CN102680690A - 第四代hiv抗体抗原检测试纸及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种第四代HIV抗体抗原检测试纸及其制备方法和应用，包括：吸水滤纸、硝酸纤维素膜、胶体金垫、样品垫和反应支持物；在所述反应支持物外表面上依次相互搭接粘帖所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水滤纸。因此，本发明所提供的第四代HIV抗体抗原检测试纸具有使用方便、操作简单、便于推广、能够在一个检测试纸上同时区分P24抗原阳性结果和HIV抗体阳性结果的优点。

Description

第四代HIV抗体抗原检测试纸及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种第四代HIV抗体抗原检测试纸及其制备方法和应用。

背景技术

HIV(Human Immunodeficiency Virus，人体免疫缺损病毒)传播的广泛性和危害性已成为全球关注的社会热点问题。因此，提高HIV诊断水平具有重要现实意义。

从1985年第1代HIV抗体检测试剂问世到现在，HIV血清学检测试剂已经发展到了第4代。第4代ELISA试剂的优点在于能同时检测抗原和抗体，由于加入抗原的检测可将窗口期缩短7～9天，在对HIV早期诊断的效果上明显优于第3代。

目前国内已有部分厂家研制得到了第四代检测试剂盒，主要采用的是化学发光法和酶联免疫法，但该种检测方法需要借助实验仪器才能完成，从而不方便用户使用；而且检测效果受操作人员熟练度的影响较大，从而限制了普通用户的使用。

发明内容

针对现有技术存在的上述缺陷，本发明提供一种第四代HIV抗体抗原检测试纸，具有使用方便、操作简单、便于推广的优点。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种第四代HIV抗体抗原检测试纸，包括：吸水滤纸、硝酸纤维素膜、胶体金垫、样品垫和反应支持物；在所述反应支持物外表面上依次相互搭接粘帖所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水滤纸；

并且，所述硝酸纤维素膜上自靠近所述样品垫一侧依次设置有第一条带T1、第二条带T2和质控条带C；所述第一条带T1包被P24抗原单克隆抗体，所述第二条带T2包被GP36、GP41和GP120抗原，所述质控条带C包被羊抗鼠IgG多克隆抗体；所述胶体金垫含有胶体金标记的P24抗原单克隆抗体和胶体金标记的GP36、GP41、GP120抗原混合标记物。

本发明还提供一种制备上述的第四代HIV抗体抗原检测试纸的方法，包括以下步骤：

(1)分别制备纯度和浓度均符合要求的P24抗原单克隆抗体、GP36抗原、GP41抗原和GP120抗原；

(2)硝酸纤维素膜的制备：将步骤(1)制得的P24抗原单克隆抗体用0.02mol/L pH＝7.2的PBS稀释成1.0mg/ml，用喷膜机以1.0μl/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，形成第一条带T1；将步骤(1)制得的GP36抗原、GP41抗原和GP120抗原分别用0.02mol/L pH＝7.2的PBS稀释成0.3mg/ml、0.6mg/ml和0.4mg/ml，用喷膜机以1.0μl/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，形成第二条带T2；将羊抗鼠IgG多克隆抗体用0.02mol/LpH＝7.2的PBS稀释成1.0mg/ml，用喷膜机以1.0μl/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，形成质控条带C；

(3)胶体金垫的制备：采用最佳标记pH值为7.4至8.0、最佳标记浓度为15至18μg/ml的标记条件制得胶体金标记的P24抗原单克隆抗体；分别采用最佳标记pH值为7.4至8.0、最佳标记浓度为10至12μg/ml的标记条件制得胶体金标记的GP36、GP41和GP120抗原；将本步骤上述得到的胶体金标记的P24抗原单克隆抗体、胶体金标记的GP36、GP41和GP120抗原进行纯化后，喷涂到胶体金垫上，干燥备用；

(4)第四代HIV抗体抗原检测试纸的制备：在所述反应支持物外表面上依次相互搭接粘帖所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水滤纸。

优选的，所述制备纯度和浓度均符合要求的P24抗原单克隆抗体的制备方法为：

采用动物体内生产单抗的方法获得P24抗原单克隆抗体腹水，将获得的P24抗原单克隆抗体腹水使用辛酸-饱和硫酸铵沉淀，得到蛋白浓度高于2.0mg/ml、纯度大于90％的P24抗原单克隆抗体。

