CN103335990B

CN103335990B - 测定动物肉体中甲基汞和乙基汞的方法

Info

Publication number: CN103335990B
Application number: CN201310236099.0A
Authority: CN
Inventors: 肖亚兵; 彭杨思; 张海滨; 崔颖; 姚梦楠; 林建奇
Original assignee: BEIJING HAIGUANG INSTRUMENT Co Ltd; Tianjin Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Animals Plants and Food Inspection Center
Current assignee: Beijing Haiguang Instrument Co ltd; Tianjin Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Animals Plants and Food Inspection Center
Priority date: 2013-05-28
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2016-12-28
Anticipated expiration: 2033-05-28
Also published as: CN103335990A

Abstract

一种测定动物肉体中甲基汞和乙基汞的方法，其特征在于步骤：动物肉体样品预处理；微波辅助萃取；液相色谱‑原子荧光联用仪进行分析；最后用数据处理器进行数据收集处理，测出鱼肉中的甲基汞和乙基汞的含量。本发明将微波辅助萃取和HPLC‑AFS联用的方法同时应用于动物肉体中甲基汞和乙基汞的检测，并对萃取工艺进行优化，通过对色谱分析中流动相的选择和浓度控制，以及对原子荧光分析中盐酸的浓度、还原剂的选择和灯电流等工艺的合理控制，简化了工艺流程，能快速简便地测定动物肉体中甲基汞和乙基汞的含量，本发明的检测方法不仅测定简单快速，而且稳定性好，同时具有测定灵敏度高、准确度好、抗干扰能力强的特点。

Description

测定动物肉体中甲基汞和乙基汞的方法

技术领域

本发明涉及测定动物肉体鱼肉中甲基汞和乙基汞的方法。

背景技术

海鲜是人类最基本的甲基汞污染源90％的甲基汞都是被胃肠道吸收，通过与硫醇络合而进入血液被运输到全身。口腔接触，中枢神经系统是最主要的靶器官，特别是在婴儿发展阶段。这些毒害效应使一些感觉功能(视力，听力)、运动协调、记忆力、注意力和学习能力改变。低剂量汞毒性对不同器官体系的效应，包括：神经系统、运动系统、肾脏系统、心血管系统、免疫系统和生殖系统。最极端的例子是在日本水俣和新泻、伊拉克引起死亡。

在河床中，总汞中甲基汞的含量不会超过25％，一般都小于10％。然而，水生系统中的汞很容易被水生生物吸收，引起甲基汞在鱼体内的积累。最终导致，即使在甲基汞低浓度的水中，也会导致鱼肉产生高浓度的汞污染。

鱼肉或者其他类型的海产品大多都是以甲基汞的形式被人体吸收，并且鱼肉中甲基汞的含量占总汞的72-100％。鱼体内的甲基汞转化主要是依赖于营养水平、鱼年龄和鱼长度，在食物链最上的生物甲基汞浓度高于水中生物含量的三个数量级，这可能会在食入大量鱼肉的人群中引起健康问题。在我国珠江三角区，向同一个池塘采用不同的喂食方案，通过测定不同鱼种类体内汞的浓度，发现与其它的鱼相比(杂食类、草食类、虑食类)食肉鱼(黑鲈，大口黑鲈)含有很高的总汞含量(0.9567mg/kg)，说明在水生食物链中有一个很明显的生物积累和生物扩大效应。

关于鱼肉中汞限量标准，我国国家标准GB2762-2012和欧盟No629/2008的标准大致相同，都规定(除肉食性鱼类)甲基汞限量为0.50mg/kg，肉食性鱼类、扇贝及其制品甲基汞限量为1.0mg/kg。2003年FAO/WHO委员会关于食品添加剂建立暂定的每周最大摄入量，MeHg的可摄入量为1.6μg/kg(体重)，总汞5μg/kg(体重)。2010年，每周最大摄入量撤销对总汞的限制，取而代之的是对无机汞的每周最大摄入量限制为4μg/kg(体重)。这种新的每周最大摄入量除了适用于鱼肉和贝类也适用于对其他食品的限量。对于食品，最应该限制的是甲基汞的每周最大摄入量。

最新关于海产品中已存的污染值是基于总汞浓度，甲基汞是基于简单评价，即在鱼肉中甲基汞的平均含量占到总汞含量的84％，其他形态的含量小于或者等于15％。但在文献中反对该假设，认为甲基汞在总汞中的含量不到84％。这种发现更肯定了除测定总汞浓度外，还需检测甲基汞浓度，以便获得更多特异性的毒理性参考价值和建议。

