ES2859574T3

ES2859574T3 - Anticuerpos de antivirus del dengue y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2859574T3
Application number: ES13827926T
Authority: ES
Inventors: Ram Sasisekharan; Luke Robinson; Kannan Tharakaraman
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 2012-08-07
Filing date: 2013-07-25
Publication date: 2021-10-04
Anticipated expiration: 2033-07-25
Also published as: EP2882453B1; AU2013299986B2; IL236838B; BR112015002605A2; IL236838A0; KR20150039782A; US20140056913A1; US9499607B2; US9880167B2; CN104768574B; CN104768574A; JP2018087237A; SG11201500605TA; AU2018203152A1; EP2882453A4; CA2879994C; WO2014025546A3; EP2882453A2; US20180246101A1; HK1211851A1

Abstract

Un agente de anticuerpo específico al virus de Dengue, en el que el agente de anticuerpo se une a y neutraliza cada uno de los serotipos D1, D2 ,D3 y D4 del virus de Dengue, cuyo agente de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en la que la región de marco 1 (FR1), región de marco 2 (FR2), región de marco 3 (FR3), y región de marco 4 (FR4) de cadena pesada tienen más de 90% de identidad con la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4;SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente y la FR1, FR2, FR3 y FR4 de cadena ligera tienen más de 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:13 respectivamente, en la que la región variable de cadena pesada comprende una CDR1, una CDR2 y una CDR3 cuyas secuencias de aminoácidos se establecen en la SEQ ID NO.: 23, SEQ ID NO.: 24, SEQ ID NO.: 25, respectivamente y la región variable de cadena ligera comprende una CDR1, una CDR2 y una CDR3 cuyas secuencias de aminoácidos se establecen en la SEQ ID NO.: 26, SEQ ID NO.: 27 y SEQ ID NO.: 28, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos de antivirus del dengue y usos de los mismos

Referencia cruzada con solicitudes relacionadas

Soporte gubernamental

Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno con el número de concesión R37 GM057073 otorgado por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.

Listado de secuencias

La presente especificación hace referencia a un Listado de Secuencias (presentado electrónicamente como un archivo .txt denominado “Listado de Secuencias.txt” el 25 de julio de 2013). El archivo .txt se generó el 22 de julio de 2013 y tiene un tamaño de 12.6 kb.

Antecedentes

El virus del dengue (DV) es un miembro de la familia de virus Flaviviridae y es transmitido a las personas por varias especies de mosquitos del género Aedes, principalmente Aedes aegypti. Más de 3.600 millones de personas en todo el mundo corren el riesgo de infectarse con DV y se estima que ocurren más de 200 millones de infecciones de DV cada año en todo el mundo (McBride et al., 2000 Microbes & Infection 2: 1041-1050, Guzman et al., 2010 Nature Rev. Microbiol. 8: S7-16). La fiebre del dengue es la enfermedad por arbovirus de mayor relevancia médica en humanos. Los aumentos significativos en la incidencia, alcance geográfico y gravedad de los casos de dengue están convirtiendo al DV en un patógeno humano importante. Desafortunadamente, actualmente no se dispone de regímenes terapéuticos eficaces; las medidas de prevención actuales más eficaces residen en el control de los mosquitos.

Resumen

La invención es como se define en las reivindicaciones 1 a 8 adjuntas.

En el presente documento se proporcionan métodos y composiciones para el tratamiento y/o prevención de la infección por DV. Entre otras cosas, la presente invención proporciona agentes de anticuerpos que neutralizan los cuatro serotipos de DV. En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpos proporcionados son variantes del anticuerpo de referencia 4E11; en algunas de dichas realizaciones, los agentes de anticuerpos proporcionados tienen secuencias de aminoácidos que muestren una alta identidad de secuencia general con aquel de 4E11, o un fragmento relevante del mismo, todavía incluyen variaciones de secuencias específicas en comparación con 4E11 y muestren una mejora significativa en la neutralización de al menos un serotipo de DV en comparación con aquel observado para 4E11.

La presente invención proporciona la idea de que el anticuerpo de referencia 4E11 tiene ciertos atributos deseables, que incluyen la unión a todos los cuatro serotipos de DV y tiene una potente capacidad neutralizante de tres de los cuatro serotipos de DV, pero también carece de la capacidad de neutralizar eficazmente el cuarto serotipo de DV. La presente invención identifica la fuente del problema de la incapacidad de 4E11 para neutralizar eficazmente este cuarto serotipo de DV. En particular, se definen modificaciones de características estructurales que mejoran la capacidad de un agente de anticuerpo cuya secuencia contiene la modificación o modificaciones para neutralizar el serotipo DV relevante, en comparación con la capacidad de 4E11, que carece de modificaciones. Por lo tanto, se definen y proporcionan anticuerpos que tienen estructuras que incluyen las modificaciones de características estructurales relevantes (pero pueden ser sustancialmente idénticas a las de 4E11) y que se caracterizan por una capacidad para neutralizar el serotipo 4 de DV (DV4). En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpos siempre que muestren capacidades para neutralizar cada uno de los otros tres serotipos de DV que no se reducen significativamente en comparación con el de 4E11. De hecho, en algunas realizaciones, los agentes de anticuerpos proporcionados se caracterizan por un aumento sorprendente en la capacidad de neutralización con respecto a uno o más de los otros tres serotipos de DV (DV1-4) en comparación con el observado con 4E11.

En el presente documento se proporcionan tecnologías para definir modificaciones estructurales que imparten actividades biológicas de interés a los polipéptidos, al tiempo que mantienen las características estructurales necesarias para preservar otras actividades.

En el presente documento se proporcionan agentes de anticuerpos que se unen a epítopos de DV, así como composiciones que los contienen y métodos para diseñarlos, proporcionarlos, formularlos, utilizarlos, identificarlos y/o caracterizarlos. En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpos proporcionados muestran una unión significativa a una pluralidad de serotipos de DV. En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpos proporcionados muestran una unión significativa a todos los cuatro serotipos de DV. Los agentes de anticuerpos proporcionados son útiles, por ejemplo, en la profilaxis, tratamiento, diagnóstico y/o estudio del DV.

En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpos proporcionados compiten de forma cruzada con uno o más anticuerpos anti-DV de referencia descritos anteriormente. En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpos proporcionados se unen a un epítopo que es o comprende una secuencia de aminoácidos dentro de la SEQ ID NO.

17 (EDIII-DV1), SEQ ID NO. 18 (EDIII-DV2), SEQ ID NO. 19 (EDIII-DV3), SEQ ID NO. 20 (EDIII-DV4) y/o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpos proporcionados no compiten significativamente de forma cruzada con uno o más anticuerpos anti-DV descritos previamente particulares.

En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpos proporcionados neutralizan el DV en sistemas modelo establecidos con mayor potencia que uno o más anticuerpos anti-DV de referencia descritos anteriormente. La presente invención abarca, entre otras cosas, el reconocimiento de que los agentes de anticuerpos proporcionados pueden ofrecer un mayor beneficio terapéutico y/o profiláctico que los anticuerpos anti-DV descritos anteriormente. Los agentes de anticuerpos proporcionados son útiles en una variedad de contextos que incluyen, por ejemplo, en aplicaciones terapéuticas, profilácticas, de diagnóstico y/o de investigación. En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpos proporcionados son útiles en el tratamiento de la infección por DV crónica y/o aguda, por ejemplo, al administrar a un sujeto que padece o es susceptible a dicha infección una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de dichos agentes de anticuerpos proporcionados. En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad suficiente para lograr uno o más efectos biológicos particulares, que incluyen, pero no se limitan a, (i) reducir la gravedad o frecuencia y/o retrasar el inicio o la reaparición de uno o más síntomas o características de la infección por DV en un individuo susceptible o que padece una infección por DV; y/o (ii) reducir el riesgo de infección y/o el desarrollo de uno o más síntomas o características de la infección por DV en un individuo expuesto o en riesgo de exposición a infección por DV. En algunas realizaciones, el uno o más síntomas o características de la infección por DV es o comprende fiebre alta y al menos uno o más síntomas adicionales seleccionados, por ejemplo, de dolor de cabeza intenso, dolor ocular intenso, dolor articular, dolor muscular, dolor óseo, erupción cutánea, manifestación hemorrágica leve (por ejemplo, hemorragia nasal o de encías, petequias, fácil formación de moretones), dolor abdominal, vómitos, heces negras y alquitranadas, somnolencia o irritabilidad, piel pálida, fría o húmeda, dificultad para respirar, recuento bajo de glóbulos blancos, partículas virales circulantes en individuo o uno o más tejidos (por ejemplo, sangre, médula ósea) u órganos (por ejemplo, hígado) de los mismos. En algunas realizaciones, un individuo que padece una infección por DV presenta fiebre alta y al menos dos de dichos síntomas adicionales.

Los agentes de anticuerpos proporcionados se pueden utilizar para prevenir, reducir la recurrencia y/o retrasar la aparición de uno o más síntomas o características de la infección por DV. Los agentes de anticuerpos proporcionados se pueden utilizar, por ejemplo, para la inmunización pasiva de individuos recientemente expuestos a DV o en riesgo de estar expuestos a DV, bebés recién nacidos de madres con DV positivo y/o pacientes con trasplante de hígado (por ejemplo, para prevenir posibles infecciones por DV recurrentes en dichos pacientes). También se proporcionan en el presente documento agentes miméticos virales cuya estructura incluye uno o más elementos conservados de ciertos antígenos de DV, por ejemplo suficientes para permitir que el agente mimético viral imite una o más actividades biológicas del antígeno de DV relevante. Dichos agentes miméticos virales incluyen dichos elementos estructurales conservados de los antígenos de DV, por ejemplo, como se define en el presente documento, y carecen de uno o más elementos estructurales de los antígenos de DV. Los agentes miméticos virales proporcionados son o comprenden uno o más polipéptidos. Los polipéptidos de agentes miméticos virales proporcionados tienen secuencias de aminoácidos que incluyen uno o más elementos de secuencia conservados de un antígeno de DV; los polipéptidos del agente imitador viral proporcionado carecen de uno o más elementos de secuencia del antígeno de DV. Por ejemplo, los polipéptidos del agente mimético viral proporcionado son o comprenden fragmentos de un antígeno de DV.

En el presente documento se proporcionan métodos terapéuticos de tratamiento, utilizados después del desarrollo de uno o más síntomas de infección por DV. En el presente documento se proporcionan métodos terapéuticos de profilaxis, utilizados antes del desarrollo de uno o más síntomas de infección por DV y/o antes de la exposición a DV, infección por DV o riesgo de la misma. También se proporcionan en el presente documento tecnologías de inmunización pasiva.

En el presente documento se proporcionan métodos de diagnóstico para detectar DV en y/o caracterizar de otro modo muestras tales como muestras clínicas, ambientales y/o de investigación.

En el presente documento se proporcionan sistemas para diseñar, identificar y/o caracterizar agentes de anticuerpos anti-DV útiles. Por ejemplo, se proporcionan enfoques computacionales empíricos que capturan características fisicoquímicas particulares comunes a las interfaces de proteínas. Dichos enfoques permiten la predicción de interacciones proteína-proteína (por ejemplo, interacciones antígeno-anticuerpo), que incluyen por ejemplo predecir qué secuencias de aminoácidos podrían mostrar una afinidad de interacción particularmente alta. Los enfoques proporcionados se aplican de manera útil para diseñar, identificar y/o caracterizar secuencias que difieren de una secuencia de referencia y muestran una o más características mejoradas (por ejemplo, afinidad mejorada) con respecto a sus interacciones proteína-proteína.

En el presente documento se proporcionan sistemas para estratificar a los pacientes en base a su respuesta inmunológica a DV. En el presente documento se proporcionan métodos para identificar a aquellos pacientes que probablemente respondan bien a la inmunoterapia con DV. Por ejemplo, se puede utilizar el suero de un paciente para probar la presencia de anticuerpos dirigidos contra un epítopo particular de DV (por ejemplo, epítopo al que se unen específicamente los agentes de anticuerpos proporcionados). Si el paciente no tiene niveles adecuados de anticuerpos dirigidos a dicho epítopo, se pueden administrar al paciente uno o más agentes de anticuerpos de DV proporcionados. La propia respuesta inmunitaria del paciente se puede complementar con los agentes de anticuerpos de DV proporcionados. En algunas realizaciones, la inmunoterapia ayuda a la eliminación del virus DV y/o la resolución de la infección por DV. La inmunoterapia puede tratar y/o prevenir la infección por DV crónica. En el presente documento se proporcionan métodos para diseñar, identificar y/o caracterizar agentes de anticuerpos útiles. Por ejemplo, dichos métodos implican determinar si un agente de anticuerpo de prueba compite por la unión del antígeno con uno o más anticuerpos anti-DV de referencia y/u otros agentes de anticuerpos. En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo de prueba se identifica como un agente de anticuerpo útil si compite de forma cruzada con uno o más anticuerpos de DV de referencia.

En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpos proporcionados se combinan con una o más sustancias farmacéuticamente aceptables adicionales para proporcionar composiciones farmacéuticas. La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas para el tratamiento, prevención, diagnóstico y/o caracterización de infección por DV.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden agentes de anticuerpos que son o comprenden, por ejemplo, anticuerpos humanos o fragmentos o variantes de los mismos que se unen a cualquier serotipo de DV y neutralizan la infección por DV in vitro. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden agentes de anticuerpos que son o comprenden, por ejemplo, anticuerpos humanos o fragmentos o variantes de los mismos que se unen a cualquier serotipo de DV y neutralizan la infección por DV in vivo. En algunas realizaciones, la neutralización de DV por agentes de anticuerpos proporcionados en sistemas in vitro es correlativa y/o predictiva de la neutralización de DV por agentes de anticuerpos proporcionados in vivo (por ejemplo, en humanos y/u otros mamíferos).

En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpos proporcionados se pueden utilizar junto con una o más terapias para tratar, reducir la incidencia, frecuencia o gravedad y/o retrasar la aparición de la infección por DV o uno o más síntomas o características de la misma. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los agentes de anticuerpos se utilizan junto con uno o más agentes antivirales, antiinflamatorios, analgésicos, terapéuticos inmunomoduladores y terapia de combinación, que preferiblemente implican otras dianas de DV. Por ejemplo, los agentes de anticuerpos proporcionados se administran en combinación con uno o más interferones (por ejemplo, interferón a-2b, interferóny, etc.), analgésicos (preferiblemente que contengan acetaminofén y no aspirina y/o ibuprofeno), anticuerpos monoclonales anti-DV, anticuerpos policlonales anti-DV, inhibidores de polimerasa de ARN, inhibidores de proteasa, análogos de nucleósidos, inhibidores de helicasa, inmunomoduladores, compuestos antisentido, ARN de interferencia corta (ARNic), ARN de horquilla corta (ARNhc), ARN micro (ARNmi), aptámeros de ARN, ribozimas, y combinaciones de los mismos.

Por lo tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona específicamente un agente de anticuerpo que se une a y neutraliza cada uno de los serotipos D1, D2, ^d3, y D4 del Virus del Dengue. En algunas realizaciones, el agente de anticuerpo se une a un epítopo que es o comprende una secuencia de aminoácidos dentro de: la SEQ ID NO. 17 (EDIII-DV1), SEQ ID NO. 18 (EDIII-DV2), SEQ ID NO. 19 (EDIII-DV3), SEQ ID NO. 20 (EDIII-DV4), o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, el agente de anticuerpo se une a un epítopo en la región de cadena A de la glicoproteína envolvente del virus de Dengue.

En algunas realizaciones, el epítopo comprende uno o más residuos que corresponden a aquellos en una posición seleccionada del grupo que consiste en 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 323, 325, 327, 329, 360, 361, 362, 363, 364, 385, 387, 388, 389, 390, 391, y combinaciones de los mismos, de una cualquiera de las SEQ ID NO. 17 20. En algunas realizaciones, el residuo correspondiente en la posición 305 se selecciona del grupo que consiste en: serina, lisina, y treonina. En algunas realizaciones, el residuo correspondiente en la posición 310 es lisina. En algunas realizaciones, el residuo correspondiente en la posición 311 es lisina. En algunas realizaciones, el residuo correspondiente en la posición 323 se selecciona del grupo que consiste en arginina, lisina, y glutamina. En algunas realizaciones, el residuo correspondiente en la posición 327 se selecciona del grupo que consiste en lisina y glutamato. En algunas realizaciones, el residuo correspondiente en la posición 329 se selecciona del grupo que consiste en arginina, aspartato, glutamato, y treonina.

En el presente documento se proporciona un agente de anticuerpo cuya región variable de cadena pesada y/o región variable de cadena ligera incluye al menos una región determinante de complementariedad (CDR) que comparte al menos 80% de identidad de secuencia con una CDR del anticuerpo de referencia 4E11, pero difiere por la sustitución de al menos un residuo amino dentro de la CDR. En algunas realizaciones, el agente de anticuerpo incluye al menos una CDR que es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia del anticuerpo 4E11 en que es ya sea idéntica a dicha CDR de referencia o incluye entre 1 - 5 sustituciones de aminoácidos dentro de dicha CDR de referencia. La CDR de referencia se puede seleccionar del grupo que consiste en una encontrada entre los residuos 27 y 33 de la cadena pesada de 4E11 (SEQ ID NO. 1), una encontrada entre los residuos 53 y 58 de la cadena pesada de 4E11 (SEQ ID NO. 1), una encontrada entre los residuos 100 y 106 de la cadena pesada de 4E11 (SEQ ID NO. 1), una encontrada entre los residuos 24 y 38 de la cadena ligera de 4E11 (SEQ ID NO. 2), una encontrada entre los residuos 54 y 60 de la cadena ligera de 4E11 (SEQ ID NO. 2), una encontrada entre los residuos 93 y 101 de la cadena ligera de 4E11 (SEQ ID NO. 2); y combinaciones de las mismas. El agente de anticuerpo puede incluir al menos una CDR que es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia establecida a continuación, en que es ya sea idéntica a dicha CDR de referencia o incluye entre 1 - 5 sustituciones de aminoácidos dentro de dicha CDR de referencia CDR de referencias: GFNIKDT (s Eq ID NO. 7), DPANGD (SEQ ID NO. 8), GWEGFAY (SEQ ID NO. 9), RASENVDKYGNSFMH (SEQ ID NO. 14), RASNLES (SEQ ID NO. 15), y/o QRSNEVPWT (SEQ ID NO. 16). La CDR de referencia puede ser una C^dR de cadena pesada. La CDR de referencia puede ser una CDR de cadena ligera. El agente de anticuerpo puede incluir al menos una CDR de cadena pesada que es sustancialmente idéntica a una CDR de cadena pesada de referencia y también incluye al menos una CDR de cadena ligera que es idéntica a una CDR de cadena ligera de referencia. Cada una de las CDR en el agente de anticuerpo puede ser sustancialmente idéntica a una de las CDR de referencia.

En el presente documento se proporciona un agente de anticuerpo cuya región variable de cadena pesada incluye al menos una región determinante de complementariedad (CDR) que comparte al menos 95% de identidad de secuencia con una CDR del anticuerpo de referencia 4E11, pero difiere por la sustitución de al menos un residuo de aminoácido dentro de la CDR. El agente de anticuerpo puede incluir al menos una CDR que es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia del anticuerpo 4E11 en que es ya sea idéntica a dicha CDR de referencia o incluye entre 1 - 5 sustituciones de aminoácidos dentro de dicha CDR de referencia. La CDR de referencia se puede seleccionar del grupo que consiste en una encontrada entre los residuos 27 y 33 de la cadena pesada de 4E11 (SEQ ID NO. 1), una encontrada entre los residuos 53 y 58 de la cadena pesada de 4E11 (SeQ ID NO. 1), una encontrada entre los residuos 100 y 106 de la cadena pesada de 4E11 (SEQ ID NO. 1), una encontrada entre los residuos 24 y 38 de la cadena ligera de 4E11 (SEQ ID NO. 2), una encontrada entre los residuos 54 y 60 de la cadena ligera de 4E11 (SEQ ID NO. 2), una encontrada entre los residuos 93 y 101 de la cadena ligera de 4E11 (SEQ ID NO. 2), y combinaciones de las mismas. El agente de anticuerpo puede incluir al menos una CDR que es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia establecida a continuación, en que es ya sea idéntica a dicha CDR de referencia o incluye entre 1 - 5 sustituciones de aminoácidos dentro de dicha CDR de referencia CDR de referencias: GFNIKDT (SEQ ID NO. 7), DPANGD (SEQ ID NO. 8), GWEGFAY (SEQ ID NO. 9), RASENVDKYGNSFMH (SEQ ID NO. 14), RASNLES (SEQ ID NO. 15), y/o QRSNEVPWT (SEQ ID NO. 16). La CDR de referencia puede ser una CDR de cadena pesada. La CDR de referencia puede ser CDR es una CDR de cadena ligera. El agente de anticuerpo puede incluir al menos una CDR de cadena pesada que es sustancialmente idéntica a una CDR de cadena pesada de referencia y también incluye al menos una CDR de cadena ligera que es idéntica a una CDR de cadena ligera de referencia. Cada una de las CDR en el agente de anticuerpo puede ser sustancialmente idéntica a una de las CDR de referencia. La región variable de CDR de cadena pesada puede tener sustitución del residuo de aminoácido en la posición 55. El aminoácido sustituto en la posición 55 se puede seleccionar del grupo que consiste en glutamato y aspartato. La región variable de CDR de cadena ligera puede tener sustitución del residuo de aminoácido en las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 31, 57, 59, 60, y combinaciones de las mismas. El residuo de aminoácido sustituto en la posición 31 puede ser lisina. El residuo de aminoácido sustituto en la posición 57 se puede seleccionar del grupo que consiste en glutamato y serina. El residuo de aminoácido sustituto en la posición 59 se puede seleccionar del grupo que consiste en glutamina y asparagina. El residuo de aminoácido sustituto en la posición 60 se puede seleccionar del grupo que consiste en triptófano, tirosina, y arginina.

En algunas realizaciones, la invención proporciona un agente de anticuerpo que es una IgG. En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo de ratón, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo purificado, un anticuerpo aislado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo policlonal, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, se proporciona un agente de anticuerpo en el que el fragmento de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en: un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fd, un fragmento Fd', un fragmento Fv, un fragmento dAb, un fragmento scFv, una región CDR aislada, un diacuerpo dsFv, un anticuerpo de cadena sencilla, y combinaciones de los mismos.

En el presente documento se proporciona una estirpe celular que expresa un agente de anticuerpo específico a virus de Dengue, en el que el agente de anticuerpo se une a y neutraliza cada uno de los serotipos D1, d2, D3, y D4 del Virus del Dengue. En el presente documento se proporciona una composición farmacéutica que incluye uno o más agentes de anticuerpo en los que el agente de anticuerpo se une a y neutraliza cada uno de los serotipos D1, D2, D3, y D4 del Virus del Dengue y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica puede incluir adicionalmente al menos un agente antiviral adicional.

En el presente documento se proporcionan métodos para tratar un sujeto en necesidad del mismo, que incluye la etapa de administrar un agente de anticuerpo en el que el agente de anticuerpo se une a y neutraliza cada uno de los serotipos D1, D2, D3, y D4 del Virus del Dengue. En algunas realizaciones, la invención proporciona kits que incluyen al menos un agente de anticuerpo en el que el agente de anticuerpo se une a y neutraliza cada uno de los serotipos D1, D2, D3, y D4 del Virus del Dengue, una jeringa, aguja, o aplicador para administración de al menos un anticuerpo o fragmento a un sujeto, e instrucciones para uso.

