CN104807989A - 核酸适体-汞离子复合物的解离及应用 - Google Patents

核酸适体-汞离子复合物的解离及应用 Download PDF

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Abstract

核酸适体-汞离子复合物的解离及应用。解离包括：用盐酸调节双蒸水使其pH为4-7并加热至25℃-55℃以形成解离溶液；以及将附着有核酸适体-汞离子复合物的玻片载体置于解离溶液中并以25-50次/min的频率震荡30-100min，从而将汞离子与玻片载体上附着的核酸适体充分解离。根据本发明的方法，解离汞离子后的固定化核酸适体可至少重复使用5-10次，并且汞离子的解离效率可高达95％。

Description

核酸适体-汞离子复合物的解离及应用
技术领域
本发明涉及汞离子的检测方法。更具体来说，涉及利用核酸适体来检测汞离子的方法。
背景技术
汞离子作为一种重金属离子，具有较强毒性，可在生物体内累积，摄入量较大时会对免疫系统和神经系统造成严重危害。因此，对汞离子污染的研究受到了广泛关注，并发展了丰富多样的检测方法，包括原子吸收光谱法、荧光法、电化学法、生物传感检测法等。其中，生物传感检测技术由于其优秀的特异性分子识别能力，在快速检测小分子方面展现了良好的能力。尤其是核酸适体技术，经过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选出的核酸适体与靶物质之间的亲合力甚至强于DNA互补碱基对之间的结合力，因而经常被用于基因突变、可卡因、重金属汞离子、铅离子等小分子的快速检测。
在当前的核酸适体检测汞离子研究中，核酸适体作为识别探针捕捉汞离子，并结合荧光基团、电化学等手段实现汞离子的快速定量检测。然而，目前核酸适体的使用都是一次性的，无法进行重复利用，导致核酸适体的使用效率低下、使用成本较高。因此，研究核酸适体-汞离子复合物的解离方法非常必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用核酸适体来检测汞离子的方法，其中的核酸适体能够被重复使用。
根据本发明的第一方面，提供了一种核酸适体-汞离子复合物的解离方法，包括：
用盐酸调节双蒸水使其pH为4-7并加热至25℃-55℃以形成解离溶液；以及
将附着有核酸适体-汞离子复合物的玻片载体置于解离溶液中并以25-50次/min的频率震荡30-100min，从而将汞离子与玻片载体上附着的核酸适体充分解离。
在本发明的一个优选实施例中，解离温度为55℃而解离震荡频率为50次/min。因为发明人发现，在上述解离过程中，解离温度在15℃-75℃之间时，与汞离子的解析效率成线性正比例关系；但如果解离温度超过55℃，则解离汞离子后的固定化核酸适体的重复使用次数会大大减少。另外，解离震荡频率在25-100次/min之间时，震荡频率越快，汞离子的解析效率越高；但如果震荡频率超过50次/min时，解离汞离子后的固定化核酸适体的重复使用次数会大大减少。
在本发明的进一步优选实施例中，解离时间为60min。因为发明人发现(参见图1)，当解离时间在0-60min之间时，解离率随着时间增加而逐渐升高，而当解离时间在60-180min之间时，复合物的解离达到饱和，进入平台期，因此60min的解离时间既能保证达到最高水平的解离程度，又能保证较高的时间效率。
根据本发明的解离方法，解离汞离子后的固定化核酸适体可至少重复使用5-10次，并且汞离子的解离效率在90％以上，甚至高达95％。另外，每重复使用1次，玻片载体上固定的核酸适体吸附汞的效率和再次解离汞的效率至多降低2％。
根据本发明的第二方面，提供了一种利用含T碱基的核酸适体来检测汞离子的方法，其包括：
提供玻片载体；
对玻片载体执行羟基化处理以获得表面洁净的羟基化玻片载体；
对羟基化玻片载体执行硅烷化处理以获得硅烷化玻片载体；
将含T碱基的核酸适体固定在硅烷化玻片载体上；
将固定在玻片载体上的核酸适体与单位体积的待测汞离子溶液反应预定时间以在玻片载体上形成T-Hg复合物；
从待测汞离子溶液中取出玻片载体；
利用权利要求1的解离方法对所取出的玻片载体执行解离；
利用电化学检测方法检测解离溶液中的汞离子浓度；
建立待测汞离子初始浓度与解离后浓度相对应的标准曲线；以及
根据解离后所检测的汞离子浓度确定待测汞离子初始浓度。
根据本发明的检测方法还可以包括：重复利用(固定在玻片载体上的)解离后的核酸适体来检测汞离子浓度。
根据本发明的一个优选实施例，还包括：从待测汞离子溶液中取出玻片载体之后(用双蒸水)立即执行清洗。在解离之前进行清洗可以在电化学检测过程中有效消除其它(金属)阳离子的干扰。
根据本发明的一个实施例，其中解离溶液的体积小于待测汞离子溶液的单位体积。该实施例尤其适用于微量汞离子存在而用常规方法无法检测出的情况，其可以利用本发明的核酸适体对汞离子(在解离溶液中)进行富集，直至可以检测出的程度。解离溶液的体积优选小于待测汞离子溶液(采样)单位体积的五分之一。
本发明对玻片载体执行羟基化处理没有特别要求，在一个优选实施例中，对玻片载体执行羟基化处理包括：
将98％浓硫酸与30％过氧化氢按体积比3:1混合均匀而形成羟基化处理液；
将玻片载体置于羟基化处理液中，加热至微沸条件下保持30min以进行羟基化反应；以及
