CN102692446A

CN102692446A - 测定含朱砂的药物中可溶性汞和价态汞含量的方法

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Publication number: CN102692446A
Application number: CN2011100676839A
Authority: CN
Inventors: 夏晶; 胡青; 季申; 王柯; 李丽敏; 王欣美; 张甦; 王枚博; 毛秀红; 郑荣; 吴赵云; 郏征伟; 苗水; 陆继伟; 陈铭; 于建; 简龙海; 钟吉强; 孙健; 孟茜
Original assignee: Shanghai Food & Drug Testing Institute
Current assignee: Shanghai Food & Drug Testing Institute
Priority date: 2011-03-21
Filing date: 2011-03-21
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2031-03-21
Also published as: CN102692446B

Abstract

本发明公开测定含朱砂的药物中可溶性汞含量的方法，其特征在于该方法包括步骤：(1)用仿生溶剂-超声处理和/或磁力搅拌提取含朱砂的药物中的可溶性汞；(2)可选的对步骤(1)提取得到的溶液进行净化；(3)ICP-MS法测定含朱砂的药物中可溶性汞的含量。本发明还公开一种测定含朱砂的药物中可溶性价态汞的含量的方法。本发明通过采用模拟体内的提取方式以及采用ICP-MS和HPLC-ICP-MS建立了朱砂药效和毒性主要成分的测定方法，该方法灵敏、准确。

Description

测定含朱砂的药物中可溶性汞和价态汞含量的方法

技术领域

本发明涉及一种采用仿生提取-ICP-MS法测定含朱砂的药物中可溶性汞含量的方法，本发明也涉及一种采用仿生提取-HPLC-ICP-MS法测定含朱砂的药物中可溶性价态汞含量的方法。

背景技术

朱砂为我国常用的矿物类中药，临床应用的历史已有几千年，最早入药的记载为《神农本草经》，可内服外用且用途广泛。传统医学认为朱砂具有清心镇惊、安神解毒等功能，被某些中医列为镇静安神药之首。自20世纪50年代以来，朱砂的镇静安神作用经现代药理证实，效果显著。据初步统计，国家标准中收载的含有朱砂的中成药约400个。说明朱砂对于中药来说，有着极其重要的作用。朱砂中所含大量汞具有有效性和有毒性双重作用，但由于其用法用量缺乏科学依据，含其制剂中缺乏相关质控方法，导致了用药的安全性隐患和国际化认可的阻碍。

1、朱砂所含的汞具有有效性和有毒性两重作用，安全性限量的缺乏影响其用药安全。它作为复方药物的组成部分，既是药物的有效成分，也是有毒成分。由于缺乏用法用量的科学依据，其安全剂量难以合理评价，用药安全问题一直困扰着我国中药行业。

2、朱砂药效、毒性的物质基础不明严重阻碍了其获得国际认可：

国际上难以认可高含量的汞中药。朱砂及其制剂若以总汞为标准，该类中药的含量将大大高于国际限度标准，使其应用受到限制，从而长期以来一直被国际上认为有毒而限制销售和进口。以汞总量作为控制标准缺乏合理性。研究表明，汞存在多种不同价态，其毒性存在较大的差异。朱砂现行质量标准中仅对总量汞进行控制，对可溶性汞及价态汞的含量未进行控制，不能反映朱砂在人体实际应用的情况，以元素的总量衡量是否安全是不合理的，也是不科学的。

3、朱砂的现有质量标准无法体现有效性和安全性，用法用量缺乏依据：

我国的2010年版《中国药典》朱砂项下仅收载了的氧化还原滴定法的含量测定方法；缺乏有效性成分的科学质控方法及有毒性成分的限量控制方法；并且其用法用量缺乏科学依据，急需进一步提高完善。

4、大量含朱砂的制剂缺乏相关研究和质控方法，导致实际应用的安全性问题：

现有的国家标准中收载了含朱砂的成方制剂约460种；目前中国药典2010年版一部中收录含朱砂品种有34种、含雄黄和朱砂的品种有23个，未收载到中国药典2010年版一部的品种中，含朱砂的为227种，含雄黄和朱砂的有94种。其中小儿用药品种就有66种之多。如何做到对上述制剂的严格质控和安全使用，急需借鉴朱砂的质控方法。

根据《中国药典》2010年版一部，朱砂的主要成分为硫化汞(HgS)计，还含有少量游离汞和可溶性汞盐，硫化汞为典型的的共价化合物，溶解度很小(容积度Ksp＝10^-52)，不溶于热盐酸和硝酸，但可溶于混合酸；溶于碱金属硫化物溶液中，遇高热可分解成汞。现有研究证明，朱砂在人工胃液中有可溶性汞盐溶出，在人工肠液中溶解较少。随着人们对朱砂及含朱砂制剂的日益重视，现通常认为朱砂的药效及毒性主要来自其所含的少量可溶性汞，故对朱砂中的可溶性汞的研究近来呈上升趋势。

为更好评价朱砂的药效及毒性作用，有必要对其的可溶性汞进行研究。通过文献查阅，发现每篇文献报道的朱砂中可溶性汞方法基本相似，均采用人工胃液或人工肠液作为提取溶剂，但得到的可溶性汞含量相差较大。另朱砂饮片与复方制剂中的可溶性汞含量也不匹配，各文献结果也不全一致。分析原因，主要与样品处理方法有关，为能较好提取出朱砂中可溶性汞，有必要对供试品前处理方法进行详细的研究。