En algunas realizaciones, la invención proporciona métodos para fabricar composiciones farmacéuticas, el método incluye las etapas de proporcionar un agente de anticuerpo en el que el agente de anticuerpo se une a y neutraliza cada uno de los serotipos D1, D2, D3, y D4 del Virus del Dengue, y formular el agente de anticuerpo con al menos un portador farmacéuticamente aceptable, de tal manera que se genera una composición farmacéutica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es una composición líquida. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para administración parenteral. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para administración intravenosa. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para administración intravenosa a un niño.

Breve descripción de los dibujos

La invención se define en las reivindicaciones y cualquiera de las siguientes figuras que no caen dentro del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente con fines comparativos.

Las Figuras de los dibujos tienen únicamente fines ilustrativos, no limitativos.

Figura 1: La Figura 1 muestra el efecto del tamaño de la ventana sobre la precisión de la predicción. El tamaño de la ventana representa el número de positivos previstos. La precisión de la predicción está determinada por el número de estructuras de casos de prueba (37 en total) predichas correctamente. Cuando el tamaño de la ventana es uno (es decir, cuando se predice que una de 101 estructuras será positiva), casi la mitad de las estructuras de rayos X (48% ~18 de 37) se identificaron correctamente, cuya probabilidad binomial es 1.46 E-26 (n =37, p = 0.009, número de aciertos =18) si las estructuras se eligieron al azar. Se considera que la precisión de predicción del método MLR es una función logarítmicamente creciente del tamaño de la ventana con una precisión que alcanza el 85 % en el tamaño de la ventana 5 y el 100 % en el tamaño de la ventana 10. Por el contrario, ZRANK no puede predecir el 100 % de las estructuras incluso cuando el tamaño de la ventana es 20.

Figura 2: Las Figuras 2A-C ilustran los resultados del acoplamiento de una búsqueda local. Para esta evaluación, las estructuras de tipo nativo se definen por tener menos de 3 ángstrom (A) de RMSD del ligando en la estructura de rayos X, calculado para los átomos del ligando que están dentro de los 7 A del receptor fijo. Las estructuras que tienen RASD > 3 A se denominan estructuras no nativas. (A) Cada punto sobre la gráfica de superficie representa un señuelo de acoplamiento. El eje x muestra la puntuación ZRANK; el eje Y representa RMSD (en A) para la estructura de rayos X; el eje Z representa las probabilidades de predicción basadas en MLR. Las puntuaciones ZRANK de estructuras similares a las nativas varían entre -60 a -30 Kcal/mol. (B) Correlación entre las puntuaciones ZRANK (eje x) y RMSD (eje y). Los puntos de datos dentro de los círculos de puntos están cerca de la estructura de rayos X nativa. (C) Correlación entre la probabilidad basada en MLR y RMSD. Existe una correlación significativa entre las probabilidades de predicción versus RMSD, pero no existe dicha correlación entre ZRANK y RMSD.

Figura 3: La Figura 3 demuestra la afinidad y la actividad in vitro del anticuerpo 4E11.

Figura 4: La Figura 4 muestra un diagrama de flujo del enfoque de diseño de anticuerpos.

Figura 5: La Figura 5 muestra la superposición de los cinco modelos de acoplamiento principales sobre EDIII fijo. El dominio EDIII se representa como esferas; 4E11, mostrado como la superficie en cada modelo.

Figura 6: Las Figuras 6A-B ilustran la secuencia y los determinantes estructurales de la pobre unión de DV4. (A) Alineación de secuencia de la región del dominio EDIII de cuatro serotipos. Los residuos de unión de mAb putativos están sombreados en gris. Los residuos en 307, 329, 361, 364, 385, 388 y 390 diferencian el DV4 del resto de las secuencias; estos están numerados. Los contactos residuales hechos por las cinco mutaciones de mAb están en cuadros. En particular, 5 de los 6 nuevos contactos se forman contra residuos de epítopos conservados de las cadenas A y B. Esto explica por qué las nuevas mutaciones no son perjudiciales para la unión de DV1-3. (B) Modelo estructural de interacción 4E11/EDIII. Las posiciones de secuencia que discriminan DV4 de otras cepas se marcan y las cadenas laterales de aminoácidos en ellas se representan como barras.

Figura 7: La Figura 7 demuestra que las mutaciones mejoradoras de afinidad se localizan en la periferia de la interfaz 4E11: EDIII-DV4. Las posiciones positivas identificadas en la pantalla de unión se resaltan y se muestran en un modelo estructural de interacción 4E11: EDIII-DV4. Todas las mutaciones positivas se encuentran en la periferia de la interfaz de unión. Los dos paneles representan diferentes vistas del mismo modelo. Las proteínas EDIII (arriba), VH (derecha) y VL (izquierda) están representadas respectivamente en cada panel.

Figura 8: Las Figuras 8A-H muestran sensogramas de resonancia de plasmón de superficie (SPR) de 4E11 WT y 4E5A con antígenos EDIII de DV1-4.

Figura 9: La Figura 9 ilustra la actividad neutralizante in vitro de anticuerpos evaluados mediante la prueba de neutralización por reducción de foco (FRNT). Los ensayos de neutralización se realizaron con DV1-4 y los anticuerpos 4E11 WT, m4E11 WT, 4E5A y 4G2. Se mezclaron diluciones seriadas de anticuerpo con cantidades iguales de virus y se agregaron a monocapas de células Vero con una placa viscosa. Después de 4-6 días, las células se fijaron y los focos se inmunotiñeron y se contaron. Los puntos de datos representan promedios de duplicados con barras de error que representan la desviación estándar. Se ajustó un modelo logístico estándar de cuatro parámetros a los datos utilizando regresión de mínimos cuadrados. 4E5A muestra una actividad neutralizante similar a 4E11 y m4E11 para DV1-3 y un aumento sustancial en la actividad neutralizante de DV4. 4G2, un anticuerpo específico de bucle de fusión de flavivirus representativo, demuestra una actividad neutralizante más baja para DV1-3 y solo una actividad ligeramente más alta para DV4 en relación con 4E5A.

Figura 10: La Figura 10 muestra un modelo de exposición de DV2 profiláctico in vivo. Los datos muestran virus en el suero de ratones AF129 el día 3 después de exposición al virus. Los ratones se trataron con AB1 o placebo 1 día antes de la exposición al virus. El ARN extraído del suero de los ratones se amplificó mediante QRT-PCR y se extrapoló un título Log^1üCCID⁵⁰aproximado basándose en una curva del ARN de control tomado de una muestra de título conocido. La línea discontinua representa el límite aproximado de detección.

Figura 11: La Figura 11 demuestra las frecuencias de aminoácidos en el parátopo y el epítopo. Los datos se generaron a partir de 77 complejos de antígeno-anticuerpos.

Definiciones

Para que la presente invención se entienda más fácilmente, primero se definen ciertos términos a continuación; aquellos expertos en la técnica apreciarán y comprenderán el uso y alcance de estos términos tal como se definen a continuación y/o se utilizan de otro modo en el presente documento.

Adulto: Como se utiliza en el presente documento, el término “adulto” se refiere a un ser humano de dieciocho años de edad o mayor. El peso corporal entre los adultos puede variar ampliamente, con un rango típico de 90 a 250 libras.

Afinidad: como se conoce en la técnica, “afinidad” es una medida de la tensión con un ligando particular (por ejemplo, un anticuerpo) que se une a su pareja (por ejemplo, un epítopo). Las afinidades se pueden medir de diferentes formas.

Aminoácido: Como se utiliza en el presente documento, el término “aminoácido”, en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que se pueda incorporar en una cadena de polipéptidos. En algunas realizaciones, un aminoácido tiene la estructura general H²NC(H)(R)-COOH. En algunas realizaciones, un aminoácido es un aminoácido de origen natural. En algunas realizaciones, un aminoácido es un aminoácido sintético; en algunas realizaciones, un aminoácido es un d-aminoácido; en algunas realizaciones, un aminoácido es un 1-aminoácido. “Aminoácido estándar” se refiere a cualquiera de los veinte l-aminoácidos estándar que se encuentran comúnmente en péptidos de origen natural. “Aminoácido no estándar” se refiere a cualquier aminoácido, distinto de los aminoácidos estándar, independientemente de si se prepara sintéticamente o se obtiene de una fuente natural. Como se utiliza en el presente documento, “aminoácido sintético” abarca aminoácidos químicamente modificados, que incluyen pero no se limitan a sales, derivados de aminoácidos (tales como amidas) y/o sustituciones. Los aminoácidos, que incluyen aminoácidos de terminal carboxi y/o amino en los péptidos, se pueden modificar mediante metilación, amidación, acetilación, grupos protectores y/o sustitución con otros grupos químicos que pueden cambiar la vida media circulante del péptido sin afectar adversamente su actividad. Los aminoácidos pueden participar en un enlace disulfuro. Los aminoácidos pueden comprender una o más modificaciones postraduccionales, tales como la asociación con una o más entidades químicas (por ejemplo, grupos metilo, grupos acetato, grupos acetilo, grupos fosfato, fracciones de formilo, grupos isoprenoides, grupos sulfato, fracciones de polietilenglicol, fracciones de lípidos, fracciones de carbohidratos, fracciones de biotina, etc.). El término “aminoácido” se utiliza indistintamente con “residuo de aminoácido” y se puede referir a un aminoácido libre y/o a un residuo de aminoácido de un péptido. Resultará evidente a partir del contexto en el que se utiliza el término si se refiere a un aminoácido libre o un residuo de un péptido.

Animal: Como se utiliza en el presente documento, el término “animal” se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunas realizaciones, “animal” se refiere a humanos, de cualquier sexo y en cualquier etapa de desarrollo. En algunas realizaciones, “animal” se refiere a animales no humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En ciertas realizaciones, el animal no humano es un mamífero (por ejemplo, Un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, un ganado vacuno, un primate y/o un cerdo). En algunas realizaciones, los animales incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces, insectos y/o gusanos. En ciertas realizaciones, el animal es susceptible de infección por DV. En algunas realizaciones, un animal puede ser un animal transgénico, un animal modificado genéticamente y/o un clon.

Agente de anticuerpo: Como se utiliza en el presente documento, el término “agente de anticuerpo” se refiere a un agente que se une específicamente a un antígeno particular. En algunas realizaciones, el término abarca cualquier polipéptido con elementos estructurales de inmunoglobulina suficientes para conferir unión específica. Los agentes de anticuerpos adecuados incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos humanos, anticuerpos primatizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos humanizados, anticuerpos conjugados (es decir, anticuerpos conjugados o fusionados con otras proteínas, radiomarcadores, citotoxinas), Inmunofármacos Modulares Pequeños (“SMIPs™”), anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos camélidos y fragmentos de anticuerpos. Como se utiliza en el presente documento, el término “agente de anticuerpo” también incluye anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos de dominio único (por ejemplo, anticuerpos de dominio único de tiburón (por ejemplo, IgNAR o fragmentos del mismo)), anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos siempre que exhiban la actividad biológica deseada. En algunas realizaciones, el término abarca péptidos grapados. En algunas realizaciones, el término abarca uno o más peptidomiméticos de unión de tipo anticuerpo. En algunas realizaciones, el término abarca una o más proteínas de andamio de unión de tipo anticuerpo. En algunas realizaciones, el término abarca monocuerpos o adnectinas. En muchas realizaciones, un agente de anticuerpo es o comprende un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos incluye uno o más elementos estructurales reconocidos por aquellos expertos en la técnica como una región determinante de complementariedad (CDR); en algunas realizaciones un agente de anticuerpo es o comprende a polipéptido cuya secuencia de aminoácidos incluye al menos una CDR (por ejemplo, al menos una CDR de cadena pesada y/o al menos una CDR de cadena ligera) que es sustancialmente idéntica a una encontrada en un anticuerpo de referencia. En algunas realizaciones una CDR incluida es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia en que ésta es ya sea idéntica en secuencia o contiene entre 1 - 5 sustituciones de aminoácido cuando se compara con la CDR de referencia. En algunas realizaciones una CDR incluida es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia en que ésta muestra al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con la CDR de referencia. En algunas realizaciones una CDR incluida es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia en que ésta muestra al menos 96%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con la CDR de referencia. En algunas realizaciones una CDR incluida es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia en que al menos un aminoácido dentro de la CDR incluida se suprime, agrega, o sustituye cuando se compara con la CDR de referencia pero la CDR incluida tiene una secuencia de aminoácidos que es de otra manera idéntica a la de la CDR de referencia. En algunas realizaciones una CDR incluida es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia en que 1 - 5 aminoácidos dentro de la CDR incluida se suprimen, agregan, o sustituyen cuando se compara con la CDR de referencia pero la CDR incluida tiene una secuencia de aminoácidos que es de otra manera idéntica a la CDR de referencia. En algunas realizaciones una CDR incluida es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia en que al menos un aminoácido dentro de la CDR incluida se sustituye cuando se compara con la CDR de referencia pero la CDR incluida tiene una secuencia de aminoácidos que es de otra manera idéntica a la de la CDR de referencia. En algunas realizaciones una CDR incluida es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia en que 1 - 5 aminoácidos dentro de la CDR incluida se suprimen, agregan, o sustituyen cuando se compara con la CDR de referencia pero la CDR incluida tiene una secuencia de aminoácidos que es de otra manera idéntica a la CDR de referencia. En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo es o comprende un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos incluye elementos estructurales reconocidos por aquellos expertos en la técnica como un dominio variable de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo es una proteína polipeptídica que tiene un dominio de unión que es homólogo o en gran medida homólogo a un dominio de unión a inmunoglobulina.

Anticuerpo: como se conoce en la técnica, un “anticuerpo” es una inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno particular. El término abarca inmunoglobulinas que se producen naturalmente porque son generadas por un organismo que reacciona al antígeno, y también aquellas que se producen o diseñan por ingeniería. Un anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Un anticuerpo puede ser miembro de cualquier clase de inmunoglobulina, que incluye cualquiera de las clases humanas: IgG, IgM, IgA e IgD. Se sabe que una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) típica, como se entiende en la técnica, comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena “ligera” (aproximadamente 25 kD) y una cadena “pesada” (aproximadamente 50 - 70 kD). El terminal N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. Los términos “cadena ligera variable” (VL) y “cadena pesada variable” (VH) se refieren a estas cadenas ligera y pesada respectivamente. Cada región variable se subdivide adicionalmente en regiones hipervariables (HV) y marco (FR). Las regiones hipervariables comprenden tres áreas de secuencia de hipervariabilidad llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR 1, CDR 2 y CDR 3), separadas por cuatro regiones marco (FR1, FR2, FR2 y FR4) que forman una estructura de hoja beta y sirven como un andamio para mantener en posición las regiones HV. El terminal C de cada cadena ligera y pesada define una región constante que consta de un dominio para la cadena ligera (CL) y tres para la cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). En algunas realizaciones, el término “longitud completa” se utiliza en referencia a un anticuerpo para significar que contiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, opcionalmente asociadas por enlaces disulfuro como ocurre con los anticuerpos producidos naturalmente. En algunas realizaciones, se produce un anticuerpo mediante una célula. En algunas realizaciones, un anticuerpo se produce mediante síntesis química. En algunas realizaciones, un anticuerpo se deriva de un mamífero. En algunas realizaciones, un anticuerpo se deriva de un animal tal como, pero sin limitarse a, ratón, rata, caballo, cerdo o cabra. En algunas realizaciones, se produce un anticuerpo utilizando un sistema de cultivo celular recombinante. En algunas realizaciones, un anticuerpo puede ser un anticuerpo purificado (por ejemplo, mediante cromatografía de inmunoafinidad). En algunas realizaciones, un anticuerpo puede ser un anticuerpo humano. En algunas realizaciones, un anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado (anticuerpo de especies no humanas cuyas secuencias de proteínas se han modificado para aumentar su similitud con variantes de anticuerpos producidas naturalmente en humanos). En algunas realizaciones, un anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico (anticuerpo elaborado al combinar material genético de una fuente no humana, por ejemplo, ratón, rata, caballo o cerdo, con material genético de humanos).

Fragmento de anticuerpo: Como se utiliza en el presente documento, un “fragmento de anticuerpo” incluye una porción de un anticuerpo intacto, tal como, por ejemplo, la región variable o de unión al antígeno de un anticuerpo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; triacuerpos; tetracuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos aislados, fragmentos “Fv”, que consisten en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, moléculas de polipéptido recombinantes de cadena sencilla en las que las regiones variables de la cadena ligera y pesada están conectadas por un ligador peptídico (“proteínas ScFv”), y unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los residuos de aminoácidos que imitan la región hipervariable. En muchas realizaciones, un fragmento de anticuerpo contiene una secuencia suficiente del anticuerpo original del cual es un fragmento que se une al mismo antígeno que el anticuerpo original; en algunas realizaciones, un fragmento se une al antígeno con una afinidad comparable a la del anticuerpo original y/o compite con el anticuerpo original por unirse al antígeno. Ejemplos de fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento F(ab')2, fragmento scFv, fragmento Fv, diacuerpo dsFv, fragmento dAb, fragmento Fd', fragmento Fd, y una región de determinante de complementariedad (CDR) aislada. Se puede producir un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo por cualquier medio. Por ejemplo, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo se puede producir enzimática o químicamente mediante la fragmentación de un anticuerpo intacto y/o se puede producir de forma recombinante a partir de un gen que codifica la secuencia parcial del anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo se puede producir total o parcialmente de forma sintética. Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede comprender opcionalmente un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla. Alternativa o adicionalmente, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede comprender múltiples cadenas que están ligadas entre sí, por ejemplo, mediante enlaces disulfuro. Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede comprender opcionalmente un complejo multimolecular. Un fragmento de anticuerpo funcional comprende normalmente al menos aproximadamente 50 aminoácidos y más normalmente comprende al menos aproximadamente 200 aminoácidos.

Agente antivírico: Como se utiliza en el presente documento, el término “agente antivírico” se refiere a una clase de medicación utilizada específicamente para tratar infecciones virales al inhibir, desactivar o destruir partículas de virus. En general, un agente antivírico puede ser o comprender un compuesto de cualquier clase química (por ejemplo, una molécula pequeña, metal, ácido nucleico, polipéptido, lípido y/o carbohidrato). En algunas realizaciones, un agente antivírico es o comprende un anticuerpo o imitador de anticuerpo. En algunas realizaciones, un agente antivírico es o comprende un agente de ácido nucleico (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido, un ARNic, un ARNhc, etc.) o un imitador del mismo. En algunas realizaciones, un agente antivírico es o comprende una molécula pequeña. En algunas realizaciones, un agente antivírico es o comprende un compuesto de origen natural (por ejemplo, molécula pequeña). En algunas realizaciones, un agente antivírico tiene una estructura química que es generada y/o modificada por la mano del hombre.

Aproximadamente: Como se utiliza en el presente documento, el término “aproximadamente” o “alrededor de”, según se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertas realizaciones, el término “aproximadamente” o “alrededor de” se refiere a un rango de valores que se encuentran dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier dirección (mayor o menor que) del valor de referencia establecido a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto (excepto cuando dicho número exceda el 100% de un valor posible).

Bebé: Como se utiliza en el presente documento, el término “bebé” se refiere a un ser humano menor de dos años. Los pesos corporales típicos de un bebé varían entre 3 libras y 20 libras.

Biológicamente activo: Como se utiliza en el presente documento, la frase “biológicamente activo” se refiere a una característica de cualquier sustancia que tenga actividad en un sistema biológico (por ejemplo, cultivo celular, organismo, etc.). Por ejemplo, una sustancia que, cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biológico sobre ese organismo, se considera biológicamente activa. En realizaciones particulares, donde una proteína o polipéptido es biológicamente activo, una porción de esa proteína o polipéptido que comparte al menos una actividad biológica de la proteína o polipéptido se denomina normalmente como una porción “biológicamente activa”.

Porción característica: Como se utiliza en el presente documento, el término “porción característica” se utiliza, en el sentido más amplio, para referirse a una porción de una sustancia cuya presencia (o ausencia) se correlaciona con la presencia (o ausencia) de una característica particular, atributo o actividad de la sustancia. En algunas realizaciones, una porción característica de una sustancia es una porción que se encuentra en la sustancia y en sustancias relacionadas que comparten la característica, atributo o actividad particular, pero no en aquellas que no comparten la característica, atributo o actividad particular. En ciertas realizaciones, una porción característica comparte al menos una característica funcional con la sustancia intacta. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una “porción característica” de una proteína o polipéptido es una que contiene un tramo continuo de aminoácidos, o una colección de tramos continuos de aminoácidos, que juntos son característicos de una proteína o polipéptido. En algunas realizaciones, cada tramo continuo de este tipo contiene generalmente al menos 2, 5, 10, 15, 20, 50 o más aminoácidos. En general, una porción característica de una sustancia (por ejemplo, de una proteína, anticuerpo, etc.) es aquella que, además de la secuencia y/o identidad estructural especificada anteriormente, comparte al menos una característica funcional con la sustancia intacta relevante. En algunas realizaciones, una porción característica puede ser biológicamente activa.

Niño: Como se utiliza en el presente documento, el término “niño” se refiere a un ser humano entre dos y 18 años de edad. El peso corporal puede variar ampliamente según las edades y los niños específicos, con un rango típico de entre 30 y 150 libras.

Terapia de combinación: el término “terapia de combinación”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a aquellas situaciones en las que se administran dos o más agentes farmacéuticos diferentes en regímenes superpuestos de modo que el sujeto se expone simultáneamente a ambos agentes.

Comparable: el término “comparable” se utiliza en el presente documento para describir dos (o más) conjuntos de condiciones o circunstancias que son suficientemente similares entre sí para permitir la comparación de los resultados obtenidos o los fenómenos observados. En algunas realizaciones, los conjuntos comparables de condiciones o circunstancias se caracterizan por una pluralidad de características sustancialmente idénticas y una o un pequeño número de características variadas. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que los conjuntos de condiciones son comparables entre sí cuando se caracterizan por un número y tipo suficiente de características sustancialmente idénticas para garantizar una conclusión razonable de que las diferencias en los resultados obtenidos o los fenómenos observados en los diferentes conjuntos de condiciones o las circunstancias son provocadas por o indicativas de la variación en aquellas características que son variadas.

Que corresponde a: Como se utiliza en el presente documento, el término “que corresponde a” se utiliza a menudo para designar la posición/identidad de un residuo de aminoácido en un polipéptido de interés. Aquellos expertos en la materia apreciarán que, por motivos de simplicidad, los residuos en un polipéptido a menudo se designan utilizando un sistema de numeración canónico basado en un polipéptido relacionado de referencia, de modo que un aminoácido “que corresponde a” un residuo en la posición 190, por ejemplo, no es necesario que sea realmente el aminoácido 190 en una cadena de aminoácidos particular, sino que corresponde al residuo encontrado en 190 en el polipéptido de referencia; los expertos en la técnica apreciarán fácilmente cómo identificar los aminoácidos “correspondientes”.

