CN103540651A - 一种纳米金复合物及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种纳米金复合物及其制备和应用。具体地,本发明提供的纳米金复合物包括纳米金颗粒和功能分子,并且所述的功能分子通过富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区结合于纳米金颗粒表面。所述的功能分子具有富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区、功能区、和位于结合区与功能区之间的过渡区。本发明还提供了所述纳米金复合物的制备方法及应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和生物检测领域,具体地,本发明涉及一种纳米金复合物及其制备和应用。
背景技术
纳米金复合物是一种常用的生物纳米材料,它由功能分子通过一定的方式联接在纳米金颗粒上,在生物诊断等方面有广泛的应用。
DNA-纳米金复合物是一种常见的纳米金复合物形式。通常,这种DNA-纳米金复合物是由巯基修饰的DNA通过金硫键在金表面自组装作用得到的。应用这种方法制备DNA-纳米金复合物,需要将DNA进行化学修饰,操作过程十分复杂,而且成本很高,操作过程中还可能形成不需要的双硫键,或存在样品污染等问题。该方法常见的缺点是未完全功能化的纳米金颗粒纳米金由于表面非特异性吸附,DNA吸附在纳米金表面呈现倒伏状态;此外,这种方法虽然携带的DNA密度很高,但是在高度功能化的纳米金颗粒上,DNA的高密度使得目标检测分子不易接近,影响检测效率。
使用竞争性的小分子,如巯基己醇(MCH),可以通过取代掉吸附在金表面的DNA并迫使DNA序列保持直立状态来提高杂交效率,但是该方法中使用的竞争性小分子数量和反应的控制非常复杂,并且竞争性小分子的引入会降低纳米金颗粒的稳定性。
因此,本领域迫切需要开发一种新型的制备纳米金复合物的方法,能通过一种简单有效的方法将功能分子连接到纳米金颗粒上,并能有效调控纳米金粒子表面固定的功能分子的密度、方向以及构型,从而提高纳米金纳米金复合物的检测效率。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的纳米金-复合物及其制备和应用。
在本发明的第一方面,提供了一种纳米金复合物,所述复合物包括纳米金颗粒和功能分子,并且所述的功能分子通过富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区结合于纳米金颗粒的表面。
在另一优选例中,所述的功能分子具有式I-式III任一所示结构:
B-L-R I;
R-L-B-L-R II;
(B-L-R-L-B)m III;
式中,
B表示富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区;
R表示功能区;
L表示位于B和R之间的任选的过渡区;
m为选自1-20的整数。
在另一优选例中,所述的富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区具有选自下组的一个或多个特征:
(i)结合区的长度为5-100个碱基,较佳地5-40个碱基,更佳地10-30个碱基;
(ii)结合区含有一个或多个poly(A)n区段,其中n为选自1-100的整数,较佳地n为选自2-30的整数,更佳地n为选自3-20的整数;
(iii)结合区中A碱基的含量≥70%,较佳地≥80%,更佳地≥90%,最佳地≥95%,或为100%;
(iv)结合区中T碱基和U碱基的总量≤20%,较佳地≤10%,更佳地≤5%,最佳地≤0%。
在另一优选例中,poly(A)n区段的个数为1-3个。
在另一优选例中,所述的结合区包括DNA、RNA、和/或PNA构成的单链。
在另一优选例中,所述的过渡区由选自下组的成分组成:寡核苷酸、多肽、高分子链、小分子、或其组合。
在另一优选例中,所述的过渡区是长度为0-50个(较佳地5-20个)碱基组成的寡核苷酸。
在另一优选例中,所述的碱基为T或U,较佳地为T。
在另一优选例中,所述的功能区为修饰或未修饰的、以及标记或未标记的选自下组的分子(moiety):核酸、核酸适配体、核酶(DNAzyme或RNAzyme)、蛋白质、多肽、抗体、探针、酶、凝集素、配体、小分子、胆固醇。
在另一优选例中,所述的小分子为胆固醇。
在另一优选例中,所述的修饰包括:生物素修饰、亲和素修饰、羧基修饰、羟基修饰、氨基修饰、糖基修饰、荧光修饰。
在另一优选例中,所述的荧光修饰为荧光分子修饰或荧光团修饰。
在另一优选例中,所述的纳米金颗粒具有选自下组的一个或多个特征:
(1)纳米金颗粒的平均粒径为1-150nm,较佳地为5-100nm,更佳地5-20nm;
(2)在纳米金颗粒中,80%以上(较佳地90%以上)的纳米金颗粒的粒径在1-150nm范围内,较佳地在5-100nm范围内。
在另一优选例中,所述纳米金颗粒的表面上功能分子的结合密度为1×105—5×1013个/cm2,较佳地为1×107—2×1013个/cm2,更佳佳地为1×109—2×1013个/cm2,更佳地为1×1011—2×1013个/cm2,最佳地为1×1012—2×1013个/cm2。
在本发明的第二方面,提供了一种功能分子,所述的功能分子可通过富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区结合于纳米金颗粒表面,并且所述的功能分子具有式I-式III任一所示结构:
B-L-R I;
R-L-B-L-R II;
(B-L-R-L-B)m III;
式中,
B表示富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区;
R表示功能区;
L表示位于B和R之间的任选的过渡区;
m为选自1-20的整数。
在另一优选例中,所述功能分子的富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区具有选自下组的一个或多个特征:
(i)结合区的长度为5-100个碱基,较佳地5-40个碱基,更佳地10-30个碱基;
(ii)结合区含有一个或多个poly(A)n区段,其中n为选自1-100的整数,较佳地n为选自2-30的整数,更佳地n为选自3-20的整数;
(iii)结合区中A碱基的含量≥70%,较佳地≥80%,更佳地≥90%,最佳地≥95%,或为100%;
(iv)结合区中T碱基和U碱基的总量≤20%,较佳地≤10%,更佳地≤5%,最佳地≤0%。
在另一优选例中,poly(A)n区段的个数为1-3个。
在另一优选例中,所述的结合区包括DNA、RNA、和/或PNA构成的单链。
在另一优选例中,所述功能分子的过渡区由选自下组的成分组成:寡核苷酸、多肽、高分子链、小分子、或其组合。
在另一优选例中,所述的过渡区是长度为0-50个(较佳地5-20个)碱基组成的寡核苷酸。
在另一优选例中,所述的碱基为T或U,较佳地为T。
在另一优选例中,所述功能分子的功能区为修饰或未修饰的、以及标记或未标记的选自下组的分子(moiety):核酸、核酸适配体、核酶(DNAzyme或RNAzyme)、蛋白质、多肽、抗体、探针、酶、凝集素、配体、小分子、胆固醇。
在另一优选例中,所述的小分子为胆固醇。
在另一优选例中,所述的修饰包括:生物素修饰、亲和素修饰、羧基修饰、羟基修饰、氨基修饰、糖基修饰、荧光修饰。
在另一优选例中,所述的荧光修饰为荧光分子修饰或荧光团修饰。
在本发明的第三方面,提供了一种组合物,所述的组合物含有药学上可接受的载体或检测学上可接受的载体,以及本发明第一方面所述的纳米金复合物。
在本发明的第四方面,提供了本发明第一方面所述的纳米金复合物的制备方法,包括步骤:将功能分子与纳米金颗粒接触,使得功能分子通过富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区结合于纳米金颗粒的表面,从而形成纳米金复合物。
在另一优选例中,所述方法包括步骤:
(a)将功能分子与纳米金颗粒混合,获得功能分子与纳米金颗粒的混合溶液;
(b)向步骤(a)的混合溶液中加入老化剂,促进富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区与纳米金颗粒的表面的连接,获得含有第一方面所述的纳米金复合物的溶液体系;和
(c)从步骤(b)的溶液中分离所述的纳米金复合物。
在另一优选例中,所述方法还包括步骤(d):对纳米金复合物进行洗涤和/或性能验证。
在另一优选例中,(b)中所述的老化剂选自下组:氯化钠溶液、氯化钾溶液、氯化镁溶液、或其组合。
