CN109320607B

CN109320607B - 抗登革病毒de3的纳米抗体、制备方法及用途

Info

Publication number: CN109320607B
Application number: CN201811036758.5A
Authority: CN
Inventors: 胡适; 崔瀛书; 李天�; 雷长海; 傅文燕
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2018-09-06
Filing date: 2018-09-06
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2038-09-06
Also published as: CN109320607A

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，提供了一种抗登革病毒DE3的纳米抗体、制备方法及应用，该抗登革病毒DE3的纳米抗体为VHH抗体，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，编码该纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，通过亲和力分析本发明的纳米抗体具有良好的亲和力，通过体外病毒中和试验，本发明的纳米抗体具有登革4型病毒特异中和活性，并且病毒的中和活性具有浓度依赖关系，说明本发明的纳米抗体具有潜在的的抗登革病毒的作用，对登革热流行或爆发具有优良的预防或治疗作用，具备广阔的临床应用前景。

Description

抗登革病毒DE3的纳米抗体、制备方法及用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗登革病毒DE3的纳米抗体、其制备方法和用途，尤其是在制备登革热疫苗以及在治疗或预防登革病毒流行或爆发方面的用途。

背景技术

随着“加快建设海洋强国”国家政策的逐步推进，我国海军承担维和护航、远洋保障、联合演习等的军事任务日益增加。存在于热带亚热带地区的有毒有害的蚊虫蚁兽是海军战士面临的常见威胁，极易造成部队战斗力的下滑和经济的损失。因此针对热带疾病的防治研究工作对于渡海登陆作战的卫勤保障和医疗工作有重大意义，尽快着手开展治疗热带疾病的科学应用研究是十分必要的。

登革热是分布最广、发病人数最多的虫媒病毒病之一，主要流行于热带和亚热带地区，范围覆盖100多个国家和地区(李玉华.登革病毒及登革热疫苗研究进展[J].国际生物制品学杂志,2012,35(6):292-297)。登革病毒是属于黄病毒科黄病毒属，可导致感染者罹患登革热，严重者发展为登革出血热和登革休克综合征，危及生命(Guzman M G,AlvarezM,Halstead S B.Secondary infection as arisk factor for dengue hemorrhagicfever/dengue shock syndrome:an historical perspective androle ofantibody-dependent enhancement ofinfection[J].Archives ofVirology,2013,158(7):1445-1459)。近十几年来，登革热作为一种重要的病毒性疾病，对包括美洲在内的热带和亚热带地区的公共卫生构成了巨大的威胁，并且有加剧的趋势，其主要媒介是埃及伊蚊。(AzevedoA S,

A J,Archer M,et al.The synergistic effect ofcombinedimmunization with a DNA vaccine and chimeric yellow fever/dengue virus leadsto strong protection against dengue[J].Plos One,2013,8(3):e58357)。目前我国海军部队执行海外维和、保障援助的任务日益增加，海军官兵在热带地区易面临登革病毒感染的风险，对这些地区的海洋作业及军事训练构成一定的威胁。

目前，初次感染登革病毒伴发的登革热一般无特殊治疗，适当休息并进行必要的对症处理即可。然而针对于再次感染登革病毒而引起严重登革出血热和登革休克综合征的患者的主要是实施支持疗法，一般进行快速的血容量补充，纠正休克症状等，帮助患者度过急性期(杨思齐.登革热与登革出血热的治疗[J].人民军医,1995(4):18-19)。由于登革病毒血清型多、致病机制复杂，导致登革热疫苗的研制存在许多困难(Sridhar S,Luedtke A,Langevin E,et al.Effect ofDengue Serostatus on Dengue Vaccine Safety andEfficacy.[J].New England Journal ofMedicine,2018)。目前无治疗重症登革的特效方案，登革热现已成为一个严重的公共卫生问题。