冷却后用双蒸水清洗羟基化处理的玻片载体并晾干，从而得到表面洁净的羟基化玻片。
在本发明的一个实施例中，对羟基化玻片载体执行硅烷化处理包括：
将羟基化玻片载体浸入温度为45℃、浓度为4mmol/L的GOPS溶液并保持30min以进行硅烷化反应；以及
用乙醇清洗硅烷化处理的玻片载体并晾干，从而获得硅烷化玻片载体。
发明人发现，γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(GOPS)作为偶联剂可以良好地将本发明的含T碱基的核酸适体固定于玻片载体表面，并便于其进行后面与汞离子的结合和解离过程。
在本发明的一个实施例中，将含T碱基的核酸适体固定在硅烷化玻片载体上包括：
制备固定化缓冲液：含0.1mol/L 1-甲基咪唑，体积比为10％的二甲亚砜，以及pH为10；
将含T碱基的核酸适体溶于固定化缓冲液中以形成浓度为5-25μmol/L的核酸适体溶液；以及
取预定量的核酸适体溶液涂抹于硅烷化玻片载体上并在25℃-65℃之间反应30-120min，从而使核酸适体固定在玻片载体表面上。
在进一步的优选实施例中，含T碱基的核酸适体的结构为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’。发明人偶然发现，这种结构的核酸适体对汞离子的结合和/或解离，尤其是对汞离子的解离有着惊人的高效。
在本发明的一个实施例中，将固定在玻片载体上的核酸适体与待测汞离子形成T-Hg复合物包括：
制备MOPS-NaNO3缓冲液：含10mmol/L 3-(N-吗啡啉)丙磺酸(MOPS),100mmol/L NaNO3,以及pH为7.1；以及
将待测汞离子和固定在玻片载体上的核酸适体分别引入MOPS-NaNO3缓冲液并保持10-180min，从而在玻片载体上形成T-Hg复合物。
在进一步的优选实施例中，在检测T-Hg复合物之前用MOPS-NaNO3缓冲液再次冲洗T-Hg复合物。
在本发明的检测方法中，待测汞离子初始浓度与解离后浓度相对应的标准曲线的建立过程为：
给出一系列已知(标准)浓度的汞离子溶液，并将这些已知浓度作为标准曲线的横坐标值；以及
在(与检测未知浓度或待测汞离子溶液的条件)相同的条件下求出解离后汞离子浓度作为标准曲线的纵坐标值。
本发明对上述步骤中的电化学检测无特殊要求，任何能够合适检测金属阳离子浓度的电化学检测装置均可用于本发明，因此在此不再详细描述这类常规电化学检测装置的结构和原理。
根据本发明的检测方法，通过核酸适体与待测汞离子的结合与解离作用，能够排除待测样本中的其它杂质例如非汞金属阳离子的干扰，从而能够完成对汞离子的可靠以及重复性检测，并大大降低了检测成本。
附图说明
附图1为解离时间对核酸适体-汞离子解离程度的影响。
附图2为多次回收的核酸适体对汞的结合效率。
附图3为多次回收的核酸适体对汞的解离效率。
具体实施方式
以下实施例描述了本发明的解离率的测定过程。本领域技术人员应当理解，下述实施例中所涉及的工艺步骤只是本发明的方法中的某些示例性工艺步骤，并非用于限制本发明。本领域技术人员还可以理解，虽然下述实施例描述的是本发明的解离率的测定过程，但通过下面的具体描述，本发明的解离方法以及检测方法均得以清晰明确。
玻片羟基化：将玻片置于98％浓硫酸与30％过氧化氢按体积比3:1所形成的混合液中，加热至微沸并保持30min，冷却后取出玻片用双蒸水清洗，再晾干。
硅烷化：将上述玻片浸入45℃4mmol/L的GOPS溶液30min进行表面硅烷化处理，然后用乙醇清洗并晾干。
固定核酸适体：准备含T碱基的核酸适体(结构为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)；溶于固定化缓冲液(含0.1mol/L 1-甲基咪唑，体积比为10％的二甲亚砜，pH10)中，使其浓度达到15μmol/L；然后取10μL涂抹于上述玻片，45℃反应120min。此后还可以用固定化缓冲液冲洗，收集废液，然后用超微量分光光度计测量核酸适体的残余量，从而获知核酸适体的固定量。
核酸适体-汞离子复合物：室温下，固定了上述核酸适体的玻片在20mL 0.1μmol/L的HgCl2溶液中(包含10mmol/LMOPS,100mmol/L NaNO3,pH7.1)浸泡100min，并以上述浓度的MOPS-NaNO3溶液冲洗，去除非特异性吸附的汞离子，在玻片表面获得适体-汞离子复合物。检测(例如用原子吸收光谱仪)复合物形成后洗脱废液中汞离子的含量，从而获知核酸适体结合的汞量。
解离：双蒸水用盐酸调节为pH 4，加热至55℃保持恒温，将上述固定了适体-汞离子复合物的玻片置于其中，以50次/min的频率震荡60min,令汞离子与适体充分解离。用原子吸收光谱仪测量洗脱液中解离的汞含量，计算得知适体-汞复合物的解离效率为95％。参见图1，当解离时间在0-60min之间时，解离率随着时间增加而逐渐升高，而当解离时间在60-180min之间时，复合物的解离达到饱和，进入平台期，因此60min的解离时间既能保证达到最高水平的解离程度，又能保证较高的时间效率。
重复使用：回收上述复合物解离后的适体玻片，可再与汞离子进行结合和解离，每回收一次，核酸适体的吸汞率和复合物的解离效率约下降2％左右，回收使用10次以内的适体吸汞率和解离率分别如图2和图3所示。

