标金属离子的DNAzyme和酶切底物，并含有三段互补片段；步骤2：将两条单体序列混合杂交制备纯DNA水凝胶；步骤3：将目标金属离子溶液与纯DNA水凝胶反应，使DNA水凝胶骨架中特定的DNAzyme被激活并切断底物序列，破坏水凝胶结构，释放出核酸碎片，然后直接测量上清溶液中核酸碎片的本征紫外吸收信号，实现对目标金属离子浓度的检测。本发明建立的纯DNA水凝胶免标记检测金属离子方法简单便携、经济直观，解决了现有技术中功能水凝胶的制备和修饰过程复杂、需要封装或包埋信号标记物、每个样品都需要大量的DNA材料和标记物导致使用成本高等问题。

Description

一种基于纯DNA功能水凝胶的有害金属离子检测方法
技术领域
本发明涉及有害金属检测领域，具体涉及一种基于纯DNA功能水凝胶的有害金属离子免标记检测方法。
背景技术
随着现代工业活动的日益频繁，有毒重金属污染及其造成的环境污染和健康问题已成为世界性的重大难题。重金属离子如铅离子、汞离子、铀酰离子等是严重的高毒性金属离子，即使在低浓度下也会对人体尤其是儿童造成严重危害。因此，检测有毒重金属离子非常重要。
目前，在实际应用中，常用的分析方法主要有原子吸收光谱法(AAS)、阳极溶出伏安法 (ASV)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、X射线荧光光谱法(XRF)等。这些方法对金属离子的检测灵敏度高、准确性好，但大多需要专业的仪器设备和复杂的样品制备流程，从而限制了它们在现场、临床等快速测量场景中的应用。因此，开发快速、简便、经济的金属离子传感技术十分必要。
DNAzyme是通过体外筛选技术(SELEX)获得的具有与蛋白酶类似催化活性的单链DNA。相比蛋白酶，DNAzyme具有稳定性高、人工合成简单快捷、活性高等特点。金属离子如Pb2+、 UO2 2+、Zn2+、Ag+、Cr3+以及镧系金属离子等是DNAzyne的特异性辅助因子，与这些金属辅助因子结合后，DNAzyme的酶催化活性被激活，可以将底物序列切断。利用DNAzyme作为金属离子的特异性识别探针和信号放大元件，研究者建立了一系列优异的金属离子生物传感分析方法，包括电化学、表面增强拉曼散射(SERS)、荧光、微流体以及比色法检测等。然而，这些方法大都需要对目标输出进行光学的、电学的或其他类型的信号标记，增加了传感器设计难度和使用成本。
近年来，刺激响应型DNA水凝胶以其简单、灵敏、便携、易于存储等优点，在生物传感应用中受到了广泛关注。在典型的DNA水凝胶应用中，首先使用合成聚合物(如聚丙烯酰胺)作为支架，再使用含有功能核酸序列(如适配体、DNAzyme、i-motif、G-四链体等) 的DNA作为交联剂和反应活性单元，构建功能水凝胶以对外界刺激如pH值、金属离子、小分子、蛋白质、病毒以及毒素等产生响应。提前将信号标记物封装于水凝胶中，当遇到响应目标时，水凝胶发生解离并释放出信号标记物，进而产生敏感的可探测信号[Gacanin J,Synatschke C V,Weil T.Biomedical applications of DNA-based hydrogels[J].Advanced Functional Materials,2020,30(4):1906253]。这些方法灵敏度高、选择性强，但这些功能水凝胶的制备和修饰过程都很复杂，且信号标记物的封装或包埋过程必不可少，也同时造成每个样品都需要大量的DNA水凝胶，增加了使用成本。
因此，为了提高这类有害金属离子的检测性能和实际应用能力，仍需要发展免标记的简单便携、经济直观的检测方法。
发明内容
本发明提供了一种基于纯DNA功能水凝胶的有害金属离子检测方法，可实现免标记定量的同时快速检测目标金属离子浓度。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种基于纯DNA功能水凝胶的有害金属离子免标记检测方法，包括以下步骤：
步骤1：设计两条DNA单体序列E链和S链，分别包含目标金属离子的DNAzyme和酶切底物，并至少含有三段互补片段；
步骤2：将设计的两条单体序列混合杂交制备纯DNA水凝胶；
步骤3：将目标金属离子溶液与制备的纯DNA水凝胶反应30min～6h，使DNA水凝胶骨架中特定的DNAzyme被激活并切断底物序列，破坏水凝胶结构，释放出核酸碎片，然后直接测量上清溶液中核酸碎片的本征紫外吸收信号，进而实现对目标金属离子浓度的检测。
