CN110412170A - 海产品中有机锡的在线固相萃取气相色谱质谱检测方法 - Google Patents

海产品中有机锡的在线固相萃取气相色谱质谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种海产品中有机锡的在线固相萃取气相色谱质谱检测方法，包括以下步骤：(1)样品的采集和制样；(2)加速溶剂萃取；(3)加水定容；(4)在线固相萃取净化‑衍生；(5)浓缩定容；(6)气相色谱‑质谱检测；(7)标准曲线绘制；(8)样品测定。本发明操作简单，能快速完成样品前处理，其中首次采用C60柱实现在线富集、净化、衍生，整个在线固相萃取净化‑衍生过程只需要12～15min，且可多次使用，使用周期为6个月，结果准确，九种有机锡检出限为0.4～1.0μg/kg，回收率为77％～115％，相对标准偏差(n＝5)为3.5％～6.9％，具有较高的灵敏度和令人满意的回收率及重现性，能用于海产品中有机锡的含量测定。

Description

海产品中有机锡的在线固相萃取气相色谱质谱检测方法
技术领域
本发明涉及海产品污染检测技术领域，尤其是涉及一种海产品中有机锡的在线固相萃取气相色谱质谱检测方法。
背景技术
有机锡作为一类重要的环境激素广泛分布在大气、水体、土壤、底泥、生物体等各种介质中，具有雄性激素效应，干扰内分泌系统，导致生殖、发育和行为异常，常被广泛用作聚氯乙烯稳定剂、船体防污材料、木材防腐剂、杀虫剂、杀菌剂，其中三丁基锡、三苯基锡及其降解产物已被世界多个国家列为“优先污染物黑名单”。尽管有机锡污染已引起全球重视，但由于半衰期较长，可持久存在。溶解态的有机锡化合物更易进入海水中迁移或者通过生物富集进入食物链中，尤其是三丁基锡和三苯基锡因脂溶性较高而易在生物体内富集。大量研究表明，有机锡在鱼类，贝类等生物体内，生物浓缩系数最高达8700000，并具有生物放大作用，一旦被人类食用，最终将威胁人类健康和生命。有报告指出世界各地海洋哺乳动物体内存在高浓度的有机锡化合物，它们能使哺乳动物免疫系统防御能力下降，使神经系统中毒，致突变、致癌等。除海洋食物网，在人体肝脏中也发现了三丁基锡，这很可能是由于摄入人体的海鲜受到了有机锡的污染。据报道，仅三丁基锡，在南海贝类中检出浓度为未检出～249.9μg/kg(以Sn计)，均值67.6μg/kg(以Sn计)；南海鱼类检出浓度为未检出～1377.8μg/kg(以Sn计)，均值26.3μg/kg(以Sn计)；渤海湾软体动物检出浓度为<2.8～383.9μg/kg(以Sn计)。
我国目前对食品中有机锡的限量还未作规定。欧洲食品安全管理局已经宣布了二丁基锡、三丁基锡、三苯基锡和二辛基锡有免疫毒性，并规定食品中这些有机锡总和的最大限量标准为40μg/kg(以Sn计)，一甲基锡和二甲基锡最大限量标准为180μg/kg(以Sn计)，一辛基锡最大限量标准为1200μg/kg(以Sn计)。然而，其他有机锡化合物的限量标准现也还尚无定论，这与方法检出限和一次性能检出的有机锡化合物种类有着直接关系。现有报道的大多数方法一次大多检测3～6种有机锡化合物。因此，分析海产品中有机锡尤为重要。
目前，国内外主要采用索氏提取、振荡萃取、微波辅助提取、加速溶剂萃取、超声波萃取等萃取技术，结合层析柱净化、固相萃取、凝胶渗透色谱净化的等一种或两种净化方法，再采用气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法、气相色谱串联质谱法等技术进行生物体中有机锡检测，而当采用气相色谱分析时，还需要进行衍生；液相色谱法虽无需衍生，但灵敏度较差。目前采用固相萃取-气相色谱质谱法检测有机锡时，都是采用的是离线固相萃取，萃取液衍生后，主要采用层析柱或商品化固相萃取小柱进行离线固相萃取净化。常用的净化柱有弗罗里硅土柱、硅胶-弗罗里硅土串联柱等，小柱中的吸附剂通过极性、疏水等相互作用选择性地保留物质，再通过淋洗液选择性地把目标物质洗脱下来，达到对样品净化的目的。常用的洗脱液有环己烷、正己烷、正己烷-甲苯(v/v，1:1)、甲醇-水-醋酸(v/v/v，72.5:21.5:6)、丙酮、正己烷、含5％乙醚(v/v)的正己烷等，这些传统方法通常需要额外进行反萃取，耗时，洗脱剂用量也较大。
因此，开发一种可实时在线富集、净化、衍生的前处理方法，并结合高灵敏的气相色谱质谱检测技术有望解决现有技术瓶颈。
发明内容
