CN102121009B

CN102121009B - 特异结合丙型肝炎病毒核心蛋白的核酸适体及其应用

Info

Publication number: CN102121009B
Application number: CN 201010581008
Authority: CN
Inventors: 方晓红; 张振; 赵子龙; 徐丽; 朱海珍
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2010-12-09
Filing date: 2010-12-09
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2030-12-09
Also published as: CN102121009A

Abstract

本发明公开了一种特异结合丙型肝炎病毒核心蛋白的核酸适体及其应用。本发明提供的核酸适体，是如下(a)或(b)：(a)序列表的序列2所示的单链DNA；(b)含有(a)所述核酸适体的单链DNA。所述核酸适体与丙型肝炎病毒核心蛋白具有较好的亲和能力。利用本发明的核酸适体，可以捕获溶液中的丙型肝炎病毒病毒核心蛋白，也可以检测溶液中丙型肝炎病毒的核心蛋白，将有利于丙型肝炎血清学诊断和血液筛查。利用本发明的核酸适体，部分代替单克隆抗体捕获核心蛋白进行丙型肝炎检测，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本发明具有很高的应用价值。

Description

特异结合丙型肝炎病毒核心蛋白的核酸适体及其应用

技术领域

本发明涉及一种特异结合丙型肝炎病毒核心蛋白的核酸适体及其应用。

背景技术

丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)引起的一种传染性疾病，可以通过血液或血制品感染。目前全世界有近2亿人感染HCV，我国约有4000万至5000万人感染HCV，仅次于乙型肝炎携带者数量。由于丙肝是RNA病毒引起的，目前世界范围内尚未开发出有效的HCV疫苗。丙肝只有早发现、早治疗，才能减轻病毒对肝细胞的破坏。因此，探索、开发新型的HCV早期检测方法具有非常重要的意义。

判断是否感染丙肝的唯一办法是做丙肝血清检测。目前丙型病毒性肝炎的血清学诊断方法包括检测抗HCV抗体和HCV RNA。抗HCV抗体一般出现在感染HCV 12周后，并且有相当一部分病人体内无抗HCV抗体，不利于对HCV的早期诊断。HCV RNA多出现于病毒感染1周后，但临床检测易出现假阳性和假阴性结果。因此这些诊断方法或多或少的存在窗口期检测效果不理想，检测技术操作复杂，仪器昂贵，大批量筛查能力不足等局限性，离早期诊断与临床血液或血制品筛查的要求还有相当差距。

已知HCV基因组编码约3100个氨基酸残基组成的多聚蛋白，该蛋白在机体与病毒蛋白酶作用下可分解为核心蛋白(core)、E1、E2结构蛋白及p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B非结构蛋白。HCV core蛋白出现于HCV感染1周后，可作为HCV早期诊断及临床筛查指标，有望实现窗口期检测。

在国际上美国ORTHO公司于2000年推出了第四代HCV-ELISA试剂盒就是基于HCVcore蛋白的检测。在国内，2005年湖南景达生物工程有限公司也生产了类似的检测HCV病毒试剂盒。尽管这些试剂盒能够检测HCV抗原，但是因为这些试剂盒均采用双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)进行检测，所以需要进行大量单克隆抗体的制备。然而单克隆抗体的制备过程复杂，价格昂贵，保存条件苛刻，这使得检测HCV病毒的成本较高，检测灵敏度也受到严重的影响。

核酸适体(Aptamer，又称适配体，适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生物靶标的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，SELEX)从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有很多优良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性，在生物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异结合丙型肝炎病毒核心蛋白的核酸适体及其应用。

