CN101373187A - 一种同时筛查多种重大传染病的免疫层析试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种通过单次实验即可实现艾滋、乙肝、丙肝、梅毒这四种重大传染病中的三到四项同时筛查的免疫层析试剂盒。将胶体金的颗粒直径从普通的20～40nm提高到80～90nm，因此提高了金颗粒的灵敏度。包被方式为每个检测项目分开，例如，所有检测项目在同一NC膜上分开划线，最后在同一个试纸条组装。或者，包被方式为每个检测项目分开，例如，每个检测项目分开在不同的NC膜上划线，每个项目分开布局组装。再者，所有检测项目的包被抗原/抗体混合，然后划线，检测线只有一条。可应用于体检、献血、输血、手术前的筛查等方面，可以节省检测时间，提高效率，并且可以提早检测HIV P24抗原，缩短HIV检测的窗口期。

Description

一种同时筛查多种重大传染病的免疫层析试剂盒

技术领域

本发明涉及一种免疫层析试剂盒，具体地说，是涉及一种通过单次实验即可实现艾滋、乙肝、丙肝、梅毒这四种重大传染病中的三到四项同时筛查的免疫层析试剂盒。

背景技术

由于传染病的蔓延，在体检、献血、输血、手术前对传染病检测是必需的。目前传染最广泛，危害最大的几种传染病有艾滋、乙肝、丙肝、梅毒。乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒(HCV)抗体(anti-HCV)、艾滋病毒(HIV)抗体(anti-HIV)和P24抗原(HIV P24Ag)、梅毒螺旋体(TP)抗体(anti-TP)即HBV、HCV、HIV、TP检测，是目前传染病筛查的主要项目。

目前，检测以上传染病最常用的方法是免疫检测，此方法以抗原-抗体的特异性识别为基础，包括传统的酶联免疫吸附试验(ELISA)和近来兴起的胶体法两种。胶体法分为免疫层析和免疫渗滤两种方式，其中以免疫层析法最为方便、快捷。

我国有40％左右的人感染过HBV，其中约有10％的人携带HBsAg，快速准确地检测和普查HBsAg，对于乙型肝炎的预防、诊断和治疗，具有极大的实用价值，HBsAg检测一般采用的是双抗体夹心法检测。

丙型肝炎是波及全球的传染病，在输血后的肝炎中，80-90％是丙型肝炎，在散发的非甲非乙肝炎中有50％以上是丙型肝炎，在肝炎的慢性化和肝硬化的发病过程中起着重要作用。间接法检测HCV抗体(anti-HCV)是目前丙型肝炎筛查的主要方式。

目前免疫检测HIV的主流方式是双抗原夹心法检测HIV抗体(anti-HIV)，属于HIV第三代检测方法。正在逐步发展的是第四代检测方法，它在第三代检测方法的基础上加入了HIV P24抗原检测(双抗体夹心法)，可以缩短检测的窗口期。

梅毒是一种传播广泛的性病，免疫学检测梅毒主要采用的方式是双抗原夹心法检测TP抗体(anti-TP)。

免疫层析法是上世纪九十年代兴起的一种基于免疫胶体金技术的快速诊断技术，其原理是将特异的抗体/抗原先固定于硝酸纤维膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素膜加样端浸入样品后，由于毛细管作用，样品沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体/抗原的区域时，样品中相应的抗原/抗体即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。

公开号为CN1409111A的中国专利文献中曾提出一种“一种能同时检测多种与疾病有关的抗原、抗体的装置”，该装置可以联合检测几种传染病，但是它采用的检测手段是免疫渗滤法，操作步骤多，检测时间长，不够方便、快捷。公开号为CN1373365A的中国专利文献中曾提出一种“血库采血传染病检测蛋白质芯片”，该芯片可以联合检测HBV、HCV、HIV、TP这四个项目，但是它的操作步骤多，检测时间长，不够方便、快捷，另外该方法没有考虑到HIV P24 Ag的检测，致使检测的窗口期较长，在检测刚感染不久的病毒携带者血清时，由于此时anti-HIV还未产生，容易导致检测的假阴性。

公开号为CN1140090A的中国专利文献中曾提出一种“人类免疫缺陷病毒丙肝病毒抗体联合诊断试剂的制备方法”，它可以联合检测HIV和HCV两种传染病，但采用的是ELISA法，操作时间长，达不到快速诊断的要求。

公开号为CN1305109A的中国专利文献中曾提出一种“对艾滋病与丙型肝炎病毒抗体的联合快速检测方法”，此专利虽然可以联合检测HIV和HCV，但是采用的原理是间接法，比夹心法的特异性差。

