CN103336122B - 一种血小板抗体检测的免疫荧光层析试纸条及检测方法 - Google Patents
一种血小板抗体检测的免疫荧光层析试纸条及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种血小板抗体检测的免疫荧光层析试纸条及检测方法，包括反应膜、样品垫、吸收垫和底板，反应膜位于底板上，反应膜上固定有检测带和质控带，样品垫与反应膜的一侧部分重叠并位于反应膜和底板上，吸收垫与反应膜的另一侧部分重叠并位于反应膜和底板上，样品垫的两侧各设置有一个加样点，滴加样本和荧光标记二抗并洗涤，反应后通过荧光素标记二抗指示反应结果。通过上述方式，本发明提供的一种血小板抗体检测的免疫荧光层析试纸条及检测方法，检测过程简单、高效、准确、价廉且实用，可实现半定量或定量检测，保障临床安全、有效、科学的血小板输血，同时还可节约宝贵的血小板资源。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验领域，特别是涉及一种血小板抗体检测的免疫荧光层析试纸条及检测方法。
背景技术
血小板表面具有复杂的血型抗原，包括ABO抗原、HLA-I抗原及HPA抗原（存在于血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa，GPⅠa/Ⅱa，GPⅠb/Ⅸ上），这些抗原均可以刺激机体产生相应抗体并引起相关免疫性疾病。
临床上很多以血小板减少和出血为主要症状的疾病是由于血小板抗体引起，纠正血小板减少症状又常常是选择疾病治疗方案的直接要求。临床上最为常见的血小板减少性疾病有：血小板输注无效症、胎母血型不相容性血小板减少症、原发性自身免疫性血小板减少症、继发性血小板减少症、药物型免疫性血小板减少症，以及很多其它种类如白血病等疾病。要准确、高效率、及时地诊断和治疗血小板相关免疫性疾病，理论上都必须进行血小板抗原抗体检测，但是现实状况是，国内外极少数医疗单位能够临床常规地开展血小板抗原抗体检验项目，其直接原因就是缺少简单、高效、准确、价廉，以及实用的血小板抗原抗体检测免疫学试验技术。
血小板输血是目前血小板减少症和多种疾病的最主要治疗手段之一。大量研究结果表明，患者输注血小板前进行交叉配型以筛选相容性的血小板进行输注，输血有效率大于70％，而仅ABO血型相同的随机输注血小板有效率低于30％。这不仅仅浪费了宝贵的血液，而且不相容血小板使病人体内生成血小板抗体，导致免疫反应，造成输血无效，病人也几乎无例外地病情加重。目前在我国，以及在世界上绝大多数国家，临床上最为普遍是随机血小板输血，病人发生血小板输血无效症后不进行血型抗体检测和交叉配血。在英国、法国和美国等少数发达国家，应用昂贵的试验程序繁杂的HLA和血小板基因检测技术对病人HLA-I基因和血小板血型即HPA基因全系列谱抗原基因定型，选择合适血型的献血员，之后再对少数病人应用单克隆抗体固着血小板抗原分析技术（Themonoclonalantibodyimmobilizationofplateletantigenassay,MAIPA），或红细胞免疫吸附试验（solid-phaseredcelladherence,SPRCA）进行抗体检测和交叉配血。但前者实验程序繁杂，又容易漏检，后者对实验操作人员技术要求高，结果有时难以判定。
在我国，至今没有建立血小板献血员库，因此近年内我国很难开展血型基因型相容性血小板输血。MAIPA技术本身并不适合应用于常规的血型抗体检测。国外企业的SPRCA试剂价格极为昂贵，国产试剂的质量和供应没有得到保证。同时MAIPA和SPRCA只能做到定性检测，不能做到定量检测。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种血小板抗体检测的免疫荧光层析试纸条及检测方法，该方法简单、高效、准确、价廉且实用。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种血小板抗体检测的免疫荧光层析试纸条，包括反应膜、样品垫、吸收垫和底板，所述反应膜位于所述底板上，所述反应膜上固定有检测带和质控带，所述样品垫与所述反应膜的一侧部分重叠并位于所述反应膜和所述底板上，所述吸收垫与所述反应膜的另一侧部分重叠并位于所述反应膜和所述底板上，所述样品垫上包括第一加样点和第二加样点，所述第一加样点设置在远离所述样品垫与所述反应膜重叠的一侧，所述第二加样点设置在接近所述样品垫与所述反应膜重叠的一侧。
在本发明一个较佳实施例中，所述检测带为至少一条，所述检测带上固定有抗人血小板糖蛋白单克隆抗体，所述抗人血小板糖蛋白单克隆抗体为特异性针对HLAⅠ、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠa/Ⅱa、GPⅠb/Ⅸ、GPⅣ中的一种或多种抗体。
在本发明一个较佳实施例中，所述质控带为一条，所述质控带上固定有人IgG，所述反应膜的材料为硝酸纤维膜，醋酸纤维膜，尼龙膜或聚四氟乙烯膜。
在本发明一个较佳实施例中，试纸条用于血小板抗体筛检和抗体鉴定的检测方法，包括步骤为：
（1）将血小板用Tris-HCl缓冲液裂解为可溶性抗原并加入到所述第二加样点处中，将洗涤液加入到第一加样点处洗涤；
（2）将待检测样本加入到所述第二加样点处中，将洗涤液加入到第一加样点处洗涤；
（3）将用荧光素标记的二抗加入到所述第二加样点处中，将洗涤液加入到第一加样点处洗涤；
（4）将所述试纸条置于荧光检测仪中检测。
在本发明一个较佳实施例中，试纸条用于血小板交叉配型的检测方法，包括步骤为：
（1）提取献血员的血小板并与患者的样本反应得到复合物；
（2）将所述复合物用Tris-HCl缓冲液裂解为可溶性抗原并加入到所述第二加样点处中，将洗涤液加入到第一加样点处洗涤；
（3）将用荧光素标记的二抗加入到所述第二加样点处中，将洗涤液加入到第一加样点处洗涤；
（4）将所述试纸条置于荧光检测仪中检测。
在本发明一个较佳实施例中，所述洗涤液是含有体积分数为0.5%的Tween-20且pH值为7.2的0.15M磷酸盐缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.4且含有体积分数为0.5%的TritonX-100。
在本发明一个较佳实施例中，所述荧光素为花青素Cy系列荧光素或AlexaFluor系列荧光素。
在本发明一个较佳实施例中，所述二抗为羊抗人IgG、兔抗人IgG或鸡抗人IgG。
本发明的有益效果是：本发明的血小板抗体检测的免疫荧光层析试纸条及检测方法，免疫荧光层析技术操作快速简便，结合检测仪器可实现半定量或定量检测，检测过程简单、高效、准确、价廉且实用，不容易漏检，对操作人员技术要求不高，能辅助临床血小板相关免疫性疾病的诊断，以及进行输血前相容性实验检测，减少血小板输注无效症的发生及其引起的出血及死亡病例，保障临床安全、有效、科学的血小板输血，同时还可节约宝贵的血小板资源。
附图说明
图1是本发明血小板抗体检测的免疫荧光层析试纸条一较佳实施例的结构示意图；
附图中各部件的标记如下：1、反应膜，2、样品垫，3、吸收垫，4、底板，5、检测带，6、质控带，7、第一加样点，8、第二加样点。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例一：
请参阅图1，提供一种血小板抗体检测的免疫荧光层析试纸条，包括反应膜1、样品垫2、吸收垫3和底板4，所述反应膜1位于所述底板4上，所述反应膜1上固定有检测带5和质控带6，所述样品垫2与所述反应膜1的一侧部分重叠并位于所述反应膜1和所述底板4上，所述吸收垫3与所述反应膜1的另一侧部分重叠并位于所述反应膜1和所述底板4上，所述样品垫2上包括第一加样点7和第二加样点8，所述第一加样点7设置在远离所述样品垫2与所述反应膜1重叠的一侧，所述第二加样点8设置在接近所述样品垫2与所述反应膜1重叠的一侧。
实施例二：
提供一种实施例一所述试纸条用于血小板抗体筛检的方法：
（1）试纸条的制备
1）反应膜的制备
选取MilliporeHF180带背衬膜作为反应膜，将其裁成30×1.8cm大小备用。用0.01M的pH为7.2磷酸盐缓冲液将人IgG的浓度调节为0.5mg/ml，加入体积分数为1%的Tween-20，使用划膜仪将其喷于NC膜表面作为质控线，划膜量为0.5μl/cm。将特异性针对HLAⅠ、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠa/Ⅱa、GPⅠb/Ⅸ、GPⅣ的单克隆抗体混合后，用0.01M的pH为7.2磷酸盐缓冲液即PBS调节其浓度为0.5mg/ml，加入体积分数为1%的Tween-20，使用划膜仪将其喷于NC膜表面作为检测线。每条线间隔为5mm。划膜结束后立即放入37℃烘箱中干燥过夜，室温保存备用。
2）试纸条的组装
选取国产优质玻璃纤维膜BT100作为样品垫材料，将其剪成30×1.8cm大小备用。选取国产优质吸水纸CH37K，并将其剪裁成30×1.8cm大小备用。在规格为30×6cm的PVC底板上先黏贴反应膜，再将样本垫与吸水纸采取搭接的方法黏贴于底板上，搭接的长度为0.5mm，以便于反应液的扩散。组装好后，将其切成4mm宽的试纸条，并封装于塑料外壳中，放于铝箔袋中，4℃下密封保存。
3）荧光反应液的制备
将抗人IgG抗体溶液用磷酸盐缓冲液调节其浓度为2mg/ml，pH为7.5至8.0。取1ml抗体溶液，缓慢加入100μl浓度为1mg/ml的cy5荧光染料，在4℃下缓慢搅拌3h后再室温反应1h，再用pH为7.4的磷酸盐缓冲液进行透析，去除未反应的cy5染料。透析液完成后回收偶联好的荧光抗体，测定偶联效率与抗体浓度后，在4℃下避光保存。
（2）血小板抗原的制备
1）提取血小板
采集3人份O型新鲜EDTA抗凝全血，转速设定为900rpm的条件下离心10min，取上层富血小板血浆即PRP。将该富血小板血浆在转速为3800rpm下离心5min，弃上层清液，取压积血小板用含有质量浓度为0.5%的EDTA且pH为7.2的PBS洗涤3次，最后一次洗涤后弃去上清，并用管壁上残留液体浮压积血小板。
2）制备血小板抗原
加入10倍体积裂解液，所述裂解液中含有pH为7.4的Tris-HCl缓冲液和体积分数为0.5%的TritonX-100，混匀后4℃孵育30min，再在4℃、转速为10000rpm条件下离心5min后取上层清液备用。
（3）检测步骤
1）将试纸条和荧光反应液平衡至室温即18-25℃；
2）加入2μl血小板裂解液至样品垫中。
3）加入15μl含有体积分数为0.5%的Tween-20的pH为7.2的0.15MPBS至样品垫中。
4）重复一次步骤3）。
5）加入5μl待检样本至样品垫中。
6）重复步骤3）三次。
7）加入5μlcy5-抗人IgG至样品垫中。
8）重复步骤3）三次。
9）将试纸条置于荧光信号读取仪器中，读取荧光信号进行测定。
实施例三：
提供一种实施例一所述试纸条用于血小板抗体特异性鉴定的方法：
（1）试纸条的制备
1）反应膜的制备
选取MilliporeHF180带背衬膜作为反应膜，将其裁成30×1.8cm大小备用。用0.01M的pH为7.2磷酸盐缓冲液将人IgG的浓度调节为0.5mg/ml，加入体积分数为1%的Tween-20，使用划膜仪将其喷于NC膜表面作为质控线，划膜量为0.5μl/cm。将特异性针对HLAⅠ、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠa/Ⅱa、GPⅠb/Ⅸ、GPⅣ的单克隆抗体，分别用pH为7.2的0.01MPBS调节其浓度为0.5mg/ml，加入体积分数为1%的Tween-20，使用划膜仪将其喷于NC膜表面作为检测线，每条线间隔为5mm，即每张NC膜表面固定不同特异性的单克隆抗体。划膜结束后立即放入37℃烘箱中干燥过夜，室温保存备用。
2）试纸条的组装