本发明提供的核酸适体，是如下(a)或(b)：

(a)序列表的序列2所示的单链DNA；

(b)含有(a)所述核酸适体的单链DNA。

所述(b)中的核酸适体具体可为序列表的序列1所示的单链DNA(自5’末端第38-72位核苷酸为序列表的序列2所示的单链DNA)。

所述核酸适体与丙型肝炎病毒核心蛋白具有较好的亲和能力。

还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。

所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种：

a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

d)将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。

固定有所述核酸适体的酶标板(如96孔板)也属于本发明的保护范围。可采用酶联放大法检测待测样本中的丙型肝炎病毒核心蛋白，从而实现临床中丙肝病毒的检测。

所述核酸适体可用于制备辅助检测丙型肝炎病毒核心蛋白的试剂盒；所述丙型肝炎病毒核心蛋白如序列表的序列3所示。

所述核酸适体可用于制备辅助检测丙肝患者的试剂盒。

本发明还保护一种辅助检测丙型肝炎病毒核心蛋白的试剂盒，包括所述核酸适体；所述丙型肝炎病毒核心蛋白如序列表的序列3所示。所述试剂盒还可包括包被有丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的酶标板(如96孔板)。所述包被有丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的酶标板具体可为湖南景达制药有限公司生产的具有肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的96孔板。通过包被有丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的酶标板和核酸适体可以检测待测样本中的丙型肝炎病毒核心蛋白。所述待测样本具体可为血清。

本发明还保护一种辅助检测丙肝患者的试剂盒，包括所述核酸适体。所述试剂盒还可包括包被有丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的酶标板(如96孔板)。所述包被有丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的酶标板具体可为湖南景达制药有限公司生产的具有肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的96孔板。丙肝目前尚没有疫苗预防，因此早期检测就显得相当重要。发展在“窗口期”内查出丙型肝炎病毒是目前国际研究和临床的热点问题。利用本发明的核酸适体，可以在丙型肝炎病毒感染1周后，通过检测丙型肝炎病毒核心抗原而不是抗体实现对丙型肝炎病毒的检测。本发明的核酸适体将有利发展丙肝检测的新方法。

本发明还保护固定有所述核酸适体的酶标板在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒可以辅助检测丙型肝炎病毒核心蛋白和/或辅助检测丙肝患者；所述丙型肝炎病毒核心蛋白如序列表的序列3所示。

利用本发明的核酸适体，可以捕获溶液中的丙型肝炎病毒核心蛋白，也可以检测溶液中的丙型肝炎病毒核心蛋白，将有利于丙型肝炎血清学诊断和血液筛查。利用本发明的核酸适体，部分代替单克隆抗体捕获核心蛋白进行丙型肝炎检测，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本发明具有很高的应用价值。

附图说明

图1为实施例1中带组氨酸标签蛋白的western-blot结果；A：带组氨酸标签的丙型肝炎病毒核心蛋白；B：带组氨酸标签的PET蛋白。

图2为实施例3中核酸适体的特异性检测结果。

图3为实施例4中核酸适体的特异性检测结果。

图4为实施例5中应用核酸适体板检测靶标蛋白的检测结果；A为核酸适体板上的核酸适体对靶标蛋白的捕获作用的结果；B为用核酸适体板检测靶标蛋白的特异性的结果；C为采用核酸适体板检测血清中的靶标蛋白的结果。

图5为实施例6中在单克隆抗体板上采用核酸适体检测血清中的靶标蛋白的结果；A为应用单克隆抗体板和核酸适体检测靶标蛋白的特异性的结果；B为采用单克隆抗体板和核酸适体检测血清中的靶标蛋白的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒(显色液A+B、辣根过氧化物酶(HRP)修饰的丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体、具有丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的96孔板)购自湖南景达制药有限公司。Ni-NTA琼脂糖微珠购自Qiagen公司。链霉亲和素修饰的96孔板(购于pierce公司)。辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素购自pierce公司。大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株购自北京鼎国公司。大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)菌株购自Invitrogen公司。

原核表达载体pLM1；公众可以从中国科学院化学研究所获得；参考文献：SodeokaM，Larson C，Chen L，et al.A multifunctional plasmid for protein expressionby ECPCR：overproduction of the p50 subunit of NF-κB.Bioorg Med Chem Lett.1993，3：1089-1094。

实施例1、相关蛋白和相关溶液的制备

一、带组氨酸标签的丙型肝炎病毒核心蛋白(靶标蛋白)的制备

1、HCV核心蛋白的编码基因的扩增

制备序列表的序列4所示的DNA(丙型肝炎病毒核心蛋白的编码基因，GENBANKACCESSION NO.HM566118.1，编码序列表的序列3所示的丙型肝炎病毒核心蛋白)，作为PCR扩增的模板，用引物1和引物2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