定量和定性分析都包括样品的前处理步骤。提取步骤是很多分析程序必不可少的，索氏提取至今在很多常规实验室都还在使用。近几年，对新的提取技术要求日益增加，该技术需要能自动化，提取时间短，有机溶剂消耗少，可规避污染分析实验室和减少样品前处理量。由于要求驱使，出现了大量新技术，如微波辅助萃取(MAE)，超临界流体萃取(SFE)和加压液体萃取法(PLE；加速溶剂萃取，商业用名为ASE)。它们之间的共性在于，工作时能升温和增压，从而提高提取步骤的速度。

MAE最大的优势就是微波加热可以减少提取时间。这主要是由于微波加热和传统加热方式的不同。在传统的加热方式中，在热量被传到溶剂中时，需要一定的时间来加热消解罐。而对于微波加热，溶剂是被微波直接加热。这样使温度以一个最小的梯度上升。另外，MAE极大的减小有机试剂消耗，可同时消解多种样品。现代药品消解有一些标准，MAE都可以最大限度的满足相关要求。Cecilia Sparr Eskilsson等人做过相关统计，从十年之前的科技统计文献就可看出MAE已成功地替代传统手段的趋势。

联用技术是目前汞形态分析最常用的技术，其中HPLC和AFS以其具有接口简单、价格低、灵敏度高、线性范围宽、检出限低、抗干扰能力强等优点，成为汞形态分析的首选技术，本研究拟用微波辅助萃取、并结合高效液相色谱分离技术、利用原子荧光光度计测定鱼肉中的甲基汞和乙基汞。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种测定动物肉体中甲基汞和乙基汞的方法，采用微波辅助萃取和HPLC-AFS联用的方法，具有简单快速、测定灵敏度高、准确度好、抗干扰能力强的特点。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：测定动物肉体中甲基汞和乙基汞的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)动物肉体样品预处理：将动物肉体样品绞碎，-75～-85℃预冷冻2.5～3.5小时，放进真空冷冻干燥机，冷冻65～80h，将其碾碎，放至-18～-22℃冰箱，待分析检测；

2)微波辅助萃取：称取上述样品0.19～0.21g于微波萃取罐中，加入4.5～5.5mL浓度为1～6mol/L的盐酸及浓度为0.24～0.26mol/L的NaCl，在50～80℃提取9～11min，得到萃取液；

3)将萃取液注入液相色谱-原子荧光联用仪进行分析：

其中液相色谱分离是选用C18反相柱，流动相为甲醇+乙酸铵+半胱氨酸，其中甲醇的体积浓度为4.8～5.2％(v/v)，乙酸铵的浓度为0.44～0.48％(m/v)，半胱氨酸的浓度为0.11～0.13％(m/v)，控制流动相的流速为1.0mL/min，将萃取液通过C18反相柱，流动相将甲基汞、乙基汞依次吸收洗脱；经液相色谱分离后的待测液在2.5～12.5％(m/v)盐酸的载流下载入氢气发生器，并加入还原剂在氢气发生器中将溶液中的甲基汞、乙基汞氧化降解还原成原子汞，由载气将汞带入原子化器中，汞在空心阴极灯的照射下，发射出汞特征波长的荧光；

4)最后将原子化器中得到的汞原子发出的荧光强度用数据处理器进行数据收集，经列表或绘图分析，既能准确测出鱼肉中的甲基汞和乙基汞的含量。

作为改进，所述步骤2)的盐酸的浓度为5mol/L，NaCl的浓度为0.25mol/L，萃取温度为60℃。

作为改进，所述步骤3)流动相中的甲醇的浓度为5.0％(v/v)，乙酸铵的浓度为0.462％(m/v)，半胱氨酸的浓度为0.12％(v/v)，流动相的配制过程为：准确称取2.31g乙酸铵和0.60g L-半胱氨酸至200mL烧杯中，搅拌充分溶解后转移至500mL容量瓶中，用超纯水冲洗烧杯多次，洗涤液一并转移入容量瓶中，并向容量瓶中加入25mL甲醇，使混合均匀，经0.45μm膜过滤后，超声脱气20min。

再改进，所述步骤3)的盐酸的浓度为5％(m/v)，所述还原剂为浓度为0.5％KOH(m/v)+0.5％KBH₄(m/v)。

再改进，所述原子化器中的光电倍增管负高压为240～320V，原子荧光石英炉芯中屏蔽气流速为800～1100mL/min，空心阴极灯灯电流强度为20～30mA。

进一步改进，所述原子化器中光电倍增管负高压为280V，原子荧光石英炉芯中屏蔽气流速为800mL/min，空心阴极灯灯电流强度为28mA。

与现有技术相比，本发明的优点在于：将微波辅助萃取和HPLC-AFS联用的方法同时应用于动物肉体中甲基汞和乙基汞的检测，并对萃取工艺进行优化，通过对色谱分析中流动相的选择和浓度控制，以及对原子荧光分析中盐酸的浓度、还原剂的选择和灯电流等工艺的合理控制，简化了工艺流程，能快速简便地测定肉体中甲基汞和乙基汞的含量，本发明的检测方法不仅测定简单快速，而且稳定性好，同时具有测定灵敏度高、准确度好、抗干扰能力强的特点。

附图说明

图1是本发明实施例的工艺流程示意图；

图2是本发明实施例的测试数据的座标图；

图3是图2在不同测试状态下的座标图；

图4是图2在另一种不同测试状态下的座标图；

图5是图2在开启紫外消解状态下的座标图；

图6是图2在关闭紫外消解状态下的座标图；

图7是本实施例在不同负高压条件汞形态的测试数据的座标图；

图8是本实施例在不同负高压条件下汞形态峰面积的测试数据的座标图；

图9是本实施例在不同屏蔽气流速条件下汞形态峰面积的测试数据的座标图；

图10是本实施例在不同灯电流值条件下汞形态峰面积的测试数据的座标图；

图11是本实施例在不同盐酸浓度条件下汞形态峰面积的测试数据的座标图；

图12是本实施例在不同硼氢化钾浓度条件下汞形态的测试数据的座标图；

图13是本实施例在不同硼氢化钾浓度汞形态峰面积的测试数据的座标图；

图14是本实施例的甲基汞标准曲线图；

图15是本实施例的乙基汞标准曲线图；

图16是本实施例中不同盐酸浓度对甲基汞和乙基汞回收率影响的测试数据的座标图；

图17是本实施例中不同萃取温度对甲基汞和乙基汞回收率影响的测试数据的座标图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

本实施例以鱼肉为例，测定鱼肉中的甲基汞和乙基汞的方法，包括以下步骤：

1)鱼肉预处理：将鱼肉绞碎，-75～-85℃预冷冻2.5～3.5小时，放进真空冷冻干燥机，冷冻65～80h，将其碾碎，放至-18～-22℃冰箱，待分析检测；

2)微波辅助萃取：称取上述鱼肉0.2g于微波萃取罐中，加入5.0mL浓度为5mol/L的盐酸和0.25mol/L的NaCl，60℃提取10min，得到萃取液；

3)将萃取液注入液相色谱-原子荧光联用仪进行分析：

其中液相色谱分离是选用C18反相柱，流动相为甲醇+乙酸铵+半胱氨酸，其中甲醇的体积浓度为5.0％(v/v)，乙酸铵的浓度为0.462％(m/v)，半胱氨酸的浓度为0.12％(m/v)，控制流动相的流速为1.0mL/min，将萃取液通过C18反相柱，流动相将甲基汞、乙基汞依次吸收洗脱；经液相色谱分离后的待测液在5％(m/v)盐酸的载流下载入氢气发生器，与0.5％(m/v)的KBH₄在氢气发生器中将溶液中的甲基汞、乙基汞氧化降解还原成原子汞，由载气将汞带入原子化器中，所述原子化器中光电倍增管负高压优选为280V，原子荧光石英炉芯中屏蔽气流速优选为800mL/min，空心阴极灯灯电流强度优选为28mA，汞在空心阴极灯的照射下，发射出汞特征波长的荧光，荧光强度与汞含量成正比；

所述步骤3)流动相的配制过程为：准确称取2.31g乙酸铵和0.60g L-半胱氨酸至200mL烧杯中，搅拌充分溶解后转移至500mL容量瓶中，用超纯水冲洗烧杯多次，洗涤液一并转移入容量瓶中，并向容量瓶中加入25mL甲醇，上下颠倒容量瓶，使混合均匀，定容，经0.45μm膜过滤后，超声脱气20min。

下面通过具体实验数据对本发明进行更为详细的说明：

一、试剂

所有试剂均为分析纯，全部使用二次去离子水。

重量法配制500mg/L(以Hg计)氯化甲基汞((CH₃)HgCl)溶液：准确称取(CH₃)HgCl固体0.0063g于15ml聚乙烯瓶中，将该聚乙烯瓶放天平上，天平归零，称取10g超纯水，即可配置得500mg/L的甲基汞(MeHg)；

重量法配制500mg/L(以Hg计)氯化乙基汞((C₂H₅)HgCl)溶液：准确称取(C₂H₅)HgCl固体0.0066g于15ml聚乙烯瓶中，将该聚乙烯瓶放天平上，天平归零，称取10g超纯水，即可配置得500mg/L的乙基汞(EtHg)；

以上标准标准储备液在-20℃保存，需要用到时提前拿出来融化，再根据需要逐级稀释配置。

常用试剂的配制(其他相关试剂一次类推)：

流动相的配制：5％甲醇-0.462％乙酸铵-0.12％L-半胱氨酸

准确称取2.31g乙酸铵和0.60g L-半胱氨酸至200mL烧杯中，搅拌充分溶解后转移至500mL容量瓶中，用超纯水冲洗烧杯多次，洗涤液一并转移入容量瓶中，并向容量瓶中加入25mL甲醇，上下颠倒容量瓶，使混合均匀，定容。经0.45μm膜过滤后，超声脱气20min。该试剂限当天使用。

氧化剂：0.5％KOH+1.0K₂S₂O₈准确称取10.00g K₂S₂O₈和5.00g KOH溶于1000mL超纯水中，搅拌均匀，使完全溶解。该试剂限当天使用。

载流：5％HCl溶液：准确量取50mL盐酸与1L玻璃瓶中，缓缓加入950mL超纯水，盖紧瓶盖，上下颠倒使均匀。

还原剂：0.5％KOH+0.5KBH₄准确称取5.00g KBH₄和5.00g KOH溶于1000mL超纯水中，搅拌均匀，使完全溶解。该试剂需先用现配。

微波萃取溶剂：5％m/v HCl+0.15％的NaCl准确称取0.15g NaCl固体，用量筒量取5mL盐酸溶液，再量取95mL超纯水溶液，搅拌使NaCl完全溶解，搅拌均匀，使完全溶解。

二、仪器

液相色谱-原子荧光联用仪，该装置包含总共包括五部分：HPLC部分；紫外在线消解部分；氢化物发生部分；原子化荧光检测器部分；数据处理器；所述HPLC-AFS表示的意思是：液相色谱串联原子荧光光度计。在网上均能查到。

其中HPLC部分包括高压泵：高压泵、100μL定量环的进样阀、Agilent C18反相柱(4.6mmx150mm，5μm)、柱温为室温。液相色谱柱的出口与氢化物生成系统通过三通相连；紫外在线消解：液体从柱后流出时，直接进入紫外在线消解装置；

真空抽滤装置，用于过滤流动相；

超声装置，用于流动相脱气；

微波辅助萃取仪；

三、样品

小黄鱼、金枪鱼、三文鱼：市售。

样品预处理：将鱼肉用绞肉机绞碎，-80℃预冷冻3小时，放进真空冷冻干燥机，冷冻72h，使其水分尽量升华。将其碾碎，放至-20℃冰箱，待分析检测。

四、HPLC-AFS结构示意图

如图1所示，HPLC-AFS接口基于一个三通设计，液相流出液管路，盐酸入口和到氢化物发生系统的管路。

五、实验与结果

1、色谱条件的优化

1)色谱柱选择

目前做汞形态分析方法，主要包括离子交换色谱分离、毛细管电泳分离以及高效液相色谱分离，其中高效液相色谱分析分离大多数用的是C18柱的反相色谱分离。

2)流动相条件优化

本实验拟用甲醇、乙酸铵、半胱氨酸以一定比列配置作为流动相。乙酸铵的作用是调节溶液的pH，一定量的乙酸铵使分离条件达到最佳pH。半胱氨酸可以与待分离组分形成络合物，影响待分离组分与色谱柱的结合，所以半胱氨酸含量对分离效果影响更大。流动相中的甲醇流动相中的甲醇影响待分离组分汞化合物的出峰时间。改变流动相中甲醇的含量调节待分离组分的出峰时间，使出峰控制在最佳时间。

由图2～4可知流动相中甲醇含量对待分离两组分有影响，当流动相中甲醇含量增大时，两组分出峰时间缩短，但对出峰时间的影响并不大。相反，甲醇含量对两组分分离效果较大。虽然三个甲醇比例都能实现基线分离，但不难看出5％甲醇分离效果更好。为了后期的定量实验，最终选定了5％甲醇含量作为最优条件。

2、是否使用紫外在线消解

理论上，紫外可使有机态的汞R-Hg键断裂，提高其氧化还原效率。本实验设置紫外灯开(增加管路)和紫外灯关(减少管路)两种状态。由于仪器设计所致，只能将紫外消解装置接于色谱柱后。当用三通接入过氧化剂时，由于紫外消解装置内部通路过窄，柱后流出液和过氧化剂同时流入紫外通路，导致压力过大，出现进管。所以取消了加入氧化剂K₂S₂O₈的设计。柱后流出液直接进入紫外装置。

由图5和图6可知，在加入紫外消解装置但没有引入氧化剂的情况下，对响应值的增加影响不大。相反，由于增加了整个系统的管路，使分离效果变差。所以，之后的实验都取消了紫外消解装置。

3、原子荧光仪器条件优化

1)负高压条件优化

光电倍增管负高压是指加于光电倍增管两端的电压，它影响着检测汞信号的高低。同时汞空心阴极灯要求测定汞的负高压要小于或者等于360V，所以本实验设置负高压梯度为：240、260、280、300、320(V)。以40μg/L的甲基汞、乙基汞混标进样，记录单个组分响应值，连续进样三次取平均值。固定其他条件不变，只改变负高压大小，测定20μg/L的MeHg溶液和40μg/L的EtHg溶液峰面积。由图7和图8可知，负高压对分离效果并没有太大影响。随着负高压绝对值的增大，响应信号增大。但同时仪器噪音增大，信噪比减小。综合考虑，最终选择了280V作为最优负高压。

2)屏蔽气流速优化

通常的原子荧光石英炉芯都会有内外两层，里面一层是通氩气和样品的氢化物，外面一层是通氩气，主要作用是把内层氢化物和外界的气体隔开，一定程度减少荧光淬灭。通向内层的为载气部分，通向外层的为屏蔽气部分。屏蔽气含量越大，信号值越稳定，但同时，也会增加基线噪音。以40μg/L的甲基汞、乙基汞混标进样，记录单个组分响应值，连续进样三次取平均值，屏蔽气流速梯度为：800mL/min、900mL/min、1000mL/min、1100mL/min。如图9所示，在屏蔽气流速为800mL/min，两组分的信号值最大。再加上使用800mL/min，为最小流速。最终选定800mL/min为最佳屏蔽气流速。

3)灯电流值优化

光源是原子荧光分析仪器的重要部分，它提供基态原子能级跃迁的能量。灯电流的大小直接影响到灵敏度和噪声情况。当然，灯电流的使用不当，也会影响空心阴极灯的寿命。以40μg/L的甲基汞、乙基汞混标进样，记录单个组分响应值，连续进样三次取平均值，空心阴极灯灯电流梯度为：20mA、22mA、24mA、26mA、28mA、30mA；如图10所示，随着等电流的增大，信号响应值增大。为了避免过大的噪声和影响灯的使用寿命，选择28mA为最佳灯电流。

4)载流HCl浓度优化

在HPLC-AFS中，盐酸的作用是将液相的馏分载入氢化物发生装置。盐酸的浓度会影响汞的氢化物发生效率和原子化火焰状态。以40μg/L的甲基汞、乙基汞混标进样，记录单个组分响应值，连续进样三次取平均值，实验设置的HCl梯度为：2.5％，5％，7.5％，10％，12.5％(m/v)。如图11所示，盐酸浓度在5％和10％两个浓度响应值较大。考虑到HCl浓度过大，对管路腐蚀性更大，且成本更高，选择5％作为最佳HCl浓度。