在本发明的第五方面,提供了第一方面所述的纳米金复合物的用途,它被用于制备检测试剂或用于制备调控基因表达或调节蛋白活性的药物组合物。
在本发明的第六方面,提供了一种检测产品,所述的产品含有第一方面所述的纳米金复合物,所述复合物作为检测剂。
在另一优选例中,所述的检测产品包括测试片、测试条、侧流片等。
在本发明的第七方面,提供了一种检测试剂盒,所述的检测试剂盒包括第一方面所述的纳米金复合物或第六方面所述的检测产品。
在本发明的第八方面,提供了一种检测方法,包括步骤:将第一方面所述的纳米金复合物用作检测剂,进行检测。
在另一优选例中,在检测时观察/检测所述检测剂与待测物形成的复合物。
在另一优选例中,在检测时观察/检测因所述检测剂与待测物的相互作用所导致的变化,所述变化包括:颜色变化或荧光变化。
在另一优选例中,在本发明第一方面所述的纳米金复合物中,功能分子的功能区为核酸、核酸适配体、核酶(DNAzyme或RNAzyme)、蛋白质、多肽、抗体、凝集素、胆固醇。
在另一优选例中,所述方法用于检测核酸、小分子(如ATP)、金属离子(如铅、汞、铜、银等)、蛋白、多肽、多糖等。
在另一优选例中,纳米金复合物的功能分子的功能区为核酸,用于检测序列与功能区核酸互补的目标多核苷酸。
在另一优选例中,2种或2种以上的纳米金复合物同时与目标多核苷酸结合。
在另一优选例中,所述的目标多核苷酸为DNA或RNA。
在另一优选例中,纳米金复合物的功能分子的功能区为核酸适配体,用于检测核酸适配体的底物。
在另一优选例中,所述的核酸适配体还包括核酸适配体的活性片段或其互补序列。
在另一优选例中,纳米金复合物的功能分子的功能区为核酶,用于检测金属离子。
在另一优选例中,所述的核酶为DNAzyme或RNAzyme。
在另一优选例中,所述的核酶还包括核酶的活性片段,以及核酶或其活性片段的互补序列。
在另一优选例中,纳米金复合物的功能分子的功能区为抗体,用于检测抗原。
在本方面的第九方面,提供了一种检测溶液中待测物的方法,包括步骤:将第一方面所述的纳米金复合物加入所述的溶液,使得所述纳米金复合物上的功能分子与待测物结合或作用,并检测溶液的变化。
在另一优选例中,所述的溶液的变化为颜色变化或荧光变化。
在另一优选例中,所述的待测物质选自下组:核酸、多肽、ATP,金属离子(如铅、汞、铜、银等)。
在本方面的第十方面,提供了一种体外非治疗性的基因调控方法,包括步骤:在培养体系中加入第一方面所述的纳米金复合物,并且所述的功能分子具有调控目标基因表达的核苷酸序列。
在另一优选例中,所述的调控目标基因表达的核苷酸序列为MicroRNA、干扰RNA、反义RNA等。
在另一优选例中,所述的功能分子还可以包括多肽分子(如TAT多肽)等。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案,而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了本发明一种优选的纳米金复合物的示意图;结合于纳米金表面的功能分子包括三部分:结合区、过渡区和功能区;结合区利用腺嘌呤与金之间的亲和作用力固定到纳米金表面,并且能通过改变结合区调控探针之间的距离;过渡区位于结合区和功能区之间,起连接过渡作用;功能区为实现具体功能所需的功能分子。
图2显示不同体系的DNA-纳米金在不同离子强度下的电解质溶液中的稳定性,图2a右侧为该体系在不同离子强度的电解质溶液中所呈现的颜色,红色说明该纳米金在溶液中分散良好,紫色或蓝色说明纳米金发生聚合,结果显示该体系的耐盐度很低,在NaCl浓度仅为50mM时溶液颜色即变紫,离子强度更高时颜色即变为蓝色,该体系在高离子强度的电解质溶液中稳定性较差。图2b显示在含多聚腺嘌呤核苷酸结合区的DNA与金纳米粒子的体系中,polyA能够将寡聚核苷酸结合在纳米金上,寡聚核苷酸表面的负电荷使纳米金在高离子强度的电解质溶液中仍然能够良好地分散,在离子浓度高达0.3M的NaCl电解质溶液中仍十分稳定。图2c显示巯基修饰的寡聚核苷酸与金纳米粒子结合的体系中在高离子强度的电解质溶液中也有很好的稳定性。
图3显示三种纳米金寡聚核苷酸-纳米金样品溶液的紫外可见吸收光谱图;图3a显示DNA中不含多聚腺嘌呤核苷酸组成的结合区polyA与金纳米粒子的体系在不同NaCl浓度下的紫外可见吸收光谱,说明该体系在无盐时分散性良好,在体系中含有300mM NaCl时纳米金即发生聚合;图3b和图3c分别显示含有多聚腺嘌呤核苷酸组成的结合区的DNApolyA与金纳米粒子的体系和巯基修饰的寡聚核苷酸与金纳米粒子结合的体系在无盐和300mM NaCl时体系的紫外可见吸收光谱图。
图4显示含有多聚腺嘌呤核苷酸结合区的DNA-纳米金复合体系对其互补富T链的杂交解析作用具有良好的抵抗力;所使用的含有多聚腺苷寡聚核苷酸一端标记有荧光基团FAM,另一端为包含不同数目的腺嘌呤碱基的polyA,分别含有10个腺嘌呤核苷酸(polyA10,图4a),15个腺嘌呤核苷酸(polyA15,图4b),20个腺嘌呤核苷酸(polyA20,图4c),30个腺嘌呤核苷酸(polyA30,图4d);各图中blank线为不经处理的寡聚核苷酸-纳米金体系的荧光光谱图,各图中(polyT10或polyT15或polyT20或polyT30)线为用同样长度的多聚胸腺嘧啶核苷酸与纳米金复合体系杂交处理后体系的荧光光谱图,各图中MCH线表示用巯基己醇(MCH)取代处理后的纳米金复合体系的荧光光谱图。
图5显示通过改变polyA结合区的长度可以调控纳米金上DNA的组装密度;图5a为随着寡聚核苷酸中polyA结合区长度的增加,金纳米粒子表面所结合的DNA的密度逐渐降低的理论示意图;图5b为通过荧光光谱的检测和计算得到含有不同长度polyA(从左到右依次含有polyA5、polyA10、polyA15、polyA20、polyA30)的DNA在纳米金上的组装密度,纵坐标为纳米金粒子上连接的寡聚核苷酸的密度,结果显示随着polyA长度的增加,纳米金粒子上组装的寡聚核苷酸密度逐渐降低,与理论示意图5a一致;图5c显示为通过计算得到的纳米金粒子表面所吸附的脱氧腺嘌呤核苷酸的密度。
图6显示为含有不同长度polyA结合区的DNA-纳米金复合物纳米金流体动力学直径的动态光散射检测图。图中,从上到下依次为含有polyA5、polyA10、polyA15、polyA20、polyA30的复合体系的流体动力学直径。
图7显示含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物的功能区部分采取了一种延伸且直立的构型;图中由上到下分别为巯基修饰的寡聚核苷酸-纳米金复合物、含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物的流体动力学直径的动态光散射检测结果。
图8显示通过polyA结合区组装的DNA-纳米金复合物的热动力学性质;图8a为通过polyA组装的寡聚核苷酸-纳米金与完全互补的目标杂交物的的热解曲线,显示温度转折点在70℃左右;图8b为通过polyA组装的寡聚核苷酸-纳米金复合结构在一系列温度循环中的循环等离子振动变化;当温度有序地在熔链点(约70℃)上(80℃)下(60℃)循环时,颜色会重复地在红色(说明颗粒是分散的)和蓝色(说明颗粒是聚集的)之间可逆变化。
图9显示基于polyA组装的寡聚核苷酸-纳米金体系具有非常快的杂交动力学,图9a显示将两种通过polyA组装的DNA-纳米金纳米金复合物与互补DNA链混合后0min(a曲线),1min(b曲线),10min(c曲线),20min(d曲线)9,40min(e曲线)反应过程的紫外可见吸收光谱图;图9b显示将两种通过巯基组装的DNA-纳米金与互补DNA链混合后0min(a曲线),1min(b曲线),10min(c曲线),20min(d曲线),40min(e曲线)时体系的紫外可见吸收光谱图。上述结果显示基于polyA组装的体系紫外可见吸收峰在40min内红移了80nm,而巯基组装的体系在40min内仅移动了13nm,表明基于polyA组装的体系由于杂交作用,纳米金较快发生了较大程度的聚集,基于polyA组装的寡聚核苷酸-纳米金体系比基于巯基的体系杂交动力学更快。
图10显示基于polyA结合和基于巯基组装的寡聚核苷酸-纳米金体系纳米金的杂交动力学对比;图10a显示通过计算两种体系的与反应时间和聚合反应几何学有关的特征时间τ和与聚合生长的物理过程有关的Avrami指数n比较两种体系的反应动力学;图10b显示为两种纳米结合体系在10min内检测不同浓度(0.5,1,2,4,6,8,10nM)物的目标DNA的A650/A520快速(10min内)比值色检测的剂量反应曲线和相对应的体系颜色变化。
图11显示基于含有polyA结合区的DNA-纳米金复合探针可以通过荧光检测,实现对目标DNA的定量分析。
图12显示含有polyA结合区的DNA-纳米金复合探针可以实现对目标DNA的定量分析;图中的待测DNA浓度分别为0.5nM,1nM,2nM,4nM,6nM,8nM,10nM。A650/A520为各待测DNA浓度下紫外可见吸收光谱图中650nm和520nm处吸光度信号强度的比值。
图13显示含有polyA结合区的核酸适配体-纳米金复合探针可以实现对ATP分子的定量分析;图中目标ATP的浓度依次分别为0.1mM,0.5mM,1.5mM,1mM,2mM;A520为各待测ATP浓度下紫外可见吸收光谱图中520nm处吸光度信号强度。
图14显示含有polyA结合区的寡聚核苷酸-纳米金复合探针可以实现对铅离子的定量分析;图中显示铅离子浓度与紫外光谱信号的对应关系图。其中铅离子浓度依次分别为2μM,4μM,6μM,8μM,10μM。A520为各待测铅离子浓度下紫外可见吸收光谱图中520nm处吸光度信号强度。
图15是显示含有polyA结合区的抗体-纳米金复合探针可以实现对蛋白质TNF-a的定量分析;图中显示蛋白质TNF-a浓度与紫外光谱信号的对应关系图。其中,图中的TNF-a浓度依次分别为1ng/mL,2ng/mL,4ng/mL,6ng/mL。A650/A520为各待测TNF-a浓度下紫外可见吸收光谱图中650nm和520nm处吸光度信号强度的比值。
图16显示通过poly A结合于金表面的siRNA-纳米金复合物对对细胞内目标基因表达抑制效果图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,首次意外地发现,功能分子可以通过富含腺嘌呤核苷酸(A)或其类似物的寡核苷酸结合区与纳米金颗粒的表面结合,从而形成纳米金复合物;所述功能分子包括富含A的寡核苷酸结合区、功能区和位于结合区和功能区之间过渡区。本发明的纳米金复合物可实现纳米金表面上功能分子密度的自我调控;在纳米尺度上可以精确控制功能分子之间的距离,充分保证功能区的识别活性,促进功能区对目标分子的检测能力。在此基础上完成了本发明。
术语
纳米金
如本文所用,术语“纳米金”或“纳米金颗粒”可以互换使用,都是指一种微小的,其平均粒径为1-150nm。纳米金颗粒具有高电子密度、介电特性和催化作用,能与多种生物分子结合,且不影响其生物活性。
在本发明中,优选的纳米金颗粒为5-100nm,更佳地为5-20nm。在纳米金颗粒的群体中,80%以上(较佳地90%以上)的纳米金颗粒的粒径在1-150nm范围内,优选在5-100nm范围内。
本领域的普通技术人员可以商业购买途径(如向Sigma-Aldrich公司购买)或常规方法制备获得。
功能分子
本申请提供了一种新的功能分子,该功能分子可通过富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区结合于纳米金颗粒表面。
本发明的的功能分子具有式I-式III任一所示结构:
B-L-R I;
R-L-B-L-R II;
(B-L-R-L-B)m III;
式中,B表示富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区;R表示功能区;L表示位于B和R之间的任选的过渡区;m为选自1-20的整数。
在本发明中,富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区具有选自下组的一个或多个特征:(i)结合区的长度为5-100个碱基,较佳地5-40个碱基,更佳地10-30个碱基;(ii)结合区含有一个或多个poly(A)n区段,其中n为选自1-100的整数,较佳地n为选自2-30的整数,更佳地n为选自3-20的整数;(iii)结合区中A碱基的含量≥70%,较佳地≥80%,更佳地≥90%,最佳地≥95%,或为100%;(iv)结合区中T碱基和U碱基的总量≤20%,较佳地≤10%,更佳地≤5%,最佳地≤0%。本发明优选poly(A)n区段的个数为1-3个。更优选地,结合区包括DNA、RNA、和/或PNA构成的单链。
在本发明中,过渡区由选自下组的成分组成:寡核苷酸、多肽、高分子链、小分子、或其组合。过渡区优选为长度为0-50个(较佳地5-20个)碱基组成的寡核苷酸;所述的碱基为T或U,较佳地为T。
在本发明中,功能区为修饰或未修饰的、以及标记或未标记的选自下组的分子(moiety):核酸、核酸适配体、核酶(DNAzyme或RNAzyme)、蛋白质、多肽、抗体、探针、酶、凝集素、配体、小分子、胆固醇。所述的小分子也可以为胆固醇。所述的修饰包括:生物素修饰、亲和素修饰、羧基修饰、羟基修饰、氨基修饰、糖基修饰、荧光修饰。荧光修饰为荧光分子修饰或荧光团修饰。
如本文所用,术语“核酸适配体”或“Apatmer”可以互换使用,都是指一段DNA或RNA序列,该序列能够与多种目标物质高特异性高敏感性高选择性的结合,当核酸适配体与特定的目标物质发生结合时,核酸适配体自身的结构发生变化,这种变化可以进行检测。本领域的普通技术人员使用常规方法(如体外筛选技术等)可以对核酸适配体的序列进行选择;使用全人工化学方法制备所述的核酸适配体。此外,所述的核酸适配体还包括核酸适配体的活性片段或其互补序列。
如本文所用,术语“核酶”是指具有催化活性的核酸序列,其化学本质虽然是核酸,却具有酶的催化功能。核酶的作用底物可以是不同的分子,有些作用底物就是分子中的特定部位。核酶包括DNAzyme或RNAzyme等,所述的核酶还包括核酶的活性片段,以及核酶或其活性片段的互补序列。一种优选的DNAzyme底物链(substrate strand)序列如下:
其中,rA代表组成RNA的腺嘌呤核糖核苷酸,其他的都代表组成DNA的脱氧核糖核苷酸,形成了切割位点(cleavage site)。
纳米金复合物
如本文所用,术语“纳米金复合物”、“纳米金复合”、“纳米金-功能分子复合物”或“纳米金-功能分子复合体”可以互换使用,所述复合物或复合体包括纳米金颗粒和功能分子,并且所述的功能分子通过富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区结合于纳米金颗粒表面。
本发明纳米金复合物的表面上具有适宜的功能分子的结合密度,所述密度为1×105—5×1013个/cm2,较佳地为1×107—2×1013个/cm2,更佳地为1×109—2×1013个/cm2,更佳地为1×1011—2×1013个/cm2,最佳地为1×1012—2×1013个/cm2。
本发明纳米金复合物的纳米金颗粒的平均粒径为1-150nm,较佳地为5-100nm,更佳地5-20nm。在纳米金颗粒中,80%以上(较佳地90%以上)的纳米金颗粒的粒径在1-150nm范围内,较佳地在5-100nm范围内。
本发明还提供了纳米金复合物的制备方法:将功能分子与纳米金颗粒接触,使得功能分子通过富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区结合于纳米金颗粒的表面,从而形成纳米金复合物。
在本发明的一个优选例中,包括步骤:将功能分子与纳米金颗粒混合,获得功能分子与纳米金颗粒的混合溶液;加入老化剂,促进富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区与纳米金颗粒的表面的连接,获得含有纳米金复合物的溶液体系;从溶液中分离纳米金复合物。优选地,还包括步骤:对纳米金复合物进行洗涤和/或性能验证。本领域的普通技术人员可以选用常规的老化剂,如氯化钠溶液、氯化钾溶液、氯化镁溶液等。
本发明还提供了纳米金复合物的应用方法,它被用于制备检测试剂或用于制备调控基因表达或调节蛋白活性的药物组合物。
本发明提供了一种检测产品,它含有本发明的纳米金复合物,将其作为检测剂;该检测产品抗原包括测试片、测试条、侧流片等。
本发明还提供了一种检测试剂盒,它包括本发明的纳米金复合物或上述的检测产品。
可以将本发明所述的纳米金复合物用作检测剂,进行检测;在检测中,优选观察/检测所述检测剂与待测物形成的复合物或观察/检测因所述检测剂与待测物的相互作用所导致的变化;所述变化可以包括:颜色变化或荧光变化。
本发明还提供了一种应用纳米金复合物进行体外非治疗性的基因调控方法:在培养体系中加入纳米金复合物,所述的功能分子具有调控目标基因表达的核苷酸序列。调控目标基因表达的核苷酸序列为优选MicroRNA、干扰RNA、反义RNA。的功能分子还可以包括多肽分子(如TAT多肽)等。
如本文所用,术语“TAT”或“TAT多肽”可以互换使用,将TAT与目标分子连接,TAT多肽可以帮助目标分子进入细胞(核)。一种优选的TAT多肽序列如SEQ ID NO:24所示。
本发明的主要优点在于:
1.本发明的纳米金复合物可实现纳米金表面上连接上的功能分子密度的自我调控,通过控制功能分子之间的距离,充分保证功能区的识别活性,促进功能区对目标分子的检测能力;
2.本发明的纳米金复合物,其功能分子通过富A结合区结合于纳米金颗粒的表面,使得功能分子中的功能区采用更加延伸且直立的构型,促进功能区与目标分子的识别效率;
3.本发明的制备纳米金复合物的方法简单,成本低廉,无需任何化学修饰和人工合成的部分。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
部分实验材料
所有使用纳米金粒子均购自Sigma-Aldrich公司,所有的寡聚核苷酸由TaKaRa公司(Dalian,China)合成并纯化。实验中所用仪器:紫外-可见分光光度计(U-3010紫外可见光谱,日立,日本东京);荧光光谱仪(F-4500,日立,日本东京);DelsaTM纳米亚微米粒度和Zeta电位粒度仪,贝克曼库尔特公司;真彩色数码相机(尼康)。
实验方法
纳米金复合物的组装
首先将金纳米颗粒与含富A寡聚核苷酸结合区的功能分子以一定的比例(功能分子:纳米金=200:1)混合,轻轻吹打使混匀,室温孵育16小时后,加入1M PBS(1M NaCl/0.1M PB,pH7.0)使其终浓度为0.1M PBS(分5~6次加入,5min/次间隔),室温下放置16h,12000r,4℃,20min离心,吸弃上清,加入等量的0.1M PBS(0.1M NaCl/10mM PB,pH7.0)洗离三次,杂交溶液(0.3MNaCl/10mM PB,pH7.0)悬浮,4℃冰箱长期保存。
纳米金复合物表面DNA密度的定量检测
向含有组装好的DNA-纳米金复合体的溶液中加入巯基己醇(MCH)(终浓度为20mM),在室温下震荡并过夜培育,巯基己醇可以将寡聚核苷酸从纳米金表面上取代下来;将被取代下来的DNA探针通过离心法进行分离,上清液在荧光分光光度计(F-4500,日立公司,东京,日本)下进行荧光检测;将该荧光值与通过标准曲线法得到的荧光线性曲线对应,得到DNA的浓度从而计算得出DNA的物质量。荧光标准曲线是在相同pH的缓冲中,同样的离子强度和巯基乙醇浓度下用已知浓度的荧光标记的寡聚核苷酸检测荧光得到的。纳米金的浓度由紫外可见吸收光谱(U-3100紫外可见吸收光谱,日立公司,东京,日本)测得,即根据纳米金在520nm处的吸收强度,代入摩尔吸光系数计算求得纳米金的浓度从而计算得出纳米金的物质量。纳米金表面组装的DNA密度等于DNA的物质量除以纳米金物质的量。
纳米金表面组装的功能序列的杂交效率检测方法
向200μl,10nM合成好的含富A结合区的DNA-纳米金复合物中加入3μM与其功能区核酸序列互补的有荧光标记的DNA链,在杂交条件(0.3M PBS,pH7)下反应24h。用磷酸盐缓冲清洗混合物两次,通过离心除去未杂交的DNA;通过加入氢氧化钠(终浓度大于50mM,pH11-12)反应2h,使杂交结合的荧光标记的DNA与DNA-纳米金复合物解离。通过离心分离出解离的荧光标记的DNA,加入1M HCl将pH调回中性,用荧光光度计检测其荧光强度,通过与标准曲线对比得到杂交在多聚腺苷寡聚核苷酸-纳米金复合物上的DNA浓度。
动力学实验方法
在自组装动力学的研究中,向50μL含有8nM DNA-纳米金复合物(两种DNA-纳米金复合物探针1:1混合)的0.3M PBS杂交缓冲溶液中加入2μL适当的10μM的DNA linker,两种DNA-纳米金复合物中的DNA功能区分别与DNAlinker中的不同区段的序列互补。每两分钟进行紫外-可见光谱检测。
熔链分析方法
通过使用温度控制仪(PolyScience)在25-80℃之间调控温度,用紫外可见分光光度计记录不同温度下复合物的紫外可见吸收光谱。
动态光散射(DLS)检测方法
将1.5mL3nM的组装好的DNA-纳米金复合物加入到比色皿中,使用DelsaTM Nano Submicron Particle Size and Zeta potential Particle Analyzer(贝克曼库尔特公司)进行检测。
实施例1
纳米金复合物的组装
首先将金纳米颗粒与含富A寡聚核苷酸结合区的功能分子以一定的比例(DNA/纳米金为200:1)混合,轻轻吹打使混匀,室温孵育16小时后,加入1MPBS(1M NaCl/0.1M PB,pH7.0)使其终浓度为0.1M PBS(分5~6次加入,5min/次间隔),室温下放置16h,12000r,4℃,20min离心,吸弃上清,加入等量的0.1M PBS(0.1M NaCl/10mM PB,pH7.0)洗离三次,杂交溶液(0.3M NaCl/10mMPB,pH7.0)悬浮,4℃冰箱长期保存。图1显示了功能分子和纳米金复合物的示意图。
实施例2
含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物在电解质溶液中的稳定性
为了确定寡聚核苷酸DNA可以通过其结构中的polyA结合区稳定地连接到纳米金表面,本实施例取三种DNA样品:(a)DNA中无多聚腺嘌呤核苷酸(polyA)组成的结合区、(b)DNA中含有多聚腺嘌呤核苷酸组成的结合区A10、(c)DNA端部修饰巯基基团,上述DNA中过渡区为T5,功能区均为ATgAT gTTCg TTgTg。上述三种DNA分别和10nm纳米金颗粒纳米金形成DNA-纳米金复合物,对其在不同离子强度的电解质溶液的稳定性进行比较。
实验原理:分散在溶液中的粒径为10nm的纳米金呈红色,纳米金聚集后由于表面等离子共振效应会使其颜色发生蓝移,没有修饰DNA的纳米金在高离子强度环境中不稳定,容易发生聚集;修饰在纳米金表面上DNA可以使纳米金稳定存在于高离子强度环境中。
实验结果如图2和图3所示,含polyA结合区的DNA-纳米金复合物和巯基修饰的DNA-纳米金复合物在离子浓度高达0.3M的NaCl电解质溶液中仍然保持红色并且在520nm处有一个明显的特征吸收峰,表明polyA和巯基有相同的作用,可以使DNA连接到纳米金上,并可以使纳米金在高离子强度环境下保持很好的稳定性;与之相反,不含polyA结合区的DNA-纳米金体系非常不稳定,在NaCl浓度仅为20mM时,溶液颜色就有所变化并且其紫外吸收峰发生蓝移,在离子强度变高后颜色即变为蓝色,这种颜色变化说明金胶已经发生聚合,证明不含polyA的DNA多聚腺苷寡聚核苷酸不能稳定结合到纳米金表面。
上述实验结果表明,功能分子可以通过与之连接的polyA结合区稳定地结合到纳米金表面。
实施例3
含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物的热稳定性
DNA-纳米金复合物的热稳定性对其实际用途中有很重要的影响,为了证明含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物有很好的热稳定性,本实施例使用一条有荧光素标记的含polyA的寡聚核苷酸,将其连接到纳米金上,并检测它们从纳米金上随着温度变化的解吸过程。
实验原理:纳米金具有猝灭荧光的能力,连接在纳米金表面上修饰了荧光分子的DNA表现出很低荧光值,如果修饰了荧光分子的DNA从金表面脱落下来,体系的荧光值就会升高。
实验结果表明,含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物高度耐热,即使在高温(90℃)时,仍只有很少的DNA从纳米金表面脱离,这与巯基DNA-纳米金复合物的稳定性相当。
上述结果表明含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物具有良好的热稳定性。
实施例4
富T链对含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物不产生影响
由于本发明中DNA是通过一段polyA结合区和纳米金结合,这种DNA-纳米金复合物的稳定性可能会由于与结合区序列互补的DNA(富T序列)的杂交作用而变得比较低。本实施例将一系列修饰了荧光分子的富A序列(polyA10,polyA15,polyA20,polyA30)按照标准步骤组装到纳米金表面上,然后向这些体系中加入高浓度(2μM)的与其对应互补的富T链(polyT10,polyT15,polyT20,polyT30)。纳米金具有猝灭荧光的能力,连接在纳米金表面上修饰了荧光分子的polyA序列表现出很低荧光值,如果修饰了荧光分子的polyA从表面取代下来,体系的荧光值就会升高。
结果如图4所示,由于纳米金对连接在DNA末端的荧光分子FAM有淬灭作用,因此复合体系的荧光值几乎为零,MCH可以将DNA从纳米金上取代下来,导致体系的荧光值升高;而同等长度的poly dT处理后的DNA-纳米金复合体系与未经处理时的荧光强度相当,表明只有极少量金纳米粒子上的polyA被A-T互补杂交作用取代下来。
上述结果表明,纳米金上所吸附的polyA非常稳定,可以抵抗富A-富T之间的杂交解吸作用。
实施例5
PolyA结合区的长度对功能分子在纳米金表面上组装密度的影响
本实施例试图通过改变polyA结合区的长度,从而实现从空间上调控组装在纳米金表面上功能分子密度的目的。
使用一系列结合区不同长度荧光基团标记的含多聚腺苷寡聚核苷酸,按照标准方法将其组装到纳米金表面,然后利用基于取代反应的荧光法定量金纳米粒子表面DNA的组装密度。如图5所示,随着polyA长度的增加,纳米金粒子上组装的寡聚核苷酸密度逐渐降低(图5a、图5b)。另外,发明人发现不论polyA结合区长度为多少,纳米金粒子表面所吸附的腺嘌呤核苷酸的数目没有显著的差别(图5c),说明结合区所有腺嘌呤核苷酸都可以完全吸附在金纳米颗粒的弯曲表面,实现表面的完全覆盖。
上述结果表明可以通过调节含多聚腺苷结合区的长度来调控功能分子在纳米金表面上组装密度。
实施例6
含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物上功能区DNA与目标DNA的杂交效率
DNA-纳米金复合物上的DNA杂交活性对其在生物检测和生物效应等实际应用中有重要的影响。传统利用巯基结合于纳米金的DNA-纳米金复合物,由于其纳米金表明的DNA形态和DNA密度的影响导致其功能区DNA探针杂交效率很低。含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物,理论上其polyA部分不仅可以使功能分子连接到纳米金表面上,还可能屏蔽纳米金表面上非特异性作用位点,使功能分子在纳米金表面呈垂直构型,保持高的生物活性。
在本实施例中,发明人研究了含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物上功能区DNA与目标DNA的杂交效率。首先制备一系列含不同长度polyA结合区的DNA,其过渡区均为T5,功能区均为ATgAT gTTCg TTgTg,然后检测它们与互补DNA链的杂交效率。
实验结果如表1所示,含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物上功能区DNA与目标DNA的杂交效率显著提高,比基于巯基修饰的DNA-纳米金复合物的杂交效率(约5%-10%)提高了一个数量级;而且随着polyA长度的增加,功能区DNA的杂交效率逐渐提高,含polyA5的DNA的杂交效率约为42%,含polyA30的DNA的杂交效率达到约90%。
表1
上述结果表明,含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物上功能区DNA与目标DNA的杂交效率显著提高,而且其杂交效率随着polyA序列的增长而增加。
实施例7
含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物上功能区DNA的构型研究
在本实施例中,发明人进一步比较了巯基DNA-纳米金复合物和含有不同长度polyA结合区的DNA-纳米金复合物的流体动力学直径,其过渡区均为T5,功能区均为ATgAT gTTCg TTgTg。
应用动态光散射(DLS)测定的各种DNA-纳米金复合物的流体动力学直径,结果如图6和图7所示:含有不同长度polyA结合区(A5,A10,A15,A20,A30)的DNA-纳米金复合物显示出几乎一致的水力学直径,为29~32nm,与富A嵌段的长度无关,说明富A嵌段完全覆盖于金的表面,而过渡区和功能区DNA则伸出纳米金表面;与之相比,巯基DNA-纳米金的平均流体动力学直径仅为21.6nm。
通过polyA和通过巯基结合于纳米金上的DNA-纳米金复合物的流体动力学直径的差别(~10nm),表明含polyA结合区的DNA,其过渡区和功能区采取了一种更加延伸且直立的构型;含polyA30的DNA-纳米金复合物,几乎所有的功能区DNA链都可参加杂交反应,与链间距增加、库仑排斥力降低的事实相一致。
上述结果表明,含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物上功能区DNA采取了一种更加延伸且直立的构型,从而利于与目标DNA的杂交。
实施例8
含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物的杂交热动力学性质
在本实施例中,发明人进一步研究了含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物的杂交热动力学性质。
结果如图8所示,图8a显示含polyA结合区的DNA-纳米金复合物的熔链曲线,温度转折点在70℃左右,这与巯基DNA-纳米金复合物的性质几乎一致,表明功能区DNA与用巯基方法连接的DNA有着相似的热动力学性质,此外,这种熔链过程是完全可以逆转的。图8b喜显示含polyA结合区的DNA-纳米金复合物在一系列温度循环中的循环聚集-分散变化,当温度有序地在熔链点(约70℃)上(80℃)下(60℃)循环时,颜色会重复地在红色(说明颗粒是分散的)和蓝色(说明颗粒是聚集的)之间变化。
上述结果表明,含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物,其熔解变化是快速、可逆的。
实施例9
含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物的杂交动力学行为研究
本实施例研究含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物的杂交动力学行为。发明人使用一种“三明治”体系,含有三段DNA进行反应:两种分别用于连接到纳米金上的含polyA结合区的DNA和目标DNA,这两种连接在纳米金上的DNA的功能区序列分别与目标DNA的不同区段的序列互补,从而可以形成“三明治”复合物(复合物示意图如图8b所示)。
在传统的巯基修饰的DNA-纳米金体系中,这种体系的动力学反应非常慢(在无催化剂,室温),12小时之内没有明显的颜色变化,紫外可见吸收光谱曲线表明等离子共振峰在40min内移动了13nm(图9b)。然而,基于含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物的“三明治”体系的动力学反应非常快,如图9a所示,当三种物质混合后,可以很快地观察到明显的颜色变化,在约5min内颜色就会变蓝,等离子共振峰在40min内移动了80nm。
为进一步定量分析动力学过程,发明人使用Avrami法则:Abs=Abs0exp(-((t-t0)/τ)n)来描述它们的成核和生长过程,其中t为组装时间,t0为反应开始时间,τ为与反应时间和聚合反应几何学有关的特征时间,n为与聚合生长的物理过程有关的Avrami指数。含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物体系的τ与n分别为112min和0.77,而巯基DNA-纳米金体系的τ与n分别为595min和0.99(图10a)。含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物体系的τ与n小与其快速的反应动力学相一致的。
发明人进一步进行了目标DNA的比色检测,如图10b所示,结果表明含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物体系在10min内可以显示出明显的颜色变化,通过比较不同目标DNA浓度下650nm/520nm的比值,得到了比值-浓度曲线,目标DNA检测限为0.5nM。相反,基于巯基DNA的纳米结合物在10nM的目标DNA存在下几乎没有颜色和吸光度的变化。
上述实验结果表明,含有polyA结合区的DNA-纳米金复合物具备快速的杂交动力学,可以实现对目标分子的快速检测。
实施例10
富A结合区中核苷酸的组成对功能分子连接到纳米金效果的研究
DNA四种核苷酸,除了A之外,G和C对金表面也有一定的亲和力。发明人进一步研究了富A结合区中加入一定比例的G或C对功能分子连接到纳米金表面的影响。使用了一系列结合区具有不同A含量的DNA分子(结合区除了A,还含有不同比例的G或C),然后利用基于取代反应的荧光法定量金纳米粒子表面DNA的组装密度。与FAM连接的DNA序列:
A1:5’-AAAAA AAAAA AAAAA TTTTT ATgAT gTTCg TTgTg-3’
(SEQ ID NO.:1)
A2:5’-AAAAg AAAAg AAAAA TTTTT ATgAT gTTCg TTgTg-3’
(SEQ ID NO.:2)
A3:5’-AAAAc AAAAc AAAAA TTTTT ATgAT gTTCg TTgTg-3’
(SEQ ID NO.:3)
A4:5’-AAAgA AAgAA AgAAA TTTTT ATgAT gTTCg TTgTg-3’
(SEQ ID NO.:4)
A5:5’-AAAcA AAcAA AcAAA TTTTT ATgAT gTTCg TTgTg-3’
(SEQ ID NO.:5)
A6:5’-AAggA AAgAA AgAAA TTTTT ATgAT gTTCg TTgTg-3’
(SEQ ID NO.:6)
A7:5’-AAccA AAcAA AcAAA TTTTT ATgAT gTTCg TTgTg-3’
(SEQ ID NO.:7)
A8:5’-AAggA AAggA AggAA TTTTT ATgAT gTTCg TTgTg-3’
(SEQ ID NO.:8)
A9:5’-AAccA AAccA AccAA TTTTT ATgAT gTTCg TTgTg-3’
(SEQ ID NO.:9)
结果如表2所示。
表2
结果表明,在存在G或C的情况下,结合区的A含量达到70%以上就可以在纳米金表面起到很好的连接作用。
实施例11
基于荧光方法的应用含polyA结合区的DNA-纳米金复合物检测目标DNA
检测试剂包括:一条修饰了荧光基团具有茎环结构的含polyA结合区的DNAS1,待检测的目标DNA S2,均购自大连Takara生物有限公司。
S1中m1和m2互补,可以形成茎环结构。S2可以和S1中m1与m2之间的序列完全互补,当S2和S1结合后,可以破环S1的茎环结构。
S1(SEQ ID NO.:10):
5’-A A A A A A A A A A TTTTT CGCTCCAGAGGCAGTA ACCAGAGCG-3’
m1 m2
S2(SEQ ID NO.:11):5’-TGGTTACTGCCTCTG-3’
本发明的检测步骤如下:
第一步,使用S1和15nm纳米金,按照标准组装步骤的合成DNA-纳米金复合物。
第二步,检测目标DNA分子S2。
将不同浓度的目标DNA S2(0.5nM,2nM,10nM,100nM,500nM)加入到上述DNA-纳米金复合物(5nM),其中杂交缓冲溶液为含0.3M NaCl,10mM PB,pH=7.4,37℃孵育30min。检测体系的荧光值。
检测原理:由于S1含有茎环结构,在通过polyA部分连接到纳米金表面上,其3’端标记的荧光分子靠近纳米金表面,这时候标记的荧光分子由于荧光能量转移作用,其荧光会被猝灭。当S2存在时,S2和S1结合打开S1的茎环结构,使得荧光分子远离纳米金表面,使得荧光分子的荧光恢复。
检测结果如图11所示,反应体系的荧光值随着目标DNA的浓度发生变化,利用此曲线,根据本发明的寡聚核苷酸-纳米金复合探针可实现对目标DNA的定量分析。本发明的DNA功能序列可以根据目标DNA序列进行设计。
上述结果表明,通过polyA部分组装DNA探针到纳米金表面可以实现利用单种DNA-纳米金复合物实现目标DNA的定量检测。
实施例12
基于比色法的应用含polyA结合区的DNA-纳米金复合物检测目标DNA
检测试剂包括:两条含polyA结合区的DNA,P1(30bp,分子量9282.2,单链DNA),P2(30bp,分子量9158.1,单链DNA),待检测的目标DNA T1(30bp,分子量9090,单链DNA),均购自大连Takara生物有限公司。直径为15nm金纳米粒子,购自sigma公司。待检测的目标DNA T1包含B1、B2两段识别序列,分别能够和探针P1中的A1,探针P2的A2序列互补,从而形成夹心结构。
P1(SEQ ID NO:12):5’-A A A A A A A A A A TTTTT ATgATgTTCgTTgTg-3’
A1
P2(SEQ ID NO.:13):5’-gTgTTTAggA TTTgC TTTTT AAAAA AAAAA-3’
A2
T1(SEQ ID NO.:14):5’-gCAAA TCCTA AACAC CACAA CgAAC ATCAT-3’
B2 B1
检测步骤如下:
第一步,使用P1,P2和15nm纳米金,按照标准组装步骤的合成DNA-纳米金复合物探针。
第二步,检测目标DNA分子T1。
在用纳米金复合探针进行DNA实验时,将8nM纳米金复合探针(两种纳米金复合探针1:1混合)与含有不同浓度的目标DNA T1(0.5nM,1nM,2nM,4nM,6nM,8nM,10nM)在0.3M PBS杂交缓冲溶液进行混合,反应10min。
检测原理:由于B1与A1,B2与A2序列互补配对,从而将探针P1、P2、目标DNA偶联在一起,形成复合物。此时P1、P2上偶联的纳米金粒子也相互靠近,发生聚集。由于分散的纳米金呈红色,而聚集的纳米金粒子呈蓝色,因此这种由于目标DNA存在而导致的P1、P2偶联的纳米金粒子的聚集可以通过比色进行检测。
检测结果如图12所示,反应体系的颜色随着目标DNA的浓度发生变化。利用此曲线,根据本发明的DNA-纳米金复合探针可实现对目标DNA的定量分析。本发明的DNA功能序列可以根据目标DNA序列进行设计。
上述结果表明,polyA部分组装DNA探针到纳米金表面可以利用两种或两种以上的DNA-纳米金复合物通过比色法实现目标DNA的定量检测。
实施例13
应用含有polyA结合区的核酸适配体-纳米金复合实现对小分子的定量分析
检测试剂包括:两条含多聚腺苷寡聚核苷酸P3(27bp,分子量8307,单链DNA)和P4(27bp,分子量8402,单链DNA),一条包含识别三磷酸腺苷(ATP)分子核酸适配体序列的DNA L1,L1包含D1、D2两段识别序列,分别能够和探针P3中的C1,探针P4的C2序列互补,从而形成夹心结构,其中下划线标识的部分是可以和ATP结合的特异性序列,D1和ATP aptamer序列有7个碱基的重合,当L1中ATP aptamer序列在和ATP分子结合在一起后,可以抑制D1和P3中C1部分的互补杂交。
P3(SEQ ID NO:15):5’-A A A A A A A A A A TTTTT CCCAGGTTCTCT-3’
C1
P4(SEQ ID NO.:16):5’-TCACAGATGAGT TTTTT AAAAA AAAAA-3’
C2
L1(SEQ ID NO.:17):
5’-ACTCATCTGTGGAAGAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’
D2 D1 ATP aptamer
本发明的检测步骤如下:
第一步,使用P3,P4和15nm纳米金,按照标准组装步骤的合成两种DNA-纳米金复合物探针;第二步,检测目标ATP分子。
在用纳米金复合探针进行DNA实验时,将8nM纳米金复合探针(两种纳米金复合探针1:1混合+8nM L1)与含有不同浓度的目标ATP(0.1mM,0.5mM,1mM,2mM)的0.3M PBS杂交缓冲溶液进行混合,反应10min。对其进行比色观测。
检测原理:由于D1与C1,D2与C2序列互补配对,从而将探针P3、P4、L1偶联在一起,形成复合物。此时P3、P4上偶联的纳米金粒子也相互靠近,发生聚集。由于分散的纳米金呈红色,而聚集的纳米金粒子呈蓝色,而当ATP存在的条件下,L1中ATP aptamer序列与ATP分子形成三级结构,因为D1和ATPaptamer序列有7个碱基的重合,当L1中ATP aptamer序列在和ATP分子结合在一起后,可以抑制D1和P3中C1部分的互补杂交,从而抑制P3、P4偶联的纳米金粒子的聚集。因此这种由于ATP分子存在而抑制的P3、P4偶联的纳米金粒子的聚集可以通过比色进行观测。
结果如图13所示,颜色随着目标ATP的浓度发生变化。利用此曲线,根据本发明的寡聚核苷酸-纳米金复合探针可实现对ATP分子的定量分析。
上述结果表明,这种通过polyA部分连接生物分子到纳米金表面上的方法制备的DNA-纳米金复合物,当功能分子的功能区为DNA适配体(aptamer)或其互补序列,可以用于检测DNA适配体的底物(如ATP)。
实施例14
应用含有polyA结合区的寡聚核苷酸-纳米金复合物实现对金属离子的定量分析
在溶液中存在DNAzyme1和DNAzyme2的情况下,检测目标物为铅离子。DNAzyme1两端F1和F2分别和P5的E1,P6的E2互补,形成夹心结构。DNAzyme2可以在铅离子存在下切断DNAzyme1中F3部分。
P5(SEQ ID NO.:18):
5’-A A A A A A A A A A TTTTT CACGAGTTGACA-3’
E1
P6(SEQ ID NO.:19):
5’-TCACAGATGAGT TTTTT AAAAA AAAAA-3’
E2
DNAzyme1(SEQ ID NO.:20):
5’-ACTCATCTGTGAACTCACTATrAGGAAGAGATGTGTCAACTCGTG-3’
F2 F3 F1
DNAzyme2(SEQ ID NO.:21):
5’-CATCTTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT-3’
检测步骤如下:
第一步,使用P5,P6和15nm纳米金,按照标准组装步骤的合成两种DNA-纳米金复合物探针。第二步,在用纳米金复合探针进行实验时,将8nM纳米金复合探针(两种纳米金复合探针1:1混合+8nM DNAzyme1+8nM DNAzyme2)与含有不同浓度的目标物铅离子(2μM,4μM,6μM,8μM,10μM)的0.3M PBS杂交缓冲溶液进行混合,反应10min。对其进行比色观测。
由于F1与E1,F2与E2序列互补配对,从而将探针P5、P5、DNAzyme1偶联在一起,形成复合物。此时P5、P6上偶联的纳米金粒子也相互靠近,发生聚集。由于分散的纳米金呈红色,而聚集的纳米金粒子呈蓝色,而当铅离子存在的条件下,DNAzyme2可以在铅离子存在下切断DNAzyme1中F3部分,从而抑制P5、P6偶联的纳米金粒子的聚集。因此这种由于铅离子存在而抑制的P5、P6偶联的纳米金粒子的聚集可以通过比色进行观测。
结果如图14所示,颜色随着铅离子的浓度发生变化。利用此曲线,根据本发明的寡聚核苷酸-纳米金复合探针可实现对铅离子的定量分析。
上述结果表明,含有polyA的DNA-纳米金复合物通过结合对金属离子敏感的特殊的DNA序列可以用于检测金属离子。
实施例15
应用polyA结合区将蛋白质连接到纳米金上形成稳定的蛋白-纳米金复合物
为了证明可以通过多聚腺苷和纳米金的作用将蛋白质分子连接到纳米金上,发明人首先将一个蛋白质分子和一条羧基修饰含多聚腺苷寡聚核苷酸分子连接在一起,然后通过多聚腺苷和纳米金的作用将蛋白质分子连接到纳米金上。
实验试剂包括一条羧基修饰含多聚腺苷寡聚核苷酸分子,Pro1:5’-HOOC-CACGA CACAC CTAGCTTTTTAAAAAAAAAA-3’(HOOC-SEQ ID NO.:22),亲和素avidin。
连接步骤如下:
第一步:将亲和素avidin通过碳化二亚胺/n-羟基琥珀酰亚胺缩合(EDC/NHS)方法和一条羧基修饰含多聚腺苷寡聚核苷酸分子连接在一起,反应30分钟后,利用电泳分离得到DNA和蛋白的偶联物。
第二步:利用连接好的DNA-蛋白偶联物和15nm的纳米金按照标准组装步骤组装到得复合物。复合物洗涤后加入到含0.3M NaCl10mM磷酸盐(pH=7.0)的缓冲液中,仍能保持红色,由于没有组装上生物分子的纳米金抗盐能力很弱,所以这说明蛋白质通过polyA部分成功连接到纳米金表面上。
上述实验表明,应用polyA结合区可以将蛋白质连接到纳米金上形成稳定的蛋白-纳米金复合物。
实施例16
应用含有polyA结合区的抗体-纳米金复合实现对蛋白质的定量分析
为了证明可以通过多聚腺苷和纳米金的作用将蛋白质分子连接到纳米金上用于检测蛋白质分子,发明人将两种抗体分子通过多聚腺苷和纳米金的作用力合成两种纳米探针用于检测蛋白质分子。
实验试剂包括:一条羧基修饰含多聚腺苷寡聚核苷酸分子,Pro1:5’-HOOC-CACGA CACAC CTAGCTTTTTAAAAAAAAAA-3’(HOOC-SEQ ID NO.:22)。抗鼠TNF-α-1,抗鼠TNF-α-2和重组鼠TNF-α购置eBioscience公司。亲和素修饰的磁珠,购自polyscience公司。抗鼠TNF-α-1和抗鼠TNF-α-2是一对TNF-α的抗体,可以同时和TNF-α结合到在一起。
检测步骤如下:第一步,将两种的抗鼠TNF-α分别通过碳化二亚胺/n-羟基琥珀酰亚胺缩合(EDC/NHS)方法分别一条羧基修饰含多聚腺苷寡聚核苷酸分子连接在一起,反应30分钟后,利用电泳分离得到DNA和蛋白的偶联物。第二步:利用两种连接好的DNA-蛋白偶联物分别和15nm的纳米金按照标准组装步骤组装到得两种复合物。第三步,将待检测的重组鼠TNF-α加入到上述两种探针的混合溶液中,在TNF-α存在的条件下,由于抗鼠TNF-α-1和抗鼠TNF-α-2可以同时和TNF-α结合到在一起,从而将抗鼠TNF-α-1和抗鼠TNF-α-2偶联在一起,形成复合物。此时抗鼠TNF-α-1和抗鼠TNF-α-2上偶联的纳米金粒子也相互靠近,发生聚集。由于分散的纳米金呈红色,而聚集的纳米金粒子呈蓝色,因此这种由于目标抗原而导致的抗鼠TNF-α-1和抗鼠TNF-α-2偶联的纳米金粒子的聚集可以通过比色进行观测。
结果如图15所示,颜色随着TNF-α的浓度发生变化。利用此曲线,根据本发明的寡聚核苷酸-纳米金复合探针可实现对蛋白质分子的定量分析。
上述结果表明,这种通过polyA部分连接抗体到纳米金形成的复合物可以用于检测蛋白质分子。
实施例17
应用polyA结合区将RNA连接到纳米金上形成稳定的纳米金复合物
通过多聚腺苷作用连接RNA分子,polyA-RNA(SEQ ID NO.:23):5’-AAAAAAAAAAUUUUUGCUCGAGUCGGUAGA-3’;“AAAAAAAAAA”为结合区,“UUUUU”为过渡区,“GCUCGAGUCGGUAGA”为功能区。连接步骤:将金纳米颗粒与polyA-RNA以1:200的比例混合培育16h。向混合液中加入10mM磷酸盐(pH7.4)溶液和0.1M NaCl溶液,反应40h。然后,用10mM磷酸盐(pH7.4)和0.1M NaCl溶液清洗组装后的纳米颗粒三次,通过离心除去未组装的DNA(12000rpm,20min,4℃)。最后,将所得到的产物分散在PBS溶液中(0.3M NaCl,10mM磷酸盐,pH7.4),所用溶液均用RNAse-free H2O配置。
复合物洗涤后加入到含0.3M NaCl10mM磷酸盐(pH=7.4)的缓冲液中,仍能保持红色,由于没有组装上生物分子的纳米金抗盐能力很弱,所以这说明RNA通过polyA部分成功连接到纳米金表面上。
上述结果表明,应用polyA结合区可以将RNA连接到纳米金上形成稳定的纳米金复合物。
实施例18
应用polyA结合区将多肽连接到纳米金上形成稳定的纳米金复合物
通过多聚腺苷作用连接多肽,实验试剂包括:一条羧基修饰的含多聚腺苷寡聚核苷酸分子(polyA-pro):5’-HOOC-CACGA CACACCTAGCTTTTTAAAAAAAAAA-3’(HOOC-SEQ ID NO.:22),和合成的Tat寡肽分子:H2N-CYGRKKRRQRRR-OH(SEQ ID NO.:24)。
连接步骤如下:第一步:将polyA-pro和合成的Tat寡肽分子通过碳化二亚胺/n-羟基琥珀酰亚胺缩合(EDC/NHS)方法连接在一起;第二步:将金纳米颗粒与连接了Tat寡肽分子的polyA-pep以1:200的比例混合培育16h。向混合液中加入10mM磷酸盐(pH7.4)溶液和0.1M NaCl溶液,反应40h。然后,用10mM磷酸盐(pH7.4)和0.1M NaCl溶液清洗组装后的纳米颗粒三次,通过离心除去未组装的DNA(12000rpm,20min,4℃)。最后,将所得到的产物分散在PBS溶液中(0.3M NaCl,10mM磷酸盐,pH7.4)。
复合物洗涤后加入到含0.3M NaCl10mM磷酸盐(pH=7.4)的缓冲液中,仍能保持红色,由于没有组装上生物分子的纳米金抗盐能力很弱,表明多肽通过polyA部分成功连接到纳米金表面上。
上述结果表明,应用polyA结合区将多肽连接到纳米金上形成稳定的纳米金复合物。
实施例19
应用polyA结合区将小分子连接到纳米金上形成稳定的纳米金复合物
通过多聚腺苷作用连接小分子(胆固醇分子),实验试剂包括一条胆固醇分子修饰的DNA分子:5’-AAAAAAAAAAA gCAAA TCCTA AACAC-Cholesterol-3’(5’-SEQ ID NO.:25-Cholesterol-3’)。将金纳米颗粒与一条胆固醇分子修饰的DNA分子以1:200的比例混合培育16h。向混合液中加入10mM磷酸盐(pH7.4)溶液和0.1M NaCl溶液,反应40h。然后,用10mM磷酸盐(pH7.4)和0.1M NaCl溶液清洗组装后的纳米颗粒三次,通过离心除去未组装的DNA(12000rpm,20min,4℃)。最后,将所得到的产物分散在PBS溶液中(0.3MNaCl,10mM磷酸盐,pH7.4)
复合物洗涤后加入到含0.3M NaCl10mM磷酸盐(pH=7.4)的缓冲液中,仍能保持红色,由于没有组装上生物分子的纳米金抗盐能力很弱,表明胆固醇分子通过polyA部分成功连接到纳米金表面上。
上述结果表明,应用polyA结合区将小分子连接到纳米金上形成稳定的纳米金复合物。
实施例20
通过polyA结合于金表面的siRNA-纳米金复合物能进入细胞并抑制目标基因的表达
为了实现抑制细胞内基因表达的作用,在纳米金颗粒表面通过纳米金与多聚腺苷的相互作用,连接一段针对细胞内磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的siRNA,同时连接一段可以增加纳米颗粒细胞摄取效率的寡肽(HIV病毒Tat蛋白信号)。
步骤如下:
1.合成GAPDH siRNA:
5’-AGUAGAGGCAGGGAUGAUGUUUUUAAAAAAAAAA-3’(SEQ IDNO.:26);
2.将polyA-siRNA和合成的Tat寡肽分子通过碳化二亚胺/n-羟基琥珀酰亚胺缩合(EDC/NHS)方法连接在一起;
3.用柠檬酸三钠还原氯金酸法合成粒径13nm的纳米金颗粒(浓度为9nM),用0.22μm滤膜过滤除菌;
4.将连接有Tat寡肽分子的寡聚核苷酸按照标准方法连接到纳米金表面。
5.细胞培养与转染:Hela细胞以含penicillin/streptomycin双抗和10%热失活胎牛血清的DMEM培养基培养于37℃,5%CO2条件下。将生长到80%聚合度的细胞消化后以15000细胞/孔的密度种于96孔培养板中生长24小时,将细胞用PBS清洗,加入新鲜培养基和由步骤4得到的纳米颗粒(终浓度40nM)继续培养。48小时后,用PBS洗细胞,以胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞,离心后重悬于DMEM培养基中,用细胞计数器计数后,用细胞裂解液消解细胞,用于Western实验。
6.Western实验:将步骤5得到的细胞裂解液用4%-12%梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,并转移至0.45μm硝化纤维素膜,在常温下以封闭液封闭1小时后,与鼠抗人α-tubulin抗体溶液孵育1小时,以洗涤液彻底洗涤后,加入鼠抗人GAPDH抗体溶液孵育1小时,再次彻底洗涤后,加入HRP标记的羊抗鼠二抗溶液孵育1小时,最后加入发光底物反应并成像。纳米颗粒对GAPDH基因的抑制效果由GAPDH条带亮度/各自α-tubulin条带亮度进行定量。
从图16的结果可以看出,通过对目标基因表达有明显的抑制效果,目标基因GAPDH的表达水平显著下降,而游离的GAPDH siRNA没有对目标基因的表达产生显著影响。
上述结果表明,通过polyA部分可以将siRNA连接到纳米金表面的功能分子具有调控目标基因表达。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (12)
1.一种纳米金复合物,其特征在于,所述复合物包括纳米金颗粒和功能分子,并且所述的功能分子通过富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区结合于纳米金颗粒的表面。
2.如权利要求1所述的纳米金复合物,其特征在于,所述的功能分子具有式I-式III任一所示结构:
B-L-R I;
R-L-B-L-R II;
(B-L-R-L-B)m III;
式中,
B表示富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区;
R表示功能区;
L表示位于B和R之间的任选的过渡区;
m为选自1-20的整数;
或优选地,
所述的富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区具有选自下组的一个或多个特征:
(i)结合区的长度为5-100个碱基,较佳地5-40个碱基,更佳地10-30个碱基;
(ii)结合区含有一个或多个poly(A)n区段,其中n为选自1-100的整数,较佳地n为选自2-30的整数,更佳地n为选自3-20的整数;
(iii)结合区中A碱基的含量≥70%,较佳地≥80%,更佳地≥90%,最佳地≥95%,或为100%;
(iv)结合区中T碱基和U碱基的总量≤20%,较佳地≤10%,更佳地≤5%,最佳地≤0%;
或较佳地,
所述的过渡区由选自下组的成分组成:寡核苷酸、多肽、高分子链、小分子、或其组合;
或优选地,
所述的功能区为修饰或未修饰的、以及标记或未标记的选自下组的分子(moiety):核酸、核酸适配体、核酶(DNAzyme或RNAzyme)、蛋白质、多肽、抗体、探针、酶、凝集素、配体、小分子、胆固醇。
3.如权利要求1所述的纳米金复合物,其特征在于,所述的纳米金颗粒具有选自下组的一个或多个特征:
(1)纳米金颗粒的平均粒径为1-150nm,较佳地为5-100nm,更佳地5-20nm;
(2)在纳米金颗粒中,80%以上(较佳地90%以上)的纳米金颗粒的粒径在1-150nm范围内,较佳地在5-100nm范围内。
4.如权利要求1所述的纳米金复合物,其特征在于,所述纳米金颗粒的表面上功能分子的结合密度为1×105—5×1013个/cm2,较佳地为1×107—2×1013个/cm2,更佳佳地为1×109—2×1013个/cm2,更佳地为1×1011—2×1013个/cm2,最佳地为1×1012—2×1013个/cm2。
5.一种功能分子,其特征在于,所述的功能分子可通过富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区结合于纳米金颗粒表面,并且所述的功能分子具有式I-式III任一所示结构:
B-L-R I;
R-L-B-L-R II;
(B-L-R-L-B)m III;
式中,
B表示富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区;
R表示功能区;
L表示位于B和R之间的任选的过渡区;
m为选自1-20的整数;
或优选地,
所述的富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区具有选自下组的一个或多个特征:
(i)结合区的长度为5-100个碱基,较佳地5-40个碱基,更佳地10-30个碱基;
(ii)结合区含有一个或多个poly(A)n区段,其中n为选自1-100的整数,较佳地n为选自2-30的整数,更佳地n为选自3-20的整数;
(iii)结合区中A碱基的含量≥70%,较佳地≥80%,更佳地≥90%,最佳地≥95%,或为100%;
(iv)结合区中T碱基和U碱基的总量≤20%,较佳地≤10%,更佳地≤5%,最佳地≤0%;
或较佳地,
所述的过渡区由选自下组的成分组成:寡核苷酸、多肽、高分子链、小分子、或其组合;
或优选地,
所述的功能区为修饰或未修饰的、以及标记或未标记的选自下组的分子(moiety):核酸、核酸适配体、核酶(DNAzyme或RNAzyme)、蛋白质、多肽、抗体、探针、酶、凝集素、配体、小分子、胆固醇。
6.一种组合物,其特征在于,所述的组合物含有药学上可接受的载体或检测学上可接受的载体,以及权利要求1所述的纳米金复合物。
7.一种权利要求1所述的纳米金复合物的制备方法,其特征在于,包括步骤:将功能分子与纳米金颗粒接触,使得功能分子通过富含腺嘌呤核苷酸或其类似物的寡核苷酸结合区结合于纳米金颗粒的表面,从而形成纳米金复合物。
8.权利要求1所述的纳米金复合物的用途,其特征在于,它被用于制备检测试剂或用于制备调控基因表达或调节蛋白活性的药物组合物。
9.一种检测产品,其特征在于,所述的产品含有权利要求1所述的纳米金复合物,所述复合物作为检测剂。
10.一种检测试剂盒,其特征在于,所述的检测试剂盒包括权利要求1所述的纳米金复合物或权利要求9所述的检测产品。
11.一种检测方法,其特征在于,包括步骤:将权利要求1所述的纳米金复合物用作检测剂,进行检测;
或优选地,
纳米金复合物的功能分子的功能区为核酸,用于检测序列与功能区核酸互补的目标多核苷酸;
或较佳地,
纳米金复合物的功能分子的功能区为核酸适配体,用于检测核酸适配体的底物;
或优选地,
纳米金复合物的功能分子的功能区为核酶,用于检测金属离子;
或较佳地,
纳米金复合物的功能分子的功能区为抗体,用于检测抗原。
12.一种体外非治疗性的基因调控方法,其特征在于,包括步骤:在培养体系中加入权利要求1所述的纳米金复合物,并且所述的功能分子具有调控目标基因表达的核苷酸序列。
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