CN114414337B - 一种基于dna凝胶的铅离子快速检测方法 - Google Patents

一种基于dna凝胶的铅离子快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于DNA水凝胶的铅离子快速检测方法。所述检测方法包括：1)聚丙烯酰胺‑DNA偶联物的制备；(2)DNA水凝胶的合成；(3)标准曲线的绘制；(4)铅离子快速检测。本发明中的DNA水凝胶对铅离子具有响应性，当铅离子存在时会破坏DNA水凝胶的结构，导致凝胶‑溶胶的快速转化。凝胶‑溶胶转化的程度会影响水凝胶的粘度，进而影响反应混合物在试纸条上爬行距离的变化。本发明提供的快速检测方法只需要将DNA水凝胶与铅离子溶液混合反应后滴加到试纸条上测量距离即可。在检测含有浓度为10nM铅离子的待测样品时即可产生信号变化，对于铅离子的检测在40min内即可完成，实现了对铅离子的快速、灵敏和准确的检测。

Description

一种基于DNA凝胶的铅离子快速检测方法
技术领域
本发明提供了一种基于DNA凝胶的铅离子快速检测方法，属于有害金属检测技术领域。
背景技术
铅离子(Pb2+)是一种有毒的重金属离子，铅离子(Pb2+)具有严重的生物毒性且难以自然降解，其经过食物链不断富集，最终进入人体，危害人体健康。因此，加强铅离子的检测在医药、环境、食品等领域都有十分重要的意义。
刺激响应型的DNA水凝胶作为一种生物传感器被广泛关注，具有便携、易于储存、易于实现多种信号读出，且高灵敏度的优点。这种水凝胶大多以高分子作为骨架，以功能化DNA实现交联，可以广泛用于多种靶标检测，如小分子、离子、蛋白等。
现有检测方法有利用DNA水凝胶与金纳米棒结合发展了一种新型可视化检测方法，利用比色法或者紫外-可见光谱可实现对50nM Pb2+的即时检测，还有利用DNA水凝胶与金纳米颗粒比色检测10nM铅离子的气动芯片，通过检测观察距离可实现对2.6nM Pb2+的即时检测，然而以上两种方法均具有检测时间长的缺点，所用时间在2.5h以上。还有一种方法是将DNA凝胶和毛细管相结合可实现对10nM Pb2+的检测，但是该方法所用时间也超过了1h。
中国专利文献CN111239196A公开了一种基于DNA水凝胶的铅离子检测设备及其制备和检测方法，将DNA水凝胶修饰到电极上，利用电化学方法在0.0005-500nmol/L范围内实现对Pb2+的检测，但专利的检测方法所用时间超过3h。中国专利文献CN112941152A公开了一种基于纯DNA功能水凝胶的有害金属离子检测方法，包括：步骤1：设计两条DNA单体序列，分别包含目标金属离子的DNAzyme和酶切底物，并含有三段互补片段；步骤2：将两条单体序列混合杂交制备纯DNA水凝胶；步骤3：将目标金属离子溶液与纯DNA水凝胶反应，使DNA水凝胶骨架中特定的DNAzyme被激活并切断底物序列，破坏水凝胶结构，释放出核酸碎片，然后直接测量上清溶液中核酸碎片的本征紫外吸收信号，实现对目标金属离子浓度的检测。该专利方法所用时间在5h以上。中国专利文献CN113552122A公开了一种生物分子及抑制剂类分子的检测方法。所述生物分子浓度的检测方法，包括如下步骤：将待测物与粘性溶液或水凝胶混合，形成混合溶液，置于指示性试纸条一端，不同量的目标检测物引起粘性溶液或水凝胶的水解程度不同，因此粘性溶液或水凝胶分解释放出的水的含量不同，会在pH试纸条上产生不同距离得移动，通过移动距离的长短实现对目标检测物的检测。但是该专利方法制备的试纸条样品区和检测区混合为一体，使用者操作的差异会很大程度的影响检测的准确性。
上述现有的检测方法或者相关专利要么存在检测时间长，无法实现对Pb2+的快速筛查的缺点；要么存在操作要求高，准确性差的问题。因此，开发能够实现对Pb2+迅速、准确检测的方法具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种基于DNA凝胶的铅离子快速检测方法。该方法能够实现铅离子的快速、及时、准确的检测，具有重要的研究意义和应用价值。
本发明的技术方案如下：
一种基于DNA凝胶的铅离子快速检测方法，包括步骤如下：
(1)聚丙烯酰胺-DNA偶联物的制备：将底物链strand A、丙烯酰胺单体母液和超纯水振荡混合均匀，同时进行第一次吹氮气，然后加入引发剂，在20～30℃下反应4～8min，同时进行第二次吹氮气；将反应产物经超滤和吹干后重新溶解于Tris-乙酸缓冲液中，得到P-SA偶联物；再按照相同的方法处理底物链strand B，得到P-SB偶联物；
其中，所述底物链strand A(SA)的序列为5’-Acrydite-CTGTGAAAATGTGG-3’；所述底物链strand B(SB)的序列为5’-Acrydite-ATGTGTTTTTGTAG-3’；