优选的，所述GP36抗原、GP41抗原或GP120抗原的制备方法为：

将含有GP36、GP41或GP120抗原的细菌培养液用辛酸-饱和硫酸铵沉淀后，再用离子层析柱层析纯化，得到浓度高于2.0mg/ml，纯度大于90％的GP36、GP41或GP120抗原。

本发明还提供了第四代HIV抗体抗原检测试纸在检测HIV中的应用。

本发明的有益效果如下：

本发明提供一种第四代HIV抗体抗原检测试纸，不仅具有使用方便、操作简单、便于推广的优点，而且能够在一个检测试纸上同时区分P24抗原阳性结果和HIV抗体阳性结果，通过区分抗体和抗原检测，达到了区分感染阶段的目的，为患者提供更多的信息。

附图说明

图1为本发明实施例提供的第四代HIV抗体抗原检测试纸的正面示意图；

图2为本发明实施例提供的第四代HIV抗体抗原检测试纸的侧面示意图；

图3为本发明提供的第四代HIV抗体抗原检测试纸的检测结果阳性示意图；

图4为本发明提供的第四代HIV抗体抗原检测试纸的检测结果阴性示意图；

图5为本发明提供的第四代HIV抗体抗原检测试纸的检测结果无效示意图。

其中：1-吸水滤纸；

2-硝酸纤维素膜；

3-胶体金垫；

4-样品垫；

5-反应支持物。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施方式进行详细说明。

实施例1：第四代HIV抗体抗原检测试纸(参见图1和图2)

(1)P24抗原单克隆抗体的制备

采用通用的动物体内生产单抗的方法获得P24抗原单克隆抗体腹水，然后对该P24抗原单克隆抗体腹水进行纯化，具体的纯化方法为：将含有P24抗原单克隆抗体的腹水使用辛酸-饱和硫酸铵沉淀后，使用紫外分光法测定蛋白浓度、使用SDS-PAGE测定纯度，所得P24抗原单克隆抗体的蛋白浓度高于2.0mg/ml，纯度大于90％为合格。

(2)GP36、GP41和GP120抗原的制备

将含有GP36、GP41或GP120抗原的细菌培养液用辛酸-饱和硫酸铵沉淀后，再用离子层析柱层析纯化，并使用紫外分光光度法测定蛋白浓度、使用SDS-PAGE测定纯度，所得抗原以浓度高于2.0mg/ml，纯度大于90％为合格。

(3)硝酸纤维素膜上第一条带T1包被P24抗原单克隆抗体的方法：

经实验确定，最佳包被条件为：包被缓冲液为0.02mol/L pH＝7.2的PBS，包被浓度为1.0mg/ml，喷量选择为1.0μl/cm。即：将P24抗原单克隆抗体用0.02mol/L pH＝7.2的PBS稀释成1.0mg/ml，用喷膜机以1.0μl/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，形成第一条带T1。

(4)硝酸纤维素膜上质控条带C包被羊抗鼠IgG多克隆抗体的方法：

经实验确定，最佳包被条件为：包被缓冲液为0.02mol/L pH＝7.2的PBS，包被浓度为1.0mg/ml，喷量选择为1.0μl/cm。

(5)硝酸纤维素膜上第二条带T2包被GP36、GP41和GP120抗原的方法：

经实验确定，最佳包被条件为：包被缓冲液为0.02mol/L pH＝7.2的PBS，包被浓度为：GP36为0.3mg/ml、GP41为0.6mg/ml、GP120为0.4mg/ml，喷量选择为1.0μl/cm。

(6)胶体金的制备与鉴定：

使用柠檬酸三钠还原法还原氯金酸制备胶体金颗粒，使用紫外分光光度计扫描460～600nm区间的光吸收值，在520至530nm区间有最大吸收峰，且吸收值大于2.0为合格，对应胶体金颗粒直径大约为30～40nm。

(7)胶体金标记P24抗原单克隆抗体的方法：

P24抗原单克隆抗体最佳标记pH值和最佳标记浓度的确定：使用胶体金梯度pH值平行标记该抗体，选择变色边缘的标记pH值，然后将该pH值加上0.5作为P24抗原单克隆抗体进行标记的最佳pH值，大约为7.4至8.0；在该最佳pH值条件下，设定蛋白梯度进行标记，在胶体金中加入P24抗原单克隆抗体后混匀，放置20分钟以上，按每毫升胶体金加入100μl的比例加入10％的NaCl，混匀，观察颜色，选定加入P24抗原单克隆抗体浓度最低且颜色不发生变化的标记量再额外附加10％值作为最佳标记量，大约为15至18μg/ml。