随着分子生物学的发展，采用基因工程制备登革病毒的技术已经成熟，开展登革病毒的生物合成及进行抗登革热抗体的制备研究已经成为可能。登革病毒根据抗原性不同分为4个不同的血清型(DENV1至DENV4)，且每种血清型中包括几种基因型。针对于登革病毒3型(DENV3)，具有三种结构蛋白：衣壳蛋白(C)蛋白、前体膜(PRM)蛋白和包膜(E)蛋白，以及七种非结构蛋白(NS)，称为NS1，NS2A，NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5(Screaton G,Mongkolsapaya J,Yacoub S,et al.New insights into the immunopathology andcontrol ofdengue virus infection[J].Nature Reviews Immunology,2015,15(12):745-59)，应尽快筛选针对该病毒蛋白的特异性抗体药物。由于抗体能够高效、特异地与体内和体外的各种抗原蛋白结合，使得抗体不仅能应用于调节免疫系统功能，还可以应用于各种高灵敏的检测方法。

目前，抗体技术已被广泛地应用于疾病的诊断及治疗中，抗体相关的生物产品也具有极高的应用前景和商业价值。抗体可以通过多种途径获得，例如：动物或人的血液、细胞培养、注射杂交瘤细胞的鼠的腹水等，但均需要有效的方法进行纯化，以获得具有应用价值的抗体产品。色谱纯化技术是目前常用的抗体纯化方法，但因介质价格高、生产量低、操作复杂、不能连续生产，限制了它们的工业应用(应国清,祝骥,王鸿,等.单克隆抗体纯化研究进展[C]//全国化工年会.2008)。

抗体小型化是抗体基因工程研究的主要研究方向之一，如一些单价小分子抗体scFv,但在稳定性、表达产量、蛋白酶抵抗性和聚合性方面仍有待改进(杨珂,王冬.纳米抗体及其应用[J].细胞与分子免疫学杂志,2008,24(4):425-427.)。

针对上述问题，纳米抗体应运而生，纳米抗体是来源于骆驼科动物或软骨鱼的特殊抗体。研究表明，骆驼体内存在一种天然缺失轻链只含重链的抗体，称为重链抗体，克隆重链抗体的可变区可得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，称为VHH抗体(Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,et al.Naturally occurring antibodiesdevoid oflight chains[J].Nature,1993,363(6428):446-448)。VHH抗体的晶体直径仅有2.5nm，长4nm，因此又被称为纳米抗体。纳米抗体的大小只有传统IgG型抗体的十分之一，是天然存在的可与抗原结合的最小片段。(Muyldermans S.Nanobodies:natural single-domain antibodies.[J].Annual Review ofBiochemistry,2013,82(82):775-797)。纳米抗体能被单基因编码，可以很容易的利用微生物进行生产，并具有很高的产率。但目前尚未见针对登革病毒的纳米抗体的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于，依托上述研究背景，提供了一种抗登革病毒DE3蛋白的纳米抗体、其制备方法和用途。

本发明的第一方面，提供了一种抗登革病毒DE3蛋白的纳米抗体，该纳米抗体为VHH抗体，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，编码该纳米抗体的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

纳米抗体氨基酸序列(SEQ ID NO.1)如下：

DVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGMVPYNAMGWWRQAPGKEREFVARNNWSTHWIRKYADSVKGRFAVSRDNAKNTVNLQMNSLKPEDTAVYYCAAYCPCDINAKNHIYDYWGQGTTVTVSS

编码该纳米抗体的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)如下：

GATGTGCAGCTGCAAGAAAGCGGCGGTGGTCTGGTTCAGCCGGGCGGTAGTCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCAAGCGGTGGCATGGTGCCGTACAATGCCATGGGTTGGTGGCGTCAAGCTCCGGGTAAAGAACGCGAATTTGTGGCCCGCAACAATTGGAGCACCCACTGGATCCGCAAATATGCCGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTGCCGTGAGCCGCGACAATGCCAAGAACACCGTGAATTTACAGATGAACTCTTTAAAACCGGAAGATACCGCCGTGTATTACTGCGCCGCCTATTGCCCGTGCGATATCAACGCCAAAAACCACATTTATGATTATTGGGGCCAAGGTACCACCGTTACCGTGAGCAGC

关于抗登革病毒DE3的纳米抗体的获得，先构建抗登革病毒DE3的纳米抗体噬菌体展示文库，然后对纳米抗体进行筛选，并采用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性阳性克隆，经序列分析后得到具有上述氨基酸序列的VHH纳米抗体，该纳米抗体由FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4区组成。

