CN106442345A - 一种基于cd光谱检测技术的铅离子检测方法 - Google Patents

一种基于cd光谱检测技术的铅离子检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于CD光谱检测技术的铅离子检测方法，包括以下步骤：(1)设计与合成相应的寡核苷酸片段；(2)金纳米的合成；(3)金纳米二聚体的组装；(4)实际添加样品的测定；本发明的检测方法，可实现水中铅离子的简单、快速、高灵敏检测，满足现实生活中对铅离子离子的检测需求。

Description

一种基于CD光谱检测技术的铅离子检测方法
技术领域
本发明涉及一种铅离子检测方法，具体是一种基于圆二色光谱(CD)光谱检测技术的铅离子检测方法，属于分析化学和食品安全技术领域。
背景技术
核酸配子是一个单链的DNA或RNA分子，选择性地绑定到各种具有高亲和力的目标物如小分子、蛋白质和药物等。与传统的分子识别系统相比，寡核苷酸适配子由于容易合成而有很大的优势。寡核苷酸适配子容易被标记，可以长期稳定存储，具有优良的稳定性,、广泛的适用性,以及高敏感特性。因此,它们的优异属性使其在医学诊断、环境监测、生物分析方面的应用有很大潜力。此外核酸配子可以与阳离子聚合物由于静电引力而吸引相互缠绕。
铅是一种普遍存在于自然界并且有剧毒的重金属元素，其多以化合物的形态稳定存在。但是由于铅广泛地应用于人类生活生产的各个领域，例如矿山开采、金属冶炼、汽油、建筑材料、燃煤、蓄电池汽车尾气等，在许多地区引发了不同程度地铅污染，给自然环境和人类身体健康带来危害。铅主要通过消化道和呼吸道等方式进入到人体内，并且与人体内的各种酶和氨基酸等相互结合，干扰人体的生化和生理活性。儿童、老人和免疫力低的人对铅比较敏感，铅中毒主要容易引发贫血症、神经失调和肾损伤等。虽然许多传统的方法已应用于的汞离子检测，如酶联免疫吸附法，电感耦合等离子体质谱法，冷原子吸收光谱法和色谱等，其样品制备复杂和昂贵的设备限制了它的广泛发展。
由于具有特殊的光学性质，手性金属或半导体纳米材料在很多领域存在着广泛应用溶液中组装体的等离子体。CD信号与体系中组装体的组成及构型密切相关。研究表明金纳米颗粒组装体的CD信号会随着产物聚集程度的增加而信号强度降低。因此，为了获得强烈的CD信号，本研究构建了一种基于非对称金纳米颗粒二聚体手性传感器。该二聚体的CD信号在530nm，这是由于组装体中的手性分子的手性从紫外区转移到可见光区导致的。
GR-5 DNA酶已经被很多学者应用于铅离子的检测(如公开号为CN103695540A的专利文献)，在铅离子存在的情况下，GR-5 DNA酶能切断偶联DNA的“rA”处，使金纳米二聚体分离，导致CD光谱的变化，通过检测信号的变化强度实现对铅离子的快速灵敏检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于CD光谱检测技术的铅离子检测方法，该检测方法实现水中铅离子的简单、快速、高灵敏检测。
为了达到上述的技术目的，本发明的技术方案是：
一种基于CD光谱检测技术的铅离子检测方法，包括以下步骤：
(1)设计、合成寡核苷酸片段：
设计能够对铅离子特异性识别且具有GR-5 DNA酶剪切作用的DNA1；制备合成具有巯基修饰的DNA2，DNA1、DNA2序列：
DNA1：5’-SH-GCGCCTTACCACTrAGGAAGAGATGATT-3’
DNA2：5’-SH-CGGTAATCATCTCTGAAGTA-3’
(2)根据柠檬酸钠法合成金纳米颗粒溶液：Au NP1＝35±5nm、Au NP2＝20±3nm；
(3)金纳米颗粒二聚体的组装；
1)将上述制备的金纳米颗粒溶液和100μM的DNA1溶液在室温下反应3h，然后加入2M的氯化钠溶液至终浓度为0.05M，混合均匀，并在不断的摇晃下反应12h；上述金纳米颗粒溶液和DNA1溶液的体积比为50：1；