所述步骤1中，当目标金属离子为铅离子时，DNA水凝胶的两条单体序列分别为：
S1链：
5’-TATCAGATTCGATTTTTT CACTAT/rA/GGAA GAGATGTTTTTGTCGGTAACCAG-3’；
E1链：
5’-TCGAATCTGATATTT TT CATCTCTTCTCCGA GCCG GTCGAAATAGTGATTTTTCTGGTTACCGAC-3’。
在此基础上，所述步骤3具体包括以下步骤：
步骤3a：将80μL 0～1000nmol/L不同浓度的Pb2+标准液加入10μL的DNA水凝胶中，于25℃恒温条件下反应；
步骤3b：每隔1h从PCR管上清中取1～2μL，用微量核酸蛋白测定仪测试260nm处吸光度。
所述步骤1中，当目标金属离子为铀酰离子时，DNA水凝胶的两条单体序列分别为：
S2链：
5’-GAAATGGATGGG TTTTTTT ACTCACTAT/rA/G GA AGAGATGGACGTG TTTTTTTGACAAGAATAAG-3’；
E2链：
5’-CC CATCCATTTC TTTTTTT CACGTCCATCTCT GCAGTCGGGTA GTTAA ACCGACCTTCAGAC ATAGTGAGT TTTTTTT CTTATTCTTGTC-3’。
在此基础上，所述步骤3具体包括以下步骤：
步骤3a：将80μL 0～1000nmol/L不同浓度的铀酰标准液加入10μL的DNA水凝胶中，于25℃恒温条件下反应；
步骤3b：每隔1h从PCR管上清中取1～2μL，用微量核酸蛋白测定仪测试260nm处吸光度。
作为优选，所述E链和S链的浓度均为0.2～1.5mM。
进一步地，所述步骤2具体包括以下步骤：
步骤2a：将两条单体序列各自按1.5mM的理论浓度溶解于缓冲液中，并于35℃条件下充分溶解；针对铅离子，采用含100mM NaCl的50mM HEPES缓冲液，pH为7.0；针对铀酰离子，采用含100mM NaCl的50mM MES缓冲液，pH为5.5；
步骤2b：采用微量核酸蛋白测定仪中的寡核苷酸分析程序标定真实浓度；
步骤2c：将经过定量的DNA序列，按照E链与S链摩尔比1:1，在统一规格的PCR管中，用适当缓冲液一步混合配制10μL体积的终浓度为0.3～0.6mM的DNA水凝胶。
再进一步地，所述步骤2还包括以下步骤：
步骤2d：将DNA水凝胶置于PCR仪中，首先升温至60～70℃并恒温，用漩涡混合仪将粘稠的DNA水凝胶混匀；
步骤2e：将DNA水凝胶重新置于PCR仪中，升温至65～75℃并恒温5min，然后以0.45℃ /min的速率降至10℃进行退火；
步骤2f：将制备好的DNA水凝胶置于室温保存。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明将目标金属离子的DNAzyme和酶切底物核酸分别设计为两条DNA单体序列，经一步简单反应制备获得纯DNA功能水凝胶。本发明制备的水凝胶构成简单，制备便易，对目标金属具有强的识别能力和选择性。目标金属离子加入后，水凝胶中DNAzyme催化底物序列的断裂，释放出大量的短链DNA，通过简易的核酸蛋白测定仪直接测量短链DNA 的本征紫外吸收，即可进行免标记定量，实现对目标金属离子的快速检测。
(2)本发明制备工艺简单、原料来源广泛，并且在检测过程中信号来源于溶出DNA的本征紫外吸收，不需要封装或包埋任何信号标记物，成本低廉、技术效果俱佳，且工艺重复性易于控制和操作；同时，本发明可通过直接替换DNAzyme和底物序列，实现对不同金属离子的免标记检测，具有很强的拓展性和推广性。因此，本发明很好地克服了现有技术的缺陷，实现了创新，为快速、简便、经济的金属离子传感技术研究和开发提供了有力的保障。
附图说明
图1为本发明构建水凝胶的示意图。
图2为本发明-实施例中加入不同浓度铅离子后DNA水凝胶响应性测试图。
图3为本发明-实施例中检测铅离子时在第5小时对溶出DNA浓度进行的线性回归拟合图。
图4为本发明-实施例中高浓度干扰离子对铅离子检测DNA水凝胶的测试结果示意图。
图5为本发明-实施例中加入不同浓度铀酰离子后DNA水凝胶响应性测试图。
图6为本发明-实施例中检测铀酰离子时在第5小时对溶出DNA浓度进行的线性回归拟合图。
图7为本发明-实施例中高浓度干扰离子对铀酰离子检测DNA水凝胶的测试结果。
具体实施方式
