CN103396481B - 一种二型登革热病毒ns1蛋白的重链单域抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种二型登革热病毒NS1蛋白的重链单域抗体及其制备方法和应用。发明采用羊驼非免疫重链单域抗体库，用重组表达的登革热病毒NS1蛋白通过多轮生物筛选，采用ELISA法挑选得到能特异性结合的噬菌体单克隆，并进行DNA序列测定，然后转化至大肠杆菌中表达，即得到重链单域抗体。筛选得到的重链单域抗体能在大肠杆菌中高效表达，并能用于制备胶体金检测试剂盒检测二型登革热病毒感染，检测准确性更高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及针对二型登革热病毒NS1蛋白产生的重链单域抗体。发明涉及编码重链单域抗体的氨基酸序列以及采用羊驼非免疫库筛选制备重链单域抗体的方法。得到的重链单域抗体能在大肠杆菌中高效表达，并能用于制备胶体金检测试剂盒检测二型登革热病毒感染。
背景技术
登革热是由登革热病毒感染引起、依靠蚊子传播的一种疾病。近十年来，全世界范围内登革热感染日益增加，每年感染人数达到5000万～1亿。此病传播迅速，发病率高，可通过现代化交通工具远距离传播，故多发生在交通沿线及对外开放的城镇。严重且致命的登革出血热（dengue hemorrhagic fever，DHF）或登革休克综合症（dengue shock syndrome，DSS），其病死率可达12%-44%，是一种具有严重危害性的传染病。目前登革热感染诊断方法包括病毒分离、病毒核酸检测、抗原抗体检测以及这些方法的综合运用【Kao C.L.，WuM.C.，Chiu Y.H.，et al.Flow cytometry compared with indirect immunofluorescence for rapiddetection of Dengue virus type1after amplification in tissue culture.J Clin Microbiol，2001，39:3672-3677.】。登革热病毒基因编码三个结构蛋白（Structural Protein）和七个非结构蛋白(non-structural protein，NS)【Cahour A.，Falgout B.，Lai C.J.Cleavage of the dengue viruspolyprotein at the NS3/N84A and N84B/NS5junction is mediated by viral proteinaseN82B-N83，whereas NS4A/NS4B may be processed by a cellular protease.J Virol，1992，66:1525-1542.】。其中NS1是二型登革热病毒基因中被认为与免疫原性重要相关的一种非结构蛋白，现已发现，在患者出现临床症状后的1到6天之内即可检测出NS1的可溶性血清抗原；无论是初次感染还是再次感染患者，其NS1血清抗原都在第3到5天达到最高值【AlconS.，Talarmin A.，Debruyne M.，et al.Enzyme-linked immunosorbent assay specific to denguevirus type1nonstructural protein NS1reveals circulation of the antigen in the blood during theacute phase of disease in patients experiencing primary or secondary infections.J ClinMicrobiol，2002，40:376-381.】。这些特性使NS1成为一种极有价值的分子标记，用于快速诊断试剂盒的开发。
1993年，比利时科学家在骆驼血液中发现天然缺失轻链的重链抗体【Hamers-CastermanC，Atarhouch T，Muyldermans S，et al.Naturally occurring antibodies devoid of light chains.Nature1993，363:446–448.】，与传统抗体相比，重链单域抗体具有分子量小、易表达、高特异性、高亲和力等特点，且能识别独特构象的抗原表位，作为一种新型的基因工程抗体，在基础科学研究、药物开发等领域展现出了广阔的前景【M.M.Harmsen，H.J.De Haard.Properties，production，and applications of camelid single-domain antibody fragments.ApplMicrobiol Biotechnol，2007，77:13-22.】。目前还未见有关二型登革热病毒NS1蛋白的重链单域抗体的报道。
发明内容
本发明的目的是提供针对重组二型登革热病毒NS1的重链单域抗体的氨基酸编码序列及重链单域抗体的独特制备方法，以及该抗体应用于登革热病毒感染的检测应用。
针对二型登革热病毒NS1蛋白的重链单域抗体是由框架区和互补决定区组成，其中框架区FR1-FR4的氨基酸序列为：
FR1：QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAS，见SEQ NO.1
或QVQLVESGGGLVQPGASLRLSCAAS，见SEQ NO.2
或QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS，见SEQ NO.3
FR2：LGWFRQAPGKEREFVAA，见SEQ NO.4
或MGWYRQAPGKQRELVAS，见SEQ NO.5
FR3:NYADSVKGRFTISRDSAKNTLFLQLNSLKPEDTAVYYC，见SEQ NO.6
或NYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC，见SEQ NO.7
FR4:WGQGTQVTVSS，见SEQ NO.8
互补决定区CDR1-CDR3的氨基酸序列为：
CDR1：GRTFSTST，见SEQ NO.9
或RSIFRFYA，见SEQ NO.10
CDR2:ISWLGGRT，见SEQ NO.11
或ITRGGIT，见SEQ NO.12
CDR3：YARRLGVDY，见SEQ NO.13
或NRVGPLGSTPRE，见SEQ NO.14
或YARRIGRDY，见SEQ NO.15
作为一种优选方式所述的重链单域抗体分别编号为P2，P9，P10，P13，其中P2的氨基酸序列为，见SEQ NO.16
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSTSTLGWFRQAPGKEREFVAAISWLGGRTNYADSVKGRFTISRDSAKNTLFLQLNSLKPEDTAVYYCYARRLGVDY WGQGTQVTVSS。
P9的氨基酸序列为，见SEQ NO.17
QVQLVESGGGLVQPGASLRLSCAASRSIFRFYAMGWYRQAPGKQRELVASITRGGITNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNRVGPLGSTPREWGQGTQVTVSS。
P10的氨基酸序列为，见SEQ NO.18
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIFRFYAMGWYRQAPGKQRELVASITRGGITNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC YARRIGRDYWGQGTQVTVSS。
P13的氨基酸序列为，见SEQ NO.19
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSTSTLGWFRQAPGKEREFVAAISWLGGRTNYADSVKGRFTISRDSAKNTLFLQLNSLKPEDTAVYYCNRVGPLGSTPREWGQGTQVTVSS。
P2，P9，P10，P13蛋白质的氨基酸序列：左侧开始为氨基端，右侧结束为羧基端；其顺序为：无下划线的序列分别是框架区，FR1-FR4；有下划线的是抗原结合互补区，CDR1-CDR3。
进一步说明：
P2的核酸序列，SEQ NO.20
CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCGGGCGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGTACATCTACCTTGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTGGCAGCTATTAGCTGGCTTGGTGGGCGCACAAACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCGAGAGACAGCGCCAAGAACACGCTGTTTCTGCAACTGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTTATGCCAGGCGGCTTGGAGTAGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
P9的核酸序列，SEQ NO.21
CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGCGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTAGAAGCATCTTCAGGTTCTATGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCATCTATTACGCGTGGTGGTATTACAAACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTAATAGAGTCGGGCCGTTGGGTAGTACTCCGAGGGAATGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
P10的核酸序列，SEQ NO.22
CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCAGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTAGAAGCATCTTCAGGTTCTATGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCATCTATTACGCGTGGTGGTATTACAAACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTTACGCACGAAGAATTGGGCGTGACTATTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
P13的核酸序列，SEQ NO.23
CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCGGGCGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGTACATCTACCTTGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTGGCAGCTATTAGCTGGCTTGGTGGGCGCACAAACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCGAGAGACAGCGCCAAGAACACGCTGTTTCTGCAACTGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTAATAGAGTCGGGCCGTTGGGTAGTACTCCGAGGGAATGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