Forma de dosificación: Como se utiliza en el presente documento, los términos “forma de dosificación” y “forma de dosificación unitaria” se refieren a una unidad físicamente discreta de una proteína terapéutica (por ejemplo, un anticuerpo) para el paciente que se va a tratar. Cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado. Se entenderá, sin embargo, que la dosificación total de la composición la decidirá el médico tratante dentro del alcance del buen juicio médico.

Régimen de dosificación: Un “régimen de dosificación” (o “régimen terapéutico”), es el término, que se utiliza en el presente documento, es un conjunto de dosis unitarias (normalmente más de una) que se administran individualmente a un sujeto, normalmente separadas por periodos de tiempo. En algunas realizaciones, un agente terapéutico dado tiene un régimen de dosificación recomendado, que puede implicar una o más dosis. En algunas realizaciones, un régimen de dosificación comprende una pluralidad de dosis, cada una de las cuales está separada entre sí por un período de tiempo de la misma duración; en algunas realizaciones, un régimen de dosificación comprende una pluralidad de dosis y al menos dos períodos de tiempo diferentes que separan las dosis individuales. En algunas realizaciones, todas las dosis dentro de un régimen de dosificación son de la misma cantidad de dosis unitaria. En algunas realizaciones, las diferentes dosis dentro de un régimen de dosificación son de diferentes cantidades. En algunas realizaciones, un régimen de dosificación comprende una primera dosis en una primera cantidad de dosis, seguida de una o más dosis adicionales en una segunda cantidad de dosis diferente de la primera cantidad de dosis. En algunas realizaciones, un régimen de dosificación comprende una primera dosis en una primera cantidad de dosis, seguida de una o más dosis adicionales en una segunda cantidad de dosis igual que la primera cantidad de dosis.

Serotipo de DV: Como se utiliza en el presente documento, el término “serotipo” generalmente se refiere a variaciones distintas dentro de los DV. Los cuatro serotipos de DV diferentes (DV1-4) que comprenden el grupo genético DV se diferencian entre sí en aproximadamente un 25% a 40% en el nivel de aminoácidos. Los cuatro serotipos de DV varían en patogenicidad, pero todos prevalecen en áreas de Asia, África, Centroamérica y Sudamérica. La infección con uno de estos serotipos proporciona inmunidad de por vida a ese serotipo, sin embargo, también aumenta el riesgo de enfermedad grave tras una infección secundaria de un serotipo de DV heterólogo.

Epítopo: Como se utiliza en el presente documento, el término “epítopo” tiene su significado como se entiende en la técnica. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que un epítopo también conocido como determinante antigénico es una región molecular de un antígeno que es reconocido por el sistema inmunológico, específicamente por anticuerpos, células B o células T. Se apreciará además que los epítopos pueden estar compuestos de azúcares, lípidos o aminoácidos. Los epítopos de los antígenos de proteína se dividen en dos categorías, epítopos conformacionales y epítopos lineales, en base a su estructura e interacción con el parátopo (parte de un anticuerpo que reconoce el epítopo). Un epítopo conformacional se compone de secciones discontinuas de la secuencia de aminoácidos del antígeno y estos epítopos interactúan con el parátopo basándose en las características de la superficie 3-D y la forma o estructura terciaria del antígeno. Los epítopos lineales interactúan con el parátopo basándose en su estructura primaria y un epítopo lineal está formado por una secuencia continua de aminoácidos del antígeno.

Expresión: Como se utiliza en el presente documento, “expresión” de una secuencia de ácidos nucleicos se refiere a uno o más de los siguientes eventos: (1) producción de una plantilla de ARN a partir de una secuencia de ADN (por ejemplo, mediante transcripción); (2) procesamiento de una transcripción de ARN (por ejemplo, mediante empalme, edición, formación de la tapa 5' y/o formación del extremo 3'); (3) traducción de un ARN en un polipéptido o proteína; y/o (4) modificación postraduccional de un polipéptido o proteína.

Funcional: Como se utiliza en el presente documento, una molécula biológica “funcional” es una molécula biológica en una forma en la que exhibe una propiedad y/o actividad por la que se caracteriza.

Gen: Como se utiliza en el presente documento, el término “gen” tiene su significado como se entiende en la técnica. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que el término “gen” puede incluir secuencias reguladoras de genes (por ejemplo, promotores, mejoradores, etc.) y/o secuencias de intrones. Se apreciará adicionalmente que las definiciones de gen incluyen referencias a ácidos nucleicos que no codifican proteínas sino que codifican moléculas de ARN funcionales tales como ARNt, agentes inductores de ARNi, etc. Para mayor claridad, observamos que, como se utiliza en la presente solicitud, el término “gen” generalmente se refiere a una porción de un ácido nucleico que codifica una proteína; el término puede abarcar opcionalmente secuencias reguladoras, como resultará evidente a partir del contexto para aquellos expertos en la técnica. Esta definición no pretende excluir la aplicación del término “gen” a unidades de expresión que no codifican proteínas, sino más bien aclarar que, en la mayoría de los casos, el término tal como se utiliza en este documento se refiere a un ácido nucleico que codifica proteínas.

Producto génico o producto de expresión: Como se utiliza en el presente documento, el término “producto génico” o “producto de expresión” generalmente se refiere a un ARN transcrito del gen (pre y/o posprocesamiento) o un polipéptido (pre y/o posmodificación) codificado por un ARN transcrito del gen.

Homología: Como se utiliza en el presente documento, el término “homología” se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptido. En algunas realizaciones, las moléculas poliméricas se consideran “homólogas” entre sí si sus secuencias son al menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% idénticas. En algunas realizaciones, las moléculas poliméricas se consideran “homólogas” entre sí si sus secuencias son al menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% similares.

Identidad: Como se utiliza en el presente documento, el término “identidad” se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptido. El cálculo del porcentaje de identidad de dos secuencias de ácidos nucleicos, por ejemplo, se puede realizar al alinear las dos secuencias con fines de comparación óptimos (por ejemplo, se pueden introducir huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencias de ácidos nucleicos para una alineación óptima y las secuencias no idénticas pueden descartarse a efectos de comparación). En ciertas realizaciones, la longitud de una secuencia alineada con fines de comparación tiene al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o sustancialmente el 100% de la longitud de la secuencia de referencia. A continuación, se comparan los nucleótidos en las posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que se debe introducir para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden lograr utilizando un algoritmo matemático. Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Meyers y Miller (CABIOS, 1989, 4: 11-17), que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0) utilizando una tabla de residuos de peso PAM120., una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede, alternativamente, determinar utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG utilizando una matriz NWSgapdna.CMP.

Aislado: Como se utiliza en el presente documento, el término “aislado” se refiere a una sustancia y/o entidad que ha sido (1) separada de al menos algunos de los componentes con los que se asoció cuando se produjo inicialmente (ya sea en la naturaleza y/o o en un entorno experimental), y/o (2) producida, preparada y/o fabricada por la mano del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas se pueden separar desde aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, o más de aproximadamente 99% de los otros componentes con los que se asociaron inicialmente. En algunas realizaciones, los agentes aislados son aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, o más de aproximadamente 99% puros.. Como se utiliza en el presente documento, una sustancia es “pura” si está sustancialmente libre de otros componentes. Como se utiliza en el presente documento, el cálculo del porcentaje de pureza de sustancias y/o entidades aisladas no debe incluir excipientes (por ejemplo, tampón, solvente, agua, etc.).

Mimotopo: Como se utiliza en el presente documento, el término “mimotopo” se refiere a una macromolécula que imita la estructura de un epítopo. En algunas realizaciones, un mimotopo provoca una respuesta de anticuerpo idéntica o similar a la provocada por su epítopo correspondiente. En algunas realizaciones, un anticuerpo que reconoce un epítopo también reconoce un mimotopo que imita ese epítopo. En algunas realizaciones, un mimotopo es un péptido. En algunas realizaciones, un mimotopo es una molécula pequeña, carbohidrato, lípido o ácido nucleico. En algunas realizaciones, los mimotopos son mimotopos peptídicos o no peptídicos de epítopos de DV conservados. En algunas realizaciones, al imitar la estructura de un epítopo viral definido, un mimotopo interfiere con la capacidad de las partículas del virus DV para unirse a sus compañeros de unión naturales (por ejemplo, receptor diana de DV, Rab5, GRP78), por ejemplo al unirse al compañero de unión natural por sí mismo.

Mutante: Como se utiliza en el presente documento, el término “mutante” se refiere a una entidad que muestra una identidad estructural significativa con una entidad de referencia pero difiere estructuralmente de la entidad de referencia en la presencia o nivel de una o más fracciones químicas en comparación con la entidad de referencia. En muchas realizaciones, un mutante también difiere funcionalmente de su entidad de referencia. En general, si una entidad en particular se considera correctamente como un “mutante” de una entidad de referencia se basa en su grado de identidad estructural con la entidad de referencia. Como apreciarán aquellos expertos en la técnica, cualquier entidad de referencia biológica o química tiene ciertos elementos estructurales característicos. Un mutante, por definición, es una entidad química distinta que comparte uno o más de esos elementos estructurales característicos. Para dar solo algunos ejemplos, una molécula pequeña puede tener un elemento estructural de núcleo característico (por ejemplo, un núcleo de macrociclo) y/o una o más fracciones colgantes características de modo que un mutante de la molécula pequeña es uno que comparte el elemento estructural del núcleo y las fracciones colgantes características pero difiere en otras fracciones colgantes y/o en los tipos de enlaces presentes (sencillo frente a doble, E frente a Z, etc.) dentro del núcleo, un polipéptido puede tener un elemento de secuencia característico compuesto por una pluralidad de aminoácidos que tienen designadas posiciones relativas entre sí en un espacio lineal o tridimensional y/o que contribuyen a una función biológica particular, un ácido nucleico puede tener un elemento de secuencia característico compuesto por una pluralidad de residuos de nucleótidos que tienen designadas posiciones relativas entre sí en espacio lineal o tridimensional. Por ejemplo, un polipéptido mutante puede diferir de un polipéptido de referencia como resultado de una o más diferencias en la secuencia de aminoácidos y/o una o más diferencias en fracciones químicas (por ejemplo, carbohidratos, lípidos, etc.) unidas covalentemente a la estructura principal de polipéptidos. En algunas realizaciones, un polipéptido mutante muestra una identidad de secuencia general con un polipéptido de referencia que es al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% o 99%. Alternativa o adicionalmente, en algunas realizaciones, un polipéptido mutante no comparte al menos un elemento de secuencia característico con un polipéptido de referencia. En algunas realizaciones, el polipéptido de referencia tiene una o más actividades biológicas. En algunas realizaciones, un polipéptido mutante comparte una o más de las actividades biológicas del polipéptido de referencia. En algunas realizaciones, un polipéptido mutante carece de una o más de las actividades biológicas del polipéptido de referencia. En algunas realizaciones, un polipéptido mutante muestra un nivel reducido de una o más actividades biológicas en comparación con el polipéptido de referencia.

Ácido nucleico: Como se utiliza en el presente documento, el término “ácido nucleico”, en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que es o se puede incorporar en una cadena de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es un compuesto y/o sustancia que se incorpora o se puede incorporar en una cadena de oligonucleótidos mediante un enlace fosfodiéster. En algunas realizaciones, “ácido nucleico” se refiere a residuos de ácido nucleico individuales (por ejemplo, nucleótidos y/o nucleósidos). En algunas realizaciones, “ácido nucleico” se refiere a una cadena de oligonucleótidos que comprende residuos de ácido nucleico individuales. Como se utiliza en el presente documento, los términos “oligonucleótido” y “polinucleótido” se pueden utilizar indistintamente. En algunas realizaciones, “ácido nucleico” abarca ARN así como ADN y/o ADNc de cadena sencilla y/o de cadena doble. Adicionalmente, los términos “ácido nucleico”, “ADN”, “ARN” y/o términos similares incluyen análogos de ácido nucleico, es decir, análogos que tienen una estructura principal distinta de un fosfodiéster. Por ejemplo, los denominados “ácidos nucleicos peptídicos”, que se conocen en la técnica y tienen enlaces peptídicos en lugar de enlaces fosfodiéster en la estructura principal, se consideran dentro del alcance de la presente invención. El término “secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos” incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y/o codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y/o ^aRⁿpueden incluir intrones. Los ácidos nucleicos se pueden purificar a partir de fuentes naturales, producir utilizando sistemas de expresión recombinantes y opcionalmente purificarse, sintetizarse químicamente, etc. Cuando sea apropiado, por ejemplo, en el caso de moléculas sintetizadas químicamente, los ácidos nucleicos pueden comprender análogos de nucleósidos tales como análogos que tienen bases modificadas químicamente o azúcares, modificaciones de la estructura principal, etc. Se presenta una secuencia de ácidos nucleicos en la dirección 5' a 3' a menos que se indique lo contrario. El término “segmento de ácido nucleico” se utiliza en el presente documento para referirse a una secuencia de ácidos nucleicos que es una porción de una secuencia de ácidos nucleicos más larga. En muchas realizaciones, un segmento de ácido nucleico comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más residuos. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es o comprende nucleósidos naturales (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina); análogos de nucleósidos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina y 2-tiocitidina); bases modificadas químicamente; bases modificadas biológicamente (por ejemplo, bases metiladas); bases intercaladas; azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluororibosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa y hexosa); y/o grupos fosfato modificados (por ejemplo, fosforotioatos y ligamientos 5'-N-fosforamidita). En algunas realizaciones, la presente invención se dirige específicamente a “ácidos nucleicos no modificados”, es decir, ácidos nucleicos (por ejemplo, polinucleótidos y residuos, que incluyen nucleótidos y/o nucleósidos) que no se han modificado químicamente para facilitar o lograr el suministro.

Paciente: Como se utiliza en el presente documento, el término “paciente” o “sujeto” se refiere a cualquier organismo al que se puede administrar una composición proporcionada, por ejemplo, con fines experimentales, de diagnóstico, profilácticos, cosméticos y/o terapéuticos. Los pacientes típicos incluyen animales (por ejemplo, mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y/o humanos). En algunas realizaciones, un paciente es un humano. Un humano incluye formas pre y postnatales.

Farmacéuticamente aceptable: el término “farmacéuticamente aceptable” como se utiliza en el presente documento, se refiere a sustancias que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica, u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.

Portador farmacéuticamente aceptable: Como se utiliza en el presente documento, el término “portador farmacéuticamente aceptable” significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un relleno líquido o sólido, diluyente, excipiente o material encapsulante de solvente, involucrado en llevar o transportar el compuesto en cuestión desde un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano o porción del cuerpo. Cada portador debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen: azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; Solución de Ringer; alcohol etílico; soluciones tamponadas de pH; poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; y otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.

Composición farmacéutica: Como se utiliza en el presente documento, el término “composición farmacéutica” se refiere a un agente activo, formulado junto con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, el agente activo está presente en una cantidad de dosis unitaria apropiada para la administración en un régimen terapéutico que muestra una probabilidad estadísticamente significativa de lograr un efecto terapéutico predeterminado cuando se administra a una población relevante. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se pueden formular especialmente para la administración en forma sólida o líquida, que incluye aquellas adaptadas para lo siguiente: administración oral, por ejemplo, soluciones orales (soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas), comprimidos, por ejemplo, aquellos destinados a absorción bucal, sublingual y sistémica, bolos, polvos, gránulos, pastas para aplicación en la lengua; administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o epidural como, por ejemplo, una solución o suspensión estéril, o una formulación de liberación sostenida; aplicación tópica, por ejemplo, como una crema, ungüento o un parche o pulverizador de liberación controlada aplicado a la piel, los pulmones o la cavidad oral; por vía intravaginal o intrarrectal, por ejemplo, como pesario, crema o espuma; por vía sublingual; por vía ocular; por vía transdérmica; o por vía nasal, pulmonar y otras superficies de mucosa.

Polipéptido: Como se utiliza en el presente documento, un “polipéptido”, en términos generales, es una cadena de al menos dos aminoácidos unidos entre sí mediante un enlace peptídico. En algunas realizaciones, un polipéptido puede incluir al menos 3 -5 aminoácidos, cada uno de los cuales está unido a otros por medio de al menos un enlace peptídico. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que los polipéptidos a veces incluyen aminoácidos “no naturales” u otras entidades que, no obstante, son capaces de integrarse en una cadena polipeptídica, opcionalmente.

Proteína: Como se utiliza en el presente documento, el término “proteína” se refiere a un polipéptido (es decir, una cadena de al menos dos aminoácidos ligados entre sí por enlaces peptídicos). Las proteínas pueden incluir fracciones distintas de los aminoácidos (por ejemplo, pueden ser glicoproteínas, proteoglicanos, etc.) y/o se pueden procesar o modificar de otro modo. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que una “proteína” puede ser una cadena polipeptídica completa producida por una célula (con o sin una secuencia señal), o puede ser una parte característica de la misma. Aquellos expertos en la materia apreciarán que una proteína a veces puede incluir más de una cadena polipeptídica, por ejemplo ligada por uno o más enlaces disulfuro o asociada por otros medios. Los polipéptidos pueden contener I-aminoácidos, d-aminoácidos o ambos y pueden contener cualquiera de una variedad de modificaciones de aminoácidos o análogos conocidos en la técnica. Las modificaciones útiles incluyen, por ejemplo, acetilación terminal, amidación, metilación, etc. En algunas realizaciones, las proteínas pueden comprender aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, aminoácidos sintéticos y combinaciones de los mismos. El término “péptido” se utiliza generalmente para referirse a un polipéptido que tiene una longitud de menos de aproximadamente 100 aminoácidos, menos de aproximadamente 50 aminoácidos, menos de 20 aminoácidos o menos de 10 aminoácidos. En algunas realizaciones, las proteínas son anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, porciones biológicamente activas de los mismos y/o porciones características de los mismos.

Infección recurrente por DV: Como se utiliza en el presente documento, una “infección recurrente por DV” se refiere al resurgimiento de evidencia clínica y/o de laboratorio de infección, por ejemplo, uno o más síntomas de infección o la presencia de partículas de DV y/o partículas de DV circulantes en el hígado del sujeto.

Resistente: el término “resistente” como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier sujeto que no responde con una eficacia clínica esperada después de la administración de las composiciones proporcionadas como normalmente observa el personal médico en ejercicio.

Serotipo: en general, un “serotipo” o “serovariedad” se refiere a distintas variaciones dentro de una especie de bacteria o virus o entre células inmunitarias de diferentes individuos. Normalmente, estos microorganismos se clasifican juntos en función de sus antígenos de superficie celular, lo que permite la clasificación epidemiológica de organismos a nivel de subespecies.

Molécula pequeña: En general, una “molécula pequeña” es una molécula que es menor de aproximadamente 5 kilodaltons (kD) en tamaño. En algunas realizaciones, la molécula pequeña es menor de aproximadamente 4 kD, 3 kD, aproximadamente 2 kD, o aproximadamente 1 kD. En algunas realizaciones, la molécula pequeña es menor de aproximadamente 800 daltons (D), aproximadamente 600 D, aproximadamente 500 D, aproximadamente 400 D, aproximadamente 300 D, aproximadamente 200 D, o aproximadamente 100 D. En algunas realizaciones, una molécula pequeña es menor de aproximadamente 2000 g/mol, menor de aproximadamente 1500 g/mol, menor de aproximadamente 1000 g/mol, menor de aproximadamente 800 g/mol, o menor de aproximadamente 500 g/mol. En algunas realizaciones, las moléculas pequeñas no son poliméricas En algunas realizaciones, de acuerdo con la presente invención, las moléculas pequeñas no son proteínas, polipéptidos, oligopéptidos, péptidos, polinucleótidos, oligonucleótidos, polisacáridos, glicoproteínas, proteoglicanos, etc.

Sustancialmente: Como se utiliza en el presente documento, el término “sustancialmente” se refiere a la condición cualitativa de exhibir una extensión o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto en las artes biológicas comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos rara vez, o nunca, llegan a completarse y/o proceden a ser completos o logran o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término “sustancialmente” se utiliza en el presente documento para capturar la posible falta de completitud inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos.

Homología sustancial de secuencia: La frase “homología sustancial” se utiliza en el presente documento para hacer referencia a una comparación entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. Como lo apreciarán aquellos expertos en la técnica, generalmente se considera que dos secuencias son “sustancialmente homólogas” si contienen residuos homólogos en las posiciones correspondientes. Los residuos homólogos pueden ser residuos idénticos. Alternativamente, los residuos homólogos pueden ser residuos no idénticos con características estructurales y/o funcionales apropiadamente similares. Por ejemplo, como es bien conocido por aquellos expertos en la técnica, ciertos aminoácidos se clasifican normalmente como aminoácidos “hidrófobos” o “hidrófilos”, y/o tienen cadenas laterales “polares” o “no polares”. La sustitución de un aminoácido por otro del mismo tipo a menudo se puede considerar una sustitución “homóloga”. Las categorizaciones típicas de aminoácidos se resumen a continuación:

Como es bien conocido en esta técnica, las secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos se pueden comparar utilizando cualquiera de una variedad de algoritmos, que incluyen aquellos disponibles en programas informáticos comerciales como BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTP, Gapped BLAST y PSI-. BLAST para secuencias de aminoácidos. Ejemplos de dichos programas se describen en Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. Además de identificar secuencias homólogas, los programas mencionados anteriormente normalmente proporcionar una indicación del grado de homología. En algunas realizaciones, se considera que dos secuencias son sustancialmente homólogas si al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o más de sus residuos correspondientes son homólogos sobre un tramo relevante de los residuos. En algunas realizaciones, el tramo relevante es una secuencia completa. En algunas realizaciones, el tramo relevante es al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55, al menos 60, al menos 65, al menos 70, al menos 75, al menos 80, al menos 85, al menos 90, al menos 95, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, al menos 200, al menos 225, al menos 250, al menos 275, al menos 300, al menos 325, al menos 350, al menos 375, al menos 400, al menos 425, al menos 450, al menos 475, al menos 500 o más residuos.

Identidad sustancial: la frase “identidad sustancial” se utiliza en el presente documento para hacer referencia a una comparación entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. Como apreciarán aquellos expertos en la técnica, generalmente se considera que dos secuencias son “sustancialmente idénticas” si contienen residuos idénticos en las posiciones correspondientes. Como es bien conocido en esta técnica, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos se pueden comparar utilizando cualquiera de una variedad de algoritmos, que incluye aquellos disponibles en programas informáticos comerciales tales como BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTP, BLAST con huecos y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Ejemplos de dichos programas se describen en Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol, 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. Además de identificar secuencias idénticas, los programas mencionados anteriormente normalmente proporcionan una indicación del grado de identidad. En algunas realizaciones, se considera que dos secuencias son sustancialmente idénticas si al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de sus residuos correspondientes son idénticos en un tramo relevante de residuos. En algunas realizaciones, el tramo relevante es una secuencia completa. En algunas realizaciones, el tramo relevante es al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o más residuos.

Que padece de: Un individuo “que padece de” una enfermedad, trastorno o afección (por ejemplo, DV) ha sido diagnosticado y/o presenta uno o más síntomas de la enfermedad, trastorno o afección. La infección por DV suele ser asintomática. En algunas realizaciones, un individuo que padece DV ha estado expuesto y/o infectado con DV, pero no muestra ningún síntoma de infección por DV y/o no se le ha diagnosticado infección por DV. En algunas realizaciones, un individuo que padece de DV es un individuo que tiene una o más partículas de DV en su sangre.

