CN105158465A

CN105158465A - 一种人类免疫缺陷病毒ⅰ型p24抗体检测elisa试剂盒

Info

Publication number: CN105158465A
Application number: CN201510669413.3A
Authority: CN
Inventors: 李强; 徐立然; 王炜; 邓博文; 李承乘; 刘真; 何书杰
Original assignee: FIRST AFFILIATED HOSPITAL OF HENAN INSTITUTE OF CHINESE MEDICINE
Current assignee: FIRST AFFILIATED HOSPITAL OF HENAN INSTITUTE OF CHINESE MEDICINE
Priority date: 2015-10-15
Filing date: 2015-10-15
Publication date: 2015-12-16
Anticipated expiration: 2035-10-15
Also published as: CN105158465B

Abstract

本发明涉及人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒，有效解决现有ELISA检测HIV-1抗体的方法检测窗口期长，易漏检及HIV-1？P24抗体检测的试剂盒假阳性率高，特异性低的问题，该试剂盒内设有预包被HIV-1？P24抗原酶标板，阴性对照液血清、阳性对照液血清、辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体、抗体稀释液、显色剂TMB？A液和显色剂TMB？B液、终止液、洗涤液、封板膜，本发明利获取到新的HIV-1？P24基因序列，并用此序列基因重组表达抗原蛋白包被ELISA，经间接法检测样本HIV-1？P24抗体，有效用于HIV-1感染的早期辅助诊断。

Description

一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒

技术领域

本发明涉及一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)是艾滋病的病原体能攻击人体免疫系统的病毒，它把人体免疫系统中最重要的T淋巴细胞作为主要攻击目标，大量破坏该细胞，使人体丧失免疫功能。因此，人体易于感染各种疾病，并可发生恶性肿瘤，病死率较高。由于其基因易突变，到目前为止还未有特效的防治疫苗，所以防治艾滋病仍是以早发现缩小隐形感染传播范围，早治疗防止病情进一步恶化。虽然自1983发现HIV病毒以来，HIV病毒相关检测指标的研究一直没有停息过，研究从HIV抗体检测到p24抗原检测、HIV核酸检测以及T淋巴细胞计数等检测项目。但目前在国内的初筛实验依然以HIV抗体检测为主，窗口期较长容易漏检。目前HIV分为1型和2型，但是国内主要流行HIV-1，而在HIV-1病毒中，gag基因所编码的结构蛋白是该病毒含量最丰富的蛋白，对于HIV-1颗粒的组装及释放至关重要且相对稳定不易突变。gag基因全长表达产物P55经蛋白酶水解后成为P24/P17/P15蛋白，而p24是HIV-1病毒颗粒的主要结构蛋白，在病毒的包装和成熟过程中起重要作用。p24蛋白的氨基酸序列在HIV-1各毒株之间高度保守，缺失p24会导致病毒无法正常组装。衣壳蛋白p24特异性很强，与多数其他逆转录病毒无交叉反应，并且HIV-1P24抗体出现较其他抗体早，所以可用于HIV-1感染的早期辅助诊断，但目前的HIV-1P24抗体检测的试剂盒假阳性率高，特异性低，至今未能得到广泛应用。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒，可有效解决现有ELISA检测HIV-1抗体的方法检测窗口期长，易漏检及HIV-1P24抗体检测的试剂盒假阳性率高，特异性低的问题。

本发明解决的技术方案是，该试剂盒内设有预包被HIV-1P24抗原酶标板，阴性对照液血清、阳性对照液血清、辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体(即酶标二抗，购买于生工生物工程有限公司)、抗体稀释液、显色剂TMBA液和显色剂TMBB液、终止液、洗涤液、封板膜；其中，阴性对照液血清为正常人血清；阳性对照液血清为含HIV-1P24抗体的人血清；HIV-1P24抗原为纯化的重组P24蛋白，P24蛋白由以下P24基因序列构成：

所述的HIV-1P24抗原的制备方法是：选择HIV-1阳性样本，提取RNA反转录为cDNA；分别设计三轮引物，其中第一轮引物为：

gag_A_5’-TCTGGCTGTGTGCCCTTCTTTGCCACAATTGAAACACTT-3’

gag_S_5’-CGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAG-3’

第二轮引物为：

P24_S1：5’-AGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATG-3’

P24_A1：5’-TTTGTTACTTGGCTCATTGCTTCAG-3’