自然界的汞主要以金属汞、无机汞(Hg2+，Hg+)和有机汞(甲基汞，乙基汞)形式存在，其毒性大小为甲基汞＞乙基汞＞Hg2+＞Hg+。可溶性汞具有药效及毒性两方面作用，其汞存在的形式对朱砂的毒性存在一定意义，因此需要对朱砂中所含的可溶性汞进行价态研究，以便控制朱砂的毒性。

因此对含朱砂的药物中可溶性汞和价态汞含量的测定方法进行深入的研究，对保障用药安全和促进国际认可有极为重要的意义。

发明内容

鉴于现有技术的上述不足，本发明在明确了朱砂的基源及品种的基础上，对具相关性的药材、饮片和制剂进行研究，同时对朱砂药材及饮片建立了体现有效性和安全性的质量标准，对代表性制剂建立了科学的质控方法。在朱砂及含其制剂的质量控制方法和安全性研究方面取得了突破性的进展，为人民用药安全提供了保障。

本发明的第一个目的是提供一种测定含朱砂的药物中可溶性汞的含量的方法，其特征在于该方法包括步骤：

(1)用仿生溶剂-超声处理和/或磁力搅拌提取含朱砂的药物中的可溶性汞；

(3)ICP-MS法测定含朱砂的药物中可溶性汞的含量。

本发明中，术语“含朱砂的药物”是指含有朱砂成分的药物。

本发明中，术语“ICP-MS法”是指电感耦合等离子体质谱法。

根据本发明的一个优选实施方式，所述含朱砂的药物选自朱砂药材、朱砂饮片和含朱砂的制剂。

根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤(1)中的仿生溶剂选自人工胃液(胃蛋白酶活力大于等于1∶27000)、人工肠液或其组合。

从模拟人体环境的角度而言，朱砂经胃肠进行吸收，人工胃液与人工肠液是与人体胃液与肠液相当的溶液，因此朱砂应先用人工胃液提取，再用人工肠液提取，两者结果相加才能体现朱砂在人体内的吸收情况。但具体实验时，因为分离朱砂颗粒有困难，因此操作性不强。如果分别用人工胃液和人工肠液提取的结果之和，与先用人工胃液提取，分离残渣再用人工肠液提取的结果之和相比，结果相当或较大，则可用前者代替后者，以保证试验的简便性及可操作性。本发明人分别进行了这两种提取方法的比较，结果人工胃液(先)+人工肠液(后)与人工胃液+人工肠液的含量基本相当，但后者含量普遍较前者高，主要由于经人工胃液提取后的残渣可能存在一定的损失。因此，根据本发明的一个优选的实施方式，当测定朱砂药材和饮片时，可以先用人工胃液提取，再用人工肠液提取经人工胃液提取后的残渣；也可以分别用人工胃液与人工肠液提取，然后采用两者之和。当测定朱砂制剂时，仅采用人工肠液提取。制剂中人工胃液(先)+人工肠液(后)与人工肠液的含量基本相当，说明制剂中朱砂主要经胃吸收，到肠后吸收较少，因此可用人工肠液直接提取

发明人对分别采用超声6小时、振摇24小时，不同转速溶出24小时的方法提取朱砂药材和饮片溶液，结果表明，超声提取的方法得到的可溶性汞含量最高，说明该方法可有效提取出可溶性汞。溶出是模拟人体环境最佳的方式，但由于朱砂密度较大，一直沉于瓶底，无法有效混悬，影响了溶出了效果。从结果可显示，每分钟250转的结果高于每分钟100转的结果。振摇提取出的可溶性汞含量较少，主要原因也是由于朱砂密度较大，振摇不完全。上述的溶出度方法和振摇的方法均无法有效代表朱砂在体内的吸收情况，超声的方法虽远较体内实际吸收方式剧烈，但其所测得的可溶性汞含量是朱砂在机体所能吸收的最大可溶性汞量，能科学的反映出朱砂中实际存在的可溶性汞含量，从而排除了因为病理、生理、人种、年龄、性别等各种因素带来的误差，使朱砂能在同一条件下进行质量比较，最大限度体现了朱砂产生可溶性汞的含量，对朱砂的药效及毒性能从根本上进行认识。

因此，本发明优选采用超声的提取方式。37℃超声时间为2小时后，可溶性汞的含量基本趋于稳定，从简化实验操作考虑，超声2小时可以满足目前提取效率的要求。但需注意超声时应每隔10-15分钟振摇1次，以避免细小朱砂颗粒粘附于瓶壁，无法完全超声。

根据本发明的一个优选的实施方式，也可以采用磁力搅拌的方法，经试验，与超声处理结果一致。

因此，根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤(2)中的超声处理/磁力搅拌为大于或等于2小时。

朱砂样品经超声/磁力搅拌2小时后，混悬液体处于颗粒高度运动状态，若此时取样，溶液中充满未溶解的朱砂细小颗粒，测得的可溶性汞含量会偏高，不能准确代表实际溶剂中的可溶性汞。只有待混悬液中未溶解的朱砂细小颗粒全部沉降下来后，此时测得的可溶性汞含量才是实际溶出的量，因此优选地，超声/磁力搅拌后的朱砂提取溶液进一步进行净化处理。

因此，根据本发明的一个优选实施方式，所述方法还包括步骤：

(2)对步骤(1)提取得到的溶液进行净化。

发明人推测经过仿生溶剂-超声处理和/或磁力搅拌提取的朱砂溶液中汞可能有部分大分子化合物存在，净化方式不恰当会造成大分子汞化合物除去。因此，根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤(2)中采用(a)先静置，再用滤膜进行净化；或(b)采用静置进行净化。所述(a)中的静置时间为大于5小时，优选6-8小时；所述步骤(b)中的静置时间为大于18小时，优选20-24小时。

本发明人选择显微镜法进行朱砂样品溶液粒径的考察。采用OLYMPUS CHA显微镜进行测定，倍数为40×10倍。根据测得的结果，发现溶液中大多数粒子均在1μm左右，有个别大于1μm但均小于3μm，随着静置时间的增加，大粒子有减少的趋势，但趋势不甚明显。由此可判断，可溶性汞在溶液中以1μm左右的粒子形式存在，因此如果净化方式不当，即会造成含量数据的不准确和平行性较差。

根据本发明的一个优选实施方式，在静置一段时间后，选择孔径大小约为10～15μm+2～3μm的双层滤膜进行过滤，例如10μm+3μm和10μm+2μm孔径的滤膜，能兼顾净化和含量。为避免相互污染，滤膜应选用一次性的针头滤器。

根据本发明的一个优选实施方式，当采用静置方式对朱砂提取溶液进行净化时，静置时间为大于18小时，优选20-24小时。

根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤(1)提取得到的溶液中存在小粒径悬浮颗粒、络合物和离子态三种状态。

因采用人工胃液或人工肠液提出的溶液中可溶性汞含量较高，因此最好进一步稀释，以保证稀释溶液中可溶性汞的含量稳定。根据本发明的一个优选实施方式，用稀释溶剂稀释所述步骤(2)净化得到的溶液。进一步地，为了使大分子汞化合物完全解离，以便于ICP-MS能更加准确地测定，稀释后的溶液可进行消解处理。根据本发明一个特别优选的实施方式，将稀释后的溶液置顶空进样瓶中，加硝酸1.0～5.0ml、盐酸0～2ml，加盖密封，70℃～100℃水浴水解1～3小时，置量瓶中，用水稀释至刻度备用。

朱砂药材和饮片在人工胃液和人工肠液中，使用不同的稀释溶剂，结果趋势基本一致，其中盐酸浓度越高，测得值越大，估计高浓度盐酸可能会加强仪器信号，导致含量增加的假象，应该避免使用。盐酸溶液浓度在0.25mol/L以下，结果与其他溶剂基本一致，由于可溶性汞在酸溶液中较稳定，盐酸系统溶液与硝酸系统溶液相比，数据重现性更好，可能与硝酸具一定氧化性有关。本发明所用人工胃液配制时采用了盐酸，因此优选盐酸系统溶液作为稀释溶剂。根据本发明一个优选的实施方式，选择0.125mol/L盐酸溶液作为稀释溶剂。

朱砂中可溶性汞的含量较小，因此采用灵敏度较高的电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)进行测定，因此，根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤(3)中ICP-MS的质谱条件为：采用同轴雾化器或其他雾化器；以高纯液态氩气为工作气体和载气；以氦气或氢气作为反应气。

本发明还研究了高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法测定朱砂及朱砂粉中可溶性汞价态的含量测定方法。

因此，本发明的第二个目的是提供一种测定含朱砂的药物中可溶性价态汞含量的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)用仿生溶剂-超声处理和/或磁力搅拌提取含朱砂的药物中的可溶性价态汞；

(2)可选的对步骤(1)提取得到的溶液进行净化；

(3)HPLC-ICP-MS法测定含朱砂的药物中可溶性价态汞的含量。

本发明中，术语“HPLC-ICP-MS法”是指高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法。

本发明测定含朱砂的药物中可溶性价态汞含量的方法中的步骤(1)和(2)与本发明测定含朱砂的药物中可溶性汞含量的方法中的步骤(1)和(2)完全一致；即，对按照上述(1)提取得到的溶液，任选经过静置和稀释溶剂稀释后，再用HPLC-ICP-MS法测定其中可溶性价态汞的含量。

根据本发明的一个优选实施方式，所述可溶性价态汞选自一价汞、二价汞、甲基汞或乙基汞。

根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤(3)中HPLC-ICP-MS法的色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相由乙酸铵(含0.12％L-半胱氨酸，调节pH值至7.5)和甲醇组成。

根据本发明的一个优选实施方式，所述色谱柱为ZORBAX XDB-C18柱；所述流动相的流速为1.0ml/min；所述乙酸铵溶液的浓度为0.01mol/L；所述乙酸铵(含0.12％L-半胱氨酸，调节pH值至7.5)∶甲醇＝92∶8。

根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤(3)中HPLC-ICP-MS法的质谱条件为：采用同轴雾化器或其他雾化器；以高纯液氩为工作气体和载气；以氦气或氢气作为反应气。

本发明测定含朱砂的药物中可溶性汞和价态汞含量的方法的优点如下：

1、采用模拟体内的提取方式，创建了可溶性汞与价态汞的通用提取方法，有效代表朱砂药效和毒性主要成分体内吸收量，为准确测定可溶性汞及价态汞提供可靠方法；

2、采用ICP-MS和HPLC-ICP-MS建立了朱砂药效和毒性主要成分的测定方法，方法灵敏、准确，填补了国内空白。

附图说明

图1为实施例1“朱砂药材中可溶性价态汞的含量测定”项下对照品(上图)和供试品(下图)的高效液相色谱图，其中Hg(I)、Hg(II)、MeHg、EtHg分别代表一价汞、二价汞、甲基汞、乙基汞。