本发明提供了一种纯DNA功能水凝胶，用于实现有害金属离子、尤其是高毒性金属离子的检测。本发明流程上主要包括纯DNA功能水凝胶的制备和有害金属离子检测，其中，纯DNA水凝胶由两条DNA单体序列杂交形成，并且这两条DNA序列分别含有目标金属离子的DNAzyme和酶切底物序列，对目标金属离子具有强的选择性识别能力，如图1所示；而对有害金属离子检测则主要是利用水凝胶中DNAzyme催化底物序列的断裂，释放出大量的短链DNA，通过简易的核酸蛋白测定仪直接测量短链DNA的本征紫外吸收，实现对目标金属离子的快速检测。
下面结合实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
实施例1
一种基于纯DNA功能水凝胶的铅离子免标记检测方法，包括以下步骤：
步骤1：设计两条单体序列E1链和S1链，分别包含铅离子的DNAzyme和酶切底物，并含有自互补片段，具备形成水凝胶的能力，其中，S1链序列如下：
5’-TATCAGATTCGATTTTTT CACTAT/rA/GGAA GAGATGTTTTTGTCGGTAACCAG-3’；
E1链序列如下：
5’-TCGAATCTGATATTT TT CATCTCTTCTCCGA GCCG GTCGAAATAGTGATTTTTCTGGTTACCGAC-3’；
步骤2：E1链和S1链各自按1.5mM的理论浓度溶解于含100mM NaCl的50mM HEPES缓冲液(pH 7.0)中，在35℃条件下过夜以充分溶解；而后，采用微量核酸蛋白测定仪中的寡核苷酸分析程序标定真实浓度；经过定量的DNA序列，按照E链与S链摩尔比1:1，在200 μLPCR管中，用HEPES缓冲液一步混合配制10μL体积的终浓度0.6mM的DNA水凝胶；随后将DNA水凝胶置于PCR仪中，首先升温至50℃并恒温，用漩涡混合仪将粘稠的DNA 水凝胶混匀；最后，将DNA水凝胶重新置于PCR仪中，升温至65℃并恒温5min，然后以 0.45℃/min的速率降至10℃以退火(退火过程需防止顶空出现冷凝)；将制备好的DNA水凝胶置于室温保存；
步骤3：将80μL 0～1000nmol/L不同浓度的Pb2+标准液加入10μL DNA水凝胶中，于25℃条件下进行恒温反应，然后每隔1h从PCR管上清中取1.5μL，用微量核酸蛋白测定仪测试 260nm处吸光度，测定1至6小时结果。
图2是加入不同浓度铅离子后DNA水凝胶响应性测试图，图3是在第5小时对溶出DNA 浓度进行的线性回归拟合图。线性范围：0～500nM，以3倍本底标准偏差计算检测限为：7.1 nM。
另：对检测铅离子的纯DNA功能水凝胶的检测选择性
步骤1：选取常见的八种二价金属离子(MgCl2，Mg(CH2COO)2，CoCl2，ZnCl2，CdCl2，CuCl2，CaCl2，NiCl2，MnCl2)作为干扰离子研究对象，以相同方式配置成10μmol/L标准液，与0、200、1000nmol/L Pb2+对比测试终浓度0.6mM DNA水凝胶系统在25℃反应5小时上清260nm处的吸收。图4是高浓度干扰离子对DNA水凝胶的测试结果。
从结果可以看出，除Zn2+和Cu2+外，其他二价离子均保持本底水平。对于50倍浓度的 Zn2+和Cu2+，其DNA分子溶出水平仅稍高于本地，但仍远低于200nM Pb2+的信号。因Pb2+来自醋酸铅溶液，MgCl2和Mg(CH3COO)2对比显示醋酸根并不干扰本设计中DNA水凝胶响应。这些结果表明，建立的免标记DNA水凝胶传感体系对Pb2+具有非常好的选择性。
实施例2
一种基于纯DNA功能水凝胶的铀酰离子免标记检测方法，包括以下步骤：
步骤1：设计两条单体序列E2链和S2链，分别包含铀酰离子的DNAzyme和酶切底物，并含有自互补片段，具备形成水凝胶的能力，其中，S2链序列如下：
5’-GAAATGGATGGG TTTTTTT ACTCACTAT/rA/G GA AGAGATGGACGTG TTTTTTTGACAAGAATAAG-3’；
E2链序列如下：
5’-CC CATCCATTTC TTTTTTT CACGTCCATCTCT GCAGTCGGGTA GTTAA ACCGACCTTCAGAC ATAGTGAGT TTTTTTT CTTATTCTTGTC-3’；