本发明利用重组表达的二型登革热病毒NS1蛋白筛选羊驼非免疫重链单域抗体基因库，得到了针对NS1的特异性重链单域抗体，将此抗体基因与表达载体pET22b连接，构建了在大肠杆菌中高效表达的重链单域抗体细胞株，在实验室小量摇瓶试验诱导后，经镍柱亲和层析纯化，蛋白得率为8mg/L细菌培养基。该重链单域抗体能用于检测二型登革热病毒感染，检测准确性更高。
附图说明
图1为重组表达的NS1蛋白经镍柱亲和层析纯化后的电泳图，SDS-PAGE结果所示，M为标准分子量蛋白marker，1为洗脱的NS1蛋白，分子量约为42kDa。
图2重链单域抗体的基因电泳图，P2，P9，P10，P13的PCR产物条带约为400bp。
图3为P2，P9，P10，P13经镍柱亲和层析纯化后的电泳图，SDS-PAGE结果所示，M为标准分子量蛋白marker，1，2，3，4分别为洗脱的P2，P10，P9，P13抗体蛋白，分子量约为15kDa。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，本发明未特别注明的参数可参照常规技术进行。
实施例1
抗二型登革热病毒NS1蛋白的重链单域抗体的构建方法，包括如下步骤：
步骤1、二型登革热病毒NS1蛋白的制备：
（1）设计一对引物（上游引物1：5′-TTACATATGGATAGTGGTTGCGTTGTGAGC-3′，见SEQ NO.24和下游引物1：5′-TTAGTCGACGGCTGTGACCAAGGAGTTGA-3′，见SEQ NO.25），从二型登革热NGC菌株感染过的C6/36蚊子细胞培养上清中提取总RNA，采用Takara公司的one step Prime Script RT-PCR试剂盒进行RT-PCR扩增，得到全长为1.1kb左右的基因片段，然后连接到pET-30a原核表达载体（TaKaRa公司，中国大连）中，测序，得到基因序列正确的目的基因。
（2）在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达带有组氨酸标签的NS1重组蛋白。重组蛋白以包涵体形式表达，经过复性后，采取镍柱亲和层析纯化，得率可以达到135mg/L细菌培养物。
其中PCR扩增的条件为：采用购买的试剂盒（Takara公司），按照说明书进行操作，在50μl反应体系中，模版RNA为40μL（1μg），上下游引物（10μM）各1μL，2倍试剂盒反应混合液25μL，水补足到50μL总体积。扩增条件：94℃，4分钟；在94℃，30秒，63℃，30秒，72℃，30秒条件下共34个循环，然后在72℃，3分钟。经琼脂糖凝胶电泳检测获得1.1kb左右的PCR产物。
NS1的氨基酸序列，见SEQ NO.26:
DSGCVVSWKNKELKCGSGIFITDNVHTWTEQYKFQPESPSKLASAIQKAHEEGICGIRSVTRLENLMWKQITPELNHILSENEVKLTIMTGDIKGIMQAGKRSLRPQPTELKYSWKTWGKAKMLPTESHNQTFLIDGPETAECPNTNRAWNSLEVEDYGFGVFTTNIWLKLREKQDVFCDSKLMSAAIKDNRAVHADMGYWIESALNDTWKIEKASFIEVKSCHWPKPHTLWSNGVLESEMIIPKNFAGPVSQHNYRPGYHTQTAGPWHLGKLEMDFDFCEGTTVVVTEDCGDRGPSLRTTTASGKLITEWCCRSCTLPPLRYRGEDGCWYGMEIRPLKEKEENLVNSLVTA
NS1的核苷酸序列，见SEQ NO.27
GATAGTGGTTGCGTTGTGAGCTGGAAAAACAAAGAACTGAAGTGTGGCAGTGGGATTTTCATCACAGACAACGTGCACACATGGACAGAACAATACAAGTTCCAACCAGAATCCCCTTCAAAACTAGCTTCAGCTATCCAGAAAGCTCATGAAGAGGGCATTTGTGGAATCCGCTCAGTAACAAGACTGGAAAATCTGATGTGGAAACAAATAACACCAGAATTGAATCACATTCTATCAGAAAATGAGGTGAAGTTGACTATTATGACAGGAGACATCAAAGGAATCATGCAGGCAGGAAAACGATCTCTGCGGCCCCAGCCCACTGAGCTGAAGTATTCATGGAAAACATGGGGCAAAGCGAAAATGCTCCCTACAGAGTCTCATAACCAGACCTTTCTCATTGATGGCCCCGAAACAGCAGAATGCCCCAACACAAACAGAGCTTGGAATTCGCTGGAAGTTGAAGACTATGGCTTTGGAGTATTCACCACCAATATATGGCTAAAGTTGAGAGAAAAGCAGGATGTATTCTGCGACTCAAAACTCATGTCAGCGGCCATAAAAGACAACAGAGCCGTCCATGCCGATATGGGTTATTGGATAGAAAGTGCACTCAATGACACATGGAAGATAGAGAAAGCCTCTTTCATCGAAGTTAAAAGCTGCCACTGGCCAAAGCCACACACCCTCTGGAGTAATGGAGTGCTAGAAAGTGAGATGATAATTCCAAAGAATTTCGCTGGACCAGTGTCACAACACAACTACAGACCAGGCTACCATACACAAACAGCAGGACCATGGCATCTAGGTAAGCTTGAGATGGACTTTGATTTCTGCGAAGGAACCACAGTGGTGGTGACTGAGGACTGTGGAGATAGAGGACCCTCTCTAAGAACAACTACTGCCTCTGGAAAACTCATAACAGAATGGTGCTGCCGATCTTGCACATTACCACCGCTAAGATACAGAGGTGAGGACGGATGCTGGTACGGGATGGAAATCAGACCATTGAAAGAGAAAGAAGAGAATTTGGTCAACTCCTTGGTCACAGCC
步骤2、针对二型登革热病毒NS1蛋白的重链单域抗体的筛选过程：
（1）在预先包被NS1蛋白（10μg）并且封闭后（封闭液：2％BSA或5%脱脂奶粉）的免疫管中加入100μL噬菌体（1012pfu/mL非免疫羊驼重链单域抗体噬菌体展示库，加入2%BSA或5%脱脂奶粉和0.1%Tween20）室温下作用1小时。
（2）用PBST洗涤10次，PBS洗涤5次，以洗去不能与NS1结合的噬菌体。
（3）用HCl-Glycine溶液（pH2.2，0.1M）将与NS1蛋白特异性结合的噬菌体洗脱，用Tris-HCl缓冲液（1M）中和至pH7.4，并感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复4轮。通过逐步降低抗原包被浓度（第二、三、四轮抗原浓度分别为2.5μg，1μg，1μg）和增加洗涤次数，最终富集获得能与抗原NS1特异结合的噬菌体。
步骤3、采用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选NS1特异性单个阳性克隆：
（1）从上述步骤2中经过4轮富集含有噬菌体的细菌培养皿中，挑选单个菌落并接种于96孔板中，培养过夜；
（2）将过夜培养物转接后，培养至OD600=0.5。每孔加入M13KO7（滴度＞1012pfu/mL），室温静置15min，37℃150rmp摇1h，然后加入160μL2×YT（含Kana，IPTG0.1mmol/L），37℃（30℃）培养过夜。
（3）将含有噬菌体的上清液预封闭，并转移到经NS1纯化蛋白预先包被的ELISA板中，室温放置2小时，用PBST洗去未结合的噬菌体；
（4）加入辣根过氧化物酶标记的抗噬菌体M13的抗体，室温作用1小时；
（5）OPD显色，于ELISA仪上，读取OD492nm值；
（6）当样品孔OD大于对照孔OD2倍以上，判为阳性克隆孔；
（7）PCR扩增或纯化阳性孔的质粒并进行基因测序
依据各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同的克隆株。
步骤4、重链单域抗体表达质粒的构建：
对步骤3中所获得的特异性重链单域抗体基因进行PCR扩增，经BamH I和Hind III双酶切，插入表达载体pET22b中，构建获得能在大肠杆菌中高效表达的质粒，并进行基因测序确定序列的正确性。
PCR扩增的引物：上游引物2：AATAAGGATCCGATGGCCCAGGTGCAGCT，见SEQNO.28；下游引物2：CGACGAAGCTTTGGTTGTGGTTTTGG，见SEQ NO.29。
PCR的扩增体系和条件：采用购买的试剂盒（Takara），按照说明书进行操作，在50μL反应体系中，5xPrimeSTAR缓冲液(Mg2+)10μL，dNTP混合物4μL，上下游引物（10μM）各1μL，模版DNA1μL（200ng），PolySTAR HS DNA聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，水补足到50μL总体积。扩增条件参照说明书进行，98℃，10秒，55℃，15秒，72℃，30秒，共30个循环。经琼脂糖凝胶电泳检测获得400bp左右的PCR产物。
步骤5、重链单域抗体在大肠杆菌中的表达、纯化
（1）将步骤4中测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取单个克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，摇床200转/分培养过夜；
（2）按1/100的比例转接于含氨苄青霉素的LB液体培养基后，37℃，200转/分继续培养至OD600约为0.6-0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，继续培养4h；
（3）离心，收获菌体，加入溶菌酶裂解细菌，离心，收集上清；
（4）采用镍柱亲和层析纯化抗体蛋白，SDS-PAGE图显示重链单域抗体蛋白约15kDa。
实施例2
重链单域抗体应用于登革热病毒感染的检测
（1）分别采用重链单域抗体P2和针对NS1的单克隆抗体作为包被抗体，按照常规方法组装胶体金试纸条（由广州万孚生物技术股份有限公司代为完成）；
（2）将二型登革热病毒感染细胞培养上清分别按1:10，1:20，1:100，1:150稀释，用上述两种不同的胶体金试纸条进行检测，1:150为最低检测限；
（3）采用上述两种试纸条分别检测100份登革阴性血清样本，采用重链单域抗体P2作为包被抗体组装的胶体金试纸条检测时，检出一份假阳性，采用单克隆抗体作为包被抗体组装的胶体金试纸条检测时，检出六份假阳性，参见表1。
表1胶体金法检测结果
“++++”表示强阳性，“+++”表示阳性，“++”表示弱阳性，“±”表示检测限。
Claims (1)
1.一种二型登革热病毒NS1蛋白的重链单域抗体，其特征在于，所述的重链单域抗体的氨基酸序列如下，编号P2：
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSTSTLGWFRQAPGKEREFVAAISWLGGRTNYADSVKGRFTISRDSAKNTLFLQLNSLKPEDTAVYYCYARRLGVDYWGQGTQVTVSS。
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