第三轮引物为：

P24_NCOⅠ-2：5’-TTAACATGCCATGGGCCCTATAGTGCAAAACCT-3’，其5’端设计有NCOⅠ酶切位点；

P24_XHOⅠ-2：5’-AACCGCTCGAGTGGCAAGATTCTTGCTTTGT-3’，其5’端设计有XHOⅠ酶切位点；

利用上述引物，扩增模板cDNA，扩增后片段大小为693bp，利用omega胶回收试剂盒切胶回收，得切胶纯化的P24基因片段(P24DNA)，扩增DH5a-PET32a菌株，得PET32a质粒，将获得的PET32a质粒和切胶纯化的P24基因片段利用NCOⅠ和XHOⅠ分别双酶切，酶切后的产物分别用omega胶回收试剂盒进行纯化回收，得酶切PET32a质粒和酶切P24基因片段；酶切P24基因片段和酶切PET32a质粒连接，构建PET32a-P24重组质粒，提取PET32a-P24质粒转入BL21菌株中，构成BL21-PET32a-P24菌株，通过IPTG诱导表达P24抗原，利用镍柱填料初次纯化P24抗原后，再经SDS-PAGE电泳切胶回收再次纯化P24抗原，置于磷酸盐缓冲液中，透析，经聚乙二醇8000浓缩得浓缩蛋白，即为纯化的重组P24蛋白；

所述的预包被HIV-1P24抗原酶标板的制备方法是：

(1)将纯化的重组P24蛋白用碳酸盐包被液稀释至2ug/ml，得稀释液，每孔100ul稀释液包被96孔聚苯乙烯微孔板，封膜，4℃，16-18小时；

(2)微孔板洗涤：弃去96孔聚苯乙烯微孔板中液体，用PBS(即磷酸盐缓冲液)洗涤3次，拍干96孔聚苯乙烯微孔板；

(3)封闭微孔板：在96孔聚苯乙烯微孔板的各个孔中加入200ul封闭液，封膜，置于37℃水浴箱，2h；

(4)微孔板洗涤：弃去96孔聚苯乙烯微孔板中液体，用PBS洗涤3次，拍干96孔聚苯乙烯微孔板；

(5)预包板的保存：装封闭袋中，置于4℃保存备用；

其中，碳酸盐包被液的配制：碳酸钠(Na₂CO₃)0.8g，碳酸氢钠(NaHCO₃)1.45g，加纯水溶解后定容至500ml，调PH至9.6，4℃保存；

PBS的配制：氯化钠(NaCl)8g，氯化钾(KCl)0.2g，KH₂PO₄(磷酸二氢钾)0.24g，Na₂HPO₄(磷酸氢二钠)1.44g，纯水定容至1000ml，调PH至7.2；

封闭液的配制：含5％体积浓度的胎牛血清的PBS；

所述的检测人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测试剂盒的检测方法：

(1)实验设计：根据待测样本的数量选择相应的预包被HIV-1P24抗原酶标板的微孔数量，另设空白对照、阴性对照、阳性对照各一孔；

(2)试剂配制：使用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体，抗体稀释液和辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体的体积比为1:6000，即得酶标二抗工作液；

(3)加样：将待测样本用抗体稀释液按体积比1：20稀释，每个待测样本的微孔中待测样本加入量为50ul、阴性对照的微孔中阴性对照液血清加入量为50ul、阳性对照的微孔中阳性对照液血清加入量为50ul，空白对照的微孔中不加样；

(4)温育：用封板膜封盖反应板，置于37℃水浴箱，温育1h；

(5)洗板：撕去封板膜，弃去微孔中液体，注满洗涤液，浸泡至少5s，反复洗板5次，最后在吸水纸上拍干；

(6)加酶：空白对照的微孔除外，其余每孔加入酶标二抗工作液50ul；

(7)温育：用封板膜封盖反应板，置于37℃水浴箱，30min；

(8)洗板：撕去封板膜，弃去微孔中液体，注满洗涤液，浸泡至少5s，反复洗板5次，最后在吸水纸上拍干；

(9)加底物液：待测样本的微孔、阴性对照的微孔、阳性对照的微孔和空白对照的微孔内均加入显色剂TMBA液和显色剂TMBB液各50ul，震荡仪震荡混匀，置于37℃水浴箱，温育15min；