图2为实施例1测得的各批朱砂药材中可溶性汞的含量图；

图3为实施例2测得的各批朱砂饮片中可溶性汞的含量图；

图4为实施例1测得的各批朱砂药材中可溶性价态汞的含量图；

图5为实施例2测得的各批朱砂饮片中可溶性价态汞的含量图；

图6为实施例3测得的各批朱砂制剂中可溶性汞的含量图；

图7为实施例3测得的各批朱砂制剂中可溶性价态汞的含量图。

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步阐述本发明，但以下具体实施例不对本发明构成任何形式的限制。

实施例1

朱砂药材中可溶性汞的含量测定：按照电感耦合等离子体质谱法(中国药典2010年版一部附录XI D)测定。

试药和仪器

美国Agilent公司7700ce型电感耦合等离子体质谱仪；必能信超声(上海)有限公司B9500S-DTH型超声波清洗机(功率300W，频率45kHz)；美国Millipore公司Milli-Q超纯水机。汞标准溶液(1000mg/L，批号HC931554)，购自Merk公司。

硝酸、盐酸均为优级纯(Merck公司)；胃蛋白酶为生化试剂，酶活力为1∶27000，批号为100710，购自上海惠兴生化试剂有限公司；胰酶为生化试剂，酪蛋白转化力≥25.0，批号为F20100714，购自国药集团化学试剂有限公司；水为经Milli-Q处理的去离子水。高纯液态氩气(纯度＞99.99％)和氦气(纯度为99.999％)由上海成功气体工业有限公司提供。

ICP-MS工作条件：

Agilent Micromist Nebulizer同轴雾化器；石英一体化炬管，2.5mm中心通道；石英双通道型雾化室；八级杆碰撞反应池；piltier半导体控温于约2℃；镍采样锥和截取锥；以高纯液氩为工作气体和载气；以氦气作为反应气。7700ce型电感耦合等离子体质谱仪具体操作条件和采集参数见表1。

表1、Agilent 7700Ce ICP-MS仪器工作参数

仪器参数	具体设定值	仪器参数	具体设定
				射频功率	1500W	分析模式	定量分析
采样深度	8.0mm	数据采集模式	图谱模式
				等离子气流量	15.0L·min^-1	单位质量数采集点	3
载气流量	0.9L·min^-1	数据采集重复次数	3

其中取浓度为2μg/L的对照汞溶液分别测定3～5次，测定值的RSD值应小于5％。

对照品储备溶液的制备：精密称取氯化汞(HgCl₂)0.1354g，置100ml量瓶中，加10％硝酸溶液(硝酸+水＝1+9)10ml溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml相当于1.0mg的汞)。

对照品溶液的制备：精密量取对照品储备溶液适量，置聚四氟乙烯材料的量瓶中，用0.125mol/L盐酸溶液制成每L含汞为0.5μg、1μg、2μg、4μg、8μg的溶液，即得。

内标溶液的制备：精密量取铋单元素对照溶液适量，置聚四氟乙烯材料的量瓶中，用0.125mol/L盐酸溶液制成每L含1mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取朱砂药材(贵州铜仁矿业，批号H2008030502)30mg，过80目筛，精密称定，(1)置250ml玻璃量瓶(先用20％盐酸溶液(v/v)浸泡过夜，再用去离子水洗净并晾干)中，一式2份，一份加人工胃液(胃蛋白酶活力为1∶27000)，另一份加人工肠液，分别定容至刻度，摇匀，密塞，称定重量，置37℃中超声处理(功率300W，频率45kHz)2小时，每隔10-15分钟振摇1次，或(2)置250ml～500ml具塞锥形瓶(先用20％盐酸溶液(v/v)浸泡过夜，再用去离子水洗净并晾干)中，一式2份，一份加人工胃液(胃蛋白酶活力为1∶27000)250ml，另一份加人工肠液250ml，摇匀，称定重量，置37℃水浴中磁力搅拌(调整转数，使溶液能完全涡旋)2小时，再称定重量，分别用人工胃液(胃蛋白酶活力为1∶27000)或人工肠液补足减失的重量，摇匀，取适量至50ml聚丙烯材料的离心管中，静置20～24小时，小心量取上层溶液约10ml至15ml聚丙烯材料的离心管中(量取时应避免带入颗粒)，精密量取5ml，置25ml聚四氟乙烯材料的量瓶中，用0.125mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml(其余溶液供可溶性汞价态使用)，置顶空进样瓶中，加硝酸2.0ml、盐酸0.5ml，加盖密封，80℃水浴水解1小时，置50ml聚四氟乙烯材料的量瓶中，用水稀释至刻度即得。同供试品溶液制备方法制备试剂空白溶液。

测定：测定时选取的同位素为202Hg，以209Bi作为内标，选择碰撞池反应模式并根据不同仪器的要求选用适宜校正方程对测定的元素进行校正。

仪器的内标进样管在仪器分析工作过程中始终插入内标溶液中，依次将仪器的样品管插入各个浓度的对照品溶液中进行测定(浓度依次递增)，取每一浓度测得三次读数的平均值为纵坐标，相应浓度为横坐标，绘制对照曲线。再将仪器的样品管插入供试品溶液中，测定，取三次读数的平均值。从对照曲线上读出供试品溶液中202Hg的浓度，扣除相应的试剂空白溶液的浓度，计算样品中汞元素的含量，以人工胃液和人工肠液测得汞含量之和作为可溶性汞的含量。