(2)DNA水凝胶的合成：将底物链Substrate strand和底物链GR-5DNAzyme strand溶解于Tris-乙酸缓冲液，然后加入P-SA偶联物和P-SB偶联物，剧烈振荡混合均匀，在60～70℃下孵育1～3min，重复3次，将混合物在20～30℃下反应25～35min，得到DNA水凝胶；
其中，所述底物链Substrate strand(Sub)的序列为5’-CTACAAAAACACATACT CACTATrAGGAAGAGATGATCCACATTTTCACAG-3’；所述底物链GR-5DNAzyme strand(Dzy)的序列为5’-ATCTCTGAAGTAGCGCCGCCGTATAGT-3’；r代表A为RNA，其它的均为DNA；
(3)标准曲线的绘制：用Tris-乙酸缓冲液配制梯度浓度的铅离子溶液，然后向梯度浓度的铅离子溶液中加入DNA水凝胶，在20～30℃下反应25～35min，取8～12μL反应产物滴加在试纸条上，爬行4～6min，测量反应产物在试纸条上的移动距离，绘制铅离子标准曲线；
(4)铅离子快速检测：向待测样品中加入DNA水凝胶，按照步骤(3)所述的方法测定待测样品反应产物在试纸条上的移动距离，对照铅离子标准曲线，得到待测样品中铅离子的含量。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述丙烯酰胺单体母液的浓度为30％wt；所述底物链strand A和底物链strand B的浓度为2mM。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述P-SA偶联物和P-SB偶联物中底物链strand A和底物链strand B的浓度为1mM，丙烯酰胺单体的浓度为1.2～6wt％。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述引发剂按照如下方法制备：将10mg过硫酸铵和5μL的TEMED试剂溶于超纯水，配制得到100μL溶液。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述引发剂和丙烯酰胺单体母液的体积比为(2～10)：9。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述第一次吹氮气时长为4～6min；第二次吹氮气时长为2～4min。吹氮气可以有效的除氧，氧气会猝灭引发剂产生的自由基，除氧有利于聚丙烯酰胺-DNA偶联物的制备。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述超滤为采用孔径为100KDa的超滤管超滤3次，每次25～35min。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述DNA水凝胶中底物链Substrate strand、底物链GR-5DNAzyme strand、底物链strand A和底物链strand B的摩尔比为1：1：1：1。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述剧烈振荡混合均匀具体为在漩涡混匀器上混和8～12s。
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述梯度浓度的铅离子溶液和DNA水凝胶的体积比为1：(3～5)。
根据本发明优选的，步骤(3)和步骤(4)中，所述试纸条包括样品池和测量区，样品池的直径为6mm，测量区的长度为55～65mm，宽度为1～2mm；
具体制备方法如下：采用Adobe Illustrator CC2019工具设计试纸条，然后通过3D打印机或简易冲床获得相应规格的模具，最后用模具和简易压花机即可获得试纸条。
根据本发明优选的，步骤(4)中，所述待测样品和DNA水凝胶的体积比为1：(3～5)。
本发明的技术特点：
本发明中聚丙烯酰胺-DNA偶联物(P-SA和P-SB)，GR-5DNAzyme，和Substratestrand组成的DNA凝胶对铅离子具有响应性，当铅离子存在时，会激活GR-5DNAzyme的切割属性，对Substrate strand进行切割，从而会破坏DNA凝胶的结构，导致凝胶-溶胶的快速转化。凝胶-溶胶转化的程度会影响水凝胶的粘度，进而影响反应混合物在试纸条上爬行距离的变化。因此，可根据反应混合物在试纸条上爬行距离来判断铅离子的浓度。
有益效果