本发明是为了解决现有技术的海产品中有机锡类环境激素的检测方法所存在的上述技术问题，提供了一种操作简单，能快速完成样品前处理，具有较高的灵敏度和令人满意的回收率及重现性的海产品中有机锡的在线固相萃取气相色谱质谱检测方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的一种海产品中有机锡的在线固相萃取气相色谱质谱检测方法，包括以下步骤：
(1)样品的采集和制样
将海产品样品匀质后冷冻干燥，冷冻保存，待测。海产品，鱼：去鳞、去皮，沿脊背取肌肉；虾、蟹：去头、去壳、去附肢，取肌肉；贝类：去壳，取可食部分，样品切为不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm，用高速组织捣碎机匀质。
(2)加速溶剂萃取
称取1.00g待测样品，并与8g硅藻土充分混合均匀，再装入10mL萃取池中，池顶部用适量硅藻土填满，以1mol/L醋酸钠溶液：1mol/L醋酸甲醇溶液(1:1，v/v)为萃取剂，进行加速溶剂萃取，加速溶剂萃取完成后，萃取液全部进入收集瓶中。在进行萃取方式的选择时，考虑到振荡萃取、索氏提取等传统的萃取方法提取过程耗时、工作强度大，而且使用大量有毒溶剂，因此，本发明选择加速溶剂萃取法萃取海产品的有机锡，具有快速、可批量处理，溶剂消耗少等优点。
(3)加水定容
在收集的萃取液中，加二次蒸馏水稀释，并用氢氧化钠溶液调节pH至5～5.5，最终定容至25mL，得萃取稀释液。萃取稀释液的pH值是个关键因素，分析物在固相萃取柱上的吸附作用取决于中性络合物的生成，只有当络合反应速度比有机锡在酸性条件下生成Sn4+或碱性条件下生成Sn(OH)4更快时，才能实现有效的富集，本发明中，萃取稀释液pH为5～5.5时，富集效率较高。
(4)在线固相萃取净化-衍生
通过蠕动泵，将25mL萃取稀释液和络合剂二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液泵入反应池充分反应生成络合物，并富集在C60柱上；富集完成后切换进样阀A通入空气，以空气流进行脱水，同时经进样阀B向进样环内注入洗脱/衍生液；脱水后，切换进样阀A和进样阀B，通入空气，在空气流的带动下将洗脱/衍生液注入C60柱，并将富集在C60柱上的络合物洗脱下来，洗脱液收集于气相小瓶后在气相小瓶中完成衍生，得衍生产物。目前采用固相萃取-气相色谱质谱法检测有机锡时，都是采用的是离线固相萃取，萃取液衍生后，主要采用层析柱或商品化固相萃取小柱进行离线固相萃取净化，常用的净化柱有弗罗里硅土柱、硅胶-弗罗里硅土串联柱等，小柱中的吸附剂通过极性、疏水等相互作用选择性地保留物质，再通过淋洗液选择性地把目标物质洗脱下来，达到对样品净化的目的，但这些传统方法通常需要额外进行反萃取，耗时，洗脱剂用量也较大，而使用C60作为吸附剂则能完全克服这些缺点；二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液灵敏度较高，因此本发明中选择二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液作为络合剂，有机锡与络合剂反应生成不带电荷的络合物后，可富集在C60柱上。
(5)浓缩定容
在水浴条件下，将衍生产物吹氮蒸发至干，用正己烷溶解，并定容至200μL，作为上机溶液。
(6)气相色谱-质谱检测
进样针抽取上述上机溶液，按照设定好的气相色谱-质谱检测器条件进行检测，得总离子流图色谱图。色谱条件为：进样口温度为260℃；载气为高纯氦气，流速为1mL/min；进样体积为1μL；进样方式为不分流进样，0.75min后以15mL/min吹扫；传输线温度260℃；气相色谱柱升温程序为：初始温度60℃，保持1.0min，以20℃/min升温至220℃，保持10min，再以15℃/min升温至280℃/min，保持5.0min，总运行时间28min；质谱条件为：电子轰击(EI)离子源，离子源温度230℃，电离能量70eV；溶剂延迟3min；四级杆温度150℃，扫描范围50～450amu，检索谱库NIST。
(7)标准曲线绘制
选择离子监测模式定性：取溶质浓度均为100μg/L的有机锡混合标准使用液2000μL，其中有机锡混合标准使用液中的溶质为一丁基锡、二丁基锡、三丁基锡、一苯基锡、一辛基锡、四丁基锡、二苯基锡、二辛基锡、三苯基锡九种有机锡，有机锡混合标准使用液中的溶剂为pH为5～5.5的甲醇-醋酸-醋酸钠水溶液；在有机锡混合标准使用液中加入7.5mL浓度为1mol/L的醋酸钠溶液和7.5mL浓度为1mol/L的醋酸甲醇溶液，再加二次蒸馏水稀释，并用氢氧化钠溶液调节pH至5～5.5，最终定容至25mL，得到浓度为8μg/L标准溶液；取25mL的标准溶液，按上述步骤(4)～(6)进行操作，得到标准溶液的总离子流图色谱图，并与单个分析物的总离子流图色谱图进行定性离子、定量离子比较，同时结合保留时间，确定九种有机锡的种类；九种有机锡的定性离子、定量离子、保留时间用以作为外标法定量时识别九种有机锡色谱峰识别的依据；