(10)加终止液：待测样本的微孔、阴性对照的微孔、阳性对照的微孔和空白对照的微孔内均加入50ul终止液，震荡仪震荡混匀；

(11)检测：取波长450nm(参考波长630nm，建议使用双波长的酶标仪检测)设定酶标仪检测，以空白对照的微孔校零，再读取各孔OD值；

(12)结果判断：阴性对照(A值)*2.5＝临界值(cutoff值)，阴性对照高于0.05时按实际OD值算，阴性对照小于0.05按0.05计算，凡待测样本的A值大于临界值即为阳性，反之，则为阳性；

其中，抗体稀释液：100mlPBS中加入5ml胎牛血清和50ulTween-20，调pH值至7.2；洗涤液：含0.15％Tween-20的PBS，pH值为7.2；显色剂TMBA、B液：购买于北京泰天河生物技术有限公司；终止液：2mol/LH₂SO₄溶液；

本发明利获取到新的HIV-1P24基因序列，并用此序列基因重组表达抗原蛋白包被ELISA，经间接法检测样本HIV-1P24抗体，因为衣壳蛋白p24特异性很强，与多数其他逆转录病毒无交叉反应，并且HIV-1P24抗体出现较其他抗体早，所以具有较高的特异性和敏感性，有效用于HIV-1感染的早期辅助诊断。

具体实施方式

以下结合实际情况对本发明具体实施方式作进一步详细说明；

1、获取HIV-1P24基因

(1)获取经WB(免疫印记法)确证过的HIV-1阳性样本；利用Trizol法提取HIV-1P24RNA模板，方法是，复苏液氮冻存的HIV-1阳性样本PBMC(单个核细胞)，取HIV-1阳性样本PBMC500ul加1mlTrizol(RNA抽提试剂)，混匀，18-30℃放置5min，按200ul氯仿/mlTrizol(即1mlTrizol中加入200ul氯仿)加入氯仿，振荡混匀15s，18-30℃放置2-3min，4℃，12000g离心15min，吸取上层水相，按0.5ml异丙醇/mlTrizol加入异丙醇，混匀，18-30℃放置5-10min，4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底，按1ml质量浓度75％的乙醇/mlTrizol加入质量浓度75％的乙醇，振荡离心管，悬浮沉淀，4℃8000g离心5min，弃上清，18-30℃晾5-10min，得RNA样品，用50ul0.1％DEPC处理水(DEPC为焦碳酸二乙酯)溶解(0.1％DEPC处理水的配制方法：在1000ml的纯水中加入1mlDEPC，混匀，室温避光静置过夜，121℃高压蒸汽灭菌20min)RNA样品，55-60℃，溶解5-10min，-70℃保存，即得HIV-1P24RNA模板；

(2)选用随机引物反转录RNA为cDNA(Takara反转录试剂盒)：反应体系：HIV-1P24RNA模板1ul，Oligoprimer(引物)1ul，5×reactionbuffer4ul，RibolockRNaseInhibitor(20U/ul)1ul，10mMdNTPMix2ul，RevertAidM-MuLVReverseTranscriptase(200U/ul)1ul，Water10ul，总体系20ul，混匀；反应条件：混匀体系，放于PCR仪，42℃孵育60min，70℃孵育5min，4℃保存1小时，取出后-70℃保存，得模板cDNA；