2)将上述制备的金纳米颗粒溶液和100μM的DNA2溶液在室温下反应3h，然后加入2M的氯化钠溶液至终浓度为0.05M，混合均匀，并在不断的摇晃下反应12h；上述金纳米颗粒溶液和DNA2溶液的体积比为50：1；
3)上述反应液分别在3000rpm下离心10min，去除未偶联上的DNA，并将混合液分别命名为NP1-DNA1和NP2-DNA2；
4)将NP1-DNA1和NP2-DNA2按照1:1的体积混合，室温下孵育过夜，离心重悬在超纯水中，制得金纳米颗粒二聚体的组装溶液；
(4)在金纳米颗粒二聚体的组装溶液中加入样品(即待检测的铅离子溶液)，反应30min，通过CD光谱检测铅离子。
GR-5DNA酶剪切反应及标准曲线的建立：
取金纳米颗粒二聚体的组装溶液100μL，分别加入不同浓度的铅离子溶液(浓度范围0、0.5、1、5、10、20、50ng/mL)，反应30min，对样品进行CD光谱表征，如图1所示。在铅离子溶液中，随着其浓度的增加，金纳米颗粒二聚体自组装体的程度越小，因此，可以建立随着铅离子的浓度增加而成比例增强的CD光谱信号传感器。利用这一特性，设置铅离子的浓度为0.5-50ng/mL，以535nm处的CD信号强度值作为纵坐标y，铅离子浓度为横坐标x建立标准曲线，如图2所示，方程为y＝8.615LOG(x)–16.339，所得曲线表现出良好的相关性(R2＝0.9911)。
铅离子的特异性测定：
取5个小离心管分别加入金纳米二聚体的组装溶液100μL，然后向各离心管中分别加Pb2+、Hg2+、Cu2+、Cd2+、Ni2+、Mn2+，使加入金属离子的最终浓度为50ng/mL，混合并在室温下反应30分钟。以535nm处的CD信号强度值绘制特异性柱状图，如图3所示，由实验结果得知这种基于CD光谱检测技术的铅离子检测传感器具有很高的特异性。
上述方法实现液体中铅离子的检测，进一步地，为了获得液体中铅离子的浓度，基于下列方程确定样品中铅离子浓度：y＝8.615LOG(x)–16.339，535nm处的CD信号强度值作为纵坐标y，铅离子浓度为横坐标x。
本发明的检测方法，可实现水中铅离子的简单、快速、高灵敏检测，满足现实生活中对铅离子离子的检测需求。本发明方法中使用的寡核苷酸适配子容易被标记，可以长期稳定存储，具有优良的稳定性,、广泛的适用性,以及高敏感特性。
附图说明
图1为不同浓度的铅离子溶液CD光谱图。
图2为铅离子浓度的标准曲线图。
图3为不同金属离子溶液在535nm处的CD信号强度值的特异性柱状图
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
(1)设计、合成寡核苷酸片段：
设计能够对铅离子特异性识别且具有GR-5 DNA酶剪切作用的DNA1；制备合成具有巯基修饰的DNA2，DNA1、DNA2序列：
DNA1：5’-SH-GCGCCTTACCACTrAGGAAGAGATGATT-3’
DNA2：5’-SH-CGGTAATCATCTCTGAAGTA-3’
(2)根据柠檬酸钠法(现有技术)合成金纳米颗粒溶液：Au NP1＝35±5nm、Au NP2＝20±3nm；
(3)金纳米颗粒二聚体的组装；
1)将上述制备的金纳米颗粒溶液100μL和2μL 100μM的DNA1溶液在室温下反应3h，然后加入2M的氯化钠溶液至终浓度为0.05M，混合均匀，并在不断的摇晃下反应12h；
2)将上述制备的金纳米颗粒溶液100μL和2μL 100μM的DNA2溶液在室温下反应3h，然后加入2M的氯化钠溶液至终浓度为0.05M，混合均匀，并在不断的摇晃下反应12h；
3)上述反应液分别在3000rpm下离心10min，去除未偶联上的DNA，并将混合液分别命名为NP1-DNA1和NP2-DNA2；
4)将NP1-DNA1和NP2-DNA2按照1:1的体积混合，室温下孵育过夜，离心重悬在超纯水中，制得金纳米颗粒二聚体的组装溶液；
