CN102253008B - 一种检测雌激素受体与肽酸酯配体相互作用的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测雌激素受体与肽酸酯配体相互作用的方法，包括将SPR的金属芯片进行特殊处理，再将从鲤鱼肝脏中提取的雌激素受体固定到经过特殊处理的金属芯片上，再进样不同浓度的肽酸酯溶液，得到受体-配体结合曲线。本发明受体与配体的结合特异性好，检出限低，可达10-17g/L，灵敏度为10-8ng/L，操作快捷简便，可用于研究低浓度下配体-受体的相互作用，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于检测受体与配体相互作用领域，特别涉及一种检测雌激素受体与肽酸酯配体相互作用的方法。
背景技术
肽酸酯(PAES)是一类重要的有机化合物，属环境雌激素类物质，其常见的主要有邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DOP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)和邻苯二甲酸丁基苄酯(BBP)。肽酸酯类物质对人类及动物体的肝脏、生殖系统、免疫系统等具有一定的毒性作用，某些条件下对生物体还具有急性毒性作用，有研究发现肽酸酯还具有远期的生物毒理效应。有研究认为，肽酸酯类物质主要是通过与生物体内的雌激素受体发生作用，进而干扰生物体的正常机能。
表面等离子共振SPR是一种物理光学现象。其原理为：当入射光以临界角入射到两种不同透明介质(如镀在玻璃表面的金膜)界面时，可引起金属自由电子的共振，电子吸收光能量从而使反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的入射光角度即为共振角(SPR角)。SPR随金属表面的折射率变化而变化，而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比，因而可通过对生物反应过程中SPR角的动态变化获取生物分子相互作用的特异信号。该技术目前被广泛应用于受体-配体、抗体-抗原、免疫识别等生物分子之间的检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测雌激素受体与肽酸酯配体相互作用的方法，该方法受体与配体的结合特异性好，检出限低，可达10-17g/L，灵敏度为10-8ng/L，操作快捷简便，可用于研究低浓度下配体-受体的相互作用，具有良好的应用前景。
本发明的一种检测雌激素受体与肽酸酯配体相互作用的方法，包括：
(1)将喂养于含肽酸酯的水中的鲤鱼杀死并取出肝脏，用KCl溶液洗去血液，吸干水分，加入与肝脏质量体积比为1g∶4～6ml的HEDG缓冲液匀浆，离心取上清，即得含有受体的细胞溶质；
(2)使用SDS-PAGE电泳对上述含有受体的细胞溶质进行分离分析，浓缩胶中使用80～90V电压，进入分离胶后使用120～130V电压；分离分析结束后将目的蛋白条切碎，装入1mL电洗脱液，置于电泳槽中以120～130V的电压洗脱，离心取上清，即为纯化后的受体蛋白溶液；
(3)用超纯水冲洗金片，将金片放入硫酸/过氧化氢混合液中，静置，随后依次用超纯水、丙酮、超纯水、无水乙醇、超纯水冲洗金片表面，烘干；将金片置于10mmol/L的3-巯基丙酸乙醇溶液中，40℃下孵育30～40min，取出金片用乙醇(80vol％)洗涤，再用超纯水冲洗、吹干；在金片上分别滴加150μl EDC/NHS混合液和150μl 200μg/L的链霉亲和素溶液，分别于室温静置、超纯水冲洗、吹干；
(4)将经上述预处理的金片放到表面等离子共振仪上，通入PBS缓冲液，注入70μl受体，静置反应20min，再用PBS缓冲液冲洗至稳定，再依次进样不同浓度的肽酸酯溶液，得到雌激素受体-肽酸酯配体结合曲线。
所述步骤(1)中的KCl溶液浓度为0.15～0.2mol/L。
所述步骤(2)中的浓缩胶(质量百分比浓度)为5％，分离胶(质量百分比浓度)为12％。
所述步骤(3)中的静置时间为15～20min。
所述步骤(3)中的吹干采用N2吹干。