(8)胶体金分别标记GP36、GP41和GP120抗原的方法：

GP36抗原最佳标记pH值和最佳标记浓度的确定：使用胶体金梯度pH值平行标记该抗原，选择变色边缘的标记pH值，然后将该pH值加上0.5作为该GP36抗原进行标记的最佳pH值，大约为7.4至8.0；在该最佳pH值条件下，设定蛋白梯度进行标记，在胶体金中加入GP36抗原后混匀，放置20分钟以上，按每毫升胶体金加入100μl的比例加入10％的NaCl，混匀，观察颜色，选定加入GP36抗原浓度最低且颜色不发生变化的标记量再额外附加10％值作为最佳的标记量，大约为10至12μg/ml。

GP41抗原最佳标记pH值和最佳标记浓度的确定：使用胶体金梯度pH值平行标记该抗原，选择变色边缘的标记pH值，然后将该pH值加上0.5作为该GP41抗原进行标记的最佳pH值，大约为7.4至8.0；在该最佳pH值条件下，设定蛋白梯度进行标记，在胶体金中加入GP41抗原后混匀，放置20分钟以上，按每毫升胶体金加入100μl的比例加入10％的NaCl，混匀，观察颜色，选定加入抗原浓度最低且颜色不发生变化的标记量再额外附加10％值作为最佳的标记量，大约为10至12μg/ml。

GP120抗原最佳标记pH值和最佳标记浓度的确定：使用胶体金梯度pH值平行标记该抗原，选择变色边缘的标记pH值，然后将该pH值加上0.5作为该GP120抗原进行标记的最佳pH值，大约为7.4至8.0；在该最佳pH值条件下，设定蛋白梯度进行标记，在胶体金中加入GP120抗原后混匀，放置20分钟以上，按每毫升胶体金加入100μl的比例加入10％的NaCl，混匀，观察颜色，选定加入GP120抗原浓度最低且颜色不发生变化的标记量再额外附加10％值作为最佳的标记量，大约为10至12μg/ml。

(9)对上述(7)(8)中所得到的四种胶体金标记溶液进行纯化的方法：

将标记好的胶体金溶液，加入BSA和PEG20000至终浓度均为0.2％，混匀，放置15分钟以上，使用高速冷冻离心机12000rpm离心15分钟以上，弃去上清，将沉淀使用胶体金保存液复溶，体积为原标记胶体金体积的1/10。复溶比例的调试：使用胶体金工作液稀释标记胶体金浓缩液进行稀释，稀释比例为10至20倍，喷涂到胶体金垫上进行干燥，最后根据与包被硝酸纤维素膜配对的检测结果确定最佳的稀释比例，一般选择15倍左右。

(10)第四代HIV抗体抗原检测试纸的制备：在所述反应支持物外表面上依次相互搭接粘帖所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水滤纸。具体的，搭接粘帖可以为以下方式：包被好的硝酸纤维素膜2粘贴在反应支持物5上，其条带T1、T2线方向硝酸纤维素膜的边缘距离反应支持物5边缘28.0mm(具体数值会根据反应支持物5的尺寸发生变化)，条带C线方向硝酸纤维素膜的边缘距离反应支持物5的边缘32.0mm(具体数值会根据反应支持物5的尺寸发生变化)；条带C线方向的反应支持物5上粘贴有吸水滤纸1，压住硝酸纤维素膜1mm到2mm；条带T线方向的反应支持物5上首先粘贴4mm到8mm(根据实际生产活性的差异而变化)的胶体金垫3，压住硝酸纤维素膜条带T线的边缘1mm到2mm；在此方向上继续粘贴样品垫4，压住胶体金垫2mm到4mm(依赖于胶体金垫3的宽度)。

实施例2：检测方法(参见图3、4、5)

将待检标本(全血、血清或者血浆)60至100μl直接加入实施例1所得的检测试纸中的样品垫4处(全血样本需要额外加入一些稀释液)，样品将沿着反应支持物5的各个附着物向吸水滤纸方向移动，20分钟内读取实验结果。

结果：

参照图3，如果样本中含有P24抗原，则与检测试纸上的胶体金标记的P24抗原的单克隆抗体特异性结合形成复合物，沿着膜区继续上行则与包被在硝酸纤维素膜2上的另一个P24抗原单克隆抗体发生特异性结合，在条带T1处出现红色或者粉红色；如果样本中含有HIV抗体，则与检测试纸上的胶体金标记的GP36、GP41、GP120抗原的单克隆抗体特异性结合形成复合物，沿着膜区继续上行则与包被在硝酸纤维素膜2上的另一个GP36、GP41、GP120抗原单克隆抗体发生特异性结合，在条带T2处出现红色条带，如果同时含有以上两种待检物则在两条线上同时显示红色条带。

参照图4，如果样本中没有P24抗原也没有HIV的抗体，就不能形成上述复合物，条带T1和T2处也就不能出线红色或粉红色，为阴性。

参照图5，无论样本中是否含有P24抗原或者HIV抗体，胶体金标记的单克隆抗体都会继续上行至包被膜的条带C，去此处包被的羊抗鼠IgG结合形成红色或者粉红色条带，即为质控线，如果在检测中此条带不出现，则证明胶体金失效或者操作有失误，结果无效，需要重新检测。

综上所述，通过使用本发明所提供的第四代HIV抗体抗原检测试纸，不仅具有使用方便、操作简单、便于推广的优点，而且能够在一个检测试纸上同时区分P24抗原阳性结果和HIV抗体阳性结果，通过区分抗体和抗原检测，达到了区分感染阶段的目的，为患者提供更多的信息。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例和附图所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

Claims (5)

1.一种第四代HIV抗体抗原检测试纸，其特征在于，包括：吸水滤纸、硝酸纤维素膜、胶体金垫、样品垫和反应支持物；在所述反应支持物外表面上依次相互搭接粘帖所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水滤纸；

并且，所述硝酸纤维素膜上自靠近所述样品垫一侧依次设置有第一条带T1、第二条带T2和质控条带C；所述第一条带T1包被P24抗原单克隆抗体，所述第二条带T2包被GP36、GP41和GP120抗原，所述质控条带C包被羊抗鼠IgG多克隆抗体；所述胶体金垫含有胶体金标记的P24抗原单克隆抗体和胶体金标记的GP36、GP41、GP120抗原混合标记物。

2.一种制备权利要求1所述的第四代HIV抗体抗原检测试纸的方法，包括以下步骤：

(1)分别制备纯度和浓度均符合要求的P24抗原单克隆抗体、GP36抗原、GP41抗原和GP120抗原；

(2)硝酸纤维素膜的制备：将步骤(1)制得的P24抗原单克隆抗体用0.02mol/L pH＝7.2的PBS稀释成1.0mg/ml，用喷膜机以1.0μl/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，形成第一条带T1；将步骤(1)制得的GP36抗原、GP41抗原和GP120抗原分别用0.02mol/L pH＝7.2的PBS稀释成0.3mg/ml、0.6mg/ml和0.4mg/ml，用喷膜机以1.0μl/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，形成第二条带T2；将羊抗鼠IgG多克隆抗体用0.02mol/L pH＝7.2的PBS稀释成1.0mg/ml，用喷膜机以1.0μl/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，形成质控条带C；

(3)胶体金垫的制备：采用最佳标记pH值为7.4至8.0、最佳标记浓度为15至18μg/ml的标记条件制得胶体金标记的P24抗原单克隆抗体；分别采用最佳标记pH值为7.4至8.0、最佳标记浓度为10至12μg/ml的标记条件制得胶体金标记的GP36、GP41和GP120抗原；将本步骤上述得到的胶体金标记的P24抗原单克隆抗体、胶体金标记的GP36、GP41和GP120抗原进行纯化后，喷涂到胶体金垫上，干燥备用；

(4)第四代HIV抗体抗原检测试纸的制备：在所述反应支持物外表面上依次相互搭接粘帖所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水滤纸。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述制备纯度和浓度均符合要求的P24抗原单克隆抗体的制备方法为：

采用动物体内生产单抗的方法获得P24抗原单克隆抗体腹水，将获得的P24抗原单克隆抗体腹水使用辛酸-饱和硫酸铵沉淀，得到蛋白浓度高于2.0mg/ml、纯度大于90％的P24抗原单克隆抗体。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述GP36抗原、GP41抗原或GP120抗原的制备方法为：

将含有GP36、GP41或GP120抗原的细菌培养液用辛酸-饱和硫酸铵沉淀后，再用离子层析柱层析纯化，得到浓度高于2.0mg/ml，纯度大于90％的GP36、GP41或GP120抗原。

5.权利要求1所述的第四代HIV抗体抗原检测试纸在检测HIV中的应用。

Images