Susceptible a: Un individuo que es “susceptible a” una enfermedad, trastorno o afección (por ejemplo, DV) tiene riesgo de desarrollar la enfermedad, trastorno o afección. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno o afección no muestra ningún síntoma de la enfermedad, trastorno o afección. En algunas realizaciones, a un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno o afección no se le ha diagnosticado la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno o afección es un individuo que ha estado expuesto a afecciones asociadas con el desarrollo de la enfermedad, trastorno o afección (por ejemplo, el individuo ha estado expuesto a DV). En algunas realizaciones, el riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno y/o afección es un riesgo basado en la población (por ejemplo, usuarios de drogas intravenosas; receptores de sangre, productos sanguíneos y órganos donados antes de 1992, cuando dichos productos comenzaron a ser cribados; trabajadores de la salud que manipulan agujas; bebés nacidos de madres infectadas con DV; etc.).

Los síntomas se reducen: de acuerdo con la presente invención, los “síntomas se reducen” cuando uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno o afección particular se reducen en magnitud (por ejemplo, intensidad, gravedad, etc.) o frecuencia. Para mayor claridad, un retraso en la aparición de un síntoma en particular se considera una forma de reducir la frecuencia de ese síntoma. Para dar solo algunos ejemplos, los síntomas de DV de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, aparición repentina de fiebre, fiebre alta (a menudo más de 40 ° C), dolores musculares y articulares, dolor de cabeza, vómitos, diarrea, aparición de una erupción como piel enrojecida o erupción similar al sarampión, petequias (pequeñas manchas rojas provocadas por capilares rotos que no desaparecen cuando se presiona la piel), sangrado de las membranas mucosas, recuento bajo de glóbulos blancos, plaquetas bajas, acidosis metabólica, nivel elevado de aminotransferasa de hígado, pérdida de plasma que resulta en hemoconcentración (indicada por un aumento del hematocrito) e hipoalbuminemia, acumulación de líquido en el pecho y la cavidad abdominal (por ejemplo, derrame pleural o ascitis), hemorragia gastrointestinal, choque y hemorragia, prueba de torniquete positiva, hipotensión, infección del cerebro o el corazón, deterioro de órganos vitales (por ejemplo, hígado), trastornos neurológicos tales como mielitis transversa y/o combinaciones de los mismos. No se pretende que la presente invención se limite únicamente a los casos en los que se eliminen los síntomas. La presente invención contempla específicamente un tratamiento tal que uno o más síntomas se reducen (y de ese modo se “mejora” la afección del sujeto), aunque no se eliminan por completo.

Agente terapéutico: Como se utiliza en el presente documento, la frase “agente terapéutico” se refiere a cualquier agente que provoca un efecto farmacológico deseado cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, se considera que un agente es un agente terapéutico si demuestra un efecto estadísticamente significativo en una población apropiada. En algunas realizaciones, la población apropiada puede ser una población de organismos modelo. En algunas realizaciones, una población apropiada se puede definir mediante varios criterios, tales como un determinado grupo de edad, género, antecedentes genéticos, afecciones clínicas preexistentes, etc. En algunas realizaciones, un agente terapéutico es cualquier sustancia que se pueda utilizar para aliviar, mejorar, mitigar, inhibir, prevenir, retrasar el inicio, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno y/o afección.

Cantidad terapéuticamente eficaz: Como se utiliza en el presente documento, el término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de una proteína terapéutica que confiere un efecto terapéutico al sujeto tratado, en una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. El efecto terapéutico puede ser objetivo (es decir, medible mediante alguna prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto da una indicación o siente un efecto). En particular, la “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de una proteína o composición terapéutica eficaz para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección deseada, o para exhibir un efecto terapéutico o preventivo detectable, tal como al mejorar los síntomas asociados con la enfermedad, prevenir o retrasar la aparición de la enfermedad y/o también disminuir la gravedad o frecuencia de los síntomas de la enfermedad. Una cantidad terapéuticamente eficaz se administra comúnmente en un régimen de dosificación que puede comprender múltiples dosis unitarias. Para cualquier proteína terapéutica particular, una cantidad terapéuticamente eficaz (y/o una dosis unitaria apropiada dentro de un régimen de dosificación eficaz) puede variar, por ejemplo, dependiendo de la vía de administración, en combinación con otros agentes farmacéuticos. También, la cantidad específica terapéuticamente eficaz (y/o dosis unitaria) para cualquier paciente particular puede depender de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del agente farmacéutico específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administración, ruta de administración y/o velocidad de excreción o metabolismo de la proteína de fusión específica empleada; la duración del tratamiento; y factores similares como es bien conocido en las técnicas médicas.

Tratamiento: Como se utiliza en el presente documento, el término “tratamiento” (también “tratar” o “que trata”) se refiere a cualquier administración de una sustancia (por ejemplo, composiciones proporcionadas) que alivia, mejora, revive, inhibe, retrasa parcial o completamente la aparición de, reduce la gravedad y/o reduce la incidencia de uno o más síntomas, características y/o causas de una enfermedad, trastorno y/o afección particular (por ejemplo, DV). Dicho tratamiento puede ser de un sujeto que no muestra signos de la enfermedad, trastorno y/o afección relevante y/o de un sujeto que exhibe solo signos tempranos de la enfermedad, trastorno y/o afección. Alternativa o adicionalmente, dicho tratamiento puede ser de un sujeto que exhibe uno o más signos establecidos de la enfermedad, trastorno y/o afección relevante. En algunas realizaciones, el tratamiento puede ser de un sujeto al que se le ha diagnosticado que padece la enfermedad, trastorno y/o afección relevante. En algunas realizaciones, el tratamiento puede ser de un sujeto que se sabe que tiene uno o más factores de susceptibilidad que están correlacionados estadísticamente con un mayor riesgo de desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección relevante.

Dosis unitaria: La expresión “dosis unitaria” como se utiliza en el presente documento se refiere a una cantidad administrada como una dosis única y/o en una unidad físicamente discreta de una composición farmacéutica. En muchas realizaciones, una dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada de un agente activo. En algunas realizaciones, una dosis unitaria contiene una única dosis completa del agente. En algunas realizaciones, se administra más de una dosis unitaria para lograr una dosis única total. En algunas realizaciones, se requiere, o se espera que se requiera, la administración de múltiples dosis unitarias para lograr el efecto deseado. Una dosis unitaria puede ser, por ejemplo, un volumen de líquido (por ejemplo, un portador aceptable) que contiene una cantidad predeterminada de uno o más agentes terapéuticos, una cantidad predeterminada de uno o más agentes terapéuticos en forma sólida, una formulación de liberación sostenida o un dispositivo de suministro de fármaco que contiene una cantidad predeterminada de uno o más agentes terapéuticos, etc. Se apreciará que puede estar presente una dosis unitaria en una formulación que incluye cualquiera de una variedad de componentes además del agente o agentes terapéuticos. Por ejemplo, se pueden incluir portadores aceptables (por ejemplo, portadores farmacéuticamente aceptables), diluyentes, estabilizadores, tampones, conservantes, etc., como se describe más adelante. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que, en muchas realizaciones, una dosificación diaria total apropiada de un agente terapéutico particular puede comprender una porción, o una pluralidad, de dosis unitarias, y puede ser decidida, por ejemplo, por el médico tratante dentro del alcance del buen juicio médico. En algunas realizaciones, el nivel de dosis eficaz específico para cualquier sujeto u organismo particular puede depender de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; actividad del compuesto activo específico empleado; composición específica empleada; edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto; tiempo de administración y tasa de excreción del compuesto activo específico empleado; duración del tratamiento; fármacos y/o terapias adicionales utilizados en combinación o coincidentemente con el compuesto o compuestos específicos empleados, y factores similares bien conocidos en la técnica médica.

Vacunación: Como se utiliza en el presente documento, el término “vacunación” se refiere a la administración de una composición destinada a generar una respuesta inmunitaria, por ejemplo, a un agente que causa una enfermedad. Para los propósitos de la presente invención, la vacunación se puede administrar antes, durante y/o después de la exposición a un agente causante de enfermedad y, en ciertas realizaciones, antes, durante y/o poco después de la exposición al agente. En algunas realizaciones, la vacunación incluye múltiples administraciones, apropiadamente separadas en el tiempo, de una composición de vacunación.

Vector: Como se utiliza en el presente documento, “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que está asociado. En alguna realización, los vectores son capaces de replicación extracromosómica y/o expresión de ácidos nucleicos a los que están ligados en una célula anfitriona, tal como una célula eucariota y/o procariota. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes unidos operativamente se denominan en el presente documento “vectores de expresión”.

Tipo silvestre: Como se utiliza en el presente documento, el término “tipo silvestre” tiene su significado entendido en la técnica que se refiere a una entidad que tiene una estructura y/o actividad como se encuentra en la naturaleza en un estado o contexto “normal” (en contraste con mutante, enfermo, alterado, etc.). Aquellos expertos en la técnica apreciarán que los genes y polipéptidos de tipo silvestre a menudo existen en múltiples formas diferentes (por ejemplo, alelos).

Nomenclatura DV

Es bien sabido por aquellos expertos en la técnica que la nomenclatura DV normalmente utiliza números romanos (por ejemplo, “I”, “ II”, “III”, “IV”, etc.) que representa el genotipo DV y una letra minúscula (por ejemplo, “a”, “b”, etc.) que representa el subtipo DV. Aunque las reglas de nomenclatura son generalmente aceptadas en la técnica, aquellos expertos en la técnica reconocen que las reglas de nomenclatura no siempre se siguen estrictamente en publicaciones, presentaciones, conversaciones, etc. Por lo tanto, aquellos expertos en la técnica reconocerán que, por ejemplo, está implícito que “DV la”, “DV genotipo la” y “DV subtipo la” se podrían utilizar indistintamente por un experto en la técnica, y que los tres términos están destinados a referirse al genotipo DV I, subtipo a.

Como se utiliza en el presente documento, los números romanos (por ejemplo, “I”, “ II”, “ III”, “ IV”, etc.) se utilizan para referirse al genotipo D^vy letras minúsculas (por ejemplo, “a” “b”, etc.) se utilizan para referirse a subtipos de DV. También se entenderá que, cuando en el presente documento se hace referencia a DV de un genotipo particular, se pretende que abarque todos los subtipos del genotipo mencionado. Para dar solo un ejemplo, “genotipo I” se utiliza en el presente documento para referirse a todos los subtipos del genotipo I (por ejemplo, genotipo I, subtipo a; genotipo I, subtipo b; etc.).

Como se utiliza en el presente documento, cualquier número romano (por ejemplo, “ I”, “II”, “III”, “IV”, etc.) que esté presente después de las designaciones de genotipo y subtipo se entenderá que se refiere a la cepa de DV.

Descripción detallada de ciertas realizaciones

En el presente documento se proporcionan agentes de anticuerpos anti-DV útiles con características estructurales y/o funcionales particulares, así como composiciones y métodos que se relacionan con dichos agentes de anticuerpos.

Infección por el Virus del Dengue (DV)

La infección por DV representa una importante enfermedad viral transmitida por artrópodos, con más de 3.500 millones de personas viviendo en áreas de riesgo de la enfermedad y más de 200 millones de infecciones en todo el mundo, lo que resulta en 21,000 muertes por año. En particular, el número promedio anual de infecciones por el Virus del Dengue notificadas, la propagación geográfica y la gravedad de la enfermedad han aumentado drásticamente en los últimos años. Las epidemias del Virus del Dengue pueden provocar una morbilidad significativa, lo que genera costes económicos sustanciales e impactos en la atención médica (Guzman et al, 2010 Nature Reviews Microbiol. 8: S7-16).

La infección por DV es provocada por cualquiera de los cuatro virus relacionados transmitidos principalmente por mosquitos Aedes aegypti y es endémica de las regiones tropicales y subtropicales. La infección en un mamífero se inicia mediante la inyección de DV durante la ingestión de sangre de un mosquito Aedes infectado, por lo que el DV se deposita principalmente en los tejidos extravasculares. El período de incubación del DV después de la picadura de un mosquito es de 3 a 14 días. Las células dendríticas, los monocitos y los macrófagos se encuentran entre los primeros objetivos del DV. Después de la replicación inicial en la piel y los ganglios linfáticos, el DV aparece en la sangre en el transcurso de la etapa febril aguda, generalmente de 3 a 5 días.

El diagnóstico de laboratorio de rutina de la infección por el Virus del Dengue se basa en el aislamiento del DV y/o la detección de anticuerpos específicos para el DV. La infección puede provocar varios síndromes diferentes, influenciados por la edad y/o el estado inmunológico del individuo infectado. La infección por DV primaria puede ser asintomática o puede resultar en Fiebre del Dengue. La Fiebre del Dengue se caracteriza por una fiebre alta que normalmente tiene dos fases y al menos un síntoma adicional, tal como dolor de cabeza (a menudo severo), dolor (que puede ser severo) en cualquiera de una variedad de partes del cuerpo (por ejemplo, ojo, articulación, músculo, hueso, abdomen), erupciones cutáneas o sarpullido, manifestación hemorrágica leve (por ejemplo, sangrado de la nariz o las encías, petequias, fácil aparición de hematomas), linfadenopatía, vómitos, heces decoloradas (negras), efectos del estado de ánimo como postración, somnolencia o irritabilidad, piel que está pálida, fría o húmeda, dificultad para respirar, recuento bajo de glóbulos blancos, partículas virales circulantes en uno o más de los tejidos de un organismo (por ejemplo, sangre, médula ósea, etc.) y/u órganos (por ejemplo, hígado) (véase, para ejemplo, descripción del Centro para el Control de Enfermedades; véase también documento US 2011/0189226). Con frecuencia se produce una reducción del número de leucocitos y plaquetas.

La Fiebre Hemorrágica del Dengue (DHF) es una complicación potencialmente mortal de la infección por DV. La DHF se caracteriza por letargo y somnolencia extremos, junto con fiebre alta y otros síntomas asociados con la fiebre del dengue. El aumento de la permeabilidad vascular y la homeostasis anormal pueden provocar una disminución del volumen sanguíneo, hipotensión y, en casos graves, choque hipovolémico y hemorragia interna. Dos factores que parecen desempeñar una función importante en la aparición de la Fiebre del Dengue hemorrágica son: la rápida replicación viral con un alto nivel de viremia; y una respuesta inflamatoria importante con la liberación de altos niveles de mediadores inflamatorios. Sin tratamiento, la tasa de mortalidad por Fiebre del Dengue hemorrágica puede alcanzar el 10%.

Los niños son particularmente susceptibles a los efectos de la infección por DV, que pueden aumentar drásticamente con la exposición repetida. Durante las infecciones iniciales por el Virus del Dengue, la mayoría de los niños experimentan una infección subclínica o síndromes febriles indiferenciados leves. Durante las infecciones secundarias por el Virus del Dengue, la fisiopatología de la enfermedad a menudo cambia drásticamente. Las infecciones secuenciales pueden provocar un síndrome de permeabilidad vascular agudo conocido como Síndrome de Choque por Dengue (DSS). El DSS suele ser una progresión de la DHF y con frecuencia es mortal. El DSS se caracteriza por pulso rápido y de bajo volumen, hipotensión, extremidades frías e inquietud. Sin intervención médica, la tasa de mortalidad por DSS puede alcanzar el 40-50% (Thullier et al, 1999 Journal of Biotechnology 69: 183-190). La gravedad del DSS depende de la edad y la fuga vascular es más grave en los niños pequeños.

Las infecciones por DV en adultos a menudo van acompañadas de una tendencia al sangrado que puede conducir a una hemorragia grave. Las infecciones por DV pueden ser potencialmente mortales cuando ocurren en individuos con asma, diabetes y/u otras enfermedades crónicas (Guzman et al, 2010 Nature Reviews Microbiol. 8: S7-16). La teoría principal propuesta para explicar el mayor riesgo de enfermedad grave en casos secundarios de DV es la mejora dependiente de anticuerpos (ADE). Los Virus del Dengue (DV) exhiben epítopos de anticuerpos que son únicos para cada serotipo, así como epítopos que se comparten entre serotipos. Un sujeto que ha experimentado (y se ha recuperado de) una infección por DV primaria puede desarrollar fuertes respuestas de anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con todos los serotipos de DV (DV1-4). Sin embargo, a pesar de la reactividad cruzada, los anticuerpos solo previenen la reinfección por el mismo serotipo (homólogo) y los individuos son susceptibles a infecciones posteriores con diferentes serotipos (heterólogos). Las personas que experimentan una infección de Dengue secundaria con un nuevo serotipo enfrentan un riesgo mucho mayor de desarrollar DHF, lo que indica que la inmunidad preexistente al DV puede exacerbar la enfermedad. La teoría ADE de DV postula que los anticuerpos neutralizantes débiles de la primera infección se unen al segundo serotipo y potencian la infección de células mieloides portadoras de FcyR tales como monocitos y macrófagos (Wahala et al., 2011 Virus 3: 2374-2395). Se han propuesto al menos tres tipos de mecanismos para explicar el desarrollo de formas graves de infección por DV: (i) pueden ser provocadas por cepas de virus particularmente virulentas; (ii) los anticuerpos subneutralizantes preexistentes podrían mejorar la captación de DV mediada por anticuerpos por monocitos o macrófagos, que se designan como células anfitrionas de DV (por ejemplo, aDE); y (iii) los anticuerpos dirigidos contra una proteína no estructural del virus (NS1) pueden reaccionar de forma cruzada con fibrinógeno, trombocitos y células endoteliales, desencadenando de esta manera hemorragias.

Actualmente, no existe un tratamiento específico para la Fiebre del Dengue. Las terapias recomendadas abordan los síntomas e incluyen reposo en cama, control de la fiebre y dolor mediante antipiréticos y/o analgésicos e hidratación adecuada. Los esfuerzos se centran en equilibrar las pérdidas de líquidos, el reemplazo de los factores de coagulación y la infusión de heparina. La secuencia y la variabilidad antigénica de los DV han desafiado los esfuerzos para desarrollar vacunas o terapias eficaces (Whitehead et al., 2007 Nature Reviews Microbiology 5: 518 528). Desafortunadamente, la vacuna candidata líder demostró recientemente una eficacia protectora de solo el 30% en un estudio de fase II (Thomas et al., 2011 Curr Op Infectious Disease 24: 442-450; Sabchareon et al., 2012 Lancet 380(9853): 1559-1567). Por lo tanto, subsiste la necesidad de desarrollar vacunas y terapias mejoradas para el DV. Particularmente valioso sería el desarrollo de tratamientos aplicables a todos los serotipos de DV. Dicha terapia tendría un impacto tremendo en la salud humana, especialmente en los países en desarrollo.

Antígenos de DV

Las infecciones por DV son provocadas por cuatro virus (DV1-4), que son de tipo serológico similar pero difieren antigénicamente. Los DV son virus ARN de cadena sencilla positivos que pertenecen al género flavivirus dentro de la familia Flaviviridae. El virión comprende una partícula esférica, de 40 a 50 nm de diámetro, con una envoltura de lipopolisacárido. El genoma del ARN, que tiene aproximadamente 11 kb de longitud, comprende un extremo de tipo I 5' pero carece de una cola poli-A 3'. La organización del genoma comprende los siguientes elementos: una región 5' no codificante (NCR), una región que codifica proteínas estructurales (cápside (C), premembrana/membrana (prM/M), envoltura (E)) y una región que codifica proteínas no estructurales (NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5) y una NCR 3'.

El ARN genómico viral se asocia con las proteínas de la cápside para formar una nucleocápside. Como es típico de los flavivirus, el genoma viral del Dengue codifica una región codificante ininterrumpida que se traduce en una sola poliproteína que se procesa postraduccionalmente. Las propiedades biológicas importantes del DV, que incluyen la unión al receptor, la hemaglutinación de eritrocitos, la inducción de anticuerpos neutralizantes y la respuesta inmunitaria protectora, están asociadas con la proteína E (Wahala et al., 2011 Virus 3: 2374-2395).

La proteína PrM, una glicoproteína de aproximadamente 19 kDa, contiene seis residuos de cisteína altamente conservados que forman tres puentes disulfuro y se escinde en proteínas Pr y M por furina o proteasa similar a furina durante la maduración.

La proteína NS1, también una glicoproteína de aproximadamente 40 kDa, contiene 12 residuos de cisteína altamente conservados que forman seis puentes disulfuro y está presente intracelularmente, sobre la superficie celular y fuera de las células (Lai et al., 2008 Journal of Virology 82 (13): 6631-43).

La proteína E, una glicoproteína de aproximadamente 55 kDa, contiene 12 residuos de cisteína estrictamente conservados que forman seis puentes disulfuro y está presente como un heterodímero con la proteína PrM antes de la maduración del virión. Los estudios cristalográficos de rayos X del ectodominio de la proteína E han revelado tres dominios de barril beta distintos conectados a la membrana viral por un anclaje de tallo helicoidal y dos dominios transmembrana antiparalelos. El dominio III (EDIII) adopta un pliegue similar a la inmunoglobulina y se ha sugerido que desempeña una función fundamental en las interacciones del receptor. El dominio II (EDII) es un dominio alargado compuesto por dos estructuras largas en forma de dedos y contiene un bucle de fusión de 13 aminoácidos altamente conservado (HEDÍ-FL) en la punta, y participa en la fusión de la membrana y la dimerización de la proteína E. El dominio central de E (dominio I; EDI) es un barril p de nueve cadenas que está conectado a EDIII y EDII por uno y cuatro ligadores flexibles, respectivamente. Las proteínas E son importantes para el ensamble viral, unión del receptor, entrada, fusión viral y posiblemente evasión inmunitaria durante el ciclo de vida del flavivirus y, por tanto, son proteínas dinámicas necesarias para adoptar varias conformaciones y disposiciones distintas en la partícula del virus. Más aún, la proteína E es la diana principal de los anticuerpos tanto neutralizantes como potenciadores (Lai et al., 2008 Journal of Virology 82: 6631-6643; Pierson et al., 2008 Cel1Host & Microbe 4: 229 38).