公开号为CN1627073A的中国专利文献中曾提出一种“梅毒抗体与乙型肝炎表面抗原胶体金法联合检测试剂”，该试剂可以联合快速检测TP和HBV，但是未顾及到HIV和HCV。另外，这种联检方式存在的缺陷就是：为了保证试剂盒的特异性，就不能把胶体金用量调高，但是由于要同时检测两个项目，所以HIV和HCV各占一半的胶体金，这样导致的结果是，每个项目的灵敏度比单独检测时低一半，在实际应用时，会存在灵敏度偏低的问题。目前，还没有能够同时同时筛查HBV、HCV、HIV、TP这四种传染病的免疫层析试剂盒问世，其主要原因在于：还没有解决几个项目联合检测时，灵敏度不如单独检测的难题。因此，在体检、献血、输血、手术前以及家体自检等筛查时，需要多项分开检测，不够方便、快捷，从而导致检测时间长，效率低，成本高，浪费人力物力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过单次实验即可实现艾滋、乙肝、丙肝、梅毒的三到四项重大传染病同时筛查的免疫层析试剂盒，具有方便、快捷的优势，可以节省检测时间，提高效率，降低成本，节约人力物力，可以提早检测HIV P24抗体，缩短HIV感染的窗口期。

本发明还提供一种通过单次实验即可实现anti-HCV、anti-HIV/HIVP24Ag、anti-TP或者HBsAg、anti-HIV/HIV P24 Ag、anti-TP或者HBsAg、anti-HCV、anti-TP或者HB sAg、anti-HCV、anti-HIV/HIV P24 Ag同时筛查的免疫层析试剂盒。

本发明还提供一种通过单次实验即可实现HBsAg、anti-HCV、anti-HIV/HIV P24 Ag、anti-TP四项同时筛查的免疫层析试剂盒。

为了解决上面所说的多项目同时检测时，灵敏度比不上单项检测的问题，本发明采用了改进的胶体金制备技术，将胶体金的颗粒大小从普通的20～40nm提高到80～90nm，从而保证了检测的灵敏度。

本发明试剂盒的制备、检测方案如下：

(1)包被：在固相载体上包被预先稀释成工作浓度的针对HBsAg单克隆抗体、HCV抗原、HIV抗原和HIV P24单克隆抗体、TP抗原中的三到四项，以及质控线抗体。

(2)标记：将HBsAg单克隆抗体、HCV抗原、HIV抗原和HIV P24标记抗体、TP抗原中的三到四项与标记物标记之后，分别与标记好的对照线抗体以合适比例混合，浸泡玻璃纤维，干燥。

(3)组装：PVC胶板，把包被好的NC膜，和玻璃纤维以及其它辅助材料，按照免疫层析试剂盒的一般组装方法进行组装，用切条机切成试纸条。

(4)检测：加入待测标本，判定结果。

本发明的优选方案：

本发明所用的免疫层析固相载体，优选硝酸纤维素滤膜(NC膜)。本发明的HIV检测，优选为HIV第四代检测法，是基于anti-HIV检测加上P24抗原检测。本发明的HCV抗原、HIV抗原、TP抗原，优选为基因工程重组抗原。本发明的针对HBsAg和HIV P24 Ag单克隆抗体，优选为鼠抗HBsAg和P24抗原单克隆抗体。在本发明的一个优选方案中，包被方式为每个检测项目分开，例如，所有检测项目在同一NC膜上分开划线，最后在一个试纸条组装。在本发明的另一个优选方案中，包被方式为每个检测项目分开，例如，每个检测项目分开在不同的NC膜上划线，每个项目分开布局组装。在再一个优选方案中，所有检测项目的包被抗原/抗体混合，然后划线，检测线只有一条。

本发明所用的标记物，包括胶体金属、分散型染料和染料标记的微球、乳胶，进一步优选为胶体金、胶体银、胶体硒，更进一步优选胶体金。在本发明的另一个优选方案中，免疫层析标记物为乳胶。

本发明的最优方案是：

(1)包被：用划膜仪在硝酸纤维素滤膜(NC膜)上划预先稀释成工作浓度的针对HBsAg单克隆抗体、HCV抗原、HIV抗原以及HIV P24 Ag的单抗、TP抗原以及羊抗兔IgG抗体，共六条线。