引物1(上游引物)：5’-CGCGCGAATTCATGAGCACGAATCCT-3’；

引物2(下游引物)：5’-CTGCAGGGATCCAGAGGCCGGGACGGTCA-3’；

上、下游引物的5’端分别引入EcoR1酶切位点和BamH1酶切位点。

PCR扩增条件：95℃2min；95℃30s，66℃30s，72℃1min，35个循环；72℃7min。

2、原核表达载体的构建

①用限制性酶EcoR1和BamH1双酶切步骤1的PCR扩增产物，得到酶切产物。

②用限制性酶EcoR1和BamH1双酶切原核表达载体pLM1，回收载体骨架。

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到连接产物。

④将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含氨苄青霉素(Amp)的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒依次进行酶切鉴定和测序鉴定。

测序结果表明，得到了重组质粒pLM1-core(骨架质粒为原核表达载体pLM1，在EcoR1和BamH1酶切识别位点之间插入了序列表的序列4所示的DNA，序列4所示的丙型肝炎病毒核心蛋白的编码基因与载体上的组氨酸标签的编码基因融合，表达带组氨酸标签的丙型肝炎病毒核心蛋白)。

3、带组氨酸标签的丙型肝炎病毒核心蛋白的原核表达鉴定

①将重组质粒pLM1-core转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆。

②挑取阳性克隆于LB液体培养基，37℃振摇过夜，加入IPTG(终浓度1mmol/L)继续培养诱导10h。

③13000rpm离心1min，收集菌体进行SDS-PAGE电泳和Western blot。Westernblot的一抗为anti-his(购自Sigma公司)。Western blot的结果见图1A。结果表明，菌体中含有带组氨酸标签的丙型肝炎病毒核心蛋白。

4、带组氨酸标签的丙型肝炎病毒核心蛋白的大量表达、纯化及检测

①将重组质粒pLM1-core转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到重组菌。

②将步骤①得到的重组菌接种LB培养基，37℃振荡培养过夜，按1∶50的体积比转接到含50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振摇培养约2h(使OD600为0.6-0.8)，加入IPTG(终浓度1mmol/L)继续培养诱导12h。

③3500rpm离心收集菌体，在含100ug/ml溶菌酶的start buffer(0.02M磷酸钠，0.5M NaCl，pH7.4)中超声破碎(频率120w，每个循环内超声3s停3s，400个循环，在冰浴上进行)，4℃、10000rpm离心10min，收集裂解上清。

④将裂解上清上样于Ni-NTA偶联的琼脂糖黏附柱(购自GE公司)，用washingbuffer(0.02M磷酸钠，0.5M NaCl，0.05M咪唑，pH7.4)洗涤去除杂蛋白，用elutionbuffer(0.02M磷酸钠，0.5M NaCl，0.5M咪唑，pH7.4)洗脱目的蛋白，得到带组氨酸标签的丙型肝炎病毒核心蛋白(用丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒检测为阳性)。

二、带组氨酸标签的PET蛋白的(对照蛋白)制备

1、制备序列表的序列6所示的DNA(PET蛋白的编码基因，GENBANK ACCESSION NO.U46489.1，编码序列表的序列5所示的PET蛋白)，插入原核表达载体pLM1的EcoR1和BamH1位点之间，得到重组质粒pLM1-PET(骨架质粒为原核表达载体pLM1，在EcoR1和BamH1酶切识别位点之间插入了序列表的序列6所示的DNA，序列6所示的PET蛋白的编码基因与载体上的组氨酸标签的编码基因融合，表达带组氨酸标签的PET蛋白)。

2、带组氨酸标签的PET蛋白的原核表达鉴定

①将重组质粒pLM1-PET转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆。

③13000rpm离心1min，收集菌体进行SDS-PAGE电泳和Western blot。Westernblot的一抗为anti-his(购自Sigma公司)。Western blot的结果见图1B。结果表明，菌体中含有带组氨酸标签的PET蛋白。

