CN101832936A - 一种基于纳米金与核酸结构的比色检测法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于纳米金与核酸结构的比色检测法及其试剂盒，包括以下步骤：1)将能与靶分子特异性结合的特异性DNA与待检溶液混合，进行反应；2)将步骤1)的反应溶液与摩尔数为特异性DNA的0.01～1倍的纳米金溶液混合，进行反应；3)加入反应浓度在10～600mM之间的高盐溶液，观察溶液颜色变化。本发明在操作过程中，DNA无需标记，无需昂贵仪器，只需通过观察纳米金溶液的颜色变化就可以判断靶分子是否存在，因此本发明简便、快捷、成本低廉、高特异性、高灵敏的检测任意靶分子，尤其适用于野外分析和高通量筛选，应用范围广。

Description

一种基于纳米金与核酸结构的比色检测法及其试剂盒

技术领域

本发明特别涉及一种基于纳米金与核酸结构的比色检测法及其试剂盒。

背景技术

核酸适体(aptamer)是指利用上个世纪末建立而发展起来的SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)体外筛选技术，从随机寡核苷酸文库中筛选获得的短单链寡核苷酸配基，它能够与靶分子特异结合，从而本身发生构象变化。

通过体外筛选技术，理论上可筛选到任意物质的核酸适体，再加上高通量筛选的技术特点与核酸适体精确识别、易体外合成与修饰等特性，使得核酸适体在分析化学与生物医药研究方面具有广阔的应用前景。例如，核酸适体在生物传感器的设计中具有重要作用，被应用于生物学、环境、安全等领域的检测，包括蛋白质(凝血酶、生长因子、HIV相关多肽等)、有机小分子(cAMP、ATP、可卡因等)和金属离子(K⁺、Hg²⁺、Pb²⁺等)，其他新的令人兴奋的应用包括基于核酸适体的蛋白质芯片，和在蛋白质组学中用于高通量成像、基于DNA酶和RNA酶的分子尺度的逻辑DNA分子计算机等。

除此之外，还有一些其他的DNA序列也可以在某一特定环境下发生构象变化。核酸适体和这些DNA对各自的靶物质来说都有其特异性的核酸结构，可与靶物质发生特异性反应，从而本身发生构象的变化。

这种核酸结构在遇到相应的靶分子进行结合时通常会伴有明显的构象变化。这种结构的差异形成了基于核酸结构传感器的理论基础。一个典型的基于核酸结构的传感器包括一个双标记的寡核苷酸序列(电子传递或能量传递的受体和供体)，因此，靶分子结合导致的结构变化可以直接影响到受体和供体之间的距离，从而可以高灵敏度的检测到电信号或光信号的产生。在此基础上，核酸结构在分析化学方面的应用逐渐成为人们关注的焦点，例如，Tan等将核酸适体应用于分子信标研究，发展了一种高效、高灵敏检测生物分子的方法-分子aptamer信标(MAB)，并进一步用于凝血酶和血小板源生长因子(PDGF)的检测。另外，由于核酸适体与抗体具有类似的特异结合性质，因此在ELISA、免疫学分析、Western印迹法和生物传感器等许多应用中具有更大的发展潜力，并取得初步结果。

纳米金颗粒在生物学中的应用非常广泛，目前，核酸结构-纳米复合物在分析检测中的应用也受到了关注。1996年，Mirkin和Alivisatos所在工作组分别报道了纳米金-DNA复合物的重要应用，并将其发展为基于纳米结构的新型检测平台。通过深入了解金胶独特的光学和电学性质，Mirkin等人随后发展了一系列方法对DNA和蛋白质进行超微量检测。他们的方法依赖于巯基DNA探针在金胶表面的修饰，当加入靶时，可以引起金胶的团聚或解聚，从而引起宏观上颜色的红-蓝变化。