朱砂药材中可溶性汞含量结果的分析：

朱砂中可溶性汞的来源

朱砂为硫化物类矿物辰砂族辰砂，主含硫化汞(HgS)。药典中规定朱砂药材中HgS不得少于96.0％，饮片中HgS不得少于98.0％。测定含量除药典规定的容量法外，还有原子吸收法，原子荧光法，电感耦合等离子体原子发射光谱法等，所有方法均以测定其中汞的含量，折算到HgS的含量。由于朱砂为矿物药，随着产地、伴生矿不同，质地也不同，民间有片砂、豆砂、颗砂、采砂、菜子砂、汞砂、朱宝砂之分。因此不排除朱砂中除主含硫化汞(HgS)化合物外，还可能含有其他微量含汞化合物，表2列出部分可能含有的含汞化合物。

表2、朱砂中可能含有的其他含汞化合物

名称	分子式	毒性	水中溶解性
				氯化亚汞	HgCl	轻	不溶
氯化汞	HgCl₂	剧毒	可溶
				硝酸亚汞	HgNO₃	有毒	可溶
硝酸汞	Hg(NO₃)₂	高毒	易溶
				硫酸亚汞	Hg₂SO₄	有毒	微溶
硫酸汞	HgSO₄	剧毒	微溶

碳酸亚汞	Hg₂CO₃	无	不溶于冷水
				氧化汞	HgO	轻	不溶

由上表可知，大多存在毒性的化合物均在水中有不同程度溶解度，这也间接说明了朱砂饮片水飞的重要性，水飞可去除大部分有毒的含汞化合物，保留下的均是毒性较弱或无毒性的含汞化合物，这些化合物进入机体后，通过酶、酸等作用，可少量溶解，从而产生药理作用。朱砂中可能含有上述化合物，这是可溶性汞的来源之一。另外朱砂的主成分硫化汞(HgS)在水中难溶，但在酶的影响下，溶解度会增加，可溶性汞如果不断的被体内物质消耗，其溶解过程将不断进行，这可能是朱砂可溶性汞的主要来源。

综上所述，采用本发明方法，除硫化汞(HgS)产生的可溶性汞外，朱砂药材中可溶性汞的来源复杂，具体可能因所含化合物的种类、含量不同而存在差异。

由于硫化汞(HgS)在人体溶解的过程可能是持续的动态过程，且受机体影响较大，在体外测定朱砂可溶性汞的时候，只能尽量做到极限量，代表人体能吸收的最大量，保证在同一水平进行比较。

本发明实施例1测定了27批朱砂药材，其可溶性汞含量范围在1.00～2.77％。

朱砂药材中可溶性价态汞的含量测定：按照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)和电感耦合等离子体质谱法(附录XI D)测定。

试药和仪器

美国Agilent公司7700ce型电感耦合等离子体质谱仪；美国Agilent公司1100型液相色谱仪；必能信超声(上海)有限公司B9500S-DTH型超声波清洗机(功率300W，频率45kHz)；美国Millipore公司Milli-Q超纯水机。

氯化甲基汞(C15100000，50301，纯度为98.5％)、氯化乙基汞(C13345000，50407，纯度为98.0％)二价汞(High Purity Standards，53916，纯度为99.9995％，均购自德国Dr.Ehrenstrorfer公司)。

硝酸、盐酸均为优级纯，购自德国Merck公司；半胱氨酸、醋酸铵、氨水均为优级纯，均购自国药集团化学试剂有限公司；水为经Milli-Q处理的去离子水。高纯液态氩气(纯度＞99.99％)和氦气(纯度为99.999％)由上海成功气体工业有限公司提供。

HPLC-ICP-MS工作条件：

电感耦合等离子体质谱：

Agilent Micromist Nebulizer同轴雾化器；石英一体化炬管，2.5mm中心通道；石英双通道型雾化室；八级杆碰撞反应池；piltier半导体控温于约2℃；镍采样锥和截取锥；以高纯液氩为工作气体和载气；以氦气作为反应气。7700x型电感耦合等离子体质谱仪具体操作条件和采集参数见表3。

表3、Agilent 7700x ICP-MS仪器工作参数

仪器参数	具体设定值
		射频功率	1500W
采样深度	8.0mm
		等离子气流量	15.0L·min^-1
载气流量	0.9L·min^-1
		分析模式	定量分析
数据采集模式	时间分辨分析模式

高效液相色谱：

色谱柱为ZORBAX XDB-C18(4.6mm ID×150mm，5μm)；流动相为0.01mol/L乙酸铵溶液(含0.12％L-半胱氨酸，调节pH值至7.5)-甲醇(92∶8)；流速为1.0ml/min。

参比溶液的制备：取一价汞(Hg(I))、二价汞(Hg(II))、甲基汞(MeHg)、乙基汞(EtHg)对照品适量，用0.125mol/L盐酸溶液制成每1L各含100μg的混合溶液，即得。

对照品储备溶液的制备：精密量取二价汞(Hg(II))对照物质溶液适量，用0.125mol/L盐酸溶液制成每1L含5mg的混合溶液，即得。

对照曲线溶液的制备：精密量取对照品储备溶液适量，分别用0.125mol/L盐酸溶液制成每L含0μg、4μg、20μg、40μg、100μg、200μg、400μg、800μg的一系列对照溶液，即得。