Los DV se ensamblan en la membrana del retículo endoplásmico (ER) y el virus brota en el lumen del ER como partículas virales inmaduras. A diferencia de las partículas de virus maduros que tienen una superficie lisa, las partículas de virus inmaduros que brotan en el ER tienen una superficie rugosa creada por trímeros de heterodímeros E/prM que forman sesenta proyecciones puntiagudas con simetría icosaédrica en la envoltura viral (Perera et al., 2008 Antivir .Res. 80 11-22). Las proteínas E de cada trímero se proyectan lejos de la superficie del virión e interactúan con prM a través del extremo distal de EDII, que incluye el bucle de fusión. La PrM sobre viriones inmaduros restringe la capacidad de las proteínas E de experimentar un reordenamiento oligomérico en los compartimentos secretores derivados de Golgi de pH bajo durante la salida viral, previniendo de esta manera la fusión prematura y accidental (Guirakhoo et al., 1991 Journal of Virology 72: 1323-1329; Heinz et al., 1994 Journal of Virology 198(1): 109-117). A medida que los viriones inmaduros atraviesan los compartimentos ácidos de la red trans-Golgi (TGN), los cambios en la orientación de las proteínas prM y E desenmascaran un sitio para la serina proteasa celular furina. En este entorno de pH bajo, las proteínas E de viriones inmaduros forman dímeros antiparalelos que se encuentran planos contra la superficie del virión y están dispuestos con una simetría cuasiicosaédrica T = 3 (Yu et al., 2009 Journal of Virology 83 (23): 12101-12107). La proteína prM continúa enmascarando el bucle de fusión de EDII hasta que se libera después de la escisión de la furina y se produce una transición a pH neutro en el espacio extracelular. Los virus maduros e infecciosos resultantes son relativamente partículas lisas compuestas de 90 dímeros de proteína E y 180 copias de proteína M de ~70 aminoácidos. En esta configuración, las proteínas E sobre el DV maduro existen en tres entornos distintos definidos por su proximidad al eje de simetría de 2, 3 o 5 pliegues (Kuhn et al., 2002 Cell 108: 717-25). Por tanto, todas las subunidades de la proteína E no se encuentran sobre entornos idénticos en la superficie viral y las consideraciones estéricas y de otro tipo dan como resultado interacciones preferenciales de algunas subunidades E sobre otras con receptores y anticuerpos.

Los anticuerpos que reconocen el bucle de fusión altamente conservado sobre la proteína E demuestran una amplia reactividad con los cuatro serotipos de DV; sin embargo, su potencia de neutralización es normalmente limitada, presumiblemente debido a que este epítopo es en gran parte inaccesible en DV maduro. Se ha demostrado que algunos anticuerpos que reconocen la cadena p 'A' del dominio III de la proteína E (EDIII) neutralizan de manera potente cepas de DV particulares, pero no se sabe que sean eficaces contra los cuatro serotipos (Lok et al., Nature Structural & Molecular Biol. 15: 312-317). La cadena p 'A' es parte de un epítopo subcomplejo centrado en las posiciones 305-308 (numeración DV3) sobre el EDIII.

Como se describe en el presente documento, la presente invención abarca el hallazgo de que el antígeno E, y particularmente el dominio EDIII, pueden servir como una diana antigénica útil para agentes de anticuerpos anti-DV de amplio espectro. La invención demuestra en particular que los anticuerpos que se unen al antígeno E (por ejemplo, al dominio EDIII) pero no neutralizan todos los serotipos de DV pueden diseñarse racionalmente para producir variantes y/u otros agentes de anticuerpos que neutralicen todos los serotipos de DV 1 -4 (véase, por ejemplo, la Figura 3). Adicionalmente, la presente invención demuestra que los anticuerpos que se unen al antígeno E (por ejemplo, al dominio EDIII) y neutralizan algunos, pero no todos los serotipos de DV, se pueden diseñar por ingeniería racionalmente para producir variantes y/u otros agentes de anticuerpos que hayan ganado actividad de neutralización, en comparación con el anticuerpo original, contra una o más cepas y/o serotipos particulares, sin agotar significativamente su actividad, en comparación con el anticuerpo original, contra ciertas otras cepas y/o subtipos.

Anticuerpo 4E11

Los anticuerpos han demostrado ser una clase eficaz de agentes terapéuticos antivirales, en parte debido a su alta especificidad bioquímica y su historial de seguridad establecido. Adicionalmente, los anticuerpos tienen una vida media en suero prolongada (~21 días), lo que permite usos profilácticos en personas, una aplicación de especial necesidad para las enfermedades infecciosas que muestran brotes rápidos, que incluye el Virus del Dengue.

Se considera que los anticuerpos que protegen contra la infección por flavivirus actúan a través de múltiples mecanismos, que incluyen uno o más de (1) neutralización directa de la unión al receptor, (2) inhibición de la fusión viral, (3) depuramiento viral dependiente del receptor Fc-y, (4) lisis mediada por complemento de virus o células infectadas, y (5) citotoxicidad dependiente de anticuerpos de células infectadas (Pierson et al., 2008 Cel1Host & Microbe 4: 229-38). Se considera que la neutralización de flavivirus requiere la unión de múltiples anticuerpos (Dowd et al., 2011 Virology 411: 306-15). Los estudios con E16, un mAb de unión a EDIII que neutraliza el virus del Nilo Occidental en una etapa posterior a la unión, indican que se deben unir ~30 anticuerpos para una neutralización eficaz. Los estudios han sugerido que tanto la afinidad de la unión del anticuerpo como el número total de epítopos accesibles contribuyen a la potencia de neutralización de un anticuerpo. Por tanto, incluso para un anticuerpo que se une con alta afinidad, el anticuerpo no podrá neutralizar si el número de epítopos accesibles está por debajo de cierto nivel requerido para la neutralización. Por el contrario, un anticuerpo de menor afinidad puede neutralizar si muchos de los epítopos son accesibles para unirse.

Como ya se señaló, los virus del Dengue (DV) exhiben epítopos de anticuerpos que son únicos para cada serotipo y epítopos que se comparten entre los serotipos. La mayoría de los estudios para comprender cómo los anticuerpos neutralizan o mejoran el DV se han realizado con anticuerpos monoclonales de ratón (mAb). Como la proteína E es el principal antígeno expuesto sobre la superficie del virión, los mAb de ratón que se unen a la proteína E han sido el foco de muchos análisis. Aunque se han mapeado mAb de ratón neutralizantes en los tres dominios, los mAb más fuertemente neutralizantes son específicos de serotipo y se unen a EDIII, que sobresale de la superficie del virión. Dos epítopos que se solapan parcialmente en EDIII designados como la cresta lateral y los epítopos de cadena A son las principales dianas de los mAb de ratón que neutralizan el DV.

El epítopo de la cresta lateral interactúa con anticuerpos fuertemente neutralizantes específicos de serotipo. Por ejemplo, mAb 3H5 se asigna al EDIII-LR del serotipo 2 de DV, y el epítopo reconocido por estos mAb está ubicado tanto sobre la cadena A (aminoácido 304) como en el bucle FG (residuos 383 y 384) (Sukupolvi-Petty et al., 2007 Journal of Virology 81(23): 12816-12826).

Sin embargo, no todos los anticuerpos que se unen a EDIII exhiben actividad neutralizante específica de tipo. Los mAb que se unen al epítopo de cadena A reaccionan de forma cruzada con más de un serotipo de DV y se denominan mAbs neutralizantes del subcomplejo del Virus del Dengue. Por ejemplo, el mAb 1A1D-2 específico del subcomplejo reconoce un epítopo centrado en la cadena A de la superficie lateral de EDIII y puede neutralizar la infección por los serotipos de dV 1-3 (DV1-3), pero no el serotipo 4 de DV (DV4) (Lok et al., 2008 Nature Struct Mol Biol 15(3): 312-317; Roehrig et al., 1998 Virology 246(2): 317-328; Sukupolvi-Petty et al., 2007 Journal of Virology 81(23): 12816-12826). Se ha investigado la base molecular de la especificidad de este mAb; sólo uno de los tres residuos en el centro del epítopo 1A1D-2 se conserva entre los cuatro serotipos de DV (DV1-4). Un epítopo de cadena A similar también es reconocido por el DV mAb 4E11 con reactividad cruzada ampliamente neutralizante (Thullier et al., 2001 Journal Gen Virol. 82(8): 1885-1892). Sin embargo, los enfoques experimentales hasta ahora no han logrado producir anticuerpos capaces de neutralizar de manera potente los cuatro serotipos de DV.

Un anticuerpo monoclonal de murino particular, conocido como 4E11, que se une dentro de EDIII de la glicoproteína E, muestra una potente actividad neutralizante contra los serotipos 1-4 de DV. 4E11 se une a un epítopo conformacional en DV EDIII de la glicoproteína E y reacciona de forma cruzada con los cuatro serotipos. 4E11 neutraliza de forma potente DV1-3 al interferir con la unión a la célula anfitriona. Sin embargo, tiene poca afinidad y, por lo tanto, una débil actividad neutralizante contra DV4.

Se ha depositado una estirpe celular de hibridoma que secreta el anticuerpo monoclonal de ratón 4E11 en el American Type Culture Collection (ATCC). Número de acceso: HB-9259. Se conocen secuencias de cadena pesada de 4E11 de tipo silvestre (“wt”) (h C; SEQ ID NO. 1) y cadena ligera (LC; SEQ ID NO. 2). Se conocen las secuencias del marco (FR) de 4E11 wt y las regiones determinantes de complementariedad (CDR) (4E11 wt HC FR1 es la SEQ ID NO. 3, 4E11 wt HC FR2 es la SEQ ID NO. 4, 4E11 wt HC FR3 es la SEQ ID NO. 5, 4E11 wt HC FR4 es la SEQ ID NO. 6, 4E11 wt HC CDR1 es la SEQ ID NO. 7, 4E11 wt HC CDR2 es la SEQ ID NO. 8, 4E11 wt HC CDR3 es la SEQ ID NO. 9; 4E11 wt LC FR1 es la SEQ ID NO. 10, 4E11 wt LC FR2 es la SEQ ID NO. 11, 4E11 wt LC FR3 es la SEQ ID NO. 12, 4E11 wt LC FR4 es la SEQ ID NO. 13, 4E11 wt LC CDR1 es la SEQ ID NO. 14, 4E11 wt LC CDR2 es la SEQ ID NO. 15, 4E11 wt LC CDR3 es la SEQ ID NO. 16).

SEQ ID NO I:

E VKLLCQSG AELVKPGAS YRLSCTASGFNIKDTYMS WVKQRPEQGLOWIGEQDP A NGDT K YDPKFQGKATIT ADT SS N T AYLHLSSLTSGDT A VYYCSRGWEGFA Y WÜQ GTIA T VS A

SEO ID NO 2:

E LVMT Q TPA S LAV SLGQRATT S C RASENVDRYGN S FMHWY Q QKAGQPPKLLTYRAS NL ESdPARFSGSGSRTDFTLTJNPVEADDVAT^TCQRSNEVTWTFGGGTKLEIKR

SEQ ID NO. 3:

EVKLLEQSGAELVKPGASVRLSCTAS

SEQ ID NO. 4:

YMSWVKQRPEQGLEWIGRI SEQ ID NO. 5:

TKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLHLSSLTSGDTAVYYCSR SEQ ID NO. 6:

WGQGTLVTVSA SEQ ID NO. 7:

GFNIKDT SEQ ID NO. 8:

DPANGD SEQ ID NO. 9:

GWEGFAY SEQ ID NO. 10:

ELVMTQTPASLAVSLGQRATISC SEQ ID NO. 11:

WYQQKAGQPPKLLIY SEQ ID NO. 12:

GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYFC SEQ ID NO. 13:

FGGGTKLEIKR SEQ ID NO. 14:

RASENVDRYGNSFMH SEQ ID NO. 15:

RASNLES SEQ ID NO. 16:

QRSNEVPWT

La presente invención abarca el reconocimiento de que sería deseable desarrollar anticuerpos (u otros agentes de anticuerpos) que sean variantes de 4E11 wt. La presente invención proporciona en particular dichos anticuerpos y agentes de anticuerpos. Es decir, la presente invención proporciona varios agentes de anticuerpos que muestran una identidad estructural significativa con 4E11 y además muestran características funcionales mejoradas (por ejemplo, neutralización de DV4) en comparación con las observadas con 4E11 wt.

La presente divulgación proporciona una nueva métrica de puntuación para el acoplamiento de una interacción antígeno-anticuerpo. El marco métrico de puntuación clasifica las interfaces proteína-proteína de acuerdo con las características fisicoquímicas y las propensiones de las interacciones de aminoácidos por pares observadas en las interfaces intermoleculares. La presente divulgación utiliza este marco para modificar las propiedades de un anticuerpo existente. En algunas realizaciones, se modifica la especificidad y afinidad de un anticuerpo por su antígeno. En algunas realizaciones, el anticuerpo modificado es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el marco divulgado en la presente invención se utiliza para diseñar una mayor especificidad y afinidad por un mAb neutralizante anti-DV.

Utilizando el modelo acoplado, se examinó el modo de unión de los anticuerpos anti-DV a los cuatro serotipos de DV (DV1-4) y se identificó la base estructural de pobre afinidad de estos anticuerpos hacia DV4. Se diseñaron cuidadosamente mutaciones sobre el parátopo de estos anticuerpos para mejorar su afinidad, y por tanto su actividad neutralizante, hacia DV4, mientras se mantiene la afinidad y la actividad neutralizante hacia DV1-3. Para diseñar las mutaciones, se examinaron cuidadosamente los residuos del bucle de CDR de los mAb, uno a la vez. En una posición de CDR dada, el residuo de “tipo silvestre” fue sustituido sistemáticamente por los aminoácidos restantes excluyendo glicina (Gly) y prolina (Pro), y la probabilidad de reemplazo se evaluó en cada caso utilizando las propensiones estadísticas por pares. Los residuos de Gly y Pro no se modificaron para evitar la alteración en la conformación de la estructura principal. Se modelaron mutaciones únicas con alto potencial de reemplazo y se reevaluaron computacionalmente para encontrar mutaciones que: (1) no alteren los valores phi-psi; (2) no entierren grupos polares; y (3) mejoren los enlaces H, puentes salinos, van der Waals, contactos hidrófobos y empaquetamiento. Las mutaciones únicas prometedoras identificadas mediante el enfoque computacional se cribaron utilizando un método de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas indirecto (ELISA) de alto rendimiento para identificar mutaciones positivas que mejoran la afinidad hacia DV4 EDIII mientras mantienen la afinidad hacia DV1-3 EDIII. Finalmente, se combinaron mutaciones únicas positivas para diseñar racionalmente anticuerpos de alta afinidad. Se llevaron a cabo experimentos de ELISA de competición para determinar la afinidad, en equilibrio y en solución, entre los anticuerpos manipulados y EDIII de cada uno de los cuatro serotipos. Las medidas de unión se verificaron utilizando análisis de resonancia de plasmón superficial (SPR).

En algunas realizaciones, los anticuerpos contra el epítopo de la cadena A se pueden diseñar por ingeniería para que se unan a los cuatro serotipos de DV. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-DV 4E11 wt se modifica para mejorar su afinidad y, por lo tanto, neutralizar la actividad hacia DV4, mientras se mantiene la afinidad hacia DV1-3. En algunas realizaciones, uno de los anticuerpos diseñados muestra una mejora de -15 y ~450 veces en la afinidad hacia EDIII de DV2 y DV4, respectivamente, mientras mantiene la afinidad original hacia EDIII de DV1 y DV3. En algunas realizaciones, en comparación con el 4E11 wt mAb, el anticuerpo diseñado mostró un potencial neutralizante aumentado> 75 veces hacia DV4, mientras que aún mantenía la actividad “de tipo silvestre” hacia otros serotipos. El anticuerpo 4E11 diseñado por ingeniería de acuerdo con la presente invención representa un candidato interesante para un anticuerpo terapéuti

Agentes de anticuerpos de DV variantes proporcionados

Se apreciará que los agentes de anticuerpos proporcionados se puedan diseñar por ingeniería, producir y/o purificar de tal manera que mejoren las características y/o la actividad de los agentes de anticuerpos. Por ejemplo, las características mejoradas de los agentes de anticuerpos proporcionados incluyen, pero no se limitan a, estabilidad aumentada, afinidad y/o avidez de unión mejoradas, especificidad de unión aumentada, producción aumentada, agregación disminuida, unión no específica disminuida, entre otros.

En general, como se describe en el presente documento, los agentes de anticuerpos proporcionados pueden ser o incluir, por ejemplo, un anticuerpo policlonal; un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo; un anticuerpo modificado tal como un anticuerpo quimérico, anticuerpo reformado, anticuerpo humanizado o fragmento del mismo (por ejemplo, Fab', Fab, F(ab')2); o un anticuerpo biosintético, por ejemplo, un anticuerpo de cadena sencilla, anticuerpo de dominio único (DAB), Fv, Fv de cadena sencilla (scFv) o similares.

Los métodos para preparar y utilizar anticuerpos policlonales y monoclonales se describen, por ejemplo, en Harlow et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol I. Cold Spring Harbor Laboratory (1 de diciembre de 1998). Los métodos para fabricar agentes de anticuerpos modificados, tales como anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos reformados, anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos, por ejemplo, fragmentos Fab', Fab, F(ab')2); o anticuerpos biosintéticos (por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de dominio único (DAB), Fv, Fv de cadena sencilla (scFv) y similares), se conocen en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Zola, Monoclonal Antibodies: Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivates, Springer Verlag (15 de diciembre de 2000; 1a edición).

La presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen a todos los cuatro serotipos de DV (DV1-4). En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen a DV1 con una mayor afinidad, cuando se compara con la afinidad de otro anticuerpo a DV1. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con una mayor afinidad a DV2, cuando se compara con la afinidad de otro anticuerpo a DV2. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con una mayor afinidad a DV3, cuando se compara con la afinidad de otro anticuerpo a DV3. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con una mayor afinidad a DV4, cuando se compara con la afinidad de otro anticuerpo a DV4. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con una mayor afinidad a DV1, DV2, DV3, y DV4, cuando se compara con la afinidad de otro anticuerpo a DV1, DV2, DV3, y DV4. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con mayor afinidad a DV4, y retienen afinidad de unión a DV1, DV2, y DV3, cuando se compara con las afinidades de otro anticuerpo para estos serotipos DV. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen a DV1 y DV4 con mayores afinidades, cuando se compara con las afinidades de otro anticuerpo para estos serotipos DV. En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpo proporcionados se unen con una mayor afinidad a DV1 y DV4, y retienen su afinidad de unión a DV2 y DV3, cuando se compara con las afinidades de otro anticuerpo para estos serotipos DV. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen a DV2 y DV4 con mayores afinidades, cuando se compara con las afinidades de otro anticuerpo para estos serotipos DV. En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpo proporcionados se unen con una mayor afinidad a DV2 y DV4, y retienen su afinidad de unión a DV1 y DV3, cuando se compara con las afinidades de otro anticuerpo para estos serotipos DV. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen a DV3 y DV4 con mayores afinidades, cuando se compara con las afinidades de otro anticuerpo para estos serotipos DV. En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpo proporcionados se unen con una mayor afinidad a DV3 y DV4, y retienen su afinidad de unión a DV1 y DV2, cuando se compara con las afinidades de otro anticuerpo para estos serotipos DV. En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpo proporcionados se unen a uno o más de DV1-4 con una afinidad de al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o más de la afinidad de un anticuerpo diferente para uno o más del DV1-4. En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpo proporcionados se unen a uno o más de DV1-4 con una afinidad de al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos 80 veces, al menos 90 veces, al menos 100 veces, al menos 200 veces, al menos 300 veces, al menos 400 veces, al menos 500 veces o mayor afinidad que aquella de un anticuerpo diferente para uno o más de DV1-4. En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpo proporcionados muestran afinidades de unión para diferentes serotipos de DV que están dentro de 2, dentro de 5, dentro de 10, dentro de 25, dentro de 50, dentro de 100, dentro de 150, dentro de 200, dentro de 250, dentro de 300, dentro de 350, o dentro de 400 veces afinidad de otro.

En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpo proporcionados muestran un IC⁵⁰de neutralización (ug/ml) dentro de un rango como se describe y/o ejemplifica en el presente documento. En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpo proporcionados muestran un IC⁵⁰de neutralización (ug/ml) cuyo límite inferior es aproximadamente 0.05 ug/ml y límite superior es aproximadamente 10 ug/ml. En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpo proporcionados muestran un IC⁵⁰de neutralización (ug/ml) cuyo límite inferior se selecciona del grupo que consiste en 0.05 ug/ml, 0.1 ug/ml, 0.2 ug/ml, 0.3 ug/ml, 0.4 ug/ml, 0.5 ug/ml, 0.6 ug/ml, 0.7 ug/ml, 0.8 ug/ml, 0. 9 ug/ml, 1.0 ug/ml, 1.1 ug/ml, 1.2 ug/ml, 1.3 ug/ml, 1.4 ug/ml, 1.5 ug/ml, 1.6 ug/ml, 1.7 ug/ml, 1.8 ug/ml, 1.9 ug/ml, 2.0 ug/ml, 2.5 ug/ml, 3.0 ug/ml, 3.5 ug/ml, 4.0 ug/ml, 4.5 ug/ml, 5.0 ug/ml o más, y cuyo límite superior es mayor que el límite inferior y se selecciona del grupo que consiste en 1.5 ug/ml, 1.6 ug/ml, 1.7 ug/ml, 1.8 ug/ml, 1.9 ug/ml, 2.0 ug/ml, 2.5 ug/ml, 3.0 ug/ml, 3.5 ug/ml, 4.0 ug/ml, 4.5 ug/ml, 5.0 ug/ml, 5.5 ug/ml, 6.0 ug/ml, 6.5 ug/ml, 7.0 ug/ml, 7.5 ug/ml, 8.0 ug/ml, 8.5 ug/ml, 9.0 ug/ml, 9.5 ug/ml, 10.0 ug/ml o más.

En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpo proporcionados muestran la unión a DV1-4 con un Kd (nM) menor de 40000 nM, menor de 30000 nM, menor de 20000 nM, menor de 10000 nM, menor de 5000 nM, menor de 2000 nM, menor de 1500 nM, menor de 1000 nM, menor de 500 nM, menor de 250 nM, menor de 225 nM, menor de 200 nM, menor de 175 nM, menor de 150 nM, menor de 125 nM, menor de 100 nM, menor de 75 nM, menor de 50 nM, menor de 25 nM, menor de 15 nM, menor de 10 nM, menor de 5 nM, menor de 2.5 nM, menor de 1 nM, menor de 0.5 nM, menor de 0.25 nM, menor de 0.1 nM.

En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpo proporcionados muestran la unión a DV1-4 con un K^on(M^{' V 1}) cuyo enlace inferior es aproximadamente 0.01x10⁵M^{' V 1}y límite superior es aproximadamente 5.0x10⁶M^{' V 1}. En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados muestran la unión a DV1-4 con un K^on(M^{' V 1}) cuyo enlace inferior se selecciona del grupo que consiste en 0.01x10⁵M^{' V 1}, 0.05x10⁵M^{' V 1}, 0.1x10⁵M^{' V 1}, 0.5x10⁵M^{' V 1}, 1.0x10⁵M^{' 1}s^-1, 2.0x10⁵M^{' 1}s^{' 1}, 5.0x10⁵M^{' 1}s^{' 1}, 7.0x10⁵M^{' 1}s^{' 1}, o más, y cuyo límite superior es mayor que el límite inferior y se selecciona del grupo que consiste en 1.0x10⁶M^{' V 1}, 1.5x10⁶M^{' 1}s^{' 1}, 2.0x10⁶M^{' 1}s^{' 1}, 2.5x10⁶M^{' 1}s^{' 1}, 3.0x10⁶M^{' 1}s^{' 1}, 3.5x10⁶M^{' 1}s^{' 1}, 4.0x10⁶M^{' 1}s^{' 1}, 4.5x10⁶M^{' 1}s^{' 1}, 5.0x10⁶M^{' 1}s^{' 1},o más.