外标法定量：分别取溶质浓度均为100μg/L的有机锡混合标准使用液20、50、250、500、1000、2000μL，其中有机锡混合标准使用液中的溶质为一丁基锡、二丁基锡、三丁基锡、一苯基锡、一辛基锡、四丁基锡、二苯基锡、二辛基锡、三苯基锡九种有机锡，有机锡混合标准使用液中的溶剂为pH为5～5.5的甲醇-醋酸-醋酸钠水溶液；在上述六种有机锡混合标准使用液中分别加入7.5mL浓度为1mol/L的醋酸钠溶液和7.5mL浓度为1mol/L的醋酸甲醇溶液，再加二次蒸馏水稀释，用氢氧化钠溶液调节pH至5～5.5，最终定容至25mL，得到六次加标浓度范围均为0.08～8μg/L的标准曲线系列溶液；将六种不同加标浓度的标准曲线系列溶液，根据加入的有机锡浓度和相应的定量离子积分峰面积的对应关系建立标准曲线。
(8)样品测定
将步骤(6)中得到的总离子流色谱图中的有机锡的相应定量峰面积，与上述步骤(7)中得到的标准曲线进行比较，最后通过换算即可得到样品中九种有机锡的实际含量。
作为优选，步骤(1)中，海产品样品匀质后置于冷冻干燥机中干燥12～24h，取出置于-18℃冷冻保存。
作为优选，步骤(2)中，加速溶剂萃取工艺参数为：提取温度为100～120℃，压力1000～1500psi，加热时间为5～6min，静态循环时间为3～5min，冲洗溶剂体积为60％，静态循环次数为2～3次，氮气吹扫时间为60～100s。
作为优选，当样品中含硫化合物的背景干扰时，在装填样品前在萃取池底部加入0.5～1g铜粉脱硫。
作为优选，所述铜粉使用前先用稀盐酸处理以除去其表面氧化膜，再用蒸馏水冲洗除去附在其表面的少量酸，最后用丙酮冲洗并在高纯氮气流下吹干。
作为优选，步骤(4)中，萃取稀释液的进样速度为3mL/min，络合剂二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液浓度为4×10-3mol/L，络合剂二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液的进样速度为0.5mL/min。4×10-3mol/L的二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液可确保存在足够多的络合剂，以避免存在于实际萃取稀释液中的其他金属的潜在干扰；萃取稀释液流速在0.5～3.5mL/min时对结果影响不大，为缩短分析时间，本发明中萃取稀释液的进样速度设置为3mL/min；络合剂的流速从0.2mL/min上升至0.5mL/min时，随着流速的增加，信号增强，因此本发明中络合剂二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液的进样速度设置为0.5mL/min。
作为优选，反应池为150cm长的聚四氟乙烯管线圈，C60柱为内径3mm、长1.3cm、填充有C60的聚四氟乙烯管，C60的粒径为50～70μm，填充量为100mg，聚四氟乙烯管的两端用玻璃棉密封，C60柱在使用前、后分别依次用1mL正己烷、1mL甲醇活化和清洗，使用周期为6个月。当反应池长度从50cm增加至200cm，结果表明随着反应池长度的增加，信号增强，当长度大于150cm后，信号强度趋于稳定，因此本发明中反应池长度最终选择150cm。
作为优选，脱水时，空气流流速为5mL/min，持续30s。
作为优选，所述洗脱/衍生液为浓度为0.06mol/L四乙基硼化钠的四氢呋喃溶液，进样环为1mL进样环，衍生时间2～3min，洗脱时，空气流流速为5mL/min。洗脱/衍生液的选择不仅影响洗脱效果，也影响衍生反应的进行，发明人比较了1mL含相同浓度衍生试剂0.06mol/L四乙基硼化钠的正己烷、石油醚、甲醇、乙酸乙酯、四氢呋喃的洗脱效果(回收率76％～115％)，结果表明四氢呋喃对所有有机锡洗脱效果均较好，因此本发明中洗脱/衍生液为浓度为0.06mol/L四乙基硼化钠的四氢呋喃溶液；同时比较了洗脱/衍生液体积0.2～1.2mL对回收率的影响，随着洗脱/衍生液体积的增加，回收率增加，增加至1mL后，回收率变化不明显，因此本发明中最终选择1mL进样环。
作为优选，步骤(5)中，水浴温度35～40℃。
因此，本发明具有如下有益效果：采用加速溶剂萃取、在线固相萃取净化-衍生、气相色谱质谱法测定海产品中的有机锡，该方法操作简单，能快速完成样品前处理，其中首次采用C60柱实现在线富集、净化、衍生，整个在线固相萃取净化-衍生过程只需要12～15min，且可多次使用，使用周期为6个月，结果准确，九种有机锡检出限为0.4～1.0μg/kg，回收率为77％～115％，相对标准偏差(n＝5)为3.5％～6.9％，具有较高的灵敏度和令人满意的回收率及重现性，能用于海产品中有机锡的含量测定。
附图说明
图1是本发明在线固相萃取净化-衍生装置和流程示意图。
图2是九种有机锡标准溶液(8μg/L)的总离子流图色谱图。
图中：1.一丁基锡；2.二丁基锡；3.三丁基锡；4.一苯基锡；5.一辛基锡；6.四丁基锡；7.二苯基锡；8.二辛基锡；9.三苯基锡。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的描述。
下面实施例所使用的仪器设备主要有美国Agilent科技有限公司生产的7890B/5977A气相色谱质谱仪和DIONEX公司生产的ASE 150加速溶剂萃取仪。
实施例1
小黄鱼中有机锡检测
(1)样品的采集和制样
将采集的小黄鱼样品，用洁净的铝箔包装并密封于聚乙烯袋子中，然后用便携式冷藏箱运回实验室，去鳞、去皮，沿脊背取肌肉。样品切为不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm，用高速组织捣碎机匀质，匀质后置于冷冻干燥机中干燥12h，取出置于-18℃冷冻保存，待测。
(2)加速溶剂萃取
称取1.00g待测样品，并与8g硅藻土充分混合均匀，再装入10mL萃取池中，池顶部用适量硅藻土填满，以1mol/L醋酸钠溶液：1mol/L醋酸甲醇溶液(1:1，v/v)为萃取剂，进行加速溶剂萃取，提取温度为100℃，压力1000psi，加热时间为5min，静态循环时间为3min，冲洗溶剂体积为60％，静态循环次数为3次，氮气吹扫时间为60s，加速溶剂萃取完成后，萃取液全部进入收集瓶中。
(3)加水定容
在收集的萃取液中，加二次蒸馏水稀释，并用氢氧化钠溶液调节pH至5，最终定容至25mL，得萃取稀释液。
(4)在线固相萃取净化-衍生
如图1所示，通过蠕动泵，将25mL萃取稀释液和浓度为4×10-3mol/L的络合剂二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液泵入反应池充分反应生成络合物，并富集在C60柱上，反应池为150cm长的聚四氟乙烯管线圈，萃取稀释液的进样速度为3mL/min，络合剂二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液的进样速度为0.5mL/min，C60柱为内径3mm、长1.3cm、填充有C60的聚四氟乙烯管，C60的粒径为50～70μm，填充量为100mg，聚四氟乙烯管的两端用玻璃棉密封，C60柱在使用前、后分别依次用1mL正己烷、1mL甲醇活化和清洗，使用周期为6个月；富集完成后切换进样阀A通入空气，以流速为5mL/min的空气流进行脱水，持续30s，同时经进样阀B向1mL进样环内注入洗脱/衍生液，洗脱/衍生液为浓度0.06mol/L四乙基硼化钠的四氢呋喃溶液；脱水后，切换进样阀A和进样阀B，通入空气，在空气流的带动下将洗脱/衍生液注入C60柱，空气流流速为5mL/min，并将富集在C60柱上的络合物洗脱下来，洗脱液收集于气相小瓶后在气相小瓶中完成衍生，衍生时间2～3min，得衍生产物。
(5)浓缩定容
在35℃水浴条件下，将衍生产物吹氮蒸发至干，用正己烷溶解，并定容至200μL，作为上机溶液。
(6)气相色谱-质谱检测
进样针抽取上述上机溶液，按照设定好的气相色谱-质谱检测器条件进行检测，得总离子流图色谱图；色谱条件为：进样口温度为260℃；载气为高纯氦气，流速为1mL/min；进样体积为1μL；进样方式为不分流进样，0.75min后以15mL/min吹扫；传输线温度260℃；气相色谱柱升温程序为：初始温度60℃，保持1.0min，以20℃/min升温至220℃，保持10min，再以15℃/min升温至280℃/min，保持5.0min，总运行时间28min；质谱条件为：电子轰击(EI)离子源，离子源温度230℃，电离能量70eV；溶剂延迟3min；四级杆温度150℃，扫描范围50～450amu，检索谱库NIST.