(2)标记：将HBsAg单克隆抗体、HCV抗原、HIV抗原以及HIV P24 Ag的标记抗体、TP抗原、兔IgG抗体分别与胶体金标记之后，以合适比例混合。

(3)组装：按照免疫层析试剂盒的一般组装方法进行，切成试纸条。

(4)检测：加入待测标本，在20分钟内观察结果，结果判定标准如下，

①仅质控区出现一条带，在HBV、HCV、HIV、TP各自测试区内无条带出现，为阴性(-)；

②两条或两条以上条带出现，其中一条位于质控区，其它条带位于HBV、HCV、HIV、TP各自测试区，分别对应HBV、HCV、HIV、TP阳性(+)，在HIV监测区，当HIV抗体或者HIV P24抗原有一项以上阳性时，可确定为阳性(+)；

③质控区未出现条带，表明不正确的操作过程或检测卡已变质损坏。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸条重新测试。

本发明的另一最优方案是：

(1)包被：用划膜仪在四条硝酸纤维素滤膜(NC膜)上划预先稀释成工作浓度的针对HBsAg单克隆抗体、HCV抗原、HIV抗原以及HIV P24 Ag单克隆抗体、TP抗原，以及各自的质控线抗体。

(2)标记：将HBsAg单克隆抗体、HCV抗原、HIV抗原以及HIV P24 Ag标记抗体、TP抗原分别与胶体金标记之后，以合适比例与已经标记上胶体金的兔IgG抗体，浸泡玻璃纤维，冷冻干燥。

(3)组装：PVC胶板，把HBV、HCV、HIV、TP每个项目的NC膜，和玻璃纤维以及其它辅助材料，按照免疫层析试剂盒的一般组装方法进行组装，用切条机切成试纸条。把HBV、HCV、HIV、TP四种试纸条的加样端围放在一起，另外一端(吸水纸端)发散性排列成扇形或者圆形。

(4)检测：在加样端加入待测标本，在20分钟内观察结果，结果判定标准如下，

①在HBV、HCV、HIV、TP各自测试区内无条带出现，仅各自质控区出现一条带，为阴性(-)；

②某项目检测线出现条带，对照线也出现条带，可确定为该项目阳性(+)；

③某一试纸条的质控区未出现条带，表明不正确的操作过程或检测卡已变质损坏。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸条重新测试。

本发明的再一最优方案是：

(1)包被：用划膜仪在一条硝酸纤维素滤膜(NC膜)上划预先稀释成工作浓度的针对HBsAg单克隆抗体、HCV抗原、HIV抗原以及HIV P24 Ag单克隆抗体、TP抗原，以及羊抗兔IgG抗体。

(2)标记：将HBsAg单克隆抗体、HCV抗原、HIV抗原以及HIV P24 Ag第二单克隆抗体、TP抗原分别与胶体金标记之后，以合适比例与已经标记上胶体金的兔IgG抗体，浸泡玻璃纤维，冷冻干燥。

(3)组装：PVC胶板，把包被好的NC膜，和玻璃纤维以及其它辅助材料，按照免疫层析试剂盒的一般组装方法进行组装，用切条机切成试纸条。

(4)检测：在加样端加入待测标本，在20分钟内观察结果，结果判定标准如下，

①测试区内无条带出现，自质控区出现一条带，为阴性(-)；

②有两条带出现，其中一条位于质控区，另一条带位于检测区，可确定为阳性(+)；

③质控区未出现条带，表明不正确的操作过程或检测卡已变质损坏。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸条重新测试。

本发明的优点以及创新性在于：

1、多个项目联合免疫层析法快速检测，方便、快捷；

2、加入了HIV P24 Ag检测，缩短HIV检测的窗口期；

3、可以用一条试纸筛查几种传染病，节省试剂盒成本；

4、加大胶体金的颗粒，使联检时的灵敏度可以和单项检测的灵敏度相当。

本发明的目的、特征及优点将结合实施例，作进一步详细阐述。应当理解，下列实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围，实施例中未注明具体条件之处，通常按照免疫层析法诊断的常规实验条件，或者试纸条生产厂家推荐的方法进行，在此不必赘述。

具体实施方式

实施例1 抗原抗体的包被

将HBsAg单克隆抗体、HCV抗原、HIV抗原以及HIV P24单克隆抗体、TP抗原分别稀释到合适浓度，用划膜仪划到NC膜上，即为HBV、HCV、HIV(包括HIV P24Ag)、TP五条检测线。将质控线抗体羊抗兔IgG抗体稀释到最适浓度用划膜仪划到NC膜上，即为对照线。将划好的NC膜置于37度恒温箱中干燥半小时。