En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpo proporcionados muestran la unión a DV1~4 con un K^off(s^{' 1}) cuyo enlace inferior es aproximadamente 5x10⁴s^{' 1}y límite superior es aproximadamente 900x10⁴s^{' 1}. En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpo proporcionados muestran unión a DV1~4 con un K^off(s^{' 1}) cuyo enlace inferior se selecciona del grupo que consiste en 5x10⁴s^{' 1}, 10x10⁴s^{' 1}, 12x10⁴s^{' 1}, 13x10⁴s^{' 1}, 14x10V, 15x10⁴s^{' 1}, 18x10⁴s^{' 1}, 20x10⁴s^{' 1},o más, y cuyo límite superior es mayor que el límite inferior y se selecciona del grupo que consiste en 50x10⁴s^{' 1}, 100x10⁴s^{' 1}, 120x10⁴s^{' 1}, 140x10V, 150x10⁴s^{' 1}, 200x10⁴s^{' 1}, 300x10⁴s^{' 1}, 400x10V, 500x10⁴s^{' 1}, 600x10⁴s^{' 1}, 700x10⁴s^{' 1}, 800x10⁴s^{' 1}, 900x10⁴s^{' 1},o más.

En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpo proporcionados se unen a glicoproteína E de DV1~4. En ciertas realizaciones, los agentes de anticuerpo proporcionados se unen a EDIII de DV1~4 (SEQ ID NOs. 17~20). En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpo proporcionados se unen a la cadena A de DV1~4. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con mayor afinidad a EDIII de DV4 (SEQ ID NO. 20). En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con mayor afinidad a cadena A de DV4.

SEQ ID NO 17:

VtC TG SFKLEKTVAETQH GTVT VQVKYRGTDAPCKIPFS SQDEKGVTQNGRLTTA NPTVT DKEKPVNIEAEFPFGESYIWGAGEKALKLSWFK

SEQ ID NO. IS:

MCTGKFKVVKEIAETQHGTMVIRVQYEGDDSFCKIPFE1MDLEKXHVLGRLITVNPIVIE kDSPI \ í GAEPP1 ■GDSY1L1GVEPCQLKLNWFK

SEQ ID NO 19:

MC T \ TF VLKKEVSFTQH GTILIK V F YKGED APCK1PFSTE DGQGK A HNGR T .1T ANPV VTK KF EPVNIEA EPPFGE SNTvlGl GDNALWN WYK

SüQ II) NO. 20:

MCSGKFSIDKEMAETQHGTTVVKVICYEOAGAPCKyPIEIRDVNKEKVVGRIISSTPLAEN

t n s v im e l e p p f g d s y iv ig v g n s a l t l h w f r

En algunas realizaciones, la presente invención identifica agentes de anticuerpo que se unen a uno o más residuos de aminoácidos en EDIII de DV1-4 (SEQ ID NOs. 17-20) en las posiciones 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 323, 325, 327, 329, 360, 361, 362, 363, 364, 385, 387, 388, 389, 390, 391, y/o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, la presente invención identifica agentes de anticuerpo que se unen a uno o más residuos de aminoácidos en EDIII de DV1-4 (SEQ ID NOs. 17-20) en las posiciones 305, 310, 311, 323, 327, 329, y/o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, la presente invención identifica agentes de anticuerpo que se unen a residuos de aminoácidos en EDIII de DV1-4 (SeQ ID NOs. 17-20) en las posiciones 305, 310, 311, 323, 327, y 329. En algunas realizaciones, la presente invención identifica agentes de anticuerpo que se unen al residuo de aminoácido en EDIII de DV1-4 (SEQ ID NOs. 17-20) en la posición 305. En algunas realizaciones, la presente invención identifica agentes de anticuerpo que se unen al residuo de aminoácido en EDIII de DV1-4 (SEQ ID NOs.

17-20) en la posición 310. En ciertas realizaciones, la presente invención identifica agentes de anticuerpo que se unen al residuo de aminoácido en EDIII de DV1-4 (SEQ ID NOs. 17-20) en la posición 311. En algunas realizaciones, la presente invención identifica agentes de anticuerpo que se unen al residuo de aminoácido en EDIII de DV1-4 (SEQ ID NOs. 17-20) en la posición 323. En algunas realizaciones, la presente invención identifica agentes de anticuerpo que se unen al residuo de aminoácido en EDIII de DV1-4 (SEQ ID NOs. 17-20) en la posición 327. En algunas realizaciones, la presente invención identifica agentes de anticuerpo que se unen al residuo de aminoácido en EDIII de DV1-4 (SeQ ID NOs. 17-20) en la posición 329.

En algunas realizaciones, un residuo de serina, lisina, y/o treonina en la posición 305 contribuye a la unión a agentes de anticuerpo proporcionados. En algunas realizaciones, un residuo de lisina en la posición 310 contribuye a la unión a agentes de anticuerpo proporcionados. En algunas realizaciones, un residuo de lisina en la posición 311 contribuye a la unión a agentes de anticuerpo proporcionados. En algunas realizaciones, un residuo de arginina, lisina, y/o glutamina en la posición 323 contribuye a la unión a agentes de anticuerpo proporcionados. En algunas realizaciones, un residuo de serina y/o glutamato en la posición 327 contribuye a la unión a agentes de anticuerpo proporcionados. En algunas realizaciones, un residuo de arginina, aspartato, y/o glutamato en la posición 329 contribuye a la unión a agentes de anticuerpo proporcionados.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con mayor afinidad a DV1, cuando se compara con un anticuerpo de D^vde tipo silvestre (“wt”). En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con mayor afinidad a DV2, cuando se compara con un anticuerpo de DV de referencia original o wt. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con mayor afinidad a DV3, cuando se compara con un anticuerpo de referencia tal como un anticuerpo de DV wt. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con mayor afinidad a DV4, cuando se compara con un anticuerpo de DV de referencia. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con mayor afinidad a DV1, DV2, DV3, y DV4, cuando se compara con un anticuerpo de DV de referencia. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con mayor afinidad a DV4 y retienen afinidad de unión a DV1, DV2, y DV3, cuando se compara con un anticuerpo de DV de referencia. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con mayor afinidad a DV2 y DV4, cuando se compara con un anticuerpo de DV de referencia (wt). En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpo proporcionados que se unen con mayor afinidad a DV2 y DV4 y retienen su afinidad de unión a DV1 y DV3, cuando se compara con un anticuerpo de DV de referencia. En algunas realizaciones, un anticuerpo de DV wt es un anticuerpo 4E11 wt.

Como se describe en el presente documento, la presente invención proporciona agentes de anticuerpos que muestran cierta relación estructural (es decir, secuencia) con 4E11 y/o tienen atributos funcionales particulares, que incluye por ejemplo ciertos atributos funcionales mejorados cunado se compara con 4E11 wt.

En algunas realizaciones, en el presente documento se proporcionan agentes de anticuerpo cuyas secuencias de aminoácidos, muestran niveles especificados de homología y/o identidad con 4E11 wt. En algunas realizaciones agentes de anticuerpo proporcionados muestran al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% de identidad con 4E11 wt (es decir, con la SEQ ID NOs. 1-2).

En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpo proporcionados tienen una CDR1 de cadena pesada (HC; SEQ ID NO. 21) que comprende la secuencia GFNIKDT (S^eQ ID NO. 23), una CDR2 de HC que comprende la secuencia DPENGD (SEQ ID NO. 24), una CDR3 de HC que comprende la secuencia GWEGFAY (SEQ ID NO. 25), una CDR1 de cadena ligera (LC; SeQ ID NO. 22) que comprende la secuencia RASENVDKYGNSFMH (SEQ ID No .26), una CDR2 de LC que comprende la secuencia RASELQW (SEQ ID NO. 27) y una región CDR3 de LC que comprende la secuencia QRSNEVPWT (SEQ ID NO. 28).

SEQ ID NO 21:

EVKLLEQSGAELVKPGASVRLSCTASGFNIKDTYMSWVKQRPEQGLEWIGRIDPENGDT

KYDPKFQGKATITADTSSNTAYLHLSSLTSGDTAVYYCSRGWEGFAYWGQGTLVTVSA SEQ ID NO 22:

El V'MTQTPAST, A VSLGQR A TI SC R A SENVDKYGNSFMHWYQQKAGQPPKI,11YR AS El,

QWGIP ARFSGSGSR TDFTLTEMPVEÁDDVAT YPCQR SN E VP WTFGGGTKLETK R

En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpo proporcionados tienen una o más CDR y/o una o más de FR que son idénticas en secuencia a una CDR o FR correspondiente de 4E11 wt (es decir a una o más de las SEQ ID NO. 7-9, 14-16 o 3-6, 10-13). En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpo proporcionados tienen una o más CDR y/o FR que muestran un grado especificado de homología y/o identidad con las CDR y/o FR correspondientes de 4E11 wt como se discute a continuación. En algunas realizaciones, todas las CDR y FR de agentes de anticuerpo proporcionados muestran al menos el nivel especificado de homología y/o identidad. En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo proporcionado tiene secuencias de CDR y FR que juntas contienen no más de 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 sustituciones cuando se compara con 4E11 wt.

En algunas realizaciones, una región determinante de complementariedad (CDR) 1 de un agente de anticuerpo muestra al menos 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95%, o más de 99% de identidad con 4E11 wt (SEQ ID NO. 7 y SEQ ID NO. 14). En algunas realizaciones, una CDR1 proporcionada tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a aquella de 4E11 wt y/o no contiene ninguna de las sustituciones de aminoácido cuando se compara con CDR1 de 4E11 wt (SEQ ID nO. 7 y SEQ ID NO. 14). En algunas realizaciones, una CDR1 proporcionada tiene una o más sustituciones de aminoácido cuando se compara con 4E11 wt (SEQ ID NO. 7 y SEQ ID NO. 14). En algunas realizaciones, una CDR1 proporcionada tendrá dos o más sustituciones de aminoácido cuando se compara con 4E11 wt (SEQ ID NO. 7 y SEQ ID NO. 14). En algunas realizaciones, una CDR proporcionada tiene 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones y en algunas realizaciones 1, 2, o 3 sustituciones cuando se compara con 4E11 wt.

En algunas realizaciones, una CDR2 de un agente de anticuerpo muestra al menos 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95%, o más de 99% de identidad con 4E11 wt (SEQ ID NO. 8 y SEQ ID NO. 15). En algunas realizaciones, una CDR2 proporcionada tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a aquella de 4E11 wt y/o no contiene ninguna de las sustituciones de aminoácido cuando se compara con CDR2 de 4E11 wt (SEQ ID NO. 8 y SEQ ID NO. 15). En algunas realizaciones, una CDR2 proporcionada tiene una o más sustituciones de aminoácido cuando se compara con 4E11 wt (SEQ ID NO. 8 y SEQ iD NO. 15). En algunas realizaciones, una CDR2 proporcionada tendrá dos o más sustituciones de aminoácido cuando se compara con 4E11 wt (SEQ ID NO. 8 y SEQ ID NO. 15). En algunas realizaciones, una CDR proporcionada tiene 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones y en algunas realizaciones 1, 2, o 3 sustituciones cuando se compara con 4E11 wt.

En algunas realizaciones, una CDR3 de un agente de anticuerpo muestra al menos 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95%, o más de 99% de identidad con 4E11 wt (SEQ ID NO. 9 y SEQ ID NO. 16). En algunas realizaciones, una CDR3 proporcionada tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a aquella de 4E11 wt y/o no contiene ninguna de las sustituciones de aminoácido cuando se compara con CDR3 de 4E11 wt (SEQ ID NO. 9 y SEQ ID NO. 16). En algunas realizaciones, una CDR3 proporcionada tiene una o más sustituciones de aminoácido cuando se compara con 4E11 wt (SEQ ID NO. 9 y SEQ iD NO. 16). En algunas realizaciones, una CDR3 proporcionada tendrá dos o más sustituciones de aminoácido cuando se compara con 4E11 wt (SEQ ID NO. 9 y SEQ ID NO. 16). En algunas realizaciones, una CDR proporcionada tiene 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones y en algunas realizaciones 1, 2, o 3 sustituciones cuando se compara con 4E11 wt.

En algunas realizaciones, una región de marco 1 proporcionada (FR1) de un agente de anticuerpo compartirá más de 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95%, o más de 99% por ciento de identidad con 4E11 wt (SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 10). En algunas realizaciones, una FR1 proporcionada no tendrá una sustitución de aminoácidos cuando se compara con 4E11 wt (SEQ ID NO. 3 y SEQ iD NO. 10). En algunas realizaciones, una FR1 proporcionada tendrá una o más sustituciones de aminoácido cuando se compara con 4E11 wt (SEQ ID NO. 3 y s Eq Id NO. 10). En algunas realizaciones, una FR1 proporcionada tendrá dos o más sustituciones de aminoácido cuando se compara con 4E11 wt (SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 10).

En algunas realizaciones, una región de marco 2 proporcionada (FR2) de un agente de anticuerpo compartirá más de 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95%, o más de 99% por ciento de identidad con 4E11 wt (SEQ ID NO. 4 y SEQ ID NO. 11). En algunas realizaciones, una FR2 proporcionada no tendrá una sustitución de aminoácidos cuando se compara con 4E11 wt (SEQ ID NO. 4 y SEQ iD NO. 11). En algunas realizaciones, una FR2 proporcionada tendrá una o más sustituciones de aminoácido cuando se compara con 4E11 wt (SEQ ID NO. 4 y SEQ ID NO. 11). En algunas realizaciones, una FR2 proporcionada tendrá dos o más sustituciones de aminoácido cuando se compara con 4E11 wt (SEQ ID NO. 4 y SEQ ID NO. 11).

En algunas realizaciones, una región de marco 3 proporcionada (FR3) de un agente de anticuerpo compartirá más de 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95%, o más de 99% por ciento de identidad con 4E11 wt (SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 12). En algunas realizaciones, una FR3 proporcionada no tendrá una sustitución de aminoácidos cuando se compara con 4E11 wt (SEQ ID NO. 5 y SEQ iD NO. 12). En algunas realizaciones, una FR3 proporcionada tendrá una o más sustituciones de aminoácido cuando se compara con 4E11 wt (SEQ ID NO. 5 y SEQ I^dNO. 12). En algunas realizaciones, una FR3 proporcionada tendrá dos o más sustituciones de aminoácido cuando se compara con 4E11 wt (SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 12).

En algunas realizaciones, una región de marco 4 proporcionada (FR4) de un agente de anticuerpo compartirá más de 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95%, o más de 99% por ciento de identidad con 4E11 wt (SEQ ID NO. 6 y SEQ ID NO. 13). En algunas realizaciones, una FR4 proporcionada no tendrá una sustitución de aminoácidos cuando se compara con 4E11 wt (SEQ ID NO. 6 y SEQ iD NO. 13). En algunas realizaciones, una FR4 proporcionada tendrá una o más sustituciones de aminoácido cuando se compara con 4E11 wt (SEQ ID NO. 6 y ^sE^qI^dNO. 13). En algunas realizaciones, una FR3 proporcionada tendrá dos o más sustituciones de aminoácido cuando se compara con 4E11 wt (SEQ ID NO. 6 y SEQ ID NO. 13).

En algunas realizaciones, la CDR de VH de los agentes de anticuerpo proporcionados muestran al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% de identidad con 4E11 wt (SEQ ID NOs.: 7-9). En algunas realizaciones, la CDR de VH de los agentes de anticuerpo proporcionados muestran al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% de identidad con 4E11 wt (SEQ ID NOs.: 7-9), pero difiere por la sustitución de al menos una sustitución de aminoácidos dentro de la CDR. En algunas realizaciones, la CDR de VH de agentes de anticuerpo proporcionados tienen una sustitución del residuo de aminoácido correspondiente en la posición 55 del anticuerpo 4E11 wt. En algunas realizaciones, un residuo de aminoácido sustituto en la posición 55 se selecciona del grupo que consiste en glutamato y aspartato. En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido sustituto en la posición 55 es glutamato. En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido en la CDR de VH de anticuerpos proporcionados que corresponden al residuo de aminoácido en la posición 55 de 4E11 wt no es alanina.

En algunas realizaciones, la CDR de VL de los agentes de anticuerpo proporcionados muestran al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% de identidad con 4E11 wt (SEQ ID NOs.: 14-16). En algunas realizaciones, la CDR de VL de los agentes de anticuerpo proporcionados muestran al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% de identidad con 4E11 wt (SEQ ID NOs.: 14-16), pero difieren en la sustitución de al menos una sustitución de aminoácidos dentro de la CDR. En algunas realizaciones, la CDR de VL de los agentes de anticuerpo proporcionados tienen una o más sustituciones de un residuo de aminoácido correspondiente en las posiciones 31, 57, 59, 60 y/o combinaciones de las mismas, del anticuerpo 4E11 wt. En algunas realizaciones, la ^cD^rde VL de los agentes de anticuerpo proporcionados tienen una sustitución del residuo de aminoácido correspondiente en la posición 31 del anticuerpo 4E11 wt. En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido sustituto en la posición 31 es lisina. En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido en la CDR de VL de los agentes de anticuerpo proporcionados que corresponde al residuo de aminoácido en la posición 55 de 4E11 wt no es arginina. En algunas realizaciones, la CDR de VL de los agentes de anticuerpo proporcionados tienen una sustitución del residuo de aminoácido correspondiente en la posición 57 del anticuerpo 4E11 wt. En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido sustituto en la posición 57 se selecciona del grupo que consiste en glutamato y serina. En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido sustituto en la posición 57 es glutamato. En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido en la CDR de VL de los agentes de anticuerpo proporcionados que corresponde al residuo de aminoácido en la posición 57 de 4E11 wt no es asparagina. En algunas realizaciones, la CDR de VL de los agentes de anticuerpo proporcionados tienen sustitución del residuo de aminoácido correspondiente en la posición 59 del anticuerpo 4E11 wt. En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido sustituto en la posición 59 se selecciona del grupo que consiste en glutamina y asparagina. En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido sustituto en la posición 59 es glutamina. En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido en la CDR de VL de los agentes de anticuerpo proporcionados que corresponde al residuo de aminoácido en la posición 59 de 4E11 wt no es glutamato. En algunas realizaciones, la CDR de VL de los agentes de anticuerpo proporcionados tienen una sustitución del residuo de aminoácido correspondiente en la posición 60 del anticuerpo 4E11 wt. En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido sustituto en la posición 60 se selecciona del grupo que consiste en triptófano, tirosina, y arginina. En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido sustituto en la posición 60 es triptófano. En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido en la CDR de VL de los agentes de anticuerpo proporcionados que corresponde al residuo de aminoácido en la posición 60 de 4E11 wt no es serina.

En algunas realizaciones, las CDR de VH y VL de los agentes de anticuerpo proporcionados muestran al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% de identidad con 4E11 wt (SEQ ID NOs.: 7-9 y 14-16, respectivamente). En algunas realizaciones, las CDR de VH y VL de los agentes de anticuerpo proporcionados muestran al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% de identidad con 4E11 wt (SEQ ID NOs.: 7-9 y 14-16, respectivamente), pero difieren en la sustitución de al menos una sustitución de aminoácidos dentro de las CDR. En algunas realizaciones, la CDR de VH de los agentes de anticuerpo proporcionados tienen sustitución del residuo de aminoácido correspondiente en la posición 55, y VL CDR de los agentes de anticuerpo proporcionados tienen sustitución del residuo de aminoácido correspondiente en las posiciones 31, 57, 59 y 60, del anticuerpo 4E11 wt. En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido sustituto en la posición 55 es glutamato. En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido sustituto en la posición 31 es lisina. En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido sustituto en la posición 57 es glutamato. En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido sustituto en la posición 59 es glutamina. En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido sustituto en la posición 60 es triptófano.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que muestran unión a EDIII-DV4 (SEQ ID NO. 20) con un Kd (nM) menor de 40000 nM, menor de 30000 nM, menor de 20000 nM, menor de 15000 nM, menor de 10000 nM, menor de 8000 nM, menor de 5000 nM, menor de 4000 nM, menor de 3000 nM, menor de 2000 nM, menor de 1500 nM, menor de 1000 nM, menor de 500 nM, menor de 250 nM, menor de 225 nM, menor de 200 nM, menor de 175 nM, menor de 150 nM, menor de 125 nM, menor de 100 nM, menor de 75 nM, o menor de 50 nM.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que muestran unión a EDIII-DV1 (SEQ ID NO. 17) con un Kd (nM) menor de 3 nM, menor de 2.5 nM, menor de 2 nM, menor de 1.5 nM, menor de 1.0 nM, menor de 0.5 nM, menor de 0.4 nM, menor de 0.3 nM, menor de 0.2 nM, menor de 0.1 nM, o menor de 0.05 nM. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que muestran unión a EDIII-DV2 (SEQ ID NO. 18) con un Kd (nM) menor de 15 nM, menor de 12 nM, menor de 10 nM, menor de 8 nM, menor de 7 nM, menor de 5 nM, menor de 2.5 nM, menor de 2 nM, menor de 1.5 nM, menor de 1 nM, menor de 0.5 nM, menor de 0.4 nM, menor de 0.3 nM, menor de 0.2 nM, o menor de 0.1 nM.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que muestran unión a EDIII-DV3 (SEQ ID NO. 19) con un K^d(nM) menor de 120 nM, menor de 100 nM, menor de 50 nM, menor de 40 nM, menor de 35 nM, menor de 30 nM, menor de 25 nM, menor de 20 nM, menor de 15 nM, menor de 10 nM, menor de 5 nM, menor de 2.5 nM, o menor de 1.0 nM.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo con al menos 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, o mayor afinidad para la unión a EDIII-DV4 que a 4E11 wt.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo con al menos 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, o mayor afinidad para la unión a EDIII-DV2 que a 4E11 wt.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo con al menos 1 veces, 1.5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, o mayor afinidad para la unión a EDIII-DV1 y/o EDIII-DV3 que a 4E11 wt.

En algunas realizaciones, se proporcionan agentes de anticuerpo que muestran una IC⁵⁰de neutralización (ug/ml) de EDIII-DV4 (SEQ ID NO. 20) de 60 ug/ml o menos, 50 ug/ml o menos, 40 ug/ml o menos, 30 ug/ml o menos, 20 ug/ml o menos, 10 ug/ml o menos, 5 ug/ml o menos, 4 ug/ml o menos, 3 ug/ml o menos, 2 ug/ml o menos.

En algunas realizaciones, se proporcionan agentes de anticuerpo que muestran IC⁵⁰de neutralización (ug/ml) de EDIII-DV3 (SEQ ID NO. 19) de 7.0 ug/ml o menos, 6.0 ug/ml o menos, 5.0 ug/ml o menos, 4.0 ug/ml o menos, 3.0 ug/ml o menos, 2.0 ug/ml o menos, 1.5 ug/ml o menos, 1.0 ug/ml o menos, 0.90 ug/ml o menos, 0.80 ug/ml o menos, 0.70 ug/ml o menos, 0.60 ug/ml o menos, 0.50 ug/ml o menos.

En algunas realizaciones, se proporcionan agentes de anticuerpo que muestran IC⁵⁰de neutralización (ug/ml) de EDIII-DV2 (SEQ ID NO. 18) de 0.2 ug/ml o menos, 0.19 ug/ml o menos, 0.18 ug/ml o menos, 0.17 ug/ml o menos, 0.16 ug/ml o menos, 0.15 ug/ml o menos, 0.14 ug/ml o menos, 0.13 ug/ml o menos, 0.12 ug/ml o menos, 0.11 ug/ml o menos, 0.10 ug/ml o menos, 0.09 ug/ml o menos, 0.07 ug/ml o menos, 0.06 ug/ml o menos, 0.05 ug/ml o menos, 0.04 ug/ml o menos, 0.03 ug/ml o menos, 0.02 ug/ml o menos, 0.01 ug/ml o menos.