步骤2：E2链和S2链各自按1.5mM的理论浓度溶解于含100mM NaCl的50mM MES 缓冲液(pH 5.5)中，35℃过夜以充分溶解；而后采用微量核酸蛋白测定仪中的寡核苷酸分析程序标定真实浓度；经过定量的DNA序列，按照E链与S链摩尔比1:1，在200μL PCR 管中，用HEPES缓冲液一步混合配制10μL体积的终浓度0.6mM的DNA水凝胶；随后将 DNA水凝胶置于PCR仪中，首先升温至70℃并恒温，用漩涡混合仪将粘稠的DNA水凝胶混匀；最后，将DNA水凝胶重新置于PCR仪中，升温至75℃并恒温5min，然后以0.45℃ /min的速率降至10℃以退火(退火过程需防止顶空出现冷凝)；将制备好的DNA水凝胶置于室温保存；
步骤3：将80μL 0～1000nmol/L不同浓度的铀酰标准液加入10μL DNA水凝胶中，于25℃条件下进行恒温反应，然后每隔1h从PCR管上清中取～1.5μL，用微量核酸蛋白测定仪测试 260nm处吸光度，测定1至6小时结果。
图5是加入不同浓度铀酰离子后DNA水凝胶响应性测试图，图6是在5小时对溶出DNA 浓度进行的线性回归拟合图。线性范围：0～500nM，以3倍本底标准偏差计算检测限为：22.4 nM。
另：对检测铀酰离子的纯DNA功能水凝胶的检测选择性
步骤1：选取常见的八种二价金属离子(MgCl2，Mg(CH2COO)2，CoCl2，ZnCl2，CdCl2，CuCl2，CaCl2，NiCl2，MnCl2)作为干扰离子研究对象，以相同方式配置成10μmol/L标准液，与0、200、1000nmol/L铀酰离子对比测试终浓度0.6mM DNA水凝胶系统在25℃反应5小时上清260nm处的吸收。图7是高浓度干扰离子对DNA水凝胶的测试结果。
从结果可以看出，干扰二价离子基本保持本底水平，均低于200nM铀酰离子的信号。这些结果表明，建立的免标记DNA水凝胶传感体系对铀酰离子具有非常好的选择性。
本发明看似简单，实则不易想到，只有对高毒性金属离子和DNA水凝胶的性质与特点进行深入研究，并通过不断的试验以及理论与实践的结合，才能设计出行之有效的解决方案。应当说，本发明将目标金属离子的DNAzyme和酶切底物核酸分别设计为两条DNA单体序列，并制备获得纯DNA功能水凝胶，然后以此检测金属离子浓度，解决了业内的一大难题，并实现了低成本、工艺重复性可控、检测效果好、检测效率高的优点，真正满足了当前的实际应用需求，为快速、简便、经济的金属离子传感技术研究和开发提供了有力的保障。因此，与现有技术相比，本发明技术进步十分明显，具有突出的实质性特点和显著的进步。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国工程物理研究院材料研究所
<120> 一种基于纯DNA功能水凝胶的有害金属离子检测方法
<140> 2020110867460
<141> 2020-10-12
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tatcagattc gattttttca ctatraggaa gagatgtttt tgtcggtaac cag 53
<210> 2
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgaatctga tatttttcat ctcttctccg agccggtcga aatagtgatt tttctggtta 60
ccgac 65
<210> 3
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaaatggatg ggttttttta ctcactatra ggaagagatg gacgtgtttt tttgacaaga 60
ataag 65
<210> 4
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccatccatt tctttttttc acgtccatct ctgcagtcgg gtagttaaac cgaccttcag 60
acatagtgag ttttttttct tattcttgtc 90

Claims (2)

1.一种基于纯DNA功能水凝胶的有害金属离子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：设计两条DNA单体序列E1链和S1链，分别包含目标金属离子的DNAzyme和酶切底物，并至少含有三段互补片段；所述目标金属离子为铅离子；所述两条DNA单体序列分别为：