基于纳米金和核酸结构的分析检测方法也已受到关注。Huang等用纳米金颗粒(GNPs)与核酸适体5’端的-SH直接作用形成的结合物(即Apt-AuNPs)来检测PDGF及其受体(PDGFR)，发现由于Apt-AuNPs具有简易性和专一性，所以非常适合于蛋白质分析和癌症诊断。Parlor等还将Apt-AuNPs用于光学检测凝血酶。Dwarakanath等将荧光性能优异的半导体纳米晶粒-量子点用于标记核酸适体，开辟了量子点技术与SELEX技术联合使用的先河。Korgd等通过生物素和抗生物素的作用将前列腺专一性膜抗原(PSMA)的核酸适体连接到具有近红外发光性能的CdTe量子点上来检测前列腺癌细胞，取得了较好的结果，这给核酸适体量子点标记在活细胞及生物体内的分析检测提供了新思路。但是这些方法主要是基于纳米金和HS-DNA的组装来进行的，由于DNA需要标记，而且组装的过程较为繁琐，耗时长、成本高，不利于推广应用。

最近，Rothberg等人报道了一种利用未经过修饰的金胶检测靶DNA的比色法(H.Li，L.Rothberg，PNAS 101，14036，September 28，2004)。该法基本原理是纳米金颗粒可以和单链DNA，通过静电作用发生瞬时的吸附结合，从而可以在高离子强度条件下有效地稳定纳米金，而双链DNA则不具有这种作用。但是该方法只对特定的DNA进行了检测，而不适用于任意靶物质的检测。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是将现有的纳米金检测靶DNA的比色法扩展到对不同的靶分子进行检测，借助于核酸适体和其他核酸结构对不同靶物质的特异性反应，提供一种简便、快捷、成本低廉、通用型的纳米金检测靶物质的比色法及其试剂盒，可以很方便地实现对任意靶物质的检测。

本发明人经过研究发现，将纳米金作为核酸适体的比色探针，核酸适体本身为一无规卷曲状态的柔性单链，它可以吸附在纳米金表面并有效的提高了纳米金的抗盐性能；当核酸适体与靶发生特异性结合后，构象发生变化形成有序的立体机构，而这种有序DNA结构不能吸附在纳米金表面，因此在提高溶液的离子强度后，没有靶分子的一组纳米金仍然保持单分散状态，而有靶分子的一组中，纳米金发生了团聚而产生由红到兰的颜色变化；因此，通过对纳米金颜色的观察，可以很方便地实现对靶物质的检测，从而完成了本发明。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种基于纳米金与核酸结构的比色检测法，包括以下步骤：

1)将能与靶分子特异性结合的特异性DNA与待检溶液混合，进行反应；

2)将步骤1)的反应溶液与摩尔数为特异性DNA的0.01～1倍的纳米金溶液混合，进行反应；

3)加入反应浓度在10～600mM之间的高盐溶液，观察溶液颜色变化。

本发明可实现对蛋白质、有机小分子、金属离子、甚至整个病毒颗粒等非DNA分子靶分子的检测。较佳的靶分子可为三磷酸腺苷(ATP)、可卡因(Cocaine)、血小板衍生性生长因子(PDGF)、凝血酶(thrombin)、溶菌酶(lysozyme)、汞离子或氢离子(pH值)。本发明所述的特异性DNA为核酸适体和一些其他的DNA序列，这些DNA序列也可以在某一特定环境下发生构象变化，核酸适体和这些DNA对各自的靶物质来说都有其特异性的核酸结构，可与靶物质发生特异性反应，从而本身发生构象的变化。较佳的特异性DNA为核酸适体、特异性结合钾离子的寡核苷酸(PSO)、特异性结合汞离子的寡核苷酸(MSO，mercury-specific Oligonuclide)或具有i-motif结构的寡聚核苷酸。根据本发明，步骤1)中较佳的，所述的特异性DNA的反应浓度为1～50μM，待检溶液中靶分子的反应浓度为1～1000μM，待检溶液中靶分子与特异性DNA的摩尔比为1∶1～1∶100。同常规，所述的反应较佳的可在缓冲溶液中进行，缓冲溶液较佳的为常规的Tris、PBS、柠檬酸或胂酸盐体系，缓冲溶液的反应浓度较佳的为0～25mM。另外较佳的还可加入终浓度为0～600mM的NaCl或者0-50mM的MgCl₂以调节离子强度。反应温度较佳的为4～37℃，反应时间较佳的为1～30分钟。

本发明步骤2)为将步骤1)的反应溶液与摩尔数为特异性DNA的0.01～1倍的纳米金溶液混合，进行反应。所述的纳米金较佳的为粒径10～20nm纳米金溶液。纳米金的反应浓度较佳的为1～100nM。反应温度较佳的为4～37℃，反应时间较佳的为1～5分钟。

本发明步骤3)为加入反应浓度在10～600mM之间的高盐溶液，观察溶液颜色变化。所述的高盐溶液较佳的为含有盐的缓冲溶液；其中，所述的盐为：MX/M’X₂，M＝Na⁺/K⁺，M’＝Mg²⁺/Ca²⁺，X＝Cl^-/Br^-/I^-/NO₃ ^-/ClO₄ ^-，反应浓度在10～600mM之间；所述的缓冲体系为常规的Tris、PBS或胂酸盐体系，反应浓度较佳的可为0～25mM。所述观察溶液颜色变化的方法优选为目视比色法或分光光度法。可以通过肉眼观察纳米金溶液颜色变化。肉眼观察时，当加入上述浓度的盐溶液后，含靶物质的溶液中纳米金会很快发生团聚，呈现蓝色，而没有靶物质的溶液则可以保持原来的红色不变。分光光度法可为仪器记录溶液的紫外可见光谱的变化：光谱520nm处吸收降低的，待检溶液含靶分子呈阳性；光谱保持不变的，待检溶液不含靶分子呈阴性。

同常规，本发明可以采用水或靶分子类似物替换步骤1)中所加的靶分子溶液作为对照组。所述的靶分子类似物可以是靶分子的结构类似物或性质类似物。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是：一种采用所述的比色检测法进行检测、更佳的还可定量靶物质的试剂盒，包含

1)特异性DNA；

2)纳米金溶液；

3)盐溶液。

根据本发明，在所述的试剂盒中，所述的特异性DNA如上述，较佳的为三磷酸腺苷、可卡因、血小板衍生性生长因子、凝血酶或溶菌酶的核酸适体，特异性结合汞离子的寡核苷酸或具有i-motif结构的寡聚核苷酸。所述的纳米金溶液中的纳米金的粒径较佳的为10～20nm。所述的纳米金溶液的浓度较佳的为1～100nM。所述的盐溶液较佳的为下述盐的溶液：MX/M’X₂，M＝Na⁺/K⁺，M’＝Mg²⁺/Ca²⁺，X＝Cl^-/Br^-/I^-/NO₃ ^-/ClO₄ ^-。所述的盐溶液的浓度优选0.2～1M，以使其反应浓度在10～600mM之间。所述的盐溶液中较佳的还含有的缓冲体系。所述的缓冲体系较佳的为常规的Tris、PBS或胂酸盐体系。

本发明整个反应的体系可控制在微升级别，较佳的反应体系的体积为5～500微升，优化实施方案可表述如下：反应浓度为1～50μM的特异性DNA与反应浓度为1～1000μM的靶分子，在20μL的缓冲溶液中进行充分反应。同时以不加靶分子溶液的一组、以及加入靶分子类似物的一组作为对照。然后分别取2μL的上述反应溶液加入5～500μL的纳米金(粒径10～20nm，反应浓度在1～100nM)溶液(Au∶DNA的摩尔比例范围在1∶1～1∶100)，4～37℃条件下反应1～5分钟，较佳的为5min。然后加入盐的缓冲溶液，所述的盐为：MX/M’X₂，其中M＝Na/K，M’＝Mg/Ca，X＝Cl^-/Br^-/I^-/NO₃ ^-/ClO₄ ^-；反应浓度在10～600mM之间；缓冲体系：Tris、PBS、胂酸盐等常规生化体系，反应浓度一般为0～25mM。观察实验组和对照组的纳米金颜色变化并记录紫外可见光谱。

本发明的基本原理可总结为：利用纳米金对不同结构DNA的吸附作用不同来实现对DNA结构的区分。单链DNA从分子形态上来讲主要呈现柔性状态，在溶液中可以随机的发生结构的变化；DNA骨架主要带负电荷，但碱基上游离的氨基表现为带正电。双链DNA碱基通过A-T/G-C配对而被包含在结构内部，因此表现为带负电。在溶液中，核酸适体主要以无规卷曲的单链形式存在，通过链上碱基上的游离氨基而吸附到纳米金颗粒表面，并且由于DNA链上带大量的负电荷从而提高了纳米金表面电荷密度，增强了纳米金在高浓度电解质条件下的稳定性。而当核酸适体等核酸结构结合了靶分子后，表现出较强的刚性，例如主要以双链、四分体、茎环、假结、凸环等形式存在。因此不能吸附到纳米金表面，不能提高纳米金的稳定性。因此，当在上述混合物中加入适当浓度的盐溶液后，含靶物质的溶液会很快发生团聚，呈现蓝色，而没有靶物质的溶液则可以保持原来的红色不变。本发明的检测原理图可参见图1。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明简便、快捷、成本低廉、适用于野外分析和高通量筛选的高特异性检测，在发明本方法的操作过程中，DNA无需标记，无需昂贵仪器，只需通过观察纳米金溶液的颜色变化就可以判断靶分子是否存在。

本发明的检测方法具有通用性，检测对象可以是任意靶分子，应用范围广。因为在理论上任何靶物质都可以通过SELEX技术寻找到特异性的核酸适体，而且自然界中还存在大量可以发生构象变化的DNA片段是基于某一特定环境和特定物质的。

本发明的检测方法具有高度特异性和灵敏度。因为核酸结构通常都具有非常高的亲和力，而高亲和力使得可以很方便地检测到极微量的靶分子，并将反应信号直接传输到检测元件进行读取，同时又不受其他非靶物质的干扰，实现对靶分子的特异性检测。并且整个反应的体系控制在微升级别，大大提高了检测的灵敏度，检测灵敏度可达10^-12mol数量级。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1是本发明纳米金-核酸结构探针对靶物质的检测原理示意图。

图2是本发明检测靶物质的纳米金溶液的紫外可见光谱图(以可卡因为例)。

具体实施方式

下面用本发明对三磷酸腺苷(ATP)、可卡因、凝血酶、溶菌酶、汞离子、血小板衍生性生长因子(PDGF)、pH值(氢离子)检测的实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。其中的“室温”是指进行实施例操作的实验室温度，为22～25℃。

紫外可见光谱在Hitachi UV-3010 spectrophotometer上进行，波长范围300～800nm，用50μL石英比色皿，取50μL样品进行测量。

本发明实施例中所用纳米金颗粒参考文献(S.Dwarakanath et al.，Biochemical and Biophysical Research Communications 325，739，2004)制备。具体步骤如下，将100mL 0.01％(w/w)的氯金酸溶液加热到沸腾后，在剧烈搅拌下快速加入2～5mL的柠檬酸三钠溶液(10mg/mL)并继续加热15～30min，溶液变成酒红色。停止加热继续搅拌30min后，静置过夜。然后用0.22μm滤膜进行过滤，并放置在冰箱4℃保存。根据本方法得到粒径为10～20nm，浓度为8～1nM的纳米金溶液。在制备纳米金时，使用的是同一浓度的氯金酸溶液，生成的颗粒越大，对应的浓度就越低。此处，10nm金的浓度为8nM左右，而20nm的金的浓度为1nM左右。

本发明实施例中所用的各种特异性DNA序列如表1所示，均按照已公布的序列由上海生物工程技术有限公司合成。其中，检测ATP、可卡因、凝血酶和溶菌酶所用的特异性DNA为核酸适体，检测PDGF、汞离子、pH值所用的特异性DNA分别为MSO和具有i-motif结构的DNA。

表1.特异性DNA的寡聚核苷酸序列

实施例1可卡因的检测

步骤：分别取2μL浓度为100μM的可卡因-核酸适体溶液与2μL浓度为0.1～10mM的可卡因盐酸盐的水溶液，加入18μL缓冲溶液(25mM Tris，pH8.2，0.6M NaCl)后混匀(DNA终浓度为10μM，可卡因的终浓度为10-1000μM)，室温条件下反应30min。同时以不加可卡因，加入2μL水的一组作为空白、以及加入2μL 1mM的苯甲酰芽子碱(N1)、芽子碱甲酯(N2)的两组作为对照。然后分别取2μL的上述反应溶液加入100μL如上制备而得的纳米金溶液(13nm，3.5nM)，室温反应5min后，加入30μL的0.2M PB-盐溶液(10mM PB，pH7.0，0.2M KCl)(终浓度约为50mM)。观察实验组和对照组的纳米金颜色变化并记录紫外可见光谱。

结果：如图1所示，在含有可卡因的一组溶液中，可卡因-核酸适体与可卡因作用形成刚性的双链结构，不能吸附到纳米金表面，因此加入盐后纳米金发生团聚表现为蓝色。而可卡因-核酸适体本身，以及遇到N1、N2后，DNA均保持原来的单链状态，有效的提高了纳米金的耐盐性，仍然保持红色。紫外可见光谱图见图2，显示可卡因组在520nm处明显降低，而长波处吸收明显升高，证明大部分已经形成聚集体，而N1、N2组以及空白组均没有明显变化。利用此法，可以检测纳米金溶液中终浓度为1～100μM的可卡因，溶液的体积可以控制在5～500微升。通过优化条件，例如控制溶液体积在5微升，检测浓度在1μM时，最低可以检测到5pmol的可卡因。

实施例2ATP的检测

步骤：分别取2μL浓度为10μM的ATP-核酸适体溶液与2μL浓度为0.01～1mM的ATP的水溶液，加入18μL缓冲溶液(10mM Tris，pH8.2，0.3M NaCl)后混匀(DNA终浓度为1μM，ATP的终浓度为1-100μM)，室温条件下反应15min。同时以不加ATP，加入2μL水的一组作为空白、以及加入2μL 1mM的CTP、UTP、GTP的三组作为对照。然后分别取2μL的上述反应溶液加入10μL的如上制备而得纳米金溶液(20nm，2nM)，室温反应5min后，加入10μL的0.2M PBS(10mM PB，pH7.0，0.2M NaCl)(PBS的终浓度约为100mM)。分别记录实验组和对照组的纳米金颜色变化以及紫外可见光谱。

结果：根据如图1所示的原理和操作步骤，加入ATP的一组呈现蓝色，紫外可见光谱显示520nm处的吸收峰明显降低，而长波处吸收明显升高，而UTP、CTP、GTP组以及空白组均没有明显变化。利用此法可以检测纳米金溶液中浓度为50nM～5μM的ATP，溶液的体积可以控制在5～500微升。如实施例1通过优化条件，最低可以检测到0.5pmol的ATP。

实施例3对二价汞离子的检测

步骤：取2μL浓度为100μM的Hg²⁺-MSO溶液，加入2μL浓度为0.1～2mM的Hg²⁺的水溶液(MSO的反应浓度为50μM，靶物质的反应浓度为50-1000μM，反应缓冲溶液和离子强度均为0)，室温条件下反应1min。同时以不加Hg²⁺，加入2μL水的一组作为空白实验。另外选择性分析通过两组实验来进行，一组加入2μL各25mM的Ca²⁺、Mg²⁺的，另外一组加入各0.5mM的混合离子(Fe²⁺，Cu²⁺，Co²⁺，Mn²⁺，Ni²⁺，Zn²⁺，Cd²⁺)。然后分别取2μL的上述反应溶液加入100μL如上制备而得的纳米金溶液(10nm，100nM)，37℃反应1min后，加入60μL的1M NaNO₃(盐的终浓度约为600mM)。观察实验组和对照组的纳米金颜色变化并记录紫外可见光谱。