En algunas realizaciones, se proporcionan agentes de anticuerpo que muestran IC⁵⁰de neutralización (ug/ml) de EDIII-DV1 (SEQ ID NO. 17) de 5.0 ug/ml o menos, 4.0 ug/ml o menos, 3.0 ug/ml o menos, 2.5 ug/ml o menos, 2.0 ug/ml o menos, 1.5 ug/ml o menos, 1.0 ug/ml o menos, 0.90 ug/ml o menos, 0.70 ug/ml o menos, 0.50 ug/ml o menos, 0.40 ug/ml o menos, 0.30 ug/ml o menos, 0.20 ug/ml o menos, 0.10 ug/ml o menos.

En algunas realizaciones, se proporcionan agentes de anticuerpo con al menos 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 150 veces, 200 veces, 400 veces, 500 veces, o más reducción de IC⁵⁰para neutralización de EDIII-DV4 que a 4E11 wt.

En algunas realizaciones, se proporcionan agentes de anticuerpo con al menos 1 veces, 1.5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, o más reducción de IC⁵⁰para neutralización de EDIII-DV2 que a 4E11 wt.

En algunas realizaciones, se proporcionan agentes de anticuerpo con al menos 1 veces, 1.5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, o más reducción de IC⁵⁰para neutralización de EDIII-DV1 y/o EDIII-DV3 que a 4E11 wt.

En algunas realizaciones, se ha diseñado por ingeniería una o más secuencias en un agente de anticuerpo proporcionado (por ejemplo, mediante maduración por afinidad u otro enfoque de optimización) para mejorar una o más características o actividades (por ejemplo, para aumentar la estabilidad, disminuir la agregación, disminuir la inmunogenicidad, etc.) como se conoce en la técnica.

En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo se modifica mediante PEGilación, metilación, sialilación, aminación o sulfatación. En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo se conjuga con un núcleo/capa anfifílica para producir una micela polimérica. En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo se conjuga con una macromolécula hiperramificada (es decir, dendrímero). En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo se conjuga con un polímero natural seleccionado del grupo que consiste en albúmina, quitosano, heparina, paclitaxel, poli (L-glutamato), N-(2-hidroxipropil) metacrilamida (Hp Ma ), poli (L-lactida) (PLA), poli (amidoamina) (PAMAM), folato y/o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo comprende una o más colas largas no estructuradas de aminoácidos hidrófilos (rPEG). En algunas realizaciones, se contempla la derivatización de inmunoglobulinas al introducir de forma selectiva de grupos sulfhidrilo en la región Fc de una inmunoglobulina, utilizando condiciones de reacción que no alteran el sitio de combinación del anticuerpo. Los conjugados de anticuerpos producidos de acuerdo con esta metodología pueden exhibir una longevidad, especificidad y sensibilidad mejoradas (Patente de Estados Unidos No. 5,196,066). También se ha descrito en la bibliografía la unión específica de sitio de moléculas efectoras o indicadoras, en las que la molécula indicadora o efectora está conjugada con un residuo de carbohidrato en la región Fc (O'Shannessy et al., 1987).

Anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpos

En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo de DV proporcionado es o comprende un anticuerpo o fragmento del mismo. En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo de DV proporcionado es o comprende un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo. En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo de DV proporcionado es o comprende un anticuerpo policlonal o fragmento del mismo. En algunas realizaciones, el agente de anticuerpo de DV es o comprende un anticuerpo de “longitud completa”, que contiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, opcionalmente asociadas mediante enlaces de disulfuro como se ocurre en los anticuerpos producidos de forma natural. En algunas realizaciones, el agente de anticuerpo de DV es o comprende un fragmento de un anticuerpo de longitud completa que contiene algunas, pero no todas, las secuencias encontradas en un anticuerpo de longitud completa. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un agente de anticuerpo de DV es o comprende fragmentos de anticuerpo que incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, diacuerpo dsFv, y fragmentos Fd. En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo de DV proporcionado es o comprende un anticuerpo que es un miembro de una clase de anticuerpo seleccionada del grupo que consiste en IgG, IgM, IgA, IgD, IgE o fragmento del mismo. En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo de DV proporcionado es o comprende un anticuerpo producido por síntesis química. En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo de DV proporcionado es o comprende un anticuerpo producido por una célula. En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo de DV proporcionado es o comprende un anticuerpo producido utilizando un sistema de cultivo celular recombinante. En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo de DV proporcionado es o comprende un anticuerpo quimérico, por ejemplo de ratón, rata, caballo, cerdo u otra especie, que porta dominios de región constante y/o variable humana.

En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo de DV incluye uno o más fragmentos de anticuerpo, que incluyen, pero no se limitan a, Fab', Fab, F(ab')2, anticuerpos de dominio único (DAB), Fv, scFv (Fv de cadena sencilla), polipéptidos con CDR de anticuerpos, dominios de andamiaje que presentan las CDR (por ejemplo, anticalinas) o nanocuerpos. Por ejemplo, un anticuerpo proporcionado puede ser un anticuerpo VHH (es decir, un VHH específico de antígeno) que comprende solo una cadena pesada. Dichas moléculas de anticuerpo se pueden derivar de una llama u otro anticuerpo de camélido (por ejemplo, una IgG2 o IgG3 de camélido, o un marco de presentación de CDR de dicha Ig de camélido) o de un anticuerpo de tiburón. En algunas realizaciones, el agente de anticuerpo de DV es o comprende un avicuerpo (diacuerpo, tricuerpo, tetracuerpo). Las técnicas para preparar y utilizar diversas construcciones y fragmentos basados en anticuerpos son bien conocidas en el arte. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos también son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988;).

En algunas realizaciones, el agente de anticuerpo de DV incluye uno o más “Mini-anticuerpos” o “minicuerpos”. Los minicuerpos son cadenas de polipéptidos sFv que incluyen dominios de oligomerización en sus terminales C, separados del sFv por una región bisagra (Pack et al. (1992) Biochem 31: 1579-1584). El dominio de oligomerización comprende hélices a autoasociantes, por ejemplo, cremalleras de leucina, que se pueden estabilizar adicionalmente mediante enlaces disulfuro adicionales. El dominio de oligomerización está diseñado para ser compatible con el plegamiento vectorial a través de una membrana, un proceso que se considera facilita el plegado in vivo del polipéptido en una proteína de unión funcional. Generalmente, los minicuerpos se producen utilizando métodos recombinantes bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Pack et al. (1992) Biochem 31: 1579 1584; Cumber et al. (1992) J Immunology 149B: 120-126.

Conjugados de agentes de anticuerpos

En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo de DV proporcionado es o comprende un conjugado, en el que una fracción de anticuerpo comprende o consiste en el anticuerpo o una porción funcional del mismo con una fracción conjugada. En algunas realizaciones particulares, el agente de anticuerpo de DV como se describe en el presente documento se proporciona y/o se utiliza en asociación con uno o más agentes activos o “cargas útiles”, tales como un agente terapéutico o de detección. En algunas de dichas realizaciones, la asociación entre el agente de anticuerpo de DV y el agente activo y/o de carga útil comprende al menos una interacción covalente de modo que se proporciona un conjugado de anticuerpo de DV.

En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo es un agente de carga útil terapéutica es una entidad efectora que tiene una actividad deseada, por ejemplo, actividad antiviral, actividad antiinflamatoria, actividad citotóxica, etc. Los agentes terapéuticos pueden ser o comprender cualquier clase de entidad química que incluye, por ejemplo, proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, pequeñas moléculas orgánicas, polímeros no biológicos, metales, iones, radioisótopos, etc. En algunas realizaciones, los agentes terapéuticos para uso de acuerdo con la presente invención pueden tener una actividad biológica relevante para el tratamiento de uno o más síntomas o causas de la infección por DV (por ejemplo, actividades antivirales, analgésicas, antiinflamatorias, inmunomoduladoras, inductoras del sueño, etc.). En algunas realizaciones, los agentes terapéuticos para uso de acuerdo con la presente invención tienen una o más de otras actividades.

En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo es un agente de detección de carga útil que es o comprende cualquier fracción que se pueda detectar utilizando un ensayo, por ejemplo debido a sus propiedades funcionales específicas y/o características químicas. Ejemplos no limitantes de dichos agentes incluyen enzimas, radiomarcadores, haptenos, marcadores fluorescentes, moléculas fosforescentes, moléculas quimioluminiscentes, cromóforos, moléculas luminiscentes, moléculas de fotoafinidad, partículas coloreadas o ligandos, tales como biotina.

Se conocen en la técnica muchos agentes de detección de carga útil apropiados, al igual que los sistemas para su unión a anticuerpos (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,021,236; 4,938,948; y 4,472,509). Ejemplos de dichos agentes de detección de carga útil incluyen iones paramagnéticos, isótopos radiactivos, fluorocromos, sustancias detectables por RMN, agentes de formación de imágenes de rayos X, entre otros. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un ión paramagnético es uno o más de cromo (III), manganeso (II), hierro (III), hierro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), samario (III), iterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III), holmio (III), erbio (III), lantano (III), oro (III), plomo (II) y/o bismuto (III).

En algunas realizaciones, un isótopo radiactivo es uno o más de astato211, 14carbono, 51cromo, 36cloro, 57cobalto, 58cobalto, cobre67, 152Eu, galio67, 3hidrógeno, yodo123, yodo125, yodo131, indio111, 59hierro, 32fósforo, radio23, renio186, renio188, 75selenio, 35sulfuro, tecnecio99m, torio227 y/o itrio90. Los agentes de anticuerpos marcados radiactivamente se pueden producir de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden yodar por contacto con yoduro de sodio y/o potasio y un agente oxidante químico tal como hipoclorito de sodio, o un agente oxidante enzimático, tal como lactoperoxidasa. Los agentes de anticuerpos proporcionados se pueden marcar con tecnecio99m mediante un proceso de intercambio de ligando, por ejemplo, al reducir el pertecnato con solución estannosa, quelar el tecnecio reducido en una columna de Sephadex y aplicar el anticuerpo a esta columna. En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpos de DV se marcan utilizando técnicas de marcado directo, por ejemplo, al incubar pertecnato, un agente reductor tal como SNCh, una solución tampón tal como una solución de ftalato de sodio-potasio y el anticuerpo. Los grupos funcionales intermedios que se utilizan a menudo para unir radioisótopos que existen como iones metálicos al anticuerpo son el ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) o el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

En algunas realizaciones, un marcador fluorescente es o comprende uno o más de Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Azul cascada, Cy3, Cy5,6-FAM, Isotiocianato de fluoresceína, HEX, 6-JOE, Verde Oregon 488, Verde Oregon 500, Verde Oregon 514, Azul Pacífico, REG, Verde rodamina, Rojo Rodamina, Renografina, ROX, TAMRA, TET, tetrametilrodamina y/o Rojo Texas, entre otros.

Se conocen varios métodos en la técnica para la unión o conjugación de un agente de anticuerpo a una carga útil. Algunos métodos de unión implican el uso de un complejo de quelato metálico que emplea, por ejemplo, un agente quelante orgánico tal como anhídrido del ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA); ácido etilentriaminotetraacético; N-cloro-p-toluenosulfonamida; y/o tetracloro-3a-6a-difenilglicouril-3 unido al anticuerpo (Patentes de Estados Unidos Nos. 4,472,509 y 4,938,948). Los agentes de anticuerpo de DV proporcionados también pueden reaccionar con una enzima en presencia de un agente de acoplamiento tal como glutaraldehído o peryodato. Los conjugados con marcadores de fluoresceína se preparan en presencia de estos agentes de acoplamiento o mediante reacción con un isotiocianato.

Producción de anticuerpos

Los agentes de anticuerpos proporcionados, que incluyen los anticuerpos, y/o porciones características de los mismos, o los ácidos nucleicos que los codifican, se pueden producir por cualquier medio disponible. Los métodos para generar anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y/o anticuerpos policlonales) son bien conocidos en la técnica. Se apreciará que se puede utilizar un amplio rango de especies animales para la producción de antisueros, que incluyen conejo, ratón, rata, hámster, conejillo de indias o cabra. La elección del animal puede decidirse en función de la facilidad de manipulación, los costes o la cantidad deseada de sueros, como sabrá un experto en la técnica. Se apreciará que el agente de anticuerpo también se puede producir transgénicamente a través de la generación de un mamífero o planta que es transgénico para las secuencias de la cadena ligera y pesada de inmunoglobulina de interés y la producción del anticuerpo en una forma recuperable de las mismas. En relación con la producción transgénica en mamíferos, los anticuerpos se pueden producir y recuperar de la leche de cabras, vacas u otros mamíferos. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nos. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172, y 5,741,957.

Se pueden producir agentes de anticuerpos proporcionados (que incluyen anticuerpos y/o porciones características), por ejemplo, utilizando un sistema de célula anfitriona diseñado para expresar un ácido nucleico que codifica un anticuerpo de la invención. Alternativa o adicionalmente, los agentes de anticuerpos proporcionados se pueden preparar parcial o totalmente mediante síntesis química (por ejemplo, utilizando un sintetizador de péptidos automático).

Las fuentes de ejemplo para preparaciones de agentes de anticuerpos adecuadas para la invención incluyen, pero no se limitan a, medio de cultivo acondicionado derivado del cultivo de una estirpe celular recombinante que expresa una proteína de interés, o de un extracto celular de, por ejemplo, células productoras de anticuerpos, bacterias, células fúngicas, células de insectos, plantas transgénicas o células vegetales, animales transgénicos o células animales, o suero de animales, líquido ascítico, sobrenadantes de hibridoma o mieloma. Las células bacterianas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células de Escherichia coli. Ejemplos de cepas de E. coli adecuadas incluyen: HB101, DH5a, GM2929, JM109, KW251, NM538, NM539 y cualquier cepa de E. coli que no escinda el ADN extraño. Las células anfitrionas fúngicas adecuadas que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, células de Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Aspergillus. Las células de insectos adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células S2 Schneider, células D. Mel-2, células SF9, SF21, High-5™, Mimic™-SF9, MG1 y Kc i. Las estirpes celulares recombinantes de ejemplo adecuadas incluyen, pero no se limitan a, estirpe de mieloma de ratón BALB/c, retinoblastos humanos (PER. C6), células de riñón de mono, estirpe de riñón embrionario humano (293), células de riñón de cría de hámster (BHK), células de ovario de hámster chino (CHO), células de sertoli de ratón, células de riñón de mono verde africano (VERO-76), células de carcinoma de cuello uterino humano (HeLa), células de riñón canino, células de hígado de rata búfalo, células de pulmón humano, células de hígado humano, células tumorales mamarias de ratón, células TRI, células MRC 5, células FS4 y estirpe de hepatoma humano (Hep G2).

Los agentes de anticuerpos de interés se pueden expresar utilizando varios vectores (por ejemplo, vectores virales) conocidos en la técnica y las células se pueden cultivar bajo diversas condiciones conocidas en la técnica (por ejemplo, tanda de carga). Se conocen bien en la técnica diversos métodos de ingeniería genética de células para producir anticuerpos. Véase, por ejemplo, ausabel et al., Eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York).

Los agentes de anticuerpos proporcionados se pueden purificar, si se desea, utilizando filtración, centrifugación y/o varios métodos cromatográficos tales como HPLC o cromatografía de afinidad. En algunas realizaciones, los fragmentos de los agentes de anticuerpos proporcionados se obtienen mediante métodos que incluyen digestión con enzimas, tales como pepsina o papaína, y/o mediante escisión de enlaces disulfuro por reducción química.

Ácidos nucleicos

En ciertas realizaciones, se proporcionan ácidos nucleicos que codifican un agente de anticuerpo. En algunas realizaciones, la invención proporciona ácidos nucleicos que son complementarios a los ácidos nucleicos que codifican un agente de anticuerpo.

En algunas realizaciones, se proporcionan moléculas de ácido nucleico que hibridan con ácidos nucleicos que codifican un agente de anticuerpo. Dichos ácidos nucleicos se pueden utilizar, por ejemplo, como cebadores o como sondas. Para dar solo algunos ejemplos, dichos ácidos nucleicos se pueden utilizar como cebadores en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como sondas para la hibridación (que incluyen la hibridación in situ) y/o como cebadores para la transcripción inversa-PCR (RT-PCR).

En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN, y pueden ser de cadena sencilla o de cadena doble. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos pueden incluir uno o más nucleótidos no naturales; En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos incluyen solo nucleótidos naturales.

Caracterización y/o identificación de agentes relacionados con el DV

En algunas realizaciones, se proporcionan agentes de anticuerpos que se pueden utilizar para identificar y/o caracterizar uno o más agentes que imitan un epítopo o agente de DV y/o inducen una fuerte respuesta de anticuerpos a DV.

En algunas realizaciones, dichos agentes incluyen uno o más peptidomiméticos de unión de tipo anticuerpo. Liu et al. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 2003 Mar; 49(2): 209-16 describen “peptidomiméticos de unión de tipo anticuerpo” (ABiP), que son péptidos que actúan como anticuerpos reducidos y tienen ciertas ventajas de vida media en suero más prolongada así como métodos de síntesis menos engorrosos. Asimismo, en algunos aspectos, las moléculas de tipo anticuerpo son péptidos cíclicos o bicíclicos. Por ejemplo, los métodos para aislar péptidos bicíclicos que se unen a antígenos (por ejemplo, mediante presentación en fagos) y para utilizar dichos péptidos se proporcionan en la publicación de patente de Estados Unidos No. 20100317547.

En algunas realizaciones, dichos agentes incluyen una o más proteínas de andamio de unión de tipo anticuerpo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una o más CDR que surgen de un anticuerpo se pueden injertar en un andamio proteico. En general, los andamios de proteínas pueden cumplir el mayor número de los siguientes criterios: (Skerra A., J. Mol. Recogn., 2000, 13: 167-187): buena conservación filogenética; estructura tridimensional conocida (como, por ejemplo, mediante cristalografía, espectroscopia de RMN o cualquier otra técnica conocida por un experto); talla pequeña; pocas o ninguna modificación postranscripcional; y/o fáciles de producir, expresar y purificar. El origen de dichos andamios proteicos puede ser, pero no se limita a, fibronectina (por ejemplo, fibronectina tipo III dominio 10), lipocalina, anticalina (Skerra A., J. Biotechnol., 2001, 74(4): 257-75), proteína Z que surge del dominio B de la proteína A de Staphylococcus aureus, tiorredoxina A o proteínas con un motivo repetido tal como la “repetición de anquirina” (Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705), la “repetición de armadillo”, la “repetición rica en leucina” y la “repetición de tetratricopéptido”. Por ejemplo, las anticalinas o los derivados de la lipocalina se describen en las Publicaciones de Patente de Estados Unidos Nos. 20100285564, 20060058510, 20060088908, 20050106660 y la publicación PCT N. WO2006/056464. También se pueden utilizar andamios derivados de toxinas tales como, por ejemplo, toxinas de escorpiones, insectos, plantas, moluscos, etc., y los inhibidores de proteínas de la sintasa NO neuronal (PIN).

En algunas realizaciones, dichos agentes incluyen un mimotopo, que se puede utilizar para interrumpir la interacción entre un virus de la influenza y el receptor del polipéptido HA. En alguna realización, el mimotopo se utiliza para provocar una respuesta de anticuerpo idéntica o similar a la provocada por su correspondiente epítopo diana. En algunas realizaciones, el epítopo diana es una secuencia que se conserva en más de un serotipo de DV. En alguna realización, el epítopo conservado es una secuencia que se conserva en los serotipos 1-4 de DV. En algunas realizaciones, el epítopo es una secuencia conservada ubicada dentro de la región de la cadena A de la glicoproteína E. En algunas realizaciones, un mimotopo es un péptido. En algunas realizaciones, un mimotopo es una molécula pequeña, carbohidrato, lípido o ácido nucleico. En algunas realizaciones, los mimotopos son mimotopos peptídicos o no peptídicos de epítopos de influenza conservados. En algunas realizaciones, al imitar la estructura de un epítopo viral definido, un mimotopo interfiere con la capacidad de las partículas de DV para unirse a sus compañeros de unión naturales, por ejemplo, al unirse al propio compañero de unión natural.

En algunas realizaciones, dicho agente es un péptido grapado. En algunas realizaciones, el péptido grapado comprende unas secuencias de aminoácidos que codifican una o más CDR y/o FR que comprenden al menos más de 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de homología y/o identidad con las CDR y/o FR correspondientes de un anticuerpo anti-DV (por ejemplo, 4E11). En algunas realizaciones, el péptido grapado comprende una secuencia de aminoácidos que codifica una o más secuencias de cadena VH y/o VL que comprenden al menos más de 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de homología y/o identidad con las cadenas VH y VL correspondientes de un anticuerpo anti-DV (por ejemplo, 4E11). En ciertas realizaciones, dicho agente es o comprende un ácido nucleico, tales como ADN o ARN. En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN y pueden ser de cadena sencilla o de cadena doble. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos pueden incluir uno o más nucleótidos no naturales. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos incluyen solo nucleótidos naturales. En algunas realizaciones, el ácido nucleico está diseñado para imitar un epítopo dentro de un polipéptido de DV. En algunas realizaciones, el ácido nucleico está diseñado para imitar un epítopo conservado dentro de uno o más serotipos de DV. En algunas realizaciones, dicho agente es o comprende uno o más oligonucleótidos. En algunas realizaciones, dicho agente es o comprende uno o más oligonucleótidos que comprenden una estructura secundaria tal como bucle, horquilla, pliegue o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, dicho agente es o comprende uno o más oligonucleótidos que comprenden una estructura de orden superior (terciaria o cuaternaria). En algunas realizaciones, dicho agente es o comprende un aptámero.

En algunas realizaciones, se puede diseñar una vacuna para inducir la producción de anticuerpos que se ha descubierto que faltan en el paciente. En algunas realizaciones, es deseable que las composiciones de vacuna comprendan antígenos que tengan una conformación nativa, medien una respuesta protectora (por ejemplo, activación del complemento, neutralización de virus, etc.) y/o puedan inducir una fuerte respuesta de anticuerpos. En algunas realizaciones, una vacuna contiene un epítopo o mimotopo del mismo frente al cual no se producen anticuerpos de forma natural en el individuo. Por ejemplo, los mimótopos de péptidos sintéticos aislados con anticuerpos de DV (por ejemplo, anticuerpos de DV que reconocen múltiples serotipos) tienen el potencial de inducir una potente respuesta inmunitaria similar al anticuerpo utilizado en el aislamiento original del mimotopo. La administración de dicha vacuna podría inducir al sistema inmunológico de un paciente a comenzar a producir un conjunto de anticuerpos dirigidos contra el epítopo administrado. Se apreciará que los mimotopos (o epítopos) de acuerdo con la invención se pueden utilizar solos o en combinación con proteínas recombinantes, virus DV inactivado, virus DV muerto y/o como un cóctel de varios mimotopos diferentes.