(7)标准曲线绘制
选择离子监测模式定性：取溶质浓度均为100μg/L的有机锡混合标准使用液2000μL，其中有机锡混合标准使用液中的溶质为一丁基锡、二丁基锡、三丁基锡、一苯基锡、一辛基锡、四丁基锡、二苯基锡、二辛基锡、三苯基锡九种有机锡，有机锡混合标准使用液中的溶剂为pH为5～5.5的甲醇-醋酸-醋酸钠水溶液；在有机锡混合标准使用液中加入7.5mL浓度为1mol/L的醋酸钠溶液和7.5mL浓度为1mol/L的醋酸甲醇溶液，再加二次蒸馏水稀释，并用氢氧化钠溶液调节pH至5，最终定容至25mL，得到浓度为8μg/L标准溶液；取25mL的标准溶液，按上述步骤(4)～(6)进行操作，得到标准溶液的总离子流图色谱图(如图2所示)，并与单个分析物的总离子流图色谱图进行定性离子、定量离子比较，同时结合保留时间，确定九种有机锡的种类；九种有机锡的定性离子、定量离子、保留时间用以作为外标法定量时识别九种有机锡色谱峰识别的依据；九种有机锡的定性离子、定量离子、保留时间如表1所示。
表1九种有机锡的保留时间、定量离子、定性离子
外标法定量：分别取溶质浓度均为100μg/L的有机锡混合标准使用液20、50、250、500、1000、2000μL，其中有机锡混合标准使用液中的溶质为一丁基锡、二丁基锡、三丁基锡、一苯基锡、一辛基锡、四丁基锡、二苯基锡、二辛基锡、三苯基锡九种有机锡，有机锡混合标准使用液中的溶剂为pH为5～5.5的甲醇-醋酸-醋酸钠水溶液；在上述六种有机锡混合标准使用液中分别加入7.5mL浓度为1mol/L的醋酸钠溶液和7.5mL浓度为1mol/L的醋酸甲醇溶液，再加二次蒸馏水稀释，用氢氧化钠溶液调节pH至5，最终定容至25mL，得到六次加标浓度范围均为0.08～8μg/L的标准曲线系列溶液；将六种不同加标浓度的标准曲线系列溶液，根据加入的有机锡浓度和相应的定量离子积分峰面积的对应关系建立标准曲线；标准曲线的线性回归方程、线性范围、相关系数和检出限如表2所示。
表2标准曲线的线性回归方程，线性范围，相关系数和检出限
其中，a：y和x分别代表分析物相应定量离子积分峰面积和分析物在25mLpH为5～5.5的甲醇-醋酸-醋酸钠水溶液中的理论浓度；b：线性范围代表分析物在标准曲线系列溶液中的浓度。
(8)样品测定
将步骤(6)中得到的总离子流色谱图中的有机锡的相应定量峰面积，与上述步骤(7)中得到的标准曲线进行比较，最后通过换算即可得到样品中九种有机锡的实际含量。
使用上述小黄鱼样品，按照(1)步骤的要求处理后，取1.00g，分别加入20μL、200μL的100μg/L有机锡混合标准使用液和200μL的1000μg/L有机锡混合标准使用液，配制成低(2μg/kg)，中(20μg/kg)和高(200μg/kg)三种添加浓度水平的加标样品，涡旋混合均匀，按照上述步骤(2)～(6)的要求分别进行五次平行操作，并与上述步骤(7)得到的标准曲线比较，通过换算最终得到加标小黄鱼样品中九种有机锡的测定浓度；按照下式进行回收率计算：
式中：R——回收率，％；
Cs——加标样品中九种有机锡的测定浓度，μg/kg；
C0——实际样品中九种有机锡的浓度，μg/kg；
C——加标样品中九种有机锡的理论加标浓度，μg/kg；
经检测，小黄鱼样品中九种有机锡均未检出，加标小黄鱼样品中不同加标浓度水平的加标回收实验结果见表3。
表3小黄鱼样品中九种有机锡的背景值、加标回收率和方法的精密度(n＝5)
注：“ND”代表未检出
由表3可知，加标小黄鱼样品回收率为77％～112％，相对标准偏差(n＝5)为3.5％～6.9％，满足分析方法对回收率和重现性要求。
实施例2
南美白对虾中有机锡检测
(1)样品的采集和制样
将采集的南美白对虾样品，用洁净的铝箔包装并密封于聚乙烯袋子中，然后用便携式冷藏箱运回实验室，去头、去壳、去附肢，取肌肉，样品切为不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm，用高速组织捣碎机匀质，匀质后置于冷冻干燥机中干燥18h，取出置于-18℃冷冻保存，待测；