(3)利用巢式PCR获得P24基因(TakaraPCR试剂盒)：根据NCBIBlast数据库已公布的gag蛋白基因序列设计特异性引物，第一轮引物：P24_gag-A：5’-TCTGGCTGTGTGCCCTTCTTTGCCACAATTGAAACACTT-3’和P24_gag-S：5’-CGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAG-3’，PCR反应体系：TakaraTaq(5U/ul)0.25ul，10×PCRbuffer5ul，dNTPMixture(各2.5mM)4ul，模板cDNA1ul，上述引物P24_gag-A2ul，引物P24_gag-S2ul，蒸馏水加至50ul；PCR反应条件：95℃3min，95℃1min，59.8℃2min，72℃1min30s，35循环，72℃10min，4℃保存，作为第二轮模板DNA；第二轮引物：P24_S15’-AGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATG-3’和P24_A15’-TTTGTTACTTGGCTCATTGCTTCAG-3’，PCR反应体系：TakaraTaq(5U/ul)0.25ul，10×PCRbuffer5ul，dNTPMixture(各2.5mM)4ul，第二轮模板DNA1ul，P24_A12ul，P24_S12ul，蒸馏水加至50ul；PCR反应条件：95℃3min，95℃1min，54.7℃1min，72℃1min20s，35循环，72℃10min，4℃保存，作为第三轮模板DNA；第三轮引物：P24_NCOⅠ‐25’‐TTAACATGCCATGGGCCCTATAGTGCAAAACCT‐3’其5’端设计有NCOⅠ酶切位点和P24_XHOⅠ‐25’‐AACCGCTCGAGTGGCAAGATTCTTGCTTTGT‐3’其5’端设计有XHOⅠ酶切位点，PCR反应体系：TakaraTaq(5U/ul)0.25ul，10×PCRbuffer5ul，dNTPMixture(各2.5mM)4ul，第三轮模板DNA1ul，P24_NCOⅠ‐22ul，P24_XHOⅠ‐22ul，蒸馏水加至50ul；PCR反应条件：95℃3min，95℃1min，54.7℃1min，72℃1min，35次循环，72℃10min，4℃保存，扩增后片段大小为693bp，PCR产物经在1％琼脂糖凝胶中电泳，条带与目的片段大小相符；

(4)切胶回收(利用omega胶回收试剂盒)：在紫外灯箱中用小刀切取凝胶上的目的基因条带；称量空EP管重量，把切取带有目的基因的胶装入称好的EP管中，称量出胶的重量；根据1g/1mlBudingBuffer(即每1g胶加入1ml的BudingBuffer)加入BudingBuffer；置于55-60℃预热的水浴锅中7min溶解，震荡混匀，得胶液；处理过滤柱(处理过滤柱的步骤为：a、在过滤中加入200ulGPS溶液，静置2-3min，10000g离心1min弃滤液；b、在过滤中加入700ul蒸馏水，10000g离心1min弃滤液)：向过滤柱中加入200ulGPS(omega胶回收试剂盒内试剂)，18-30℃放置2-3min，10000g离心1min，弃滤液；再加入700ul蒸馏水，10000g离心1min，弃去滤液；加入700ul溶解后的胶液，10000g离心1min，弃去滤液；加入300ulBudingBuffer，10000g离心1min，弃去滤液；加入700ulSPWwashbuffer(omega胶回收试剂盒内试剂)，10000g离心1min，弃去滤液，再加入700ulSPWwashbuffer，10000g离心1min，弃去滤液；将过滤柱放入空收集管中，13000g离心2min，弃去滤液；将过滤柱放入另取的EP管中，在过滤柱中加入30-50ulElutionBuffer，18-30℃放置1min；13000g离心1min，吸取EP管内滤液再次加入过滤柱中，13000g离心1min，即得切胶纯化的P24基因片段(P24DNA)；

2、构建PMD-18-T-P24质粒载体

(1)构建T-P24质粒：将上述切胶纯化的P24基因片段连接于PMD-18-T载体(宝生物工程有限公司)：反应体系：PMD18-T载体4ul，P24DNA16ul，Solution20ul，混匀；反应条件：放置于PCR仪，16℃，16-18小时。

(2)将(1)步骤连接好的T-P24质粒转入菌株DH5a感受态细胞中，即得DH5a-T-P24菌；其方法是，取菌株DH5a接种于LB琼脂培养基平板，37℃培养16-18小时；挑取单菌落接种于3mlLB液体培养基中，200r/min,37℃培养16-18小时，得菌液；接种菌液到LB液体培养基中，菌液和LB液体培养基的体积比为1:100，250r/min，37℃培养至OD值为0.4-0.5；转入50ml离心管中，冰浴10min；4℃，4000r/min离心10min，弃上清，倒扣于滤纸1min，加入30ml预冷至4℃的0.1mol/LCaCl₂(氯化钙)溶液(0.1mol/LCaCl₂溶液配方：_:称取1.11gCaCl₂,溶于100ml纯水中，0.22um滤膜过滤除菌，4℃保存)重悬沉淀，冰浴10min；4℃，4000r/min离心10min，弃上清，倒扣于滤纸1min，加入300ml预冷至4℃的0.1mol/LCaCl₂溶液重悬沉淀，放入冰盒中，得感受态细胞悬液；细菌质粒转化方法：用无菌枪头吸取感受态细胞悬液100ul转移到1.5ml无菌离心管中，加T-P24质粒30ul，混匀，将离心管插入浮漂中并放于冰盒中45min；再放入预热至42℃的水浴中，放置90s，转移至另取的冰盒中，使细胞冷却15min；得到已转化的感受态细胞，加入800ulLB液体培养基，混匀，150r/min，37℃培养1h，得菌液A，取200ul菌液A转移至氨苄抗性的LB琼脂培养基平板，用灭菌过的玻璃棒涂匀；将氨苄抗性的LB琼脂培养基平板置于18-30℃直至液体被吸收；倒置氨苄抗性的LB琼脂培养基平板，37℃培养16-18小时，得DH5a-PMD-18-T-P24菌；所述的LB液体培养基的配制方法：在100ml水中加入2gLB肉汤，混匀，121℃高压蒸汽灭菌，20min，待冷却到18-30℃，4℃保存，以下同；所述氨苄抗性的LB琼脂培养基平板的配制方法：在100ml水中加入2gLB肉汤和1.5g琼脂粉，混匀，121℃高压蒸汽灭菌，20min，待冷却到50-60℃，加入100ul氨苄青霉素(浓度为100mg/ml)，混匀，每个培养板中倒入20-30ml，4℃保存，以下同；