En algunas realizaciones, las vacunas para DV se pueden utilizar para inmunización activa (es decir, inmunización en la que se administran a un sujeto microbios, proteínas, péptidos, epítopos, mimotopos, etc.). En algunas realizaciones, las vacunas para DV pueden comprender cualquier agente que imite al menos un epítopo conformacional de la región de la cadena A de DV de la glicoproteína de la envoltura de DV. Por ejemplo, el agente puede ser un péptido, proteína, glicopéptido, glicoproteína, molécula pequeña, mimotopo, compuesto orgánico, lípido, sacárido, compuesto organometálico, compuesto inorgánico, etc. En algunas realizaciones, los epítopos representados en una vacuna incluyen aquellos contra los cuales se dirigen anticuerpos conocidos por prevenir infecciones. En algunas realizaciones, los epítopos representados en una vacuna de acuerdo con la invención incluyen los que se conservan entre diferentes genotipos y/o subtipos del virus o entre diferentes cepas de virus. En algunas realizaciones, los péptidos o proteínas que contienen epítopos conformacionalmente definidos de la región de la cadena A de DV se utilizan en formulaciones de una vacuna para prevenir, retrasar el inicio de, tratar, mejorar los síntomas de, y/o reducir la gravedad de la infección por DV. En algunas realizaciones, los epítopos de la región de la cadena A de DV pueden ser epítopos lineales. En algunas realizaciones, los epítopos de la región de la cadena A pueden ser una mezcla de epítopos lineales y conformacionales. En algunas realizaciones, los epítopos de la región de la cadena A pueden ser epítopos conformacionales. En algunas realizaciones, los epítopos de péptidos tienen menos de 100 aminoácidos de longitud. En ciertas realizaciones, los epítopos de péptidos tienen menos de 50, menos de 40, menos de 30, menos de 20 o menos de 10 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, los péptidos que se van a utilizar en la formulación de una vacuna son fragmentos de péptidos de la proteína de región de cadena A de DV. Normalmente, se utiliza un péptido que se pliega de una manera similar a su pliegue tridimensional en la proteína de la región cadena A nativa, preservando de esta manera la estructura tridimensional del epítopo conformacional.

Sistemas de identificación y/o caracterización de agentes de unión a DV

En el presente documento se proporcionan una variedad de sistemas para probar, caracterizar y/o identificar agentes de anticuerpos de DV. En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpos de DV proporcionados se utilizan para identificar y/o caracterizar otros agentes de unión a DV (por ejemplo, anticuerpos, polipéptidos, moléculas pequeñas, etc.).

En algunas realizaciones, los agentes de unión a DV se caracterizan por dichos sistemas y métodos que implican poner en contacto el agente de unión a DV con uno o más sustratos candidatos, tales como regiones de polipéptidos de DV, N-glicanos sobre polipéptidos de DV, receptores de DV, receptores de DV sialilados y/o glucanos sobre receptores de DV sialilados.

En algunas realizaciones, los agentes de unión a DV (por ejemplo, anticuerpos de reactividad cruzada) pueden probarse, caracterizarse y/o identificarse utilizando enfoques computacionales. En algunas realizaciones, un enfoque computacional implica el uso de características fisicoquímicas comunes a las interacciones proteína-proteína (por ejemplo, anticuerpo-antígeno) para predecir la interacción proteína-proteína y mutaciones que mejoran la afinidad. La potencia de los anticuerpos, por ejemplo, producidos utilizando este enfoque en la neutralización del DV, entonces se podría predecir mediante varios ensayos conocidos en la técnica (por ejemplo, prueba de neutralización por reducción de placa, ELISA, ensayo de hemaglutinación y inmunotransferencia de Western).

En algunas realizaciones, un agente de unión a DV y/o sustrato candidato pueden estar libres en solución, fijados a un soporte y/o expresados en y/o sobre la superficie de una célula. Se pueden marcar el sustrato y/o agentes candidatos, permitiendo de esta manera la detección de la unión. Cualquiera del agente de unión a DV o el sustrato candidato es la especie marcada. Se pueden realizar formatos de unión competitivos en los que se marca una de las sustancias, y se puede medir la cantidad de marca libre frente a la marca unida para determinar el efecto sobre la unión.

En algunas realizaciones, los ensayos de unión implican, por ejemplo, exponer un sustrato candidato a un agente de unión a DV y detectar la unión entre el sustrato candidato y el agente. Se puede realizar un ensayo de unión in vitro (por ejemplo, en un tubo candidato, que comprende sustancialmente solo los componentes mencionados; en extractos libres de células; y/o en componentes sustancialmente purificados). Alternativa o adicionalmente, los ensayos de unión se pueden realizar in cyto y/o in vivo (por ejemplo, dentro de una célula, tejido, órgano y/u organismo; descrito con más detalle a continuación).

En ciertas realizaciones, al menos un agente de unión a DV se pone en contacto con al menos un sustrato candidato y se detecta un efecto. En algunas realizaciones, por ejemplo, un agente de unión a DV se pone en contacto con un sustrato candidato y se monitoriza la unión entre las dos entidades. En algunas realizaciones, un ensayo puede implicar poner en contacto un sustrato candidato con una porción característica de un agente. Se detecta la unión del agente DV al sustrato candidato. Se apreciará que se pueden emplear fragmentos, porciones, homólogos, variantes y/o derivados de agentes de unión a DV, siempre que comprendan la capacidad de unirse a uno o más sustratos candidatos.

La unión de un agente de DV al sustrato candidato se puede determinar mediante una variedad de métodos bien conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, las mediciones de unión se pueden realizar utilizando análisis SPR. En algunas realizaciones, el análisis de SPR se puede utilizar para medir la afinidad y los parámetros de unión cinética de un agente de unión a DV. En algunas realizaciones, se pueden utilizar ensayos que implican agentes DV unidos a fase sólida y que detectan sus interacciones con uno o más sustratos candidatos. Por tanto, un agente de unión a DV puede comprender un marcador detectable, tal como un marcado radiactivo, fluorescente y/o luminiscente. Adicionalmente, el sustrato candidato se puede acoplar a sustancias que permitan la detección indirecta (por ejemplo, por medio del empleo de una enzima que utiliza un sustrato cromogénico y/o mediante la unión de un anticuerpo detectable). Se pueden detectar los cambios en la conformación de los agentes de unión a DV como resultado de una interacción con un sustrato candidato, por ejemplo, mediante el cambio en la emisión del marcador detectable. Alternativa o adicionalmente, los complejos de proteína unidos a fase sólida se pueden analizar mediante espectrometría de masas.

En algunas realizaciones, el agente de unión a DV puede no estar inmovilizado. En algunas realizaciones, se puede marcar el componente no inmovilizado (con, por ejemplo, un marcado radiactivo, una etiqueta de epítopo, un conjugado de enzima-anticuerpo, etc.). Alternativa o adicionalmente, la unión se puede determinar mediante técnicas de detección inmunológica. Por ejemplo, la mezcla de reacción se puede someter a inmunotransferencia Western y la inmunotransferencia se puede sondear con un anticuerpo que detecta el componente no inmovilizado. Alternativa o adicionalmente, se puede utilizar ELISA para ensayar la unión. En algunas realizaciones, la afinidad de unión de un agente de DV a un sustrato candidato se puede determinar utilizando un ensayo ELISA indirecto de alto rendimiento.

En algunas realizaciones, se puede utilizar el ensayo de prueba de neutralización por reducción de enfoque (FRNT) para medir la actividad o la potencia neutralizante de un agente de unión a DV. En algunas realizaciones, se puede utilizar un anfitrión animal para medir la actividad anti-DV in vivo.

En ciertas realizaciones, las células se pueden ensayar directamente para determinar la unión entre agentes de DV y sustratos candidatos. Las técnicas inmunohistoquímicas, técnicas confocales y/u otras técnicas para evaluar la unión son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Se pueden utilizar varias estirpes celulares para dichos ensayos de cribado, que incluyen las células diseñadas por ingeniería específicamente para este propósito. Ejemplos de células utilizadas en los ensayos de cribado incluyen células de mamíferos, células fúngicas, células bacterianas o células virales. Una célula puede ser una célula estimulada, tal como una célula estimulada con un factor de crecimiento. Un experto en la técnica entendería que la invención divulgada en el presente documento contempla una amplia variedad de ensayos in cyto para medir la capacidad de los agentes de unión a DV para unirse a sustratos candidatos.

Dependiendo del ensayo, puede ser necesario un cultivo de células y/o tejidos. Se puede examinar una célula utilizando cualquiera de varios ensayos fisiológicos diferentes. Alternativa o adicionalmente, se puede realizar un análisis molecular, que incluye, pero no se limita a, inmunotransferencia de Western para monitorizar la expresión de proteínas y/o probar las interacciones proteína-proteína; espectrometría de masas para monitorizar otras modificaciones químicas; etc.

En algunas realizaciones, se pueden realizar los ensayos de unión descritos en el presente documento utilizando un rango de concentraciones de agentes de unión a DV y/o sustratos candidatos. En algunas realizaciones, los ensayos de unión descritos en el presente documento se utilizan para evaluar la capacidad de un sustrato candidato para unirse a un agente de DV en un rango de concentraciones de anticuerpos (por ejemplo mayor de aproximadamente 100 |jg/ml, aproximadamente 100 jg/ml, aproximadamente 50 jg/ml, aproximadamente 40 jg/ml, aproximadamente 30 jg/ml, aproximadamente 20 jg/ml, aproximadamente 10 jg/ml, aproximadamente 5 jg/ml, aproximadamente 4 jg/ml, aproximadamente 3 jg/ml, aproximadamente 2 jg/ml, aproximadamente 1.75 jg/ml, aproximadamente 1.5 jg/ml, aproximadamente 1.25 jg/ml, aproximadamente 1.0 jg/ml, aproximadamente 0.9 jg/ml, aproximadamente 0.8 jg/ml, aproximadamente 0.7 jg/ml, aproximadamente 0.6 jg/ml, aproximadamente 0.5 jg/ml, aproximadamente 0.4 jg/ml, aproximadamente 0.3 jg/ml, aproximadamente 0.2 jg/ml, aproximadamente 0.1 jg/ml, aproximadamente 0.05 jg/ml, aproximadamente 0.01 jg/ml, y/o menor de aproximadamente 0.01 jg/ml).

En algunas realizaciones, cualquiera de los estudios de unión descritos en el presente documento se puede ejecutar con un alto rendimiento. Utilizando ensayos de alto rendimiento, es posible cribar hasta varios miles de agentes en un solo día. En algunas realizaciones, cada pozo de una placa de microvaloración se puede utilizar para correr un ensayo separado contra un sustrato candidato seleccionado o, si se van a observar los efectos de concentración y/o tiempo de incubación de, cada 5 a 10 pozos pueden probar un solo sustrato candidato. Por tanto, se puede ensayar una única placa de microvaloración estándar de hasta 96 interacciones de unión entre agentes y sustratos candidatos; si se utilizan placas de 1536 pozos, una sola placa puede ensayar hasta 1536 interacciones de unión entre agentes y sustratos candidatos; y así sucesivamente. Es posible ensayar muchas placas por día. Por ejemplo, se pueden realizar hasta aproximadamente 6,000, aproximadamente 20,000, aproximadamente 50,000 o más de aproximadamente 100,000 cribados de ensayo sobre interacciones de unión entre anticuerpos y sustratos candidatos utilizando sistemas de alto rendimiento de acuerdo con la presente invención.

En algunas realizaciones, dichos métodos utilizan un anfitrión animal. Como se utiliza en el presente documento, un “anfitrión animal” incluye cualquier modelo animal adecuado para la investigación de la influenza. Por ejemplo, los anfitriones animales pueden ser cualquier anfitrión mamífero, que incluyen primates, hurones, gatos, perros, vacas, caballos, roedores tales como ratones, hámsteres, conejos y ratas. En ciertas realizaciones, un anfitrión animal utilizado para la invención es un hurón. En particular, en algunas realizaciones, un anfitrión animal es intacto a exposición viral o infección antes de la administración de un agente (opcionalmente en una composición de la invención). En algunas realizaciones, el anfitrión animal se inocula con, se infecta con o se expone de otro modo al virus antes o al mismo tiempo que la administración de un agente. Un anfitrión animal utilizado en la práctica de la presente invención se puede inocular con, infectar con o exponer de otro modo a virus mediante cualquier método conocido en la técnica. En algunas realizaciones, un anfitrión animal se puede inocular con, infectar con o exponer al virus por vía intranasal.

Se pueden utilizar animales intactos y/o inoculados para cualquiera de una variedad de estudios. Por ejemplo, dichos modelos animales se pueden utilizar para estudios de transmisión de virus como se conoce en la técnica. Se contempla que el uso de hurones en estudios de transmisión de virus puede servir como un predictor confiable para la transmisión de virus en humanos. Los estudios de transmisión de virus se pueden utilizar para probar agentes. Por ejemplo, los agentes de unión a DV se pueden administrar a un anfitrión animal adecuado antes, durante o después de los estudios de transmisión de virus para determinar la eficacia de dicho agente para bloquear la unión de virus y/o la infectividad en el anfitrión animal. Utilizando información recopilada de estudios de transmisión de virus en un anfitrión animal, se puede predecir la eficacia de un agente para bloquear la unión del virus y/o la infectividad en un anfitrión humano.

Composiciones farmacéuticas

La presente invención proporciona composiciones que comprenden uno o más agentes de anticuerpos proporcionados. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona al menos un anticuerpo y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones farmacéuticas pueden opcionalmente comprender y/o administrarse en combinación con una o más sustancias terapéuticamente activas adicionales. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionadas son útiles en medicina. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionadas útiles como agentes profilácticos (es decir, vacunas) en el tratamiento o prevención de la infección por DV o de ramificaciones negativas asociadas o correlacionadas con infección por DV. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionadas son útiles en aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, en individuos que padecen o son susceptibles a la infección por DV. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se formulan para administración a humanos.

Por ejemplo, se pueden proporcionar las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento en una forma inyectable estéril (por ejemplo, una forma que sea adecuada para inyección subcutánea o infusión intravenosa). Por ejemplo, en algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se proporcionan en una forma de dosificación líquida que es adecuada para inyección. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se proporcionan como polvos (por ejemplo, liofilizados y/o esterilizados), opcionalmente al vacío, que se reconstituyen con un diluyente acuoso (por ejemplo, agua, tampón, solución salina, etc.) antes de inyección. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se diluyen y/o reconstituyen en agua, solución de cloruro de sodio, solución de acetato de sodio, solución de alcohol bencílico, solución salina tamponada con fosfato, etc. En algunas realizaciones, el polvo se debe mezclar suavemente con el diluyente acuoso (por ejemplo, no agitado). En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionadas comprenden uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, conservante, diluyente inerte, agente dispersante, agente de superficie activa y/o emulsionante, agente tamponador, etc.). En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más conservantes. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas no contienen conservantes.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se proporcionan en una forma que se puede refrigerar y/o congelar. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se proporcionan en una forma que no se puede refrigerar y/o congelar. En algunas realizaciones, las soluciones reconstituidas y/o las formas de dosificación líquidas se pueden almacenar durante un cierto período de tiempo después de la reconstitución (por ejemplo, 2 horas, 12 horas, 24 horas, 2 días, 5 días, 7 días, 10 días, 2 semanas, un mes, dos meses o más).

Las formas de dosificación líquidas y/o las soluciones reconstituidas pueden comprender material en partículas y/o decoloración antes de administración. En algunas realizaciones, no se debe utilizar una solución si está descolorida o turbia y/o si queda materia en partículas después de filtración.

Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden preparar mediante cualquier método conocido o desarrollado en el futuro en la técnica de la farmacología. En algunas realizaciones, dichos métodos preparatorios incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo con uno o más excipientes y/o uno o más de otros ingredientes accesorios, y luego, si es necesario y/o deseable, conformar y/o empacar el producto en una unidad deseada de dosis única o múltiple.

Una composición farmacéutica de acuerdo con la invención se puede preparar, empacar y/o vender a granel, como una dosis unitaria única y/o como una pluralidad de dosis unitarias únicas. Como se utiliza en el presente documento, una “dosis unitaria” es una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad de ingrediente activo es generalmente igual a una dosis que se administraría a un sujeto y/o una fracción conveniente de dicha dosis tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de dicha dosis.

Las cantidades relativas de ingrediente activo, excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica de acuerdo con la invención pueden variar, dependiendo de la identidad, tamaño y/o condición del sujeto tratado y/o dependiendo según la ruta por la que se administrará la composición. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre un 0.1% y un 100% (p/p) de ingrediente activo.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable, que, como se utiliza en el presente documento, puede ser o comprender solventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, adyuvantes de dispersión o suspensión, agentes de superficie activas, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, según se adapte a la forma de dosificación particular deseada. Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006) divulga varios excipientes utilizados en la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas conocidas para preparación de las mismas. Excepto en la medida en que cualquier medio de excipiente convencional sea incompatible con una sustancia o sus derivados, tal como por ejemplo al producir cualquier efecto biológico indeseable o al interactuar de otra manera de manera perjudicial con cualquier otro componente de la composición farmacéutica, se contempla que su uso esté dentro del alcance de esta invención.

Vacunas

En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones de vacuna para uso y/o para examen en inmunización pasiva (es decir, inmunización en la que se administran anticuerpos a un sujeto) de un sujeto que padece o es susceptible a la infección por DV. En algunas realizaciones, la inmunización pasiva se produce cuando los anticuerpos se transfieren de la madre al feto durante el embarazo. En algunas realizaciones, la inmunización pasiva incluye la administración de agentes de anticuerpos directamente a un individuo (por ejemplo, por inyección, por vía oral, nasal, etc.).

En algunas realizaciones, las aplicaciones profilácticas pueden incluir la administración de vacunas. En algunas realizaciones, la vacunación se adapta al paciente individual. Por ejemplo, como se describe a continuación, se puede recolectar suero de un paciente y probar la presencia de DV y, en algunas realizaciones, uno o más serotipos de DV particulares. En algunas realizaciones, los receptores apropiados de las vacunas proporcionadas son individuos que padecen o son susceptibles de infección con uno o más serotipos de DV unidos y/o neutralizados por un anticuerpo proporcionado.

En algunas realizaciones, una vacuna se administra por vía oral, intranasal, subcutánea, intramuscular, intradérmica o mediante cualquier otra ruta de administración médicamente apropiada. Se apreciará que cada ruta de administración puede requerir distintas formulaciones o mecanismos de suministro y dichos parámetros variables se contemplan dentro del alcance de la presente invención. En algunas realizaciones, la ruta de administración y/o formulación puede estar dictada en parte por la edad y/o condición del sujeto. Por ejemplo, la administración de una vacuna a un bebé se puede realizar mediante una inyección en la cara anterolateral del muslo, debido a la gran masa muscular. En algunas realizaciones, cuando el sujeto es un niño o un adulto, se puede preferir la administración de una vacuna al músculo deltoides. Se entiende que se debe utilizar un buen juicio médico para determinar la ruta y/o formulación adecuadas para la administración a un sujeto particular.

En algunas realizaciones, una composición de vacuna comprende al menos un adyuvante. Se puede utilizar cualquier adyuvante de acuerdo con la presente invención. Se conoce un gran número de adyuvantes; Los Institutos Nacionales de Salud preparan un compendio útil de muchos de estos compuestos y se puede encontrar en www.niaid.nih.gov/daids/vaccine/pdf/compendium.pdf; véase también Allison (1998, Dev. Biol. Stand., 92: 3-11), Unkeless et al. (1998, Annu. Rev. Immunol., 6: 251-281) y Phillips et al. (1992, Vaccine, 10: 151-158). Se conocen en la técnica cientos de adyuvantes diferentes y se podrían emplear en la práctica de la presente invención. Los adyuvantes de ejemplo que se pueden utilizar de acuerdo con la invención incluyen, pero no se limitan a, citocinas, adyuvantes de tipo gel (por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, fosfato de calcio, etc.); adyuvantes microbianos (por ejemplo, secuencias de ADN inmunomoduladoras que incluyen motivos CpG; endotoxinas tales como monofosforil lípido A; exotoxinas tales como toxina del cólera, toxina termolábil de E. coli y toxina pertussis; dipéptido de muramil, etc.); adyuvantes basados en emulsión de aceite y emulsionantes (por ejemplo, adyuvante de Freund, MF59 [Novartis], SAF, etc.); adyuvantes en partículas (por ejemplo, liposomas, microesferas biodegradables, saponinas, etc.); adyuvantes sintéticos (por ejemplo, copolímeros de bloque no iónicos, análogos de péptidos de muramilo, polifosfaceno, polinucleótidos sintéticos, etc.); y/o combinaciones de los mismos. Otros adyuvantes de ejemplo incluyen algunos polímeros (por ejemplo, polifosfacenos; descritos en la Patente de Estados Unidos 5,500,161), Q57, QS21, escualeno, tetraclorodecaóxido, etc. Se han descrito previamente excipientes farmacéuticamente aceptables con más detalle en la sección anterior titulada “Composiciones farmacéuticas”. Terapia de combinación

Se apreciará que los agentes de anticuerpos de DV de acuerdo con la presente invención y/o composiciones farmacéuticas de los mismos se pueden emplear en terapias de combinación. Por “en combinación con”, no se pretende implicar que los agentes se deban administrar al mismo tiempo y/o formular para suministro juntos, aunque se contemplan estos métodos de suministro. Las composiciones se pueden administrar al mismo tiempo, antes o después de uno o más de otros procedimientos terapéuticos o médicos deseados. Se apreciará que los agentes terapéuticamente activos utilizados en combinación se pueden administrar juntos en una única composición o administrarse por separado en diferentes composiciones. En general, cada agente se administrará en una dosis y/o en un horario determinado para ese agente.

La combinación particular de terapias (por ejemplo, agentes terapéuticos o procedimientos) para emplear en un régimen de combinación tendrá en cuenta la compatibilidad de los agentes terapéuticos y/o procedimientos deseados y el efecto terapéutico deseado que se va a lograr. También se apreciará que las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden emplear en terapias de combinación (por ejemplo, terapias con vacunas de combinación), es decir, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar al mismo tiempo, antes o después de una o más de otros procedimientos terapéuticos y/o de vacunación.

Cantidades terapéuticamente eficaces de agentes de anticuerpos de acuerdo con la invención combinados para uso en combinación con una composición farmacéutica proporcionada y al menos otro ingrediente activo. En algunas realizaciones, un ingrediente activo es un agente antivírico, como, entre otros, interferones (por ejemplo, interferón a-2b, interferón-Y, etc.), anticuerpos monoclonales anti-DV, anticuerpos policlonales anti-DV, inhibidores de polimerasa de ARN, inhibidores de proteasa, inhibidores de helicasa, inmunomoduladores, compuestos antisentido, ARN de interferencia cortos, ARN de horquilla corta, ARN micro, aptámeros de ARN, ribozimas y combinaciones de los mismos. La combinación particular de terapias a emplear en un régimen de combinación generalmente tendrá en cuenta la compatibilidad de las terapias y/o procedimientos deseados y el efecto terapéutico deseado que se va a lograr. También se apreciará que las terapias y/o vacunas empleadas pueden lograr un efecto deseado para el mismo trastorno (por ejemplo, un antígeno de la invención se puede administrar al mismo tiempo que otra vacuna de DV), o pueden lograr efectos diferentes.

Se apreciará que las terapias empