CN111638209A - 一种基于纳米金花与dna核酶的铅离子目视检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于纳米金花与DNA核酶的铅离子目视检测方法及其应用，该检测方法包括如下步骤：1)利用具有铅离子响应性的DNA核酶制备反应试剂A；2)加入待测样品，混匀，室温反应10分钟；3)利用聚腺嘌呤DNA合成纳米金花结构；4)纳米金花溶液加入上述样品反应液，并加入2M NaCl溶液，混匀，即可通过观察颜色变化判定样品中是否含有铅离子。该检测反应在20分钟内完成。本发明提供了一种能简便、快速、高灵敏度检测铅离子的方法，通过肉眼判定即可检测到浓度低至6μg/L的铅离子，不依赖大型仪器设备与检测技术，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于化学测量学技术领域，具体涉及一种基于纳米金花与DNA核酶的铅离子目视检测方法及其应用。
背景技术
铅污染是我国多个地区和城市都存在的重要污染之一，极大地影响了居民的生活和身体健康。调查报告显示发展中国家每年有80万人死于铅暴露。对于儿童来讲，由于大脑发育尚未完成，“血脑屏障”不能阻止铅离子进入大脑，因此更容易受到伤害。2011年9月发生了上海康桥儿童血铅超标事件，当地1306名儿童中有49名血铅超标。事情发生后在社会上引起了巨大的恐慌，调查后发现主要是康桥地区的3家涉铅企业违规排放造成的。除此之外，汽车尾气、家装材料、化妆品、儿童玩具等生活中朝夕相处的环境和物品也是重要的铅污染来源，直接影响人体健康。因此建立有效的实时监测机制，并将检测结果快速反馈到相关机构，及时采取相关措施是一件迫在眉睫的事情。
2018年1月1日起国家实施的一系列新规中，有多条涉及到环境保护，包括《中华人民共和国环境保护税法》，依照该法规定征收环境保护税，同时在全国试行生态环境损害赔偿制度，建立河长制来有效监督水污染等。这些制度的执行对于积极促进生态环境修复，保护生态环境和人民环境权益具有重要意义。在这样一个大环境下，我们提出发展一种快速、简便、便宜的检测方法，能够在任意一个环境或者现场进行快速检测，把检测结果及时反馈给环保单位，协助相关人员做出准确判断，及时采取制止措施。
目前检测铅污染的手段主要是在专业机构中利用大型仪器进行检测，成本高，反应慢，需专人操作，很难提供实时监测和反馈。例如电感耦合等离子体质谱ICPMS，电感耦合等离子体原子发射光谱法ICPAES，离子色谱等。这些仪器通常都非常昂贵(几十万到几百万元)，需要专人进行操作，检测时间也较长。对于环境监测来讲，包括偏远地区在内的大范围筛查是监测的重点内容之一，目前这种实验室检测的标准方法难以满足这种需求。事实上对于大多数情况下，能够对环境污染物做一个简单的初步筛选，获得一些初步信息，然后再对可疑环境进行重点检查，是一种行之有效的方法，可以加大监控范围。因此需要发展快速、灵敏、低成本的检测方法来满足对实时检测的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于纳米金花与DNA核酶的铅离子目视检测方法及其应用，从而解决现有技术中缺乏有效的检测方法的问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
1.首先，提供一种对铅离子具有特异响应能力的DNA核酶试剂(试剂A)。该试剂制备方法包括以下步骤：
1.1.在1.5mL离心管中加入100μL 10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2，含100mMNaCl)。
1.2.加入链I(100μM，5μL)与等量的链II(序列见表1，合成自上海生工，PAGE纯化)，用混匀仪充分混合均匀。
1.3.在恒温仪上加热至80℃，然后在90分钟内缓慢降温至室温(20℃)。
1.4.加入900μL上述Tris-HCl缓冲液，得到DNA核酶反应液。
表1.DNA核酶序列
注：rA为核糖核酸(非脱氧)碱基，其余为脱氧核糖核酸碱基。
2.其次，提供一种可对核酶反应产生可见颜色信号的纳米金花试剂(试剂B)。该纳米金花试剂制备方法如下：
2.1.在0.6mL离心管中取90μL粒径为10nm的纳米金溶液(购买至Sigma-Aldrich，浓度2.5nM)
2.2.加入10μL寡聚腺嘌呤DNA(A10，购买自上海生工，PAGE纯化，溶于去离子水，浓度10μM)，混匀，室温反应15分钟。
2.3.加入20μL浓度为10mM的盐酸羟胺混匀。
2.4.加入2μL质量-体积浓度0.2％的氯金酸溶液，室温下激烈振荡混匀，反应1分钟。
2.5.10000G离心20分钟，去上清，加100μL去离子水重悬沉淀。获得试剂B
3.进行铅离子检测，步骤如下：
3.1.在新的0.6mL离心管中加入100μL试剂A。
3.2.加入含有铅离子的待测样品溶液100μL，充分混匀，室温反应10分钟。