Claims (10)

1.核酸适体-汞离子复合物的解离方法，包括：
用盐酸调节双蒸水使其pH为4-7并加热至25℃-55℃以形成解离溶液；以及
将附着有核酸适体-汞离子复合物的玻片载体置于解离溶液中并以25-50次/min的频率震荡30-100min，从而将汞离子与玻片载体上附着的核酸适体充分解离。
2.根据权利要求1的解离方法，其中汞离子从核酸适体解离的解离率大于90％。
3.利用含T碱基的核酸适体来检测汞离子的方法，其包括：
提供玻片载体；
对玻片载体执行羟基化处理以获得表面洁净的羟基化玻片载体；
对羟基化玻片载体执行硅烷化处理以获得硅烷化玻片载体；
将含T碱基的核酸适体固定在硅烷化玻片载体上；
将固定在玻片载体上的核酸适体与单位体积的待测汞离子溶液反应预定时间以在玻片载体上形成T-Hg复合物；
从待测汞离子溶液中取出玻片载体；
利用权利要求1的解离方法对所取出的玻片载体执行解离；
利用电化学检测方法检测解离溶液中的汞离子浓度；
建立待测汞离子初始浓度与解离后浓度相对应的标准曲线；以及
根据解离后所检测的汞离子浓度确定待测汞离子初始浓度。
4.根据权利要求3的方法，还包括：
重复利用解离后的核酸适体来检测汞离子浓度。
5.根据权利要求3的方法，还包括：
从待测汞离子溶液中取出玻片载体之后立即执行清洗。
6.根据权利要求3的方法，其中解离溶液的体积小于待测汞离子溶液的单位体积。
7.根据权利要求3的方法，其中对羟基化玻片载体执行硅烷化处理包括：
将羟基化玻片载体浸入温度为40-50℃、浓度为1-4mmol/L的GOPS溶液以进行硅烷化反应；以及
用乙醇清洗硅烷化处理的玻片载体并晾干，从而获得硅烷化玻片载体。
8.根据权利要求3的方法，其中将含T碱基的核酸适体固定在硅烷化玻片载体上包括：
制备固定化缓冲液：含0.1mol/L 1-甲基咪唑，体积比为10％的二甲亚砜，以及pH为10；
将含T碱基的核酸适体溶于固定化缓冲液中以形成浓度为5-25μmol/L的核酸适体溶液；以及
取预定量的核酸适体溶液涂抹于硅烷化玻片载体上并在25℃-65℃之间反应30-120min，从而使核酸适体固定在玻片载体表面上。
9.根据权利要求8的方法，其中含T碱基的核酸适体的结构为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’。
10.根据权利要求3的方法，其中将固定在玻片载体上的核酸适体与待测汞离子形成T-Hg复合物包括：
制备MOPS-NaNO3缓冲液：含10mmol/L 3-(N-吗啡啉)丙磺酸,100mmol/L NaNO3,以及pH为7-9；以及
将待测汞离子和固定在玻片载体上的核酸适体分别引入MOPS-NaNO3缓冲液并保持10-180min，从而在玻片载体上形成T-Hg复合物。
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