结果：根据如图1所示的原理和操作步骤，加入Hg²⁺的一组呈现蓝色，紫外可见光谱显示520nm处的吸收峰明显降低，而长波处吸收明显升高，而其他混合离子组以及空白组均没有明显变化。检测灵敏度和检测限如实施例1所示。

实施例4对二价汞离子的检测

步骤：分别取2μL浓度为10μM的Hg²⁺-MSO溶液和2μL浓度为0.01～0.1mM的Hg²⁺的水溶液，加入18μL缓冲溶液(10mM胂酸盐，pH8.0)，(此处MSO的反应浓度为1μM，靶物质的反应浓度为1-10μM)在4℃条件下反应5min。同时以不加Hg²⁺，加入2μL水的一组作为空白实验。另外选择性分析通过两组实验来进行，一组加入2μL各25mM的Ca²⁺、Mg²⁺的，另外一组加入各0.5mM的混合离子(Fe²⁺，Cu²⁺，Co²⁺，Mn²⁺，Ni²⁺，Zn²⁺，Cd²⁺)。然后分别取2μL的上述反应溶液加入100μL如上制备而得的纳米金溶液(13nm，1nM)，4℃反应5min后，加入5μL的0.2M NaClO₄(终浓度约为10mM)。观察实验组和对照组的纳米金颜色变化并记录紫外可见光谱。

结果：根据如图1所示的原理和操作步骤，加入Hg²⁺的一组呈现蓝色，紫外可见光谱显示520nm处的吸收峰明显降低，而长波处吸收明显升高，而其他混合离子组以及空白组均没有明显变化。检测灵敏度和检测限如实施例1所示。

实施例5对pH-DNA结构的检测

步骤：分别取2μL浓度为100μM的pH-DNA溶液，加入到8μL柠檬酸缓冲溶液(0.05M，pH5.5)以及8μL Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲溶液中(10mM，pH8.5)，室温条件下反应5min，pH-DNA终浓度为10μM。同时以对比DNA1作为对照，如上操作。用HCl或NaOH调节如上制备而得的纳米金溶液(13nm，10nM)的pH值分别为5.5、8.5。然后分别取2μL的上述反应溶液加入相同pH值的100μL的纳米金溶液，室温反应5min后，加入20μL的PBS-盐溶液(10mM PB，pH7.0，0.1M NaI)。观察实验组和对照组的纳米金颜色变化并记录紫外可见光谱。

结果：根据如图1所示的原理和操作步骤，pH为5.5的一组呈现蓝色，紫外可见光谱显示520nm处的吸收峰明显降低，而长波处吸收明显升高，而pH为8.5的一组没有明显变化。对照组结果显示，对比DNA1无论是在碱性还是酸性条件下均没有明显变化。利用此法可以得到pH-DNA的结构半转换点在pH6.3附近，这与通过CD谱检测得到的pH6.2的结构半转换点非常吻合。

实施例6对pH的检测

步骤：

1、获得标准工作曲线

(1)分别取2μL浓度为100μM的pH-DNA溶液，加入到8μL柠檬酸缓冲溶液(0.05M，pH5.5)以及8μL Na2CO3/NaHCO3缓冲溶液中(0.05M，pH8.5)，室温条件下反应30min。

(2)用HCl或NaOH制备pH分别为4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，10.0的水溶液，然后分别取50μL该不同pH值的水溶液加入到50μL如上制备而得的纳米金溶液(13nm，3.5nM)中，混合均匀。

(3)分别取2μL的步骤(1)的反应溶液加入到步骤(2)的不同pH值的100μL的纳米金溶液中，室温反应5min，然后加入20μL的0.2M PBS(10mM PB，pH7.0，0.2M NaCl)。观察实验组和对照组的纳米金颜色变化并记录紫外可见光谱，获得标准工作曲线。