本发明的第二方面，提供了抗登革病毒DE3的纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：

(A)全基因合成抗登革病毒DE3的纳米抗体VHH片段；

(B)采用PCR技术对步骤(A)中获得的抗登革病毒DE3的纳米抗体VHH片段进行克隆，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到表达载体中，测序验证后确认获得正确的克隆；

(C)将上述表达载体引入宿主细胞内进行融合蛋白的表达。

优选的，在步骤(B)中，PCR所采用的引物序列如下：

本发明中，任何合适的载体都适用，优选为pGEM-T、Pet32a，pcDNA3.1、pEE6.4、pEE12.4、Pet22b、pDHFR或pDR1，所述表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。

本发明中，哺乳动物或昆虫宿主细胞或原核细胞培养系统均可用于本发明的融合蛋白的表达。可用的宿主细胞为含有上述载体的原核细胞，可以为DH5a、Top10、BL21(DE3)、TG1之一。

本发明的融合蛋白可在以下细胞中容易地产生：哺乳动物细胞，诸如CHO、NSO、HEK293、BHK或者COS细胞；细菌细胞，诸如大肠杆菌、枯草芽自杆菌或荧光假单胞菌；昆虫细胞，或真菌或酵母细胞，所述细胞使用本领域中己知的技术培养。

本发明中公开的融合蛋白的制备方法为在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达、分离、纯化所述融合蛋白。利用上述方法，可以将抗体纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。

可以利用亲和层析的方法对本发明公开的融合蛋白进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合蛋白多肽。

可采用各种蛋白纯化方法，并且此类方法是本领域中己知的并且描述于例如(Wilchek and Bayer,1990,Methods in enzymology)(Scopes,2013,Proteinpurification:principles andpractice)。

通过Biacore分析，本发明的纳米抗体具有良好的亲和力；通过体外中和试验证明，本发明的纳米抗体具有登革4型病毒特异中和活性，并且病毒的中和活性具有浓度依赖关系，随着抗体浓度的增加，病毒的感染率显著下降。说明本发明的纳米抗体具有优良的抗登革病毒的作用。

因此，本发明的第三方面，提供了一种含有抗登革病毒DE3的纳米抗体的药物组合物。该药物组合物除了包括抗登革病毒DE3的纳米抗体，还包括药学上可接受的药物载体。

本发明的抗登革病毒DE3的纳米抗体和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物，从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的抗登革病毒DE3的纳米抗体氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团，防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。

通常情况下，液体制剂可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，冻干制剂在30℃至少六个月保持稳定。制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂。

对于本发明公开的上述抗登革病毒DE3的纳米抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合。其中，表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUATTM等，其加入量应使双功能双特异性抗体蛋白的颗粒化趋势最小；溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态；等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一；缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。

上述制剂为包含抗登革病毒DE3的纳米抗体的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗登革热效果明显。具体来讲，对登革热的预防和/或治疗有效，可以作为抗登革热药物使用。

本发明中抗登革病毒DE3的纳米抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是1～1800mg/天。

本发明的第四方面，提供了一种抗登革病毒DE3的纳米抗体的用途，具体是在制备抗登革热药物中的用途。

本发明的有益保障及效果：

本发明提供了一种抗登革病毒DE3的纳米抗体、制备方法及其用途，该抗登革病毒DE3的纳米抗体为VHH抗体，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，大小只有传统IgG型抗体的十分之一，是天然存在的可与抗原结合的最小片段，能被单基因编码，容易利用微生物进行生产，构建和表达过程简单，并具有很高的产率，有利于实现工业化生产。

此外，通过亲和力分析本发明的纳米抗体具有良好的亲和力，通过体外中和试验证明，本发明的纳米抗体具有登革4型病毒特异中和活性，并且病毒的中和活性具有浓度依赖关系，随着抗体浓度的增加，病毒的感染率显著下降，说明本发明的纳米抗体具有优良的抗登革病毒的作用，对登革热流行或爆发具有优良的预防或治疗作用，具备广阔的临床应用前景。