3.3.加入100μL试剂B，混匀后，室温反应5分钟。
3.4.加入浓度为2M的NaCl溶液10μL，混匀。
3.5.肉眼观察纳米金花溶液颜色变化。如溶液颜色变为蓝灰色，则说明样品中不含铅离子或铅离子含量没有达到检测限；如溶液颜色变为紫色，则说明样品中含有可检测浓度(>6μg/L)的铅离子。
该检测方法的核心组成部分是DNA酶杂交的纳米金花溶液，在遇到铅离子时会发生变色反应，且颜色变化的程度与铅离子的浓度密切相关。该颜色变化可以用肉眼直接观察，因此无需任何仪器即可实现对铅离子的目视检测，其检测原理如图1所示。
本发明的积极进步效果在于：方法简便快速，在室温下20分钟内即可完成。不依赖大型设备仪器，裸眼目视即可完成结果判定。具有较好的灵敏度，可以检测到浓度低至6μg/L的铅离子，低于国家饮用水标准给出的铅离子限定值(10μg/L)。该研究提供了一种适合于大范围初步筛查铅污染的简便方法，使得重金属铅的快速检测、及时预警、及早采取措施成为可能。同时，该检测方法具有铅离子特异性，避免了其它金属离子的干扰。
总之，本发明提供了一种简便、快速、灵敏、特异的铅离子目视检测方法，在重金属离子的现场筛查等场景中有较好的应用潜力。
附图说明
图1是本发明的原理示意图；
图2是实施例1中不同浓度的铅离子溶液检测结果；
图3是对实际工业废水样品的检测。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
试剂和材料：10纳米的纳米金花溶液从Sigma购买；DNA酶购于上海生物工程有限公司；醋酸铅等试剂采购于国药集团化学试剂有限公司，工业废水样品由上海环境学会提供，所用水为Milli Q(18MΩ)。仪器设备：精密分析天平(MS105DU，Mettler Toledo)；移液器(Research plus，Eppendorf)；混匀仪(Lab DancerS25，IKA)。
实施例1：铅离子标准样品的检测
1.制备铅离子标准样品，步骤如下：
1.1.称量20mg三水合乙酸铅(C4H6O4Pb·3H2O)粉末溶于109mL去离子水，获得浓度为100mg/L的铅离子溶液。
1.2.经过进一步稀释，分别获得100μg/L、60μg/L、30μg/L、15μg/L、6μg/L、3μg/L、1μg/L等浓度的铅离子检测标准样品。
2.铅离子样品检测，步骤如下：
2.1.检测铅离子时，在新离心管中加入100μL试剂A。
2.2.加入前述铅离子标准样品溶液100μL，室温反应10分钟。
2.3.在溶液中加入纳米金花溶液100μL，混匀后，室温反应5分钟。
2.4.加入浓度为2M的NaCl溶液10μL，混匀。
2.5.肉眼观察纳米金花溶液颜色。
结果如图2所示：当样品中铅离子浓度小于6μg/L时(包括0、0.5、1、3μg/L)，溶液颜色变为蓝灰色；当样品中铅离子浓度大于或等于6μg/L时(包括6、15、30、60、100μg/L)，溶液颜色变为紫色。说明该方法可以检测浓度大于等于6μg/L的铅离子。
实施例2：对工业污水的铅离子检测
1.制备不同浓度工业废水样品，步骤如下：1.1.取工业废水样品，加去离子水稀释，获得10倍、100倍、1000倍稀释的样品。
2.铅离子样品检测，步骤如下：
2.1.检测铅离子时，在新离心管中加入100μL试剂A。
2.2.加入前述铅离子标准样品溶液100μL，室温反应10分钟。
2.3.在溶液中加入纳米金花溶液100μL，混匀后，室温反应5分钟。
2.4.加入浓度为2M的NaCl溶液10μL，混匀。
2.5.肉眼观察纳米金花溶液颜色。
利用该方法对实际工业废水样品进行检测，发现1000与100倍稀释样品溶液颜色呈蓝灰色，而10倍稀释样品呈现蓝紫色，如图3所示。根据颜色变化状态，对比之前标准溶液的浓度，估算实际样品中铅离子的浓度约100μg/L。
Claims (4)
1.一种基于纳米金花与DNA核酶的铅离子目视检测方法，其特征在于，该检测方法包括如下步骤：
1)利用具有铅离子响应性的DNA核酶制备反应试剂A；
2)加入待测样品，混匀，室温反应10分钟；
3)利用聚腺嘌呤DNA合成纳米金花结构；
4)纳米金花溶液加入上述样品反应液，并加入2M NaCl溶液，混匀，即可通过观察颜色变化判定样品中是否含有铅离子。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1)中所述试剂A当待测样品中存在铅离子时，DNA核酶催化DNA双链切割反应，释放DNA单链。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1)中所述纳米金花使用了聚腺嘌呤DNA单链(A10)合成，粒径约30nm。
4.一种如权利要求1所述的检测方法在饮用水、饮料、自然水体、工业排放的各种样品的铅离子检测中的应用。
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