(3)DH5a-PMD-18-T-P24菌中PMD-18-T-P24质粒基因测序：方法是，将上述步骤(2)培养出的产物由测序公司进行测序，得出其中P24基因序列为:

上述P24基因与NCBIBlast数据库比较未检索出相同序列，在P24基因序列中602位点处突变位点未检索出，经验证此突变不影响P24蛋白的抗原性；

3、表达载体重组

(1)扩增DH5a-PET32a菌株；使用Axygen质粒提取试剂盒提取DH5a-PET32a菌株中的PET32a质粒，提取方法是：

所述扩增DH5a-PET32a菌株方法为：取DH5a-PET32a菌株乳化于5ml氨苄抗性的LB液体培养基，放置于摇床200r/min,16-18h,得扩增DH5a-PET32a菌株菌液；取扩增DH5a-PET32a菌株菌液5ml，4℃12000g离心1min，弃上清；加250mlBufferS1悬浮细菌沉淀；加250mlBufferS2上下翻转4-6次，混合均匀，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，翻转时间不超过5min；加350ulBufferS3上下翻转6-8次，4℃,12000g离心，10min；吸取离心上清液转移至制备管,12000g,离心1min，弃滤液；将制备管置回离心管，加500ulBufferW1,4℃,12000g，离心1min，弃滤液；将制备管置回离心管，加700ulBufferW2,4℃,12000g，离心1min，弃滤液,再加700ulBufferW2,4℃,12000g，离心1min，弃滤液；将制备管置回2ml离心管中，4℃,12000g，离心1min；将制备管移入1.5ml离心管中，在制备管膜中央加40ulELuent，18-30℃静置1min，4℃,12000g，离心1min；即得PET32a质粒，-70℃保存；所述的氨苄抗性的LB液体培养基的配制方法：在100ml水中加入2gLB肉汤，混匀，121℃高压蒸汽灭菌，20min，待冷却至18-30℃，加入100ul氨苄青霉素(浓度为100mg/ml)，4℃保存，以下同；

(2)将获得的PET32a质粒和另取上述1步骤中(4)所得的切胶纯化的P24基因片段利用NCOⅠ和XHOⅠ分别双酶切，PET32a质粒酶切的反应体系：PET32a质粒32ul，NCOⅠ2ul，XHOⅠ2ul10×K4ul，总体积共40ul，混匀；PET32a质粒反应条件：放于PCR仪37℃，16-18小时；切胶纯化的P24基因片段酶切的反应体系：切胶纯化的P24基因片段32ul，NCOⅠ2ul，XHOⅠ2ul10×K4ul，总体积共40ul，混匀；切胶纯化的P24基因片段酶切的反应条件：放于PCR仪37℃，16-18小时；酶切后的产物分别用omega胶回收试剂盒进行纯化回收，得酶切PET32a质粒和酶切P24基因片段；

(3)用T4连接酶连接(2)步骤所得酶切PET32a质粒和酶切P24基因片段构建PET32a-P24重组质粒，方法是，把酶切P24基因片段插入酶切PET32a质粒：反应体系：酶切P24基因片段21.5ul，酶切PET32a质粒21.5ul，10×T4DNAligasebuffer5ul，T4DNAligase2ul，共50ul；反应条件：放置于PCR仪中，16℃，16-18小时，即得PET32a-P24重组质粒；