1、本发明提供基于DNA凝胶的铅离子快速检测方法无需专业人员，只需要将DNA凝胶与铅离子溶液混合反应后滴加到试纸条上测量距离即可。在检测含有浓度为10nM铅离子的待测样品时即可产生信号变化，对于铅离子的检测在40min内即可完成，实现了对铅离子的快速、灵敏和准确的检测。
2、本发明提供基于DNA凝胶的铅离子快速检测方法，无需大型仪器，便于野外采样和即时检查。
附图说明
图1为试纸条的规格图(a)和试纸条模具示意图(b)。
图2为试纸条规格和DNA水凝胶体积之间的关系图。
图中：a为实物照片图，b为曲线图。
图3为丙烯酰胺浓度和DNA浓度对DNA水凝胶在试纸条上移动距离的影响。
图4为Pb2+浓度对样品在试纸条上的移动实际样本图。
图5为Pb2+浓度和样品在试纸条上的移动距离的标准曲线。
图6为丙烯酰胺浓度和DNA浓度对铅离子标准溶液爬行距离的影响。
图中：I，丙烯酰胺浓度2.4wt％，DNA浓度100μM；II，丙烯酰胺浓度3.6wt％，DNA浓度70μM；III：丙烯酰胺浓度4.8wt％，DNA浓度40μM；IV，丙烯酰胺浓度6.0wt％，DNA浓度30μM。所述DNA浓度为底物链SA、SB、GR-5DNAzyme和Substrate strand各自的浓度。
图7为在湖水(Lake water)和自来水(Tap water)中检测Pb2+的响应信号。
图中：a为实物照片图，b为柱状图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所用DNA的命名及结构如下表1所示，均是由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并纯化。
表1
实施例1不同丙烯酰胺浓度的P-SA偶联物和P-SB偶联物的制备
将丙烯酰胺溶解于超纯水中，配制得到浓度为30wt％丙烯酰胺单体母液。将10mg过硫酸铵和5μL的TEMED试剂溶于超纯水，配制得到100μL引发剂。
将25μL浓度为2mM的底物链strand A(SA)、2μL丙烯酰胺单体母液和14μL超纯水分别振荡混合均匀，同时进行第一次吹氮气，吹氮气时长为5min，然后加入9μL引发剂，在25℃下反应6min，同时进行第二次吹氮气，吹氮气时长为3min，得到SA浓度为1mM，丙烯酰胺浓度为1.2wt％的P-SA反应产物。
同理，将丙烯酰胺单体母液和超纯水的体积分别改变为4μL和12μL；6μL和10μL；8μL和8μL；10μL和6μL，底物链strand A、引发剂的体积及实验方法均不变。分别得到SA浓度为1mM，丙烯酰胺浓度分别为2.4wt％、3.6wt％、4.8wt％和6.0wt％的P-SA反应产物。
将反应产物用100KD超滤管超滤3次除去未反应的丙烯酰胺、引发剂等小分子，每次30min，再将纯化后的反应产物溶于300μL超纯水中并吹干得到反应产物膜，最后将反应产物膜重新溶解于Tris-乙酸缓冲液，得到SA浓度为1mM，丙烯酰胺浓度分别为1.2wt％、2.4wt％、3.6wt％、4.8wt％和6.0wt％的P-SA偶联物。
再按照相同的方法以底物链strand B(SB)制备得到P-SB偶联物。
实施例2不同丙烯酰胺浓度的DNA水凝胶的制备
将底物链Substrate strand和底物链GR-5DNAzyme strand溶解于Tris-乙酸缓冲液，配置成浓度为2mM的母液，然后分别加入不同体积的实施例1制备的丙烯酰胺浓度为1.2wt％的P-SA偶联物和P-SB偶联物，底物链Substrate strand和底物链GR-5DNAzymestrand以及适量的超纯水，在漩涡混匀器上混和10s，在65℃下孵育2min，重复3次，将混合物在25℃下反应20min，得到丙烯酰胺浓度为1.2wt％，DNA浓度分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200μM的DNA水凝胶。
其中，底物链Substrate strand、底物链GR-5DNAzyme strand、底物链strand A和底物链strand B的摩尔比为1：1：1：1。所述DNA浓度为底物链SA、SB、GR-5DNAzyme和Substrate strand的各自浓度，即DNA浓度为10μM时，底物链SA、SB、GR-5DNAzyme和Substrate strand的浓度均为10μM。
同理，按照相同的方法丙烯酰胺浓度分别为2.4wt％、3.6wt％、4.8wt％和6.0wt％，DNA浓度分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200μM的DNA水凝胶。
实施例3试纸条的选择