5)还原剂KBH₄浓度

KBH₄的浓度影响待测元素的氢化物发生率，从而影响信号的灵敏度和分析测试的重现性。当硼氢化钾浓度较低时，生成的氩氢焰不稳定或不产生，从而无法将甲基汞氧化降解；当浓度过高时，大量的氢气会稀释汞原子，基线漂移，从而影响甲基汞的荧光信号。以40μg/L的甲基汞、乙基汞混标进样，记录个组分响应值，连续进样三次取平均值，实验设置的KBH₄浓度梯度为：0.5％，1％，1.5％，2％，2.5％(m/v)。由以上图12 和图13可看出，KBH₄浓度在0.5％时已经能够满足测定要求，当浓度再增大，虽然信号值也增大，但在浓度2.5％时基线噪音明显变大。本实验选择的最佳KBH₄浓度为0.5％。

4、检测方法准确性验证

1)仪器检出限

国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)1997年通过、1998年发表的《分析术语纲要》(UPAC Compendium of Analytical Nomenclature)中规定：“检出限以浓度(或质量)表示，是指由特定的分析步骤能够合理地检测出的最小分析信号X_L求得的最低温度C_L(或质量q_L)。”IUPAC规定应通过实验以足够多的测定次数求出，譬如说20次。表达式为：D·_L＝X_L-X_b/S＝K’S_b/S，X_L＝X_b+K’S_b，式中X_b表示空白平均值，S_b指空白标准偏差；K’是指根据所需的置信度选择的常数，IUPAC建议取K’＝3作为检出限计算标准；S(灵敏度)为分析校准曲线在低浓度范围内的斜率。本研究用流动相配制标准溶液，所以用流动相作为空白溶液，测定11次后得到空白平均值X_b和空白标准偏差S_b，计算出仪器检出限。最终计算出，MeHg的检出限为0.07μg/L，EtHg的检出限为0.13μg/L。

2)标准曲线

用流动相配制甲乙基汞混合溶液，浓度分别为0、5、10、20、30、50μg/L的标准溶液，每个浓度都重复测定三次，取其平均值。

表4.2线性回归方程和相关系数

Table4.2Regression equations and correlation coefficients

5、微波辅助萃取条件优化

1)盐酸浓度优化

通过比较不同盐酸浓度对MeHg和EtHg回收率的影响，优化盐酸浓度。不加标组组：分别加入5mL浓度为0、1、2、3、4、5、6mol/L的盐酸；一定量NaCl，使其终浓度为0.25mol/L。加标组：分别加入5mL浓度为0、1、2、3、4、5、6mol/L的盐酸，并且作两个平行；一定量NaCl，使其终浓度为0.25mol/L；一定量MeHg和EtHg母液，使其终浓度为20ppb。称取冷冻干燥的小黄鱼样品0.2g(精确到0.001g)于每个10mL微波萃取罐中。不加标组和加标组的微波萃取罐里，都加入仪器自配的磁力转子。加标组作两个平行；60℃，萃取10min。计算相应回收率，结果如图16所示。

在没有盐酸时，EtHg不能被提取出来，不过随着盐酸浓度从2-6mol/L，EtHg的提取率也在不断增大。盐酸浓度在3-6mol/L，均能保证甲基汞的回收率在80％以上。综合MeHg和EtHg的提取效率，最终选择5mol/L作为盐酸的最佳浓度。

2)温度优化

通过比较不同温度对MeHg和EtHg回收率的影响，优化萃取。不加标组：分别在在50℃、60℃、80℃、100℃和120℃提取；5mL5mol/L盐酸；一定量NaCl，使其终浓度为0.25mol/L。加标注组：分别在在50℃、60℃、80℃、100℃和120℃提取；5mL5mol/L盐酸；一定量NaCl，使其终浓度为0.25mol/L；一定量MeHg和EtHg母液，使其终浓度为20ppb。称取冷冻干燥的小黄鱼样品0.2g(精确到0.001g)于每个10mL微波萃取罐中。空白组和对照组的微波萃取罐里，都加入仪器自配的磁力转子。加标组作两个平行；计算相应回收率，结果如图17所示对于微波萃取而言，萃取温度是一个很重要的因素。

由图17可看出，MeHg在60℃时回收率最高，随着温度升高会有损失，回收率下降。萃取温度对EtHg的回收率影响较小，但普遍不高，不到80％。综合考虑甲基汞和乙基汞的回收率，最终选择60℃作为萃取最佳温度。