4、构建表达菌株：将10ulPET32a-P24重组质粒转入100ulBL21(DE3)感受态细胞，得BL21(DE3)-PET32a-P24菌液，取100ulBL21(DE3)-PET32a-P24菌液接种于氨苄抗性的LB琼脂培养基平板中，37℃，培养16-18小时，取200ul培养好的BL21(DE3)-PET32a-P24菌液接种至5ml氨苄抗性的LB液体培养基中，提取PET32a-P24质粒，经测序鉴定为目的质粒，转入BL21菌株中，成功构建P24抗原表达菌株即BL21-PET32a-P24菌株；

5、蛋白表达

用IPTG(诱导剂)诱导BL21-PET32a-P24菌株表达P24抗原：吸取氨苄抗性的LB液体培养基5ml加入20ml摇菌管中，沾取单个BL21-PET32a-P24菌落，加入20ml摇菌管中，混匀，置于37℃,250r/min摇床16-18小时，得菌液B，取5ml菌液B加入200ml氨苄抗性的LB液体培养基，37℃,250r/min摇床2h；再加入2mlIPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)溶液(IPTG溶液为IPTG加水制成，每毫升水中含有0.2gIPTG)，混匀，放置于37℃,250r/min摇床3h，得诱导表达后的菌液；

6、蛋白纯化

(1)利用镍柱填料初次纯化P24抗原；a、将诱导表达后的菌液4000r/min，10min4℃离心，弃去上清；b、加入10ml缓冲液(缓冲液为500ml水中加入NaH₂PO₄3g和Nacl8.77g，调PH为7.4)重悬，超声破菌：300V，1s超声，4s冷却，60个循环为一次，至菌液澄清为止；c、再将澄清的菌液在4000r/min，10min4℃离心，上清经0.22um滤膜过滤，与4ml镍柱填料(购买于lifescience公司)结合，混匀30min，3000r/min2min离心，弃上清；d、加入30ml20mM咪唑洗涤液(20mM咪唑洗涤液为：500ml水中加入NaH₂PO₄3g、Nacl8.77g和咪唑0.544g，调PH为7.4)，混匀，3000r/min2min离心，弃上清；重复上述d步骤两次；再加入3ml250mM咪唑脱洗液(250mM咪唑脱洗液为:500ml水中加入NaH₂PO₄3g、Nacl8.77g和咪唑6.8g，调PH为7.4)，混匀，3000r/min2min离心，吸取上清，即P24抗原溶液，-70℃保存；

(2)SDS-PAGE电泳切胶回收再次纯化P24抗原：将P24抗原溶液用蛋白上样Buffer(缓冲液)100℃10min预处理，将制胶板装好，加入12％分离胶；再加入2ml蒸馏水，静置30分钟，弃去蒸馏水，再加入5％浓缩胶，插入梳子，静置1h，拔出梳子，放入电泳仪，加入预处理的P24抗原溶液，调电压60v，跑胶；切胶回收：将电泳好的胶片取下置于预冷至4℃的0.1mol/LKCL溶液(0.745gKCL加100ml水配成浓度为0.1mol/LKCL溶液)中，再置于-20℃，放置1min；切割呈灰白色的目的蛋白条带并分成0.5cm长的小段；电渗：将上述小段装入透析袋内置于电渗槽中电渗，60v，电渗出蛋白，至凝胶变透明为止；所述的12％分离胶：在10ml烧杯中依次加入灭菌水1.6ml、30％Acrytamide2ml、1.5MTrisHCL(PH8.8)1.3ml、10％SDS0.05ml、10％过硫酸铵0.05ml、TEMED2ul，混匀，即得；所述的5％浓缩胶：在5ml烧杯中依次加入灭菌水1.4ml、30％Acrytamide0.33ml、1.5MTrisHCL(PH8.8)0.25ml、10％SDS0.02ml、10％过硫酸铵0.02ml、TEMED2ul，混匀，即得；

(3)蛋白复性及浓缩：置于PBS中，4℃透析24h；用聚乙二醇8000覆盖1h，得浓缩蛋白，-70℃保存，即为纯化的重组P24蛋白；

检测人HIV-1P24抗体检测ELISA试剂盒的制备

1、检测人HIV-1P24抗体检测ELISA试剂盒预包被HIV-1P24抗原酶标板的制备；

(1)购买96孔聚苯乙烯微孔板，将纯化的重组P24蛋白用碳酸盐包被液稀释至2ug/ml，得稀释液，每孔100ul稀释液包被96孔聚苯乙烯微孔板,封膜，4℃，16-18小时；

(2)微孔板洗涤：弃去96孔聚苯乙烯微孔板中液体，用PBS洗涤3次，拍干96孔聚苯乙烯微孔板；

(5)预包板的保存：装封闭袋中，置于4℃保存备用；

2、检测人HIV-1P24抗体检测ELISA试剂盒试剂组分：

(1)酶标二抗：HRP兔抗人IgG二抗(购买于生工生物工程有限公司)

(2)抗体稀释液(PH7.2)：含5％胎牛血清和0.05％Tween-20的PBS；

(3)洗涤液(PH7.2)：含0.15％Tween-20的PBS；

(4)显色剂TMBA、B液：购买于北京泰天河生物技术有限公司；

(5)终止液：2mol/LH₂SO₄溶液；

(6)阴性对照血清：正常人血清；

(7)阳性对照血清：含P24抗体的人血清；

检测人HIV-1P24抗体检测ELISA试剂盒使用说明：

(2)试剂配制：使用抗体稀释液稀释酶标二抗，抗体稀释液和酶标二抗的体积比为1:6000，即得酶标二抗工作液；

(4)温育：用封板膜封盖反应板，置于37℃水浴箱，温育1h；

(7)温育：用封板膜封盖反应板，置于37℃水浴箱，30min；

该试剂盒采用间接法检测人血清/血浆中的HIV-1P24抗体，若待测样本中含有HIV-1P24抗体，则会与预包被HIV-1P24抗原酶标板上的P24抗原结合形成固相抗原-P24抗体复合物，再用辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体于固相抗原-P24抗体复合物中的抗体结合，形成固相抗原-P24抗体-HRP酶标二抗复合物，如待测样本中含有HIV-1P24抗体，则加入显色剂TMBA液和显色剂TMBB液后颜色变蓝，并且随着待测样本中抗体量的增加，颜色越来越深；

需要指出的是，上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，但不能以此来限定本发明保护的范围，对于本领域的技术人员来说，在本发明的基础上做出的等同或等效的变化及替换，均属于本发明所要求保护的范围；

本发明的试剂盒的性能试验如下：

1、特异性和敏感性

按照本发明的方法研制人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测试剂盒，分别对275份经WB确证实验确定的HIV-ⅠP24抗体阳性样本、310份非HIV-Ⅰ阳性样本进行检测(其中非HIV-Ⅰ阳性样本包括：正常人血清、丙肝抗体阳性血清、乙肝阳性血清、梅毒抗体阳性血清、类风湿抗体阳性血清)；

用本发明检测试剂盒检测结果如下：275份HIV-ⅠP24抗体阳性样本均为阳性；310份非HIV-Ⅰ阳性样本中有307份为阴性，3份为阳性，由此可得：特异性为99.03％，敏感性为100％；假阳性率为0.971％，假阴性率为0％；

2、重复性试验

使用人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测试剂盒检测60份HIV-ⅠP24抗体阳性样本、10份正常人样本、20份类风湿抗体阳性样本；

1)批间可重复性试验：

分别使用三批人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测试剂盒检测60份HIV-ⅠP24抗体阳性样本、10份正常人样本、20份类风湿抗体阳性样本。其检测结果见表1：

表1批间可重复性试验

2)批内可重复试验：

使用同一批次人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测试剂盒重复检测3次上述60份HIV-ⅠP24抗体阳性样本，其检测结果见表2

表2批内可重复试验

批次	第一次	第二次	第三次	变异系数
					阳性数	60	60	60	0

由表1和表2可知本人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测试剂盒有较好的重复性。

Claims

1.一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于，试剂盒内设有预包被HIV-1P24抗原酶标板，阴性对照液血清、阳性对照液血清、辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体、抗体稀释液、显色剂TMBA液和显色剂TMBB液、终止液、洗涤液、封板膜；其中，阴性对照液血清为正常人血清；阳性对照液血清为含P24抗体的人血清；HIV-1P24抗原为纯化的重组P24蛋白，P24蛋白由以下P24基因序列SEQIDNO:1构成。