供试品溶液的制备：取朱砂药材(贵州铜仁矿业，批号H2008030502)30mg，过80目筛，精密称定，(1)置250ml玻璃量瓶(先用20％盐酸溶液(v/v)浸泡过夜，再用去离子水洗净并晾干)中，一式2份，一份加人工胃液(胃蛋白酶活力为1∶27000)，另一份加人工肠液，分别定容至刻度，摇匀，密塞，称定重量，置37℃中超声处理(功率300W，频率45kHz)2小时，每隔10-15分钟振摇1次，或(2)置250ml～500ml具塞锥形瓶(先用20％盐酸溶液(v/v)浸泡过夜，再用去离子水洗净并晾干)中，一式2份，一份加人工胃液(胃蛋白酶活力为1∶27000)250ml，另一份加人工肠液250ml，摇匀，称定重量，置37℃水浴中磁力搅拌(调整转数，使溶液能完全涡旋)2小时，再称定重量，分别用人工胃液(胃蛋白酶活力为1∶27000)或人工肠液补足减失的重量，摇匀，取适量至50ml聚丙烯材料的离心管中，静置20～24小时，小心量取上层溶液约10ml至15ml聚丙烯材料的离心管中(量取时应避免带入颗粒)，精密量取5ml，置25ml聚四氟乙烯材料的量瓶中，用0.125mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。同供试品溶液制备方法制备试剂空白溶液。

测定：吸取参比溶液20μl，注入液相色谱仪，四种不同形态的汞能完全分开，得到的图谱见附图1(上图)，四种汞的分离均良好。

分别精密吸取一系列对照曲线溶液(浓度依次递增)与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，色谱柱流出液体直接进入电感耦合等离子体质谱仪的雾化器，选取同位素为202Hg，选择碰撞池反应模式并根据不同仪器的要求选用适宜校正方程对测定的元素进行校正。以各对照曲线溶液测得不同形态的汞峰面积值为纵坐标，相应浓度为横坐标，绘制对照曲线。如供试品溶液中出现与对照曲线保留时间相同的色谱峰，则根据相应的对照曲线读出供试品溶液中的不同形态汞浓度，计算出样品中不同形态汞的含量，并折算成汞元素的含量。

检测限

以3倍信噪比计算检测限，二价汞、甲基汞和乙基汞的检测限分别为0.0006％、0.0003％和0.0001％。

朱砂中可溶性汞所含价态汞含量结果的分析

朱砂的可溶性汞中均检出了二价汞，但均未检出甲基汞与乙基汞，由于汞价态可能与朱砂的疗效与毒性有密切关系，因此需对其含量进行深入分析。本发明实施例1测定了27批朱砂药材，其中二价汞含量范围基本在0.04～0.24％。

实施例2：

朱砂饮片中可溶性汞的含量测定：按照电感耦合等离子体质谱法(中国药典2010年版一部附录XI D)测定。

将实施例1中的朱砂药材替换成朱砂饮片(来源于贵州铜仁矿业，由上海封浜中药饮片厂加工，批号H2008030502)，其余方法和过程均和实施例1相同。

溶液稳定性试验：

取朱砂饮片，按实施例1“朱砂药材中可溶性汞的含量测定”制备供试品溶液的相同方法制备供试品溶液，于不同时间进样分析，测定可溶性汞的量，结果表明(见表4)，在0～24小时内供试品溶液中可溶性汞含量基本稳定。

表4、溶液稳定性试验(可溶性汞)

时间(小时)	0	6	18	24	RSD值
						人工胃液可溶性汞含量(ug/L)	2.5823	2.6998	2.6482	2.7861	3.21％
人工肠液可溶性汞含量(ug/L)	2.9069	3.4475	3.0727	2.5047	13.10％

结果表明，溶液稳定性试验结果符合电感耦合等离子体质谱方法的要求。

重复性试验：

取朱砂饮片，按实施例1“朱砂药材中可溶性汞的含量测定”制备供试品溶液的相同方法制备供试品溶液，并按照相同条件测定，一式6份，结果见表5。

表5、重复性试验(可溶性汞)

结果表明，重复性试验结果符合电感耦合等离子体质谱方法的要求。

准确度试验：

精密称取己测定含量的朱砂饮片(人工胃液提取的可溶性汞含量为0.8523％，人工肠液提取的可溶性汞含量为1.1753％)15mg，精密加入汞标准溶液(1.000g/L)180μl、120μl、60μl，均一式三份，按上述供试品溶液的制备方法制备和测定，测定结果见表6。

表6、准确度试验(可溶性汞)

人工胃液提取的准确率在83.6％～118.9％之间，人工肠液提取的准确率在80.1％～114.7％之间，RSD均小于15.0％。结果表明，准确度试验结果符合电感耦合等离子体质谱方法的要求。

朱砂饮片中可溶性汞来源较简单，初步推测主要来源于氯化亚汞、碳酸亚汞、氧化汞等，同样含量也因所含化合物的种类、含量不同而存在差异。本发明实施例2按照相同检测方法测定了14批朱砂饮片，其中可溶性汞含量范围在1.27～2.98％。

朱砂饮片中可溶性价态汞的含量测定：按照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)和电感耦合等离子体质谱法(附录XI D)测定。

溶液稳定性试验

取实施例2“朱砂饮片中可溶性汞的含量测定”的准确度试验项下供试品溶液，于不同时间进样分析，测定不同价态汞的量，结果表明(见表7)，在0～24小时内供试品溶液中不同价态汞含量基本稳定。