2、样品的检测

取50μL待测pH值的样品加入到50μL如上制备而得的纳米金溶液中(13nm，3.5nM)。再加入2μL的步骤(1)的反应溶液，室温反应5min。然后加入20μL的0.2M PB-盐溶液(10mM PB，pH7.0，0.2M NaBr)，观察纳米金溶液的颜色变化并记录紫外可见光谱，根据标准曲线，确定待测溶液的pH值。

结果：可检测的pH值的样品的pH范围是pH5～10。

实施例7对凝血酶的检测

步骤：分别取2μL浓度为100μM的凝血酶-核酸适体溶液与2μL浓度为0.1～1mM的凝血酶的水溶液，加入18μL缓冲溶液(20mM Tris-乙酸，pH7.4，140mM NaCl，1mM CaCl₂，1mM MgCl₂)后混匀，室温条件下反应30min。(此处DNA的反应浓度为10μM，靶物质的反应浓度为10-100μM)同时以不加凝血酶，加入2μL水的一组作为空白实验。以及加入2μL 1mM的BSA(牛血清白蛋白)的一组作为对照。然后分别取2μL的上述反应溶液加入100μL如上制备而得的纳米金溶液(13nm，10nM)，室温反应5min后，加入40μL的PBS-盐溶液(10mM PB，pH7.0，0.1M CaCl₂)(终浓度约为65mM)。观察实验组和对照组的纳米金颜色变化并记录紫外可见光谱。

结果：根据如图1所示的原理和操作步骤，凝血酶组呈现蓝色，紫外可见光谱显示520nm处的吸收峰明显降低，而长波处吸收明显升高，而BSA对照和空白组均没有明显变化。检测灵敏度和检测限如实施例1所示。

实施例8对溶菌酶的检测

步骤：分别取2μL浓度为100μM的1溶菌酶-核酸适体溶液与2μL浓度为0.01～1mM的溶菌酶的水溶液，加入18μL缓冲溶液(10mM PB，pH7.0，0.1M NaCl)后混匀，(此处DNA的反应浓度为10μM，靶物质的反应浓度为10-100μM)室温条件下反应30min。同时以不加溶菌酶，加入2μL水的一组作为空白实验。以及加入2μL 1mM的BSA的一组作为对照。然后分别取2μL的上述反应溶液加入100μL如上制备而得的纳米金溶液(20nm，10nM)，室温反应5min后，加入10μL的PBS-盐溶液(10mM PB，pH7.0，0.2M MgCl₂)。观察实验组和对照组的纳米金颜色变化并记录紫外可见光谱。

结果：根据如图1所示的原理和操作步骤，溶菌酶组呈现蓝色，紫外可见光谱显示520nm处的吸收峰明显降低，而长波处吸收明显升高，而BSA对照和空白组均没有明显变化。检测灵敏度和检测限如实施例1所示。

实施例9对PDGF的检测

步骤：分别取2μL浓度为100μM的PDGF-核酸适体溶液与2μL浓度为0.01～1mM的PDGF的水溶液，加入18μL缓冲溶液(10mM PB，pH7.0，0.1MNaCl)后混匀，(此处DNA的反应浓度为10μM，靶物质的反应浓度为10-100μM)37℃条件下反应30min。同时以不加PDGF，加入2μL水的一组作为空白实验。以及加入2μL 1mM的BSA的一组作为对照。然后分别取2μL的上述反应溶液加入100μL如上制备而得的纳米金溶液(20nm，10nM)，37℃反应5min后，加入50μL的0.2M PBS(10mM PB，pH7.0，0.2M NaCl)。观察实验组和对照组的纳米金颜色变化并记录紫外可见光谱。

结果：根据如图1所示的原理和操作步骤，PDGF组呈现蓝色，紫外可见光谱显示520nm处的吸收峰明显降低，而长波处吸收明显升高，而BSA对照和空白组均没有明显变化。检测灵敏度和检测限如实施例1所示。

序列表

<110>苏州市长三角系统生物交叉科学研究院有限公司

 