采用Adobe Illustrator CC2019工具设计试纸条，然后通过3D打印机或简易冲床获得相应规格的模具，最后用模具和简易压花机获得试纸条1和试纸条2。试纸条的规格如图(a)所示，试纸条模具如图(b)所示。
所述试纸条包括样品池和测量区，试纸条1的样品池的直径为6mm，测量区的长度为60mm，宽度为1mm。试纸条2的样品池的直径为6mm，测量区的长度为60mm，宽度为2mm。
将实施例2制备的丙烯酰胺浓度为3.6wt％的DNA水凝胶和浓度为5000nM的铅离子按照体积比4：1混合，模拟DNA水凝胶完全转变成溶胶的反应物，确定合适的试纸条规格和合适的反应物体积。具体方法为：各取6、7、8、9、10μL该反应物，分别滴加在试纸条1和试纸条2上，爬行5min，测量溶胶在试纸条1和试纸条2上的移动距离，并根据绘制曲线，结果如图2所示。
由图2a可知，溶胶在试纸条1和试纸条2上的爬行距离均随着DNA水凝胶的体积增大而变长，两种规格的试纸条均可以用于检测铅离子浓度。由图2b可知，试纸条1和试纸条2上的爬行距离均和溶胶体积呈线性关系，并且测量区的宽度为1mm的试纸条1上的斜率更大，表明试纸条1对溶胶体积的变化更加敏感。因此，接下来的实验均选择样品池直径为6mm，测量区长度为60mm，宽度为1mm的试纸条。
实施例4丙烯酰胺浓度和底物链DNA浓度的选择
各取10μL实施例2制备的丙烯酰胺浓度分别为1.2wt％、2.4wt％、3.6wt％、4.8wt％和6.0wt％，DNA浓度分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200μM的DNA水凝胶，滴加在试纸条上，爬行5min，测量DNA水凝胶在试纸条上的移动距离，结果如图3所示。
由图3可知，丙烯酰胺浓度和DNA浓度均可对样品的爬行距离产生影响。随着丙烯酰胺浓度的增加，爬行相同距离所需要的DNA浓度越小。即丙烯酰胺浓度越高，形成DNA凝胶所需要的DNA浓度越低。可以发现当丙烯酰胺浓度为1.2wt％，2.4wt％，3.6wt％，4.8wt％和6.0wt％时，形成凝胶最低的DNA浓度分别为140μM，100μM，70μM，40μM和30μM。
实施例5铅离子浓度的检测
用Tris-乙酸缓冲液配制梯度浓度分别为10、30、50、100、150、200、500和1000nM的铅离子溶液。
向梯度浓度铅离子溶液中分别加入实施例2制备的丙烯酰胺浓度2.4wt％，DNA浓度100μM；丙烯酰胺浓度3.6wt％，DNA浓度70μM；丙烯酰胺浓度4.8wt％，DNA浓度40μM；丙烯酰胺浓度6.0wt％，DNA浓度30μM的DNA水凝胶，铅离子溶液和DNA水凝胶的体积比为1:4，在25℃下反应30min，得到反应产物。取10μL反应产物滴加在试纸条上，爬行5min，测量反应产物在试纸条上的移动距离，结果如图4所示，绘制标准曲线，如图5所示。然后取梯度浓度分别为50、100和200nM的铅离子溶液的爬行距离数据，绘制柱状图，结果如图6所示。
由图4可知，反应产物爬行长度与Pb2+浓度在0～200nM成线性关系。当Pb2+为10nM时即可产生爬行长度的变化，即检测可以达到10nM。
由图6可知，不同DNA凝胶样品对铅离子的敏感程度不同，不同浓度Pb2+作用下，样品I基本没有产生爬行长度的变化。样品III在100和200nM Pb2+浓度作用下，爬行长度相同。而IV在50，100和200nM Pb2+作用下，爬行长度也基本相同。样品II在不同浓度Pb2+作用下，爬行长度区分明显。表明样品II对Pb2+具有更好的线性关系。
实施例6验证实用性
向湖水和自来水中分别加入50，100和150nM的铅离子溶液为待测样品，该浓度为与水凝胶按照一定体积比混合稀释后的浓度。利用丙烯酰胺浓度为3.6wt％、DNA浓度为70μM的DNA水凝胶，按照实施例5所述方法进行铅离子浓度检测，将移动距离对照如图5所示铅离子标准液所得的标准曲线，计算得到待测样品中的铅离子浓度，结果如图7所示。
由图7可知，本发明的检测方法在实际样本中检测到的铅离子浓度分别为自来水0.75、52.48、103.28、151.53nM；湖水0.75、49.01、100.2、148.52nM。即本发明提供的检测方法所得结果与添加的铅离子浓度的误差不超过5％，并且所用时间分别为32min和35min，因此本发明实现了对铅离子的快速检测，同时具有实用性和检测准确性。
以上所述仅为本发明的具体实施方式。本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权力要求所界定的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种基于DNA凝胶的铅离子快速检测方法，其特征在于，包括步骤如下：