3、用重组质粒pLM1-PET代替重组质粒pLM1-core，其它同步骤一的4，得到带组氨酸标签的PET蛋白。

三、相关溶液的制备

PBS缓冲液：pH为7.4，由水和溶质组成；溶质及其浓度为：39mM NaH₂PO₄，61mMNa₂HPO₄，150mM NaCl。

结合缓冲液：pH为7.4，由PBS缓冲液和溶质组成；溶质及其浓度为：1mM MgCl₂，0.2mg/ml酵母转移RNA。

洗涤液：pH为7.4，由水和溶质组成；溶质及其浓度为：25mM Tris，150mM NaCl，0.1％(质量百分含量)牛血清白蛋白(BSA)，0.05％(体积百分含量)Tween-20。

TBST缓冲液：pH为7.4，由水和溶质组成；溶质及其浓度为：0.02M Tris-HCl，160mM NaCl，0.1％(体积百分含量)Tween-20。

将实施例1制备的带组氨酸标签的丙型肝炎病毒核心蛋白(靶标蛋白，为溶液形式，靶标蛋白的浓度为100ug/mL)、实施例1制备的带组氨酸标签的PET蛋白(对照蛋白，为溶液形式，对照蛋白的浓度为100ug/mL)和实施例1制备的各种相关溶液用于实施例2至实施例6。

实施例2、核酸适体的筛选和制备

一、蛋白的固定

1、取Ni-NTA琼脂糖微珠置于5ml离心管中，移走上清，PBS缓冲液洗涤三次；

2、将步骤1的微珠分散于靶标蛋白(或对照蛋白)中，室温孵育1h，PBS缓冲液离心洗涤三次；

3、将步骤2的微珠重新分散于1ml PBS缓冲液中，置于4℃备用。

二、随机核酸文库的设计

设计两端包含20个核苷酸、中间包括40个核苷酸的随机核酸文库如下：5’-ACGCTCGGATGCCACTACAG(N₄₀)CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’；N₄₀代表40个随机核苷酸。

三、核酸适体的筛选

1、DNA文库预处理

将随机核酸文库溶于结合缓冲液中。

2、反筛

将随机核酸文库与固定有对照蛋白的微珠混合，37℃孵育1-2小时；经结合缓冲液洗涤后，将微珠通过超滤离心。

3、正筛

将反筛过程中超滤离心的溶液加入固定有靶标蛋白的微珠中，37℃孵育1-2小时。将微珠通过超滤离心洗涤后，用灭菌水将微珠转移到离心管中。将微珠经95℃加热10min、冰上冷却10min、高速离心后，收集上清液并以其中的DNA为模板，利用引物(FITC-5’-ACG CTC GGA TGC CAC TAC AG-3’和Biotin-5’-GTC ACC AGC ACG TCCATG AG-3’)进行PCR扩增；扩增后通过亲和素包被的葡聚糖珠分离生物素标记的PCR产物，然后利用0.2M的氢氧化钠使双链DNA变性解链，收集FITC标记的DNA单链，这些DNA单链脱盐后用于下一轮筛选。

为了获得高亲和性和特异性结合靶标蛋白的核酸适体，在筛选的过程中逐步改变反筛和正筛的蛋白量、筛选时间、筛选溶液中tRNA含量以及正筛洗涤次数，以增加筛选压力。

8轮筛选后，以筛选产物为模板通过引物(5’-ACG CTC GGA TGC CAC TAC AG-3’和5’-GTC ACC AGC ACG TCC ATG AG-3’)进行PCR扩增，将PCR产物进行测序。

最终选择的核酸适体(HCVs)序列如下(见序列表的序列1)：

5’-ACGCTCGGATGCCACTACAG

CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’；

其中加粗下划线标记的为核心序列。

四、核酸适体的优化

步骤三得到的核酸适体较长，经结构分析后，设计并合成一系列经截短的核酸序列，与荧光染料修饰的全长核酸适体进行竞争反应，挑选竞争能力最强的结合序列用于进一步的应用，优化后的序列长度可减少至原序列的二分之一。