2.根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述的HIV-1P24抗原的制备方法是：选择HIV-1阳性样本，提取RNA反转录为cDNA；分别设计三轮引物，其中第一轮引物为：

gag_A_SEQIDNO:2，gag_S_SEQIDNO:3；第二轮引物为：P24_S1：SEQIDNO:4，P24_A1：SEQIDNO:5；第三轮引物为：P24_NCOⅠ-2：SEQIDNO:6，其5’端设计有NCOⅠ酶切位点；P24_XHOⅠ-2：SEQIDNO:7，其5’端设计有XHOⅠ酶切位点；

利用上述引物，扩增模板cDNA，扩增后片段大小为693bp，利用omega胶回收试剂盒切胶回收，得切胶纯化的P24基因片段，扩增DH5a-PET32a菌株，得PET32a质粒，将获得的PET32a质粒和切胶纯化的P24基因片段利用NCOⅠ和XHOⅠ分别双酶切，酶切后的产物分别用omega胶回收试剂盒进行纯化回收，得酶切PET32a质粒和酶切P24基因片段；酶切P24基因片段和酶切PET32a质粒连接，构建PET32a-P24重组质粒，提取PET32a-P24质粒转入BL21菌株中，构成BL21-PET32a-P24菌株，通过IPTG诱导表达P24抗原，利用镍柱填料初次纯化P24抗原后，再经SDS-PAGE电泳切胶回收再次纯化P24抗原，置于磷酸盐缓冲液中，透析，经聚乙二醇8000浓缩得浓缩蛋白，即为纯化的重组P24蛋白。

3.根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述的预包被HIV-1P24抗原酶标板的制备方法是：

（1）将纯化的重组P24蛋白用碳酸盐包被液稀释至2ug/ml，得稀释液，每孔100ul稀释液包被96孔聚苯乙烯微孔板，封膜，4℃，16-18小时；

（2）微孔板洗涤：弃去96孔聚苯乙烯微孔板中液体，用PBS洗涤3次，拍干96孔聚苯乙烯微孔板；

（3）封闭微孔板：在96孔聚苯乙烯微孔板的各个孔中加入200ul封闭液，封膜，置于37℃水浴箱，2h；

（4）微孔板洗涤：弃去96孔聚苯乙烯微孔板中液体，用PBS洗涤3次，拍干96孔聚苯乙烯微孔板；

（5）预包板的保存：装封闭袋中，置于4℃保存备用。

4.根据权利要求1或2或3所述的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于，其检测方法是：

（1）实验设计：根据待测样本的数量选择相应的预包被HIV-1P24抗原酶标板的微孔数量，另设空白对照、阴性对照、阳性对照各一孔；

（2）试剂配制：使用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体，抗体稀释液和辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体的体积比为1:6000，即得酶标二抗工作液；

（3）加样：将待测样本用抗体稀释液按体积比1：20稀释，每个待测样本的微孔中待测样本加入量为50ul、阴性对照的微孔中阴性对照液血清加入量为50ul、阳性对照的微孔中阳性对照液血清加入量为50ul，空白对照的微孔中不加样；

（4）温育：用封板膜封盖反应板，置于37℃水浴箱，温育1h；

（5）洗板：撕去封板膜，弃去微孔中液体，注满洗涤液，浸泡至少5s，反复洗板5次，最后在吸水纸上拍干；

（6）加酶：空白对照的微孔除外，其余每孔加入酶标二抗工作液50ul；

（7）温育：用封板膜封盖反应板，置于37℃水浴箱，30min；

（8）洗板：撕去封板膜，弃去微孔中液体，注满洗涤液，浸泡至少5s，反复洗板5次，最后在吸水纸上拍干；

（9）加底物液：待测样本的微孔、阴性对照的微孔、阳性对照的微孔和空白对照的微孔内均加入显色剂TMBA液和显色剂TMBB液各50ul，震荡仪震荡混匀，置于37℃水浴箱，温育15min；

（10）加终止液：待测样本的微孔、阴性对照的微孔、阳性对照的微孔和空白对照的微孔内均加入50ul终止液，震荡仪震荡混匀；

（11）检测：取波长450nm设定酶标仪检测，以空白对照的微孔校零，再读取各孔OD值；

（12）结果判断：阴性对照A值*2.5＝临界值，阴性对照高于0.05时按实际OD值算，阴性对照小于0.05按0.05计算，凡待测样本的A值大于临界值即为阳性，反之，则为阳性。