S1链：
5’- TATCAGATTCGATTTTTT CACTAT/rA/GGAA GAGATGTTTTTGTCGGTAACCAG-3’；
E1链：
5’-TCGAATCTGATATTT TT CATCTCTTCTCCGA GCCG GTCGAA ATAGTGATTTTTCTGGTTACCGAC-3’；
步骤2：将设计的两条单体序列混合杂交制备纯DNA水凝胶；该步骤具体如下：
步骤2a：将两条单体序列各自按1.5 mM的理论浓度溶解于缓冲液中，并于35 ℃条件下充分溶解；所述缓冲液为含100 mM NaCl的50 mM HEPES缓冲液，pH为7.0；
步骤2b：采用微量核酸蛋白测定仪中的寡核苷酸分析程序标定真实浓度；
步骤2c：将经过定量的DNA序列，按照E1链与S1链摩尔比1:1，在统一规格的PCR管中，用缓冲液一步混合配制10 μL体积的终浓度为0.3~0.6 mM的DNA水凝胶；
步骤2d：将DNA水凝胶置于PCR仪中，首先升温至60~70 ℃并恒温，用漩涡混合仪将粘稠的DNA水凝胶混匀；
步骤2e：将DNA水凝胶重新置于PCR仪中，升温至65~75 ℃并恒温5 min，然后以0.45℃/min的速率降至10 ℃进行退火；
步骤2f：将制备好的DNA水凝胶置于室温保存；
步骤3：将目标金属离子溶液与制备的纯DNA水凝胶反应30 min~6 h，使DNA水凝胶骨架中特定的DNAzyme被激活并切断底物序列，破坏水凝胶结构，释放出核酸碎片，然后利用核酸碎片直接测量上清溶液中DNA的本征紫外吸收信号，进而实现对目标金属离子浓度的检测；该步骤具体如下：
步骤3a：将80 μL 0~1000 nmol/L不同浓度的Pb2+标准液加入10 μL的DNA水凝胶中，于25 ℃恒温条件下反应；
步骤3b：每隔1 h从PCR管上清中取1~2 μL，用微量核酸蛋白测定仪测试260 nm处吸光度。
2.一种基于纯DNA功能水凝胶的有害金属离子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：设计两条DNA单体序列E2链和S2链，分别包含目标金属离子的DNAzyme和酶切底物，并至少含有三段互补片段；所述目标金属离子为铀酰离子；所述两条DNA单体序列分别为：
S2链：
5’- GAAATGGATGGG TTTTTTT ACTCACTAT/rA/G GA AGAGATGGACGTG TTTTTTTGACAAGAATAAG -3’；
E2链：
5’- CCCATCCATTTC TTTTTTT CACGTCCATCTCT GCAGTCGGGTAGTTAAACC GACCTTCAGACATAGTGAGT TTTTTTT CTTATTCTTGTC -3’；
步骤2：将设计的两条单体序列混合杂交制备纯DNA水凝胶；该步骤具体如下：
步骤2a：将两条单体序列各自按1.5 mM的理论浓度溶解于缓冲液中，并于35 ℃条件下充分溶解；所述缓冲液为含100 mM NaCl的50 mM MES缓冲液，pH为5.5；
步骤2b：采用微量核酸蛋白测定仪中的寡核苷酸分析程序标定真实浓度；
步骤2c：将经过定量的DNA序列，按照E2链与S2链摩尔比1:1，在统一规格的PCR管中，用缓冲液一步混合配制10 μL体积的终浓度为0.3~0.6 mM的DNA水凝胶；
步骤2d：将DNA水凝胶置于PCR仪中，首先升温至60~70 ℃并恒温，用漩涡混合仪将粘稠的DNA水凝胶混匀；
步骤2e：将DNA水凝胶重新置于PCR仪中，升温至65~75 ℃并恒温5 min，然后以0.45℃/min的速率降至10 ℃进行退火；
步骤2f：将制备好的DNA水凝胶置于室温保存；
步骤3：将目标金属离子溶液与制备的纯DNA水凝胶反应30 min~6 h，使DNA水凝胶骨架中特定的DNAzyme被激活并切断底物序列，破坏水凝胶结构，释放出核酸碎片，然后利用核酸碎片直接测量上清溶液中DNA的本征紫外吸收信号，进而实现对目标金属离子浓度的检测；该步骤具体如下：
步骤3a：将80 μL 0~1000 nmol/L不同浓度的铀酰标准液加入10 μL的DNA水凝胶中，于25 ℃恒温条件下反应；
步骤3b：每隔1 h从PCR管上清中取1~2 μL，用微量核酸蛋白测定仪测试260 nm处吸光度。
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