(2)加速溶剂萃取
加速溶剂萃取过程同实施例1，不同之处在于：加速溶剂萃取的提取温度为110℃，压力1200psi，加热时间为5.5min，静态循环时间为4min，冲洗溶剂体积为60％，静态循环次数为3次，氮气吹扫时间为80s，故不在此赘述。
(3)加水定容
在收集的萃取液中，加二次蒸馏水稀释，并用氢氧化钠溶液调节pH至5.5，最终定容至25mL，得萃取稀释液。
(4)在线固相萃取净化-衍生
在线固相萃取净化-衍生过程同实施例1，故不在此赘述。
(5)浓缩定容
在40℃水浴条件下，将衍生产物吹氮蒸发至干，用正己烷溶解，并定容至200μL，作为上机溶液。
(6)气相色谱-质谱检测
气相色谱-质谱检测过程同实施例1完全相同，故不在此赘述。
(7)标准曲线绘制
标准曲线绘制过程、结果同实施例1完全相同，故不在此赘述。
(8)样品测定
将步骤(6)中得到的总离子流色谱图中的有机锡的相应定量峰面积，与上述步骤(7)中得到的标准曲线进行比较，最后通过换算即可得到样品中九种有机锡的实际含量。
使用上述南美白对虾样品，按照步骤(1)的要求处理后，取1.00g，分别加入20μL、200μL的100μg/L有机锡混合标准使用液和200μL的1000μg/L有机锡混合标准使用液，配制成低(2μg/kg)，中(20μg/kg)和高(200μg/kg)三种添加浓度水平的加标样品，涡旋混合均匀，按照上述步骤(2)～(6)的要求分别进行五次平行操作，并与上述步骤(7)得到的标准曲线比较，通过换算最终得到加标南美白对虾样品中九种有机锡的测定浓度；按照下式进行回收率计算：
式中：R——回收率，％；
Cs——加标样品中九种有机锡的测定浓度，μg/kg；
C0——实际样品中九种有机锡的浓度，μg/kg；
C——加标样品中九种有机锡的理论加标浓度，μg/kg；
经检测，南美白对虾样品中九种有机锡均未检出，加标南美白对虾样品中不同加标浓度水平的加标回收实验结果见表4。
表4南美白对虾样品中九种有机锡的背景值、加标回收率和方法的精密度(n＝5)
注：“ND”代表未检出
由表4可知，加标南美白对虾样品回收率为80％～115％，相对标准偏差(n＝5)为3.6％～6.5％，满足分析方法对回收率和重现性要求。
实施例3
牡蛎中有机锡检测
(1)样品的采集和制样
将采集的牡蛎样品，用洁净的铝箔包装并密封于聚乙烯袋子中，然后用便携式冷藏箱运回实验室，去壳，取可食部分。样品切为不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm，用高速组织捣碎机匀质，匀质后置于冷冻干燥机中干燥24h，取出置于-18℃冷冻保存，待测。
(2)加速溶剂萃取
在萃取池底部先加入1g铜粉，铜粉使用前先用稀盐酸处理以除去其表面氧化膜，再用蒸馏水冲洗除去附在其表面的少量酸，最后用丙酮冲洗并在高纯氮气流下吹干，再进行加速溶剂萃取，加速溶剂萃取过程同实施例1，不同之处在于：加速溶剂萃取的提取温度为120℃，压力1500psi，加热时间为6min，静态循环时间为5min，冲洗溶剂体积为60％，静态循环次数为3次，氮气吹扫时间为100s，故不在此赘述。
(3)加水定容
在收集的萃取液中，加二次蒸馏水稀释，并用氢氧化钠溶液调节pH至5，最终定容至25mL，得萃取稀释液。
(4)在线固相萃取净化-衍生
在线固相萃取净化-衍生过程同实施例1，故不在此赘述。
(5)浓缩定容
在40℃水浴条件下，将衍生产物吹氮蒸发至干，用正己烷溶解，并定容至200μL，作为上机溶液。
(6)气相色谱-质谱检测
气相色谱-质谱检测过程同实施例1完全相同，故不在此赘述。
(7)标准曲线绘制
标准曲线绘制过程、结果同实施例1完全相同，故不在此赘述。