6、精密度与回收率

称取国家标准物质GBW100290.2g(精确到0.001)，平行七份，每份都加入5mL5mol/L的盐酸和一定量浓度NaCl(使其终浓度为0.25mol/L)；取其中三份加入一定量MeHg和EtHg母液，使两者终浓度为10μg/L。60℃，微波辅助萃取10min，100μL进样。计算结果如下：

表2标准物质考察精密度和回收率结果

Table2results of accuracy and recovery

7、标准物质测定和样品测定

准确称取GBW10029、小黄鱼、金枪鱼和三文鱼0.2g(精确到0.001)(后三类样品都经真空干燥处理)，每份都加入5mL5mol/L的盐酸和一定量浓度NaCl(使其终浓度为0.25mol/L)。60℃，微波辅助萃取10min，100μL进样。

表3标准物质和三种实际样品测定结果

Talbe3determination results of fishes

由表3，标准物质测定结果可以看出，该方法具有很高的准确性。金枪鱼的检测结果与文献报导相符。小黄鱼和三文鱼的结果与文献报道略有差异。正如前文所说，甲基汞的转化也依赖于鱼的营养水平、年龄和长度，这些因素都可能造成各地鱼肉中MeHg含量不同。

五、小结

该部分建立了一种微波辅助萃取HPLC-AFS提取鱼肉中的MeHg和EtHg的快捷方法。微波萃取最优的条件是0.2g的样品，包括5mol/L盐酸和0.25mol/L NaCl的15mL提取溶剂，60℃提取10min。通过分析标准物质GBW10029中的甲基汞，将其检测值与理论值作对比，说明该方法的准确度。最后，将该方法运用到实际样品的测定，包括小黄鱼、金枪鱼和三文鱼。金枪鱼的结果相近，小黄鱼和三文鱼有差异，可理解为包括生长环境等客观因素造成。

Claims

1.测定动物肉体中甲基汞和乙基汞的方法，其特征在于：包括以下步骤：

2)微波辅助萃取：称取上述样品0.19～0.21g于微波萃取罐中，加入4.5～5.5mL浓度为1～6mol/L的盐酸及加入浓度为0.24～0.26mol/L的NaCl，在50～80℃提取9～11min，得到萃取液；

3)将萃取液注入液相色谱-原子荧光联用仪进行分析：

其中液相色谱分离是选用C18反相柱，流动相为甲醇+乙酸铵+半胱氨酸，其中甲醇的体积浓度为5.0％(v/v)，乙酸铵的浓度为0.462％(m/v)，半胱氨酸的浓度为0.12％(m/v)，控制流动相的流速为1.0mL/min，将萃取液通过C18反相柱，流动相将甲基汞、乙基汞依次吸收洗脱；经液相色谱分离后的待测液在2.5～12.5％(m/v)盐酸的载流下载入氢气发生器，并加入还原剂在氢气发生器中将溶液中的甲基汞、乙基汞氧化降解还原成原子汞，由载气将汞带入原子化器中，汞在空心阴极灯的照射下，发射出汞特征波长的荧光；

4)最后将原子化器中得到的汞原子发出的荧光强度用数据处理器进行数据收集，经列表或绘图分析，即能准确测出鱼肉中的甲基汞和乙基汞的含量；所述步骤2)的盐酸的浓度为1～6mol/L，NaCl的浓度为0.24～0.26mol/L，萃取温度为50～80℃；所述步骤3)流动相中的甲醇的浓度为5.0％(v/v)，乙酸铵的浓度为0.462％(m/v)，半胱氨酸的浓度为0.12％(v/v)，流动相的配制过程为：准确称取2.31g乙酸铵和0.60g L-半胱氨酸至200mL烧杯中，搅拌充分溶解后转移至500mL容量瓶中，用超纯水冲洗烧杯多次，洗涤液一并转移入容量瓶中，并向容量瓶中加入25mL甲醇，使混合均匀，经0.45μm膜过滤后，超声脱气20min；所述步骤3)的盐酸的浓度为2.5～12.5％(m/v)，所述还原剂为浓度为0.5％KOH(m/v)+0.5％KBH₄(m/v)。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述原子化器中的光电倍增管负高压为240～320V，原子荧光石英炉芯中屏蔽气流速为800～1100mL/min，空心阴极灯灯电流强度为20～30mA。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述原子化器中光电倍增管负高压为280V，原子荧光石英炉芯中屏蔽气流速为800mL/min，空心阴极灯灯电流强度为28mA。