选取国产优质玻璃纤维膜BT100作为样品垫材料，将其剪成30×1.8cm大小备用。选取国产优质吸水纸CH37K，并将其剪裁成30×1.8cm大小备用。在规格为30×6cm的PVC底板上先黏贴反应膜，再将样本垫与吸水纸采取搭接的方法黏贴于底板上，搭接的长度为0.5mm，以便于反应液的扩散。组装好后，将其切成4mm宽的试纸条，并封装于塑料外壳中，放于铝箔袋中，4℃下密封保存。
3）荧光反应液的制备
将抗人IgG抗体溶液用PBS调节其浓度为2mg/ml，pH为7.5至8.0。取1ml抗体溶液，缓慢加入100μl浓度为1mg/ml的cy5荧光染料，在4℃下缓慢搅拌3h后再室温反应1h，再用pH为7.4的磷酸盐缓冲液进行透析，去除未反应的cy5染料。透析液完成后回收偶联好的荧光抗体，测定偶联效率与抗体浓度后，在4℃下避光保存。
（2）血小板抗原的制备
1）提取血小板
采集3人份O型新鲜EDTA抗凝全血，转速设定为900rpm的条件下离心10min，取上层富血小板血浆即PRP。将该富血小板血浆在转速为3800rpm下离心5min，弃上层清液，取压积血小板用含有质量浓度为0.5%的EDTA且pH为7.2的PBS洗涤3次，最后一次洗涤后弃去上清，并用管壁上残留液体浮压积血小板。
2）制备血小板抗原
加入10倍体积裂解液，所述裂解液中含有pH为7.4的Tris-HCl缓冲液和体积分数为0.5%的TritonX-100，混匀后4℃孵育30min，再在4℃、转速为10000rpm条件下离心5min后取上层清液备用。
（3）检测步骤
1）取出固定不同特异性抗血小板单克隆抗体的试纸条，并将其和荧光反应液平衡至室温即18-25℃；
2）加入2μl血小板裂解液至样品垫中。
3）加入15μl含有体积分数为0.5%Tween-20的pH为7.2的0.15MPBS至样品垫中。
4）重复一次步骤3）。
5）加入5μl待检样本至样品垫中。
6）重复步骤3）三次。
7）加入5μlcy5-抗人IgG至样品垫中。
8）重复步骤3）三次。
9）将试纸条置于荧光信号读取仪器中，读取荧光信号进行测定。
实施例四：
提供一种实施例一所述试纸条用于血小板交叉配型的方法：
（1）试纸条的制备
1）反应膜的制备
选取MilliporeHF180带背衬膜作为反应膜，将其裁成30×1.8cm大小备用。用0.01M的pH为7.2磷酸盐缓冲液将人IgG的浓度调节为0.5mg/ml，加入体积分数为1%的Tween-20，使用划膜仪将其喷于NC膜表面作为质控线，划膜量为0.5μl/cm。将特异性针对HLAⅠ、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠa/Ⅱa、GPⅠb/Ⅸ、GPⅣ的单克隆抗体混合后，用0.01M的pH为7.2PBS调节其浓度为0.5mg/ml，加入体积分数为1%Tween-20，使用划膜仪将其喷于NC膜表面作为检测线，每条线间隔为5mm。划膜结束后立即放入37℃烘箱中干燥过夜，室温保存备用。
2）试纸条的组装
选取国产优质玻璃纤维膜BT100作为样品垫材料，将其剪成30×1.8cm大小备用。选取国产优质吸水纸CH37K，并将其剪裁成30×1.8cm大小备用。在规格为30×6cm的PVC底板上先黏贴反应膜，再将样本垫与吸水纸采取搭接的方法黏贴于底板上，搭接的长度为0.5mm，以便于反应液的扩散。组装好后，将其切成4mm宽的试纸条，并封装于塑料外壳中，放于铝箔袋中，4℃下密封保存。
3）荧光反应液的制备
将抗人IgG抗体溶液用PBS调节其浓度为2mg/ml，pH为7.5至8.0。取1ml抗体溶液，缓慢加入100μl浓度为1mg/ml的cy5荧光染料，在4℃下缓慢搅拌3h后再室温反应1h，再用pH为7.4的PBS进行透析，去除未反应的cy5染料。透析液完成后回收偶联好的荧光抗体，测定偶联效率与抗体浓度后，在4℃下避光保存。
（2）检测步骤
1）将试纸条和荧光反应液平衡至室温即18-25℃；