最终得到截短的核酸适体(HCVs1)序列如下(见序列表的序列2)：

5’-C ACG ACC GAC GAA AAA ACA CAA CCT CAT GGA CGT G-3’。

五、核酸适体和随机核酸文库的制备

1、核酸适体HCVs的制备

合成序列表的序列1所示的单链DNA，即为核酸适体HCVs。

2、核酸适体HCVs1的制备

合成序列表的序列2所示的单链DNA，即为核酸适体HCVs1。

3、随机核酸文库的制备

合成步骤二设计的随机核酸文库。

将实施例2制备的核酸适体HCVs、核酸适体HCVs 1和随机核酸文库进行实施例3至实施例6

实施例3、核酸适体的特异性(通过荧光素检测)

一、核酸适体和随机核酸文库的FITC标记

用异硫氰酸荧光素(FITC)标记实施例2制备的核酸适体HCVs。

用异硫氰酸荧光素(FITC)标记实施例2制备的核酸适体HCVs1。

用异硫氰酸荧光素(FITC)标记实施例2制备的的随机核酸文库。

二、核酸适体的特异性

1、蛋白的固定

(1)靶标蛋白的固定

①取200ul Ni-NTA琼脂糖微珠置于5ml离心管中，移走上清，PBS缓冲液洗涤三次；

②将步骤①的微珠分散于1mL靶标蛋白中，室温孵育1h，PBS缓冲液离心洗涤三次；

③将步骤①的微珠重新分散于1ml PBS缓冲液中，置于4℃备用。

(2)对照蛋白的固定

用对照蛋白代替靶标蛋白，其它同步骤(1)。

2、核酸适体与靶标蛋白结合的特异性

设置以下6组处理：

第1组：将1ul 10uM FITC标记的核酸适体HCVs用结合缓冲液溶解(核酸适体HCVs终浓度为100nM)，与70ul固定有靶标蛋白的微珠孵育1h；

第2组：将1ul 10uM FITC标记的核酸适体HCVs用结合缓冲液溶解(核酸适体HCVs终浓度为100nM)，与70ul固定有对照蛋白的微珠孵育1h；

第3组：将1ul 10uM FITC标记的核酸适体HCVs1用结合缓冲液溶解(核酸适体HCVs1终浓度为100nM)，与70ul固定有靶标蛋白的微珠孵育1h；

第4组：将1ul 10uM FITC标记的核酸适体HCVs1用结合缓冲液溶解(核酸适体HCVs1终浓度为100nM)，与70ul固定有对照蛋白的微珠孵育1h。

第5组：将1ul 10uM FITC标记的随机核酸文库用结合缓冲液溶解(随机核酸文库终浓度为100nM)，与70ul固定有靶标蛋白的微珠孵育1h；

第6组：将1ul 10uM FITC标记的随机核酸文库用结合缓冲液溶解(随机核酸文库终浓度为100nM)，与70ul固定有对照蛋白的微珠孵育1h；

各组均在刚刚加入微珠的时刻(结合前)和孵育1小时的时刻(结合后)取上清液，测量荧光强度。

结合率＝(结合前荧光强度-结合后清液荧光强度)/结合前荧光强度×100％。

各组的结合率见图2。核酸适体HCVs和核酸适体HCVs1与靶标蛋白的结合率均大于50％，而与对照蛋白的结合率均小于5％。核酸适体HCVs1与靶标蛋白的结合能力高于核酸适体HCVs。随机核酸文库与靶标蛋白和对照蛋白的结合率都很低。结果表明：核酸适体HCVs和核酸适体HCVs1对靶标蛋白具有很好的特异性。

实施例4、核酸适体的特异性(通过辣根过氧化物酶检测)

一、核酸适体的生物素标记

用生物素(biotin)标记实施例2制备的核酸适体HCVs。

用生物素(biotin)标记实施例2制备的核酸适体HCVs1。

二、核酸适体的特异性

将1.5ul靶标蛋白点在硝酸纤维素膜上，待吸收完全后，将膜用5％(质量百分含量)BSA水溶液在室温条件下封闭2小时(2-3小时均可)；然后将生物素标记的核酸适体(HCVs或HCVs1)用结合缓冲液溶解，得到核酸适体溶液(生物素标记的核酸适体的浓度为100nM)；将1mL核酸适体溶液与带有靶标蛋白的膜37℃杂交1小时(1-2小时均可)；用TBST缓冲液清洗后，用辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素孵育，发光显迹。

将1.5ul对照蛋白点在硝酸纤维素膜上，待吸收完全后，将膜用5％(体积百分含量)BSA水溶液在室温条件下封闭2小时(2-3小时均可)；然后将生物素标记的核酸适体(HCVs或HCVs1)用结合缓冲液溶解，得到核酸适体溶液(生物素标记的核酸适体的浓度为100nM)；将1mL核酸适体溶液与带有对照蛋白的膜37℃杂交1小时(1-2小时均可)；用TBST缓冲液清洗后，用辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素孵育，发光显迹。

结果见图3。对照蛋白处无斑点产生，而靶标蛋白处呈现黑色斑点。结果表明：核酸适体HCVs和核酸适体HCVs1与靶标蛋白的结合具有特异性，可用于靶标蛋白的检测。

实施例5、应用核酸适体板检测靶标蛋白

一、核酸适体板的制备

1、核酸适体的生物素标记

用生物素(biotin)标记实施例2制备的核酸适体HCVs。

用生物素(biotin)标记实施例2制备的核酸适体HCVs1。

2、核酸适体板的制备

(1)HCVs核酸适体板的制备

将生物素标记的HCVs核酸适体用结合缓冲液溶解(生物素标记的核酸适体的浓度为100nM)，然后加入链霉亲和素修饰的96孔板，每孔加入200微升，孵育1小时；经洗涤液洗涤后，置于4℃备用。

(2)HCVs1核酸适体板的制备

将生物素标记的HCVs1核酸适体用结合缓冲液溶解(生物素标记的核酸适体的浓度为100nM)，然后加入链霉亲和素修饰的96孔板，每孔加入200微升，孵育1小时；经洗涤液洗涤后，置于4℃备用。

(3)对照板的制备

将结合缓冲液加入链霉亲和素修饰的96孔板，每孔加入200微升，孵育1小时；经洗涤液洗涤后，置于4℃备用。

二、核酸适体板上的核酸适体对靶标蛋白的捕获作用

设置以下4组处理：

第1组：将靶标蛋白加入HCVs核酸适体板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入HRP修饰的丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟；

第2组：将靶标蛋白加入HCVs1核酸适体板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入HRP修饰的丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟；

第3组：将靶标蛋白加入对照板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入HRP修饰的丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟；

第4组：将靶标蛋白加入对照板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入HRP修饰的丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟。

显色后检测450nm下的光吸收值。将第3组的光吸收值作为1，计算核酸适体板的相对吸光强度，结果见图4A。HCVs核酸适体板和HCVs1核酸适体板的相对吸光强度显著高于对照板。核酸适体HCVs和核酸适体HCVs1对靶标蛋白具有显著的捕获作用。

三、用核酸适体板检测靶标蛋白的特异性

设置以下6组处理：

第1组：将对照蛋白加入到HCVs核酸适体板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入HRP修饰的丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟；

第2组：将对照蛋白加入到HCVs1核酸适体板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入HRP修饰的丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟；

第3组：将靶标蛋白加入到HCVs核酸适体板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入HRP修饰的丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟；

第4组：将靶标蛋白加入到HCVs1核酸适体板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入HRP修饰的丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟；

第5组：将结合缓冲液加入到HCVs核酸适体板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入HRP修饰的丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟；

第6组：将结合缓冲液加入到HCVs1核酸适体板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入HRP修饰的丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟。

显色后检测450nm下的光吸收值。将第5组的光吸收值作为1，计算核酸适体板的相对吸光强度，结果见图4B。结果表明，HCVs核酸适体板和HCVs1核酸适体板与靶标蛋白的结合能力显著高于与对照蛋白的结合能力。

四、采用核酸适体板检测血清中的靶标蛋白

设置以下4组处理：

第1组：在80ul小牛血清中加入20ul靶标蛋白，得到含靶标蛋白的血清；将含靶标蛋白的血清与结合缓冲液等体积混合，加入到HCVs核酸适体板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入HRP修饰的丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟；