表7、溶液稳定性试验(价态汞)

重复性试验

取朱砂饮片，按实施例1“朱砂药材中可溶性价态汞的含量测定”制备供试品溶液的相同方法制备供试品溶液，并按照相同条件测定，一式6份，结果见表8。

表8、重复性试验(价态汞)

结果表明，朱砂饮片样品中只检出了二价汞，其重复性试验结果符合高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法的要求。

准确度试验

精密称取己测定含量的朱砂饮片(人工胃液提取的二价汞含量为0.0457％，人工肠液提取的二价汞含量为0.0436％)15mg，精密加入二价汞标准溶液(307.8733mg/L)、甲基汞溶液标准物质(321.1662mg/L)和乙基汞溶液标准物质(320.3350mg/L)适量，分高、中、低三种浓度，均一式三份，按上述供试品溶液的制备方法制备和测定，测定结果见表9。

表9、准确度试验(价态汞)

二价汞的准确度：人工胃液提取的准确率在82.245％～130.311％之间，人工肠液提取的准确率在73.514％～90.314％之间，RSD均小于15.0％。甲基汞的准确度：人工胃液提取的准确率在84.052％～104.394％之间，人工肠液提取的准确率在85.935％～98.334％之间，RSD均小于10.0％。乙基汞的准确度：人工胃液提取的准确率在87.640％～98.278％之间，人工肠液提取的准确率在85.299％～96.266％之间，RSD均小于5.0％。结果表明，准确度试验结果符合高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法的要求。

结果：本发明实施例2按照相同检测方法测了14批朱砂饮片，其中二价汞含量范围在0.04～0.12％，饮片范围较药材小，说明朱砂经水飞后，二价汞的量基本能控制在一定范围。

实施例3：

朱砂制剂中可溶性汞的含量测定：按照电感耦合等离子体质谱法(中国药典2010年版一部附录XI D)测定。

供试品溶液的制备：取局方至宝散(武汉健民大鹏药业有限公司提供，批号4)150mg，研细，精密称定，(1)置250ml玻璃量瓶(先用20％盐酸溶液(v/v)浸泡过夜，再用去离子水洗净并晾干)中，加人工肠液定容至刻度，摇匀，密塞，称定重量，置37℃中超声处理(功率300W，频率45kHz)2小时，每隔10-15分钟振摇1次，或(2)置250ml～500ml具塞锥形瓶(先用20％盐酸溶液(v/v)浸泡过夜，再用去离子水洗净并晾干)中，加人工肠液250ml，摇匀，称定重量，置37℃水浴中磁力搅拌(调整转数，使溶液能完全涡旋)2小时，再称定重量，用人工肠液补足减失的重量，摇匀，取适量至50ml聚丙烯材料的离心管中，静置20～24小时，小心量取上层溶液约10ml至15ml聚丙烯材料的离心管中(量取时应避免带入颗粒)，精密量取5ml，置25ml聚四氟乙烯材料的量瓶中，用0.125mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml(其余溶液供可溶性汞价态使用)，置顶空进样瓶中，加硝酸2.0ml、盐酸0.5ml，加盖密封，80℃水浴水解1小时，置50ml聚四氟乙烯材料的量瓶中，用水稀释至刻度即得。同供试品溶液制备方法制备试剂空白溶液。

溶液稳定性试验

按照相同方法制备供试品溶液，于不同时间进样分析，测定可溶性汞的量，结果表明(见表10)，在0～24小时内供试品溶液中可溶性汞含量基本稳定。

表10、溶液稳定性试验(制剂)

时间(小时)	0	6	18	24	RSD值
						可溶性汞含量(ug/L)	29.8953	28.3576	30.8029	31.4934	4.50％

重复性试验

取朱砂制剂(局方至宝散，武汉健民大鹏药业有限公司提供，批号4)，按上述相同方法制备供试品溶液并按照相同条件测定，一式6份，结果见表11。

表11、重复性试验(制剂)

准确度试验

精密称取己测定含量的朱砂制剂(局方至宝散，武汉健民大鹏药业有限公司提供，批号4)4，可溶性汞含量为3919mg/kg)75mg，精密加入汞标准溶液(1.000g/L)450μl、300μl、150μl，一式三份，按上述供试品溶液的制备方法制备和测定，测定结果见表12。

表12、准确度试验(制剂)

可溶性汞提取的准确率在72.7％～117.9％之间，RSD均小于15.0％。结果表明，准确度试验结果符合电感耦合等离子体质谱方法的要求。

按照相同检测方法测得9批局方至宝散的可溶性汞在0.21％～0.40％。制剂中可溶性汞的值与理论值相比，差异不明显。

朱砂制剂中可溶性价态汞的含量测定：按照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)和电感耦合等离子体质谱法(附录XI D)测定。

供试品溶液的制备：取局方至宝散(武汉健民大鹏药业有限公司提供，批号4)150mg，研细，精密称定，(1)置250ml玻璃量瓶(先用20％盐酸溶液(v/v)浸泡过夜，再用去离子水洗净并晾干)中，加人工肠液定容至刻度，摇匀，密塞，称定重量，置37℃中超声处理(功率300W，频率45kHz)2小时，每隔10-15分钟振摇1次，或(2)置250ml～500ml具塞锥形瓶(先用20％盐酸溶液(v/v)浸泡过夜，再用去离子水洗净并晾干)中，加人工肠液250ml，摇匀，称定重量，置37℃水浴中磁力搅拌(调整转数，使溶液能完全涡旋)2小时，再称定重量，用人工肠液补足减失的重量，摇匀，取适量至50ml聚丙烯材料的离心管中，静置20～24小时，小心量取上层溶液约10ml至15ml聚丙烯材料的离心管中(量取时应避免带入颗粒)，精密量取5ml，置25ml聚四氟乙烯材料的量瓶中，用0.125mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。同供试品溶液制备方法制备试剂空白溶液。