实施例2 胶体金的准备

取100ml超纯水于500ml圆底烧瓶中，放到加热搅拌器上加热至沸腾，加入1ml 1％氯金酸(美国Sigma-Aldrich公司)的水溶液，沸腾后加入0.5ml 1％的柠檬酸钠(美国Sigma-Aldrich公司)，继续加热10分钟后放置自然冷却，即为胶体金。

实施例3 胶体金-标记物的制备

取10ml HBsAg单克隆抗体装入透析袋中，对10mM PBS PH 7.4缓冲液透析8小时，其间每1小时换一次缓冲液。取10ml胶体金，用0.2M K₂CO₃溶液调节胶体金的pH至6～7，加入200ug HBsAg单克隆抗体，继续搅拌5～10分钟。在上述混合液中加入0.5ml 2％BSA溶液，继续搅拌5分钟。将上述混合液装入合适的离心管中。5000rpm离心10分钟，吸出上清，将沉淀收集至一合适容器；对上清再用10000rpm离心15分钟，重复第一次离心的操作；对上清再用12000rpm离心30分钟，弃掉上清，将三次离心的沉淀收集到同一离心管中，用胶体金稀释液定容至1ml，于-4℃冰箱中保存。HCV抗原、HIV抗原以及P24 Ag单克隆抗体、TP抗原、质控抗体的胶体金标记物也按照上述方法进行。

实施例4 金标试纸条的组装

将标记好的上述标记物按照恰当的比例混合，浸泡玻璃纤维，冷冻干燥。以PVC胶板作为载体，依次贴上加样垫玻璃纤维、预浸泡金标标记物的冻干玻璃纤维、预包被抗原和抗体的NC膜、吸水纸，剪掉多余部分，用切条机切成所需宽度的条，此即为组装好的金标试纸条。

对照试纸条：将HBV、HCV、HIV、TP的各自试纸条，按照一般操作方式组装成为普通的单项检测条，作为本发明试剂盒的检测对照。

实施例5 金标试纸条的检测

将组装好的本发明金标试纸条，与普通的单项检测条在相同条件下，同时检测标准品和质控标本，结果如下：

备注：-为阴性，+为弱阳性，++为中阳性，+++为强阳性。

另外，取20份HBsAg阳性血清，以及20份阴性血清，用本发明的联合筛选试剂盒，跟普通的HbsAg单项检测条，两种方法同时检测对比，结果二者阴阳反应一致，并且所有阳性血清灵敏度无明显差异。

本发明的联合筛查试剂盒和HCV、TP、HIV普通的单项检测条也采用上述类似的方法比较。结果发现，本发明的联合筛查试剂盒和普通的单项检测条，其灵敏度基本符合。

本发明的试剂盒可以简单、方便的应用于免疫检测领域，具有方便、快捷的优势，可以节省检测时间，提高效率，降低成本，节约人力物力，并且可以提早检测HIV P24 Ag抗原，缩短HIV检测的窗口期。

Claims (8)

1.一种免疫层析试剂盒，其特征在于该试剂盒通过单次实验即可实现HBsAg、anti-HCV、anti-HIV/HIV P24Ag、anti-TP的任意三到四项重大传染病的同时筛查。

2.根据权利要求1的免疫层析试剂盒，其特征在于通过单次实验即可实现anti-HCV、anti-HIV/HIV P24Ag、anti-TP或者HBsAg、anti-HIV/HIVP24Ag、anti-TP或者HBsAg、anti-HCV、anti-TP或者HBsAg、anti-HCV、anti-HIV/HIV P24Ag的同时筛查。

3.根据权利要求1的免疫层析试剂盒，其特征在于通过单次实验即可实现HBsAg、anti-HCV、anti-HIV/HIV P24Ag、anti-TP的同时筛查。

4.根据权利要求1的免疫层析试剂盒，其特征在于所用的标记物包括胶体金属、分散型染料和染料标记的微球、乳胶。

5.根据权利要求4的免疫层析试剂盒，其特征在于所述的胶体金属为胶体金、胶体银、胶体硒。

6.根据权利要求1的免疫层析试剂盒，其特征在于所采用的方式是所有检测项目合成一个检测线。

7.根据权利要求1的免疫层析试剂盒，其特征在于所采用的方式是每个检测项目在同一产品的不同位置分开划线。

8.根据权利要求1的免疫层析试剂盒，其特征在于所采用的方式是每个检测项目在不同的支持物，分开布局。