第2组：在80ul小牛血清中加入20ul靶标蛋白，得到含靶标蛋白的血清；将含靶标蛋白的血清与结合缓冲液等体积混合，加入到HCVs1核酸适体板中，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入HRP修饰的丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟；

第3组：将小牛血清加入到HCVs核酸适体板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入HRP修饰的丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟；

第4组：将小牛血清加入到HCVs1核酸适体板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入HRP修饰的丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟。

显色后检测450nm下的光吸收值。将第3组的光吸收值作为1，计算核酸适体板的相对吸光强度，结果见图4C。结果表明，核酸适体HCVs和核酸适体HCVs1可以检测血清中的靶标蛋白。

步骤二至四的实验结果表明：核酸适体能特异性的捕获靶标蛋白，通过HRP标记的抗体实现靶标蛋白的检测，从而该核酸适体在临床上可用于丙型肝炎病毒的检测；同时，核酸适体板能够特异性的检测血清中的靶标蛋白，从而在临床上可用于丙肝患者的血清学诊断。

实施例6、在单克隆抗体板上采用核酸适体检测血清中的靶标蛋白

一、核酸适体的生物素标记

同实施例5的步骤一。

二、应用单克隆抗体板和核酸适体检测靶标蛋白的特异性

设置以下6组处理：

第1组：将靶标蛋白加入到具有丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的96孔板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入生物素标记的核酸适体HCVs，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素，37℃孵育30分钟(30-60分钟均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟；

第2组：将靶标蛋白加入到具有丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的96孔板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入生物素标记的核酸适体HCVs1，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素，37℃孵育30分钟(30-60分钟均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟；

第3组：将对照蛋白加入到具有丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的96孔板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入生物素标记的核酸适体HCVs，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素，37℃孵育30分钟(30-60分钟均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟；

第4组：将对照蛋白加入到具有丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的96孔板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入生物素标记的核酸适体HCVs1，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素，37℃孵育30分钟(30-60分钟均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟；

第5组：将结合缓冲液加入到具有丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的96孔板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入生物素标记的核酸适体HCVs，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素，37℃孵育30分钟(30-60分钟均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟；

第6组：将结合缓冲液加入到具有丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的96孔板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入生物素标记的核酸适体HCVs1，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素，37℃孵育30分钟(30-60分钟均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟；

显色后检测450nm下的光吸收值。将第5组的光吸收值作为1，计算核酸适体板的相对吸光强度，结果见图5A。结果表明，核酸适体HCVs和核酸适体HCVs1与靶标蛋白的结合能力显著高于对照蛋白。

三、采用单克隆抗体板和核酸适体检测血清中的靶标蛋白

(1)采用HCVs核酸适体板检测血清中的靶标蛋白

设置以下4组处理：

第1组：在80ul小牛血清中加入20ul靶标蛋白，得到含靶标蛋白的血清；将含靶标蛋白的血清与结合缓冲液等体积混合，加入到具有丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的96孔板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入生物素标记的核酸适体HCVs，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素，37℃孵育30分钟(30-60分钟均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟；

第2组：在80ul小牛血清中加入20ul靶标蛋白，得到含靶标蛋白的血清；将含靶标蛋白的血清与结合缓冲液等体积混合，加入到具有丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的96孔板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入生物素标记的核酸适体HCVs1，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素，37℃孵育30分钟(30-60分钟均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟；

第3组：将小牛血清加入到具有丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的96孔板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入生物素标记的核酸适体HCVs，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素，37℃孵育30分钟(30-60分钟均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟；

第4组：将小牛血清加入到具有丙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的96孔板，200ul每孔，37℃孵育1小时(1-2小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入生物素标记的核酸适体HCVs1，37℃孵育0.5小时(0.5-1小时均可)；经洗涤液洗涤后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素，37℃孵育30分钟(30-60分钟均可)；经洗涤液洗涤后，加入显色液A+B，显色10分钟。

显色后检测450nm下的光吸收值。将第3组的光吸收值作为1，计算其它组的相对吸光强度，结果见图5B。

结果表明，单克隆抗体板与核酸适体(HCVs或HCVs1)结合可以检测血清中的靶标蛋白。