附图说明

图1为抗登革病毒DE3的纳米抗体ELISA筛选结果；

图2为VHH抗体对登革4型病毒的体外中和活性测定结果。

具体实施方式

以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质拉的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质拉的方法或将质粒引入宿主细胞的方法.这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2^ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。

实施例1.针对登革病毒DE3的纳米抗体文库的构建

(1)将0.5mg登革病毒DE3抗原与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼，每周一次，共连续免疫6次，免疫过程中剌激B细胞表达特异性的纳米抗体；

(2)6次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞200mL并提取总RNA；

(3)合成cDNA并利用套式PCR扩增VHH，该步骤中所采用的引物序列如表1所示：

表1 PCR引物序列

(4)利用限制性内切酶NdeⅠ及XhoⅠ酶切20μgpMECS噬菌体展示载体及10μg VHH并连接两种片段；

(5)将连接产物转化至电转感受态细胞TGl中，构建登革病毒DE3纳米抗体噬菌体展示文库并测定库容，库容的大小约为2.5×10⁸。与此同时，通过菌落PCR检测所建文库的插入率达到95％以上。

实施例2.针对登革病毒DE3的纳米抗体筛选过程

(1)取200uL重组TGl细胞至2TY培养基中培养，期间加入50μL辅助噬菌体VCSM13侵染TGl细胞，并培养过夜以扩增噬菌体，次日利用PEG/NaCl沉淀噬菌体，离心收集扩增噬菌体；

(2)将溶解在150mmol/L pH 8.2NaHCO₃中的登革病毒DE3150ug偶联在酶标板上，4℃放置过夜，同时设立阴性对照；

(3)第二天加入100μL的5％BSA，室温封闭2h；

(4)2h后，加入100μL扩增噬菌体(1×10¹¹tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌体展示基因库)，室温作用1小时；

(5)用PBS+0.05％Tween 20洗5遍，以洗掉结合的噬菌体；

(6)用终浓度为25mg/mL的膜蛋白酶将于DE3特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数生长期的大肠杆菌TGl细胞，37℃培养lh，产生并收集噬菌体用于下轮的筛选，相同筛选过程重复3轮，逐步得到富集。

实施例3.用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性阳性克隆

(1)从上述3轮筛选后细胞培养板中，挑选200个单菌落分别接种于含l00μg/mL氨苄青霉素TB培养基的96深孔板中，并设置空白对照，37℃培养至对数期后，加入终浓度为lmmol/L的IPTG，28℃培养过夜；

(2)利用渗透胀破法获得粗提抗体，并将抗体转移至经抗原包被的ELISA板上，室温放置lh；

(3)用PBST洗去未结合的抗体，加入l00μL经1:2000稀释后的Mouse anti-HA tagantibody(鼠抗HA抗体，购自科文斯)，在室温放置lh；

(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入l00μL经1:2000稀释后的Anti-mousealkaline phosphatase conjugate(山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自于西格玛)，在室温放置lh；

(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，反应10min后于酶标仪上405波长处，读取吸收值；

(6)当样品孔OD值大于对照孔6倍以上时，判定为阳性克隆孔，结果如图1所示，DE3孔的OD值明显大于对照孔组；

(7)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/μL氨苄青霉素的LB培养基中以便提取质粒并进行测序。根据序列比对软件VectorNTI分析各个克隆株的基因序列，把FRl、FR2、FR3、FR4、CDR1、CDR2、CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而序列不同的株视为不同克隆株，最终获得1株抗登革病毒DE3特异性纳米抗体。其抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1、核苷酸序列为SEQID NO:2。

实施例4.登革病毒DE3特异性纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中的表达及纯化

(1)将上述测序分析所获得的克隆转化到大肠杆菌WK6中，并将其涂布在含有氨苄青霉素和葡萄糖的培养平板上，37℃培养过夜；

(2)挑选单个菌落接种在5mL含有氨韦青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；

(3)接种l mL的过夜培养菌种至330mL TB培养液中，37℃摇床培养，培养到OD600nm值达到0.6-0.9时，加入lmol/L IPTG，28℃摇床培养过夜；