(8)样品测定
将步骤(6)中得到的总离子流色谱图中的有机锡的相应定量峰面积，与上述步骤(7)中得到的标准曲线进行比较，最后通过换算即可得到样品中九种有机锡的实际含量。
使用上述牡蛎样品，按照(1)步骤的要求处理后，取1.00g，分别加入20μL、200μL的100μg/L有机锡混合标准使用液和200μL的1000μg/L有机锡混合标准使用液，配制成低(2μg/kg)，中(20μg/kg)和高(200μg/kg)三种添加浓度水平的加标样品，涡旋混合均匀，按照上述步骤(2)～(6)的要求分别进行五次平行操作，并与上述步骤(7)得到的标准曲线比较，通过换算最终得到加标牡蛎样品中九种有机锡的测定浓度；按照下式进行回收率计算：
式中：R——回收率，％；
Cs——加标样品中九种有机锡的测定浓度，μg/kg；
C0——实际样品中九种有机锡的浓度，μg/kg；
C——加标样品中九种有机锡的理论加标浓度，μg/kg；
经检测，牡蛎样品中二丁基锡、三丁基锡、一苯基锡有检出，加标牡蛎样品中不同加标浓度水平的加标回收实验结果见表5。
表5牡蛎样品中九种有机锡的背景值、加标回收率和方法的精密度(n＝5)
注：“ND”代表未检出
由表5可知，加标牡蛎样品回收率为81％～113％，相对标准偏差(n＝5)为3.7％～6.6％，满足分析方法对回收率和重现性要求。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (10)

1.海产品中有机锡的在线固相萃取气相色谱质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品的采集和制样
将海产品样品匀质后冷冻干燥，冷冻保存，待测；
(2)加速溶剂萃取
称取1.00g待测样品，并与8g硅藻土充分混合均匀，再装入10mL萃取池中，池顶部用适量硅藻土填满，以1mol/L醋酸钠溶液：1mol/L醋酸甲醇溶液(1:1，v/v)为萃取剂，进行加速溶剂萃取，加速溶剂萃取完成后，萃取液全部进入收集瓶中；
(3)加水定容
在收集的萃取液中，加二次蒸馏水稀释，并用氢氧化钠溶液调节pH至5～5.5，最终定容至25mL，得萃取稀释液；
(4)在线固相萃取净化-衍生
通过蠕动泵，将25mL萃取稀释液和络合剂二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液泵入反应池充分反应生成络合物，并富集在C60柱上；富集完成后切换进样阀A通入空气，以空气流进行脱水，同时经进样阀B向进样环内注入洗脱/衍生液；脱水后，切换进样阀A和进样阀B，通入空气，在空气流的带动下将洗脱/衍生液注入C60柱，并将富集在C60柱上的络合物洗脱下来，洗脱液收集于气相小瓶后在气相小瓶中完成衍生，得衍生产物；
(5)浓缩定容
在水浴条件下，将衍生产物吹氮蒸发至干，用正己烷溶解，并定容至200μL，作为上机溶液；
(6)气相色谱-质谱检测：
进样针抽取上述上机溶液，按照设定好的气相色谱-质谱检测器条件进行检测，得总离子流图色谱图；
(7)标准曲线绘制
选择离子监测模式定性：取溶质浓度均为100μg/L的有机锡混合标准使用液2000μL，其中有机锡混合标准使用液中的溶质为一丁基锡、二丁基锡、三丁基锡、一苯基锡、一辛基锡、四丁基锡、二苯基锡、二辛基锡、三苯基锡九种有机锡，有机锡混合标准使用液中的溶剂为pH为5～5.5的甲醇-醋酸-醋酸钠水溶液；在有机锡混合标准使用液中加入7.5mL浓度为1mol/L的醋酸钠溶液和7.5mL浓度为1mol/L的醋酸甲醇溶液，再加二次蒸馏水稀释，并用氢氧化钠溶液调节pH至5～5.5，最终定容至25mL，得到浓度为8μg/L标准溶液；取25mL的标准溶液，按上述步骤(4)～(6)进行操作，得到标准溶液的总离子流图色谱图，并与单个分析物的总离子流图色谱图进行定性离子、定量离子比较，同时结合保留时间，确定九种有机锡的种类；九种有机锡的定性离子、定量离子、保留时间用以作为外标法定量时识别九种有机锡色谱峰识别的依据；