其余方法和过程均和实施例1相同。

溶液稳定性试验

取“朱砂制剂中价态汞的含量测定”准确度项下的供试品溶液，于不同时间进样分析，测定不同价态汞的量，结果表明(见表13)，在0～24小时内供试品溶液中不同价态汞含量基本稳定。

表13、溶液稳定性试验(制剂中价态汞)

重复性试验

取局方至宝散，按上述方法制备供试品溶液，一式6份，结果见表14。

表14、重复性试验(制剂中价态汞)

结果表明，局方至宝散中只检出了Hg(II)，其重复性试验结果符合高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法的要求。

准确度试验

精密称取己测定含量的局方至宝散(含Hg(II)的量为173mg/kg)75mg，精密加入标准物质溶液二价汞(307.8733mg/L)、甲基汞(321.1662mg/L)和乙基汞(320.3350mg/L)，分高、中、低三种浓度，均一式三份，按上述供试品溶液的制备方法制备和测定，测定结果见表15。

表15、准确度试验(制剂中价态汞)

上述成分的平均准确度均在92.08～100.66％之间，RSD均小于10.0％。结果表明，准确度试验结果符合高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法的要求。

结果：制剂与朱砂药材和饮片的结果一致，只检出二价汞，未检出其他成分。9批局方至宝散的Hg(II)在0.003％～0.005％。制剂中价态汞的实测值较理论值大幅度下降，说明制剂中其他药味对价态汞的影响巨大，主要是其余药味中的成分可与价态汞结合所致。另外，价态汞的理论值各批差异较大，但实测值差异减小，说明通过其他药味的配伍，使得价态汞的质量趋同。

Claims

1.测定含朱砂的药物中可溶性汞含量的方法，其特征在于该方法包括步骤：

(3)ICP-MS法测定含朱砂的药物中可溶性汞的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含朱砂的药物选自朱砂药材、朱砂饮片和含朱砂的制剂。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的仿生溶剂选自人工胃液、人工肠液或其组合。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的超声处理或磁力搅拌时间为大于或等于2小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：

(2)对步骤(1)提取得到的溶液进行净化。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中采用(a)先静置，再用滤膜进行净化；或(b)采用静置进行净化。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述滤膜为双层滤膜。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述双层滤膜孔径大小约为10～15μm+2～3μm。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述(a)中的静置时间为大于5小时，优选6-8小时。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中的静置时间为大于18小时，优选20-24小时。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)提取得到的溶液中存在小粒径悬浮颗粒、络合物和离子态三种状态。

12.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，用稀释溶剂稀释所述步骤(2)净化得到的溶液并进行消解。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述稀释溶剂为盐酸溶液。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述盐酸的浓度为0.0125～0.250mol/L，优选0.125mol/L。

15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中ICP-MS的质谱条件为：采用同轴雾化器或其他雾化器；以高纯液态氩气为工作气体和载气；以氦气或氢气作为反应气。

16.测定含朱砂的药物中可溶性价态汞的含量的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(3)HPLC-ICP-MS法测定含朱砂的药物中可溶性价态汞的含量。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述含朱砂的药物选自朱砂药材、朱砂饮片和含朱砂的制剂。

18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述可溶性价态汞选自一价汞、二价汞、甲基汞或乙基汞。

19.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的仿生溶剂选自人工胃液、人工肠液或其组合。

20.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的超声处理或磁力搅拌时间为大于或等于2小时。

21.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：

(2)对步骤(1)提取得到的溶液进行净化。

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中采用(a)先静置，再用滤膜进行净化；或(b)采用静置进行净化。

23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述滤膜为双层滤膜。

24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述双层滤膜孔径大小约为10～15μm+2～3μm。

25.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述(a)中的静置时间为大于5小时，优选6-8小时。

26.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中的静置时间为大于18小时，优选20-24小时。

27.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)提取得到的溶液中存在小粒径悬浮颗粒、络合物和离子态三种状态。

28.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，用稀释溶剂稀释所述步骤(2)净化得到的溶液。

29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述稀释溶剂为盐酸溶液。

30.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述盐酸的浓度为0.0125～0.250mol/L，优选0.125mol/L。

31.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中HPLC-ICP-MS法的色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相由乙酸铵和甲醇组成。

32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为ZORBAX XDB-C18柱。

33.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.7～1.5ml/min，优选1.0ml/min。

34.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述乙酸铵含有0.05～0.25％L的半胱氨酸，优选所述乙酸铵含有0.12％L的半胱氨酸；其pH值为6～8，优选7.5。

35.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述乙酸铵溶液的浓度为0.05～0.02mol/L，优选0.01mol/L。

36.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述乙酸铵∶甲醇＝85～95∶15～5，优选92∶8。

37.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中HPLC-ICP-MS法的质谱条件为：采用同轴雾化器或其他雾化器；以高纯液氩为工作气体和载气；以氦气或氢气作为反应气。