所述步骤(4)中的肽酸酯溶液浓度分别为1×10-17g/L、1×10-15g/L、1×10-13g/L、1×10-11g/L、1×10-9g/L、1×10-7g/L、1×10-5g/L。
有益效果
本发明受体与配体的结合特异性好，检出限低，可达10-17g/L，灵敏度为10-8ng/L，操作快捷简便，可用于研究低浓度下配体-受体的相互作用，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1的SPR检测雌激素受体-肽酸酯配体相互作用曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一、鲤鱼体内雌激素受体的提取与纯化
1.含雌激素受体的细胞溶质的提取
取驯养于含肽酸酯的水中的鲤鱼肝脏，先用0.15mol/L的KCl溶液将肝脏表面血液清洗干净，再将表面水分吸干，称重，再以质量体积比为1g∶4ml的比例加入HEDG缓冲液进行研磨，获得肝组织匀浆(以上操作均在冰上进行)。匀浆液于15000rmp，4℃下离心1小时，吸取上清，即为含有受体的细胞质溶液。分装于-80℃保存。
2.雌激素受体的分离纯化
使用SDS-PAGE电泳进行分离分析，浓缩胶质量百分比浓度为5％，分离胶质量百分比浓度为12％，浓缩胶中使用80V电压，进入分离胶后使用120V电压；跑胶过程结束后使用考马斯亮蓝法进行染色，后用脱色液脱色，至背景清晰。将目的蛋白条带切下，切碎，装入合适的透析袋中，装入1mL电洗脱液，置于电泳槽中，加入适量电洗脱液，以120V的电压洗脱2小时，然后取上清于10000rmp，4℃下离心15min，取上清，在尿素缓冲液中梯度透析复性，即为纯化后的受体蛋白溶液。
二、SPR特殊芯片的制备
取一镀金芯片，用超纯水冲洗金膜，将金膜放入硫酸/过氧化氢Piranha混合液中，静置15min，随后用超纯水-丙酮-超纯水-无水乙醇-超纯水冲洗金膜表面，烘干；将金片置于10mmol/L的3-巯基丙酸乙醇溶液中，40℃下孵育30min，取出金片用80vol％乙醇洗涤，再用超纯水冲洗，N2吹干；将金片置于培养皿中，在金片正中间滴加150μl EDC/NHS混合液，室温静置15min，超纯水冲洗，N2吹干；重新将金片置于培养皿中，在金膜正中间滴加150μl200μg/L的SA(链霉亲和素)溶液，室温静置15min，超纯水冲洗，N2吹干。
三、表面等离子共振检测雌激素受体与肽酸酯配体的相互作用
将处理好的金片放到表面等离子共振仪上，通PBS缓冲液，使其注满整个流通池，待基线平稳后，注入70μl雌激素受体，静置反应20min，再通入PBS缓冲液冲洗未结合上的受体，稳定后再依次进样不同浓度的DBP，其浓度分别为1×10-5g/L、1×10-7g/L、1×10-9g/L、1×10-11g/L、1×10-13g/L、1×10-15g/L、1×10-17g/L，得到雌激素受体-肽酸酯配体结合曲线。由图1可见，当雌激素受体结合到芯片上后，SPR的响应强度显著增大，让其反应约20min，然后继续用PBS缓冲液冲洗，将多余的未结合上的受体洗脱，待稳定后开始进样DBP溶液，浓度由低到高，由图中曲线可见，当配体与受体结合后SPR响应强度随之增大，且随着DBP溶液浓度的增大而增大，当受体上的结合位点基本上都与配体结合后，增大趋势便开始减弱，至基本饱和，然后继续用PBS缓冲液将多余的DBP冲洗掉，此时，SPR的响应强度基本稳定，可见雌激素受体与肽酸酯配体已稳定地结合。
实施例2
四、鲤鱼体内雌激素受体的提取与纯化
3.含雌激素受体的细胞溶质的提取
取驯养于含肽酸酯的水中的鲤鱼肝脏，先用0.2mol/L的KCl溶液将肝脏表面血液清洗干净，再将表面水分吸干，称重，再以质量体积比为1g∶6ml的比例加入HEDG缓冲液进行研磨，获得肝组织匀浆(以上操作均在冰上进行)。匀浆液于15000rmp，4℃下离心1小时，吸取上清，即为含有受体的细胞质溶液。分装于-80℃保存。
4.雌激素受体的分离纯化