外标法定量：分别取溶质浓度均为100μg/L的有机锡混合标准使用液20、50、250、500、1000、2000μL，其中有机锡混合标准使用液中的溶质为一丁基锡、二丁基锡、三丁基锡、一苯基锡、一辛基锡、四丁基锡、二苯基锡、二辛基锡、三苯基锡九种有机锡，有机锡混合标准使用液中的溶剂为pH为5～5.5的甲醇-醋酸-醋酸钠水溶液；在上述六种有机锡混合标准使用液中分别加入7.5mL浓度为1mol/L的醋酸钠溶液和7.5mL浓度为1mol/L的醋酸甲醇溶液，再加二次蒸馏水稀释，用氢氧化钠溶液调节pH至5～5.5，最终定容至25mL，得到六次加标浓度范围均为0.08～8μg/L的标准曲线系列溶液；将六种不同加标浓度的标准曲线系列溶液，根据加入的有机锡浓度和相应的定量离子积分峰面积的对应关系建立标准曲线；
(8)样品测定
将步骤(6)中得到的总离子流色谱图中的有机锡的相应定量峰面积，与上述步骤(7)中得到的标准曲线进行比较，最后通过换算即可得到样品中九种有机锡的实际含量。
2.根据权利要求1所述的海产品中有机锡的在线固相萃取气相色谱质谱检测方法，其特征在于，步骤(1)中，海产品样品匀质后置于冷冻干燥机中干燥12～24h，取出置于-18℃冷冻保存。
3.根据权利要求2所述的海产品中有机锡的在线固相萃取气相色谱质谱检测方法，其特征在于，步骤(2)中，加速溶剂萃取工艺参数为：提取温度为100～120℃，压力1000～1500psi，加热时间为5～6min，静态循环时间为3～5min，冲洗溶剂体积为60％，静态循环次数为2～3次，氮气吹扫时间为60～100s。
4.根据权利要求3所述的海产品中有机锡的在线固相萃取气相色谱质谱检测方法，其特征在于，当样品中含硫化合物的背景干扰时，在装填样品前在萃取池底部加入0.5～1g铜粉脱硫。
5.根据权利要求4所述的海产品中有机锡的在线固相萃取气相色谱质谱检测方法，其特征在于，所述铜粉使用前先用稀盐酸处理以除去其表面氧化膜，再用蒸馏水冲洗除去附在其表面的少量酸，最后用丙酮冲洗并在高纯氮气流下吹干。
6.根据权利要求1所述的海产品中有机锡的在线固相萃取气相色谱质谱检测方法，其特征在于，步骤(4)中，萃取稀释液的进样速度为3mL/min，络合剂二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液浓度为4×10-3mol/L，络合剂二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液的进样速度为0.5mL/min。
7.根据权利要求6所述的海产品中有机锡的在线固相萃取气相色谱质谱检测方法，其特征在于，反应池为150cm长的聚四氟乙烯管线圈，C60柱为内径3mm、长1.3cm、填充有C60的聚四氟乙烯管，C60的粒径为50～70μm，填充量为100mg，聚四氟乙烯管的两端用玻璃棉密封，C60柱在使用前、后分别依次用1mL正己烷、1mL甲醇活化和清洗，使用周期为6个月。
8.根据权利要求7所述的海产品中有机锡的在线固相萃取气相色谱质谱检测方法，其特征在于，脱水时，空气流流速为5mL/min，持续30s。
9.根据权利要求8所述的海产品中有机锡的在线固相萃取气相色谱质谱检测方法，其特征在于，所述洗脱/衍生液为浓度为0.06mol/L四乙基硼化钠的四氢呋喃溶液，进样环为1mL进样环，衍生时间2～3min，洗脱时，空气流流速为5mL/min。
10.根据权利要求1所述的海产品中有机锡的在线固相萃取气相色谱质谱检测方法，其特征在于，步骤(5)中，水浴温度35～40℃。
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