<120>一种基于纳米金与核酸结构的比色检测法及其试剂盒

 

<130>P4-081492C

 

<140>200910047300.4

<141>2009-03-10

 

<160>8

 

<170>PatentIn version 3.4

 

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial

 

<220>

<223>可卡因核酸适体

 

<400>1

gacaaggaaa atccttcaat gaagtgggtc          30

 

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial

 

<220>

<223>ATP核酸适体

 

<400>2

acctggggga gtattgcgga ggaaggt             27

 

<210>3

<211>15

<212>DNA

<213>Artificial

 

<220>

<223>凝血酶核酸适体

 

<400>3

ggttggtgtg gttgg                          15

 

<210>4

<211>42

<212>DNA

<213>Artificial

 

<220>

<223>溶菌酶核酸适体

 

<400>4

atctacgaat tcatcagggc taaagagtgc agagttactt ag              42

 

<210>5

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial

 

<220>

<223>PDGF核酸适体

 

<400>5

caggctacgg cacgtagagc atcaccatga tcctg                      35

 

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial

 

<220>

<223>Hg2+-DNA(MSO)

 

<400>6

ttctttcttc cccttgtttg tt                                    22

 

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

 

<220>

<223>pH-DNA

 

<400>7

ccctaaccct aaccctaacc c                                     21

 

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

 

<220>

<223>对比DNA1

 

<400>8

agcaacctca aacagacacc atgg                                  24

Claims (15)

1.一种基于纳米金与核酸结构的比色检测法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将能与靶分子特异性结合的特异性DNA与待检溶液混合，进行反应；

2)将步骤1)的反应溶液与摩尔数为特异性DNA的0.01～1倍的纳米金溶液混合，进行反应；

3)加入反应浓度在10～600mM之间的盐溶液，观察溶液颜色变化。

2.根据权利要求1所述的靶分子的比色检测法，其特征在于，步骤1)所述的靶分子为三磷酸腺苷、可卡因、血小板衍生性生长因子、凝血酶、溶菌酶、汞离子或氢离子；所述的特异性DNA为三磷酸腺苷、可卡因、血小板衍生性生长因子、凝血酶或溶菌酶的核酸适体，特异性结合汞离子的寡核苷酸或具有i-motif结构的寡聚核苷酸。

3.根据权利要求1所述的比色检测法，其特征在于，步骤1)所述的特异性DNA的反应浓度为1～50μM，待检溶液中靶分子的反应浓度为1～1000μM，待检溶液中靶分子与特异性DNA的摩尔比为1∶1～1∶100。

4.根据权利要求1所述的比色检测法，其特征在于，步骤1)所述的反应在缓冲溶液中进行。

5.根据权利要求1所述的比色检测法，其特征在于，步骤1)的反应温度为4～37℃，反应时间为1～30分钟。

6.根据权利要求1所述的比色检测法，其特征在于，步骤2)所述的纳米金溶液的反应浓度为1～100nM。

7.根据权利要求1所述的比色检测法，其特征在于，步骤2)的反应温度为4～37℃，反应时间为1～5分钟。

8.根据权利要求1所述的比色检测法，其特征在于，步骤3)所述观察溶液颜色变化的方法为目视比色法或分光光度法。

9.一种采用权利要求1～8任一项所述的比色检测法进行检测靶物质的试剂盒，其特征在于，包含

1)能与靶分子特异性结合的特异性DNA；

2)纳米金溶液；

3)盐溶液。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的纳米金溶液中的纳米金的粒径为10～20nm。

11.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的纳米金溶液的浓度为1～100nM。

12.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的盐溶液为下述盐的溶液：MX/M’X₂，M＝Na⁺/K⁺，M’＝Mg²⁺/Ca²⁺，X＝Cl^-/Br^-/I^-/NO₃ ^-/ClO₄ ^-。

13.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的盐溶液的浓度为0.2～1M。

14.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的盐溶液中含有的缓冲体系。

15.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的缓冲体系为常规的Tris、PBS或胂酸盐体系。

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