(1)聚丙烯酰胺-DNA偶联物的制备：将底物链strand A、丙烯酰胺单体母液和超纯水振荡混合均匀，同时进行第一次吹氮气，然后加入引发剂，在20～30℃下反应4～8min，同时进行第二次吹氮气；将反应产物经超滤和吹干后重新溶解于Tris-乙酸缓冲液中，得到P-SA偶联物；再按照相同的方法处理底物链strand B，得到P-SB偶联物；
其中，所述底物链strand A(SA)的序列为5’-Acrydite-CTGTGAAAATGTGG-3’；所述底物链strand B(SB)的序列为5’-Acrydite-ATGTGTTTTTGTAG-3’；
(2)DNA水凝胶的合成：将底物链Substrate strand和底物链GR-5DNAzyme strand溶解于Tris-乙酸缓冲液，然后加入P-SA偶联物和P-SB偶联物，剧烈振荡混合均匀，在60～70℃下孵育1～3min，重复3次，将混合物在20～30℃下反应25～35min，得到DNA水凝胶；
其中，所述底物链Substrate strand(Sub)的序列为5’-CTACAAAAACACATACT CACTATrAGGAAGAGATGATCCACATTTTCACAG-3’；所述底物链GR-5DNAzyme strand(Dzy)的序列为5’-ATCTCTGAAGTAGCGCCGCCGTATAGT-3’；
(3)标准曲线的绘制：用Tris-乙酸缓冲液配制梯度浓度的铅离子溶液，然后向梯度浓度的铅离子溶液中加入DNA水凝胶，在20～30℃下反应25～35min，取8～12μL反应产物滴加在试纸条上，爬行4～6min，测量反应产物在试纸条上的移动距离，绘制铅离子标准曲线；
(4)铅离子快速检测：向待测样品中加入DNA水凝胶，按照步骤(3)所述的方法测定待测样品反应产物在试纸条上的移动距离，对照铅离子标准曲线，得到待测样品中铅离子的含量。
2.如权利要求1所述的铅离子快速检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述丙烯酰胺单体母液的浓度为30％wt；所述底物链strand A和底物链strand B的浓度为2mM。
3.如权利要求1所述的铅离子快速检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述P-SA偶联物和P-SB偶联物中底物链strand A和底物链strand B的浓度为1mM，丙烯酰胺单体的浓度为1.2～6wt％。
4.如权利要求1所述的铅离子快速检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述引发剂按照如下方法制备：将10mg过硫酸铵和5μL的TEMED试剂溶于超纯水，配制得到100μL溶液。
5.如权利要求1所述的铅离子快速检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述引发剂和丙烯酰胺单体母液的体积比为(2～10)：9。
6.如权利要求1所述的铅离子快速检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述第一次吹氮气时长为4～6min；第二次吹氮气时长为2～4min；所述超滤为采用孔径为100KDa的超滤管超滤3次，每次25～35min。
7.如权利要求1所述的铅离子快速检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述DNA水凝胶中底物链Substrate strand、底物链GR-5 DNAzyme strand、底物链strand A和底物链strand B的摩尔比为1：1：1：1。
8.如权利要求1所述的铅离子快速检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述梯度浓度的铅离子溶液和DNA水凝胶的体积比为1：(3～5)。
9.如权利要求1所述的铅离子快速检测方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)中，所述试纸条包括样品池和测量区，样品池的直径为6mm，测量区的长度为55～65mm，宽度为1～2mm；
具体制备方法如下：采用Adobe Illustrator CC2019工具设计试纸条，然后通过3D打印机或简易冲床获得相应规格的模具，最后用模具和简易压花机即可获得试纸条。
10.如权利要求1所述的铅离子快速检测方法，其特征在于，步骤(4)中，所述待测样品和DNA水凝胶的体积比为1：(3～5)。
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