(4)在金纳米颗粒二聚体的组装溶液中加入样品一(样品一为自来水中添加1ng/mL的铅离子)，反应30min，通过CD光谱检测铅离子。
实施例2
与实施例1相同，不同处为：在步骤(4)中，在金纳米颗粒二聚体的组装溶液中加入样品二，样品二为自来水中添加10ng/mL的铅离子。
实施例3
与实施例1相同，不同处为：在步骤(4)中，在金纳米颗粒二聚体的组装溶液中加入样品三，样品三为自来水中添加20ng/mL的铅离子。
上述实施例1-3铅离子水样品测定结果如表1所示。
表1铅离子水样品的测定
由上表1可以看出，实际样本中的铅离子的添加回收率在99.35％～104.10％之间，能够满足现实生活中对铅离子离子的检测需求。
上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种基于CD光谱检测技术的铅离子检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)设计、合成寡核苷酸片段：
设计能够对铅离子特异性识别且具有GR-5DNA酶剪切作用的DNA1；制备合成具有巯基修饰的DNA2，DNA1、DNA2序列：
DNA1：5’-SH-GCGCCTTACCACTrAGGAAGAGATGATT-3’
DNA2：5’-SH-CGGTAATCATCTCTGAAGTA-3’
(2)根据柠檬酸钠法合成金纳米颗粒溶液：Au NP1＝35±5nm、Au NP2＝20±3nm；
(3)金纳米颗粒二聚体的组装；
1)将上述制备的金纳米颗粒溶液和100μM的DNA1溶液在室温下反应3h，然后加入2M的氯化钠溶液至终浓度为0.05M，混合均匀，并在不断的摇晃下反应12h；上述金纳米颗粒溶液和DNA1溶液的体积比为50：1；
2)将上述制备的金纳米溶液和100μM的DNA2溶液在室温下反应3h，然后加入2M的氯化钠溶液至终浓度为0.05M，混合均匀，并在不断的摇晃下反应12h；上述金纳米溶液和DNA2溶液的体积比为50：1；
3)上述反应液分别在3000rpm下离心10min，去除未偶联上的DNA，并将混合液分别命名为NP1-DNA1和NP2-DNA2；
4)将NP1-DNA1和NP2-DNA2按照1:1的体积混合，室温下孵育过夜，离心重悬在超纯水中，制得金纳米颗粒二聚体的组装溶液；
(4)在金纳米颗粒二聚体的组装溶液中加入待检测的样品，反应30min，通过CD光谱检测铅离子。
2.根据权利要求1所述的一种基于CD光谱检测技术的铅离子检测方法，其特征在于基于下列方程确定样品中铅离子的浓度：y＝8.615LOG(x)–16.339，535nm处的CD信号强度值作为纵坐标y，铅离子浓度为横坐标x。
3.根据权利要求2所述的一种基于CD光谱检测技术的铅离子检测方法，其特征在于所述方程标准曲线根据以下步骤建立：
取金纳米颗粒二聚体的组装溶液100μL，分别加入0、0.5、1、5、10、20、50ng/mL浓度的铅离子溶液，反应30min，对样品进行CD光谱表征，建立随着铅离子的浓度增加而成比例增强的CD光谱信号传感器，利用这一特性，设置铅离子的浓度为0.5-50ng/mL，以535nm处的CD信号强度值作为纵坐标y，铅离子浓度为横坐标x建立标准曲线，方程为y＝8.615LOG(x)–16.339。
4.根据权利要求1所述的一种基于CD光谱检测技术的铅离子检测方法，其特征在于铅离子根据以下方法进行特异性测定：
取小离心管分别加入金纳米二聚体的组装溶液100μL，然后向各离心管中分别加Pb2+、Hg2+、Cu2+、Cd2+、Ni2+、Mn2+，使加入金属离子的最终浓度为50ng/mL，混合并在室温下反应30分钟，以535nm处的CD信号强度值绘制特异性柱状图，从而测定铅离子的特异性。
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