2）献血员血小板悬液的制备。分别采集献血员新鲜EDTA抗凝全血，转速设定为900rpm进行离心10min，取上层富血小板血浆即PRP。将该富血小板血浆在转速为3800rpm下离心5min，弃上层清液，取压积血小板用含有质量浓度为0.5%的EDTA且pH为7.2的PBS洗涤3次，最后用PBS/EDTA缓冲液悬浮血小板至浓度约为200×109/L。
3）分别取50μl上述献血员血小板悬液于试管中，各加入50μl患者样本，混匀后37℃孵育30min。用PBS/EDTA缓冲液洗涤血小板3次，最后一次洗涤后弃去上层清液，并用管壁上残留液体浮压积血小板。
4）加入10倍体积裂解液，所述裂解液中含有pH为7.4的Tris-HCl缓冲液和体积分数为0.5%的TritonX-100，混匀后4℃孵育30min，再在4℃、转速为10000rpm条件下离心5min后取上层清液备用。
5）加入2μl血小板裂解液至样品垫中。
6）加入15μl含有体积分数为0.5%Tween-20的pH为7.2的0.15MPBS至样品垫中。
7）重复步骤6）一次。
8）加入5μlcy5-抗人IgG至样品垫中。
9）重复步骤6）三次。
10）将试纸条置于荧光信号读取仪器中，读取荧光信号进行测定。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (7)
1.一种血小板抗体检测的免疫荧光层析试纸条，其特征在于，包括反应膜、样品垫、吸收垫和底板，所述反应膜位于所述底板上，所述反应膜上固定有检测带和质控带，所述样品垫与所述反应膜的一侧部分重叠并位于所述反应膜和所述底板上，所述吸收垫与所述反应膜的另一侧部分重叠并位于所述反应膜和所述底板上，所述样品垫上包括第一加样点和第二加样点，所述第一加样点设置在远离所述样品垫与所述反应膜重叠的一侧，所述第二加样点设置在接近所述样品垫与所述反应膜重叠的一侧，其中所述检测带为至少一条，所述检测带上固定有抗人血小板糖蛋白单克隆抗体，所述抗人血小板糖蛋白单克隆抗体为特异性针对HLAⅠ、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠa/Ⅱa、GPⅠb/Ⅸ、GPⅣ中的一种或多种抗体。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述质控带为一条，所述质控带上固定有人IgG，所述反应膜的材料为硝酸纤维膜，醋酸纤维膜，尼龙膜或聚四氟乙烯膜。
3.根据权利要求1所述的试纸条用于血小板抗体筛检和抗体鉴定的检测方法，其特征在于，包括步骤为：
（1）将血小板用Tris-HCl缓冲液裂解为可溶性抗原并加入到所述第二加样点处中，将洗涤液加入到第一加样点处洗涤；
（2）将待检测样本加入到所述第二加样点处中，将洗涤液加入到第一加样点处洗涤；
（3）将用荧光素标记的二抗加入到所述第二加样点处中，将洗涤液加入到第一加样点处洗涤；
（4）将所述试纸条置于荧光检测仪中检测。
4.根据权利要求1所述的试纸条用于血小板交叉配型的检测方法，其特征在于，包括步骤为：
（1）提取献血员的血小板并与患者的样本反应得到复合物；
（2）将所述复合物用Tris-HCl缓冲液裂解为可溶性抗原并加入到所述第二加样点处中，将洗涤液加入到第一加样点处洗涤；
（3）将用荧光素标记的二抗加入到所述第二加样点处中，将洗涤液加入到第一加样点处洗涤；
（4）将所述试纸条置于荧光检测仪中检测。
5.根据权利要求3或4所述的试纸条的检测方法，其特征在于，所述洗涤液是含有体积分数为0.5%的Tween-20且pH值为7.2的0.15M磷酸盐缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.4且含有体积分数为0.5%的TritonX-100。
6.根据权利要求3或4所述的试纸条的检测方法，其特征在于，所述荧光素为花青素Cy系列荧光素或AlexaFluor系列荧光素。
7.根据权利要求3或4所述的试纸条的检测方法，其特征在于，所述二抗为羊抗人IgG、兔抗人IgG或鸡抗人IgG。
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