使用SDS-PAGE电泳进行分离分析，浓缩胶质量百分比浓度为5％，分离胶质量百分比浓度为12％，浓缩胶中使用90V电压，进入分离胶后使用130V电压；跑胶过程结束后使用考马斯亮蓝法进行染色，后用脱色液脱色，至背景清晰。将目的蛋白条带切下，切碎，装入合适的透析袋中，装入1mL电洗脱液，置于电泳槽中，加入适量电洗脱液，以130V的电压洗脱2小时，然后取上清于10000rmp，4℃下离心15min，取上清，在尿素缓冲液中梯度透析复性，即为纯化后的受体蛋白溶液。
五、SPR特殊芯片的制备
取一镀金芯片，用超纯水冲洗金膜，将金膜放入硫酸/过氧化氢Piranha混合液中，静置20min，随后用超纯水-丙酮-超纯水-无水乙醇-超纯水冲洗金膜表面，烘干；将金片置于15mmol/L的3-巯基丙酸乙醇溶液中，40℃下孵育40min，取出金片用80vol％乙醇洗涤，再用超纯水冲洗，N2吹干；将金片置于培养皿中，在金片正中间滴加150μlEDC/NHS混合液，室温静置20min，超纯水冲洗，N2吹干；重新将金片置于培养皿中，在金膜正中间滴加150μl200μg/L的SA(链霉亲和素)溶液，室温静置20min，超纯水冲洗，N2吹干。
六、表面等离子共振检测雌激素受体与肽酸酯配体的相互作用
将处理好的金片放到表面等离子共振仪上，通PBS缓冲液，使其注满整个流通池，待基线平稳后，注入70μl雌激素受体，静置反应20min，再通入PBS缓冲液冲洗未结合上的受体，稳定后再依次进样不同浓度的DBP，其浓度分别为1×10-5g/L、1×10-7g/L、1×10-9g/L、1×10-11g/L、1×10-13g/L、1×10-15g/L、1×10-17g/L，得到雌激素受体-肽酸酯配体结合曲线。
Claims (6)
1.一种检测雌激素受体与肽酸酯配体相互作用的方法，包括：
（1）将喂养于含肽酸酯的水中的鲤鱼杀死并取出肝脏，用KCl溶液洗去血液，吸干水分，加入与肝脏质量体积比为1g:4~6ml的HEDG缓冲液匀浆，离心取上清，即得含有受体的细胞溶质；
（2）使用SDS-PAGE电泳对上述含有受体的细胞溶质进行分离分析，浓缩胶中使用80~90V电压，进入分离胶后使用120~130V电压；分离分析结束后将目的蛋白条切碎，装入1mL电洗脱液，置于电泳槽中以120~130V的电压洗脱，离心取上清，即为纯化后的受体蛋白溶液；
（3）用超纯水冲洗金片，将金片放入硫酸/过氧化氢混合液中，静置，随后依次用超纯水、丙酮、超纯水、无水乙醇、超纯水冲洗金片表面，烘干；将金片置于10~15mmol/L的3-巯基丙酸乙醇溶液中，40℃下孵育30~40min，取出金片用乙醇洗涤，再用超纯水冲洗、吹干；在金片上滴加150μl EDC/NHS混合液，于室温静置、超纯水冲洗、吹干；然后再在金片上滴加150μl 200μg/L的链霉亲和素溶液，于室温静置、超纯水冲洗、吹干；
（4）将经上述预处理的金片放到表面等离子共振仪上，通入PBS缓冲液，注入70μl受体，静置反应20min，再用PBS缓冲液冲洗至稳定，再依次进样不同浓度的肽酸酯溶液，得到雌激素受体-肽酸酯配体结合曲线。
2.根据权利要求1所述的一种检测雌激素受体与肽酸酯配体相互作用的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的KCl溶液浓度为0.15~0.2mol/L。
3.根据权利要求1所述的一种检测雌激素受体与肽酸酯配体相互作用的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%。
4.根据权利要求1所述的一种检测雌激素受体与肽酸酯配体相互作用的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的静置时间为15~20min。
5.根据权利要求1所述的一种检测雌激素受体与肽酸酯配体相互作用的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的吹干采用N2吹干。
6.根据权利要求1所述的一种检测雌激素受体与肽酸酯配体相互作用的方法，其特征在于：所述步骤（4）中的肽酸酯溶液浓度分别为1×10-17g/L、1×10-15g/L、1×10-13g/L、1×10-11g/L、1×10-9g/L、1×10-7g/L、1×10-5g/L。
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