(4)离心，收集大肠杆菌，利用渗透胀破法，获得抗体粗提液；

(5)通过镍柱亲和层析法纯化出抗体，获得高纯度的纳米抗体，并浓缩富集。

实施例5.Biacore分析

将抗多聚组氨酸抗体(abcam)包被在CM5M5芯片(GE公司)上，捕获被检测抗体后，用Biacore T100(GE Healthcare)检测各融合蛋白的亲和力，具体检测亲和力数值见表2。

表2.Biacore分析结果

实施例6.体外中和试验

采用固定病毒稀释抗体的方法进行蚀斑减少中和试验：将不同浓度抗体与含50～100PFU的登革4型病毒悬液等量混合，37℃水浴作用1h培养于6孔板的BHK21细胞，37℃孵育1h，弃去混合液，用PBS缓冲液洗细胞；而后加入营养琼盖，继续培养5天后固定染色，计数蚀斑数，并计算抗体的中和活性。

结果如图2所示，本发明的纳米抗体具有登革4型病毒特异中和活性，并且病毒的中和活性具有浓度依赖关系，随着抗体浓度的增加，病毒的感染率显著下降。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 中国人民解放军第二军医大学

<120> 抗登革病毒DE3的纳米抗体、制备方法及用途

<130> 权利要求书说明书

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Met Val Pro Tyr Asn

20 25 30

Ala Met Gly Trp Trp Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Arg Asn Asn Trp Ser Thr His Trp Ile Arg Lys Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Ala Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val

65 70 75 80

Asn Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Ala Tyr Cys Pro Cys Asp Ile Asn Ala Lys Asn His Ile Tyr

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 2

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

gatgtgcagc tgcaagaaag cggcggtggt ctggttcagc cgggcggtag tctgcgtctg 60

agctgtgcag caagcggtgg catggtgccg tacaatgcca tgggttggtg gcgtcaagct 120

ccgggtaaag aacgcgaatt tgtggcccgc aacaattgga gcacccactg gatccgcaaa 180

tatgccgata gcgtgaaagg ccgctttgcc gtgagccgcg acaatgccaa gaacaccgtg 240

aatttacaga tgaactcttt aaaaccggaa gataccgccg tgtattactg cgccgcctat 300

tgcccgtgcg atatcaacgc caaaaaccac atttatgatt attggggcca aggtaccacc 360

gttaccgtga gcagc 375

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ggaattccat atggatgtgc agctg 25

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ccgctcgagg ctgctcacgg t 21

Claims

1.一种抗登革病毒DE3的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为VHH抗体，具有SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述的抗登革病毒DE3的纳米抗体的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的抗登革病毒DE3的纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（A）全基因合成抗登革病毒DE3的纳米抗体VHH片段；

（B）采用PCR技术对步骤（A）中获得的抗登革病毒DE3的纳米抗体VHH片段进行克隆，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到表达载体中，测序验证后确认获得正确的克隆；

（C）将上述表达载体引入宿主细胞内进行融合蛋白的表达。

4.根据权利要求3所述的抗登革病毒DE3的纳米抗体的制备方法，其特征在于：

其中，在步骤（B）中，PCR所采用的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

5.根据权利要求3所述的抗登革病毒DE3的纳米抗体的制备方法，其特征在于：

其中，所述表达载体为pGEM-T、Pet32a，pcDNA3.1、pEE6.4或pEE12.4，所述表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列，

所述宿主细胞为哺乳动物细胞、细菌细胞、昆虫细胞或真菌细胞。

6.含有权利要求1所述的抗登革病毒DE3的纳米抗体的药物组合物，其特征在于，还包括药学上可接受的药物载体。

7.根据权利要求6所述的抗登革病毒DE3的纳米抗体的药物组合物，其特征在于：

其中，所述药物组合物为水针或冻干制剂，

所述药学上可接受的药物载体包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或组合。

8.根据权利要求7所述的抗登革病毒DE3的纳米抗体的药物组合物，其特征在于：

其中，所述水针或冻干制剂静脉注射的剂量是1~1800mg/天。

9.权利要求1所述的抗登革病毒DE3的纳米抗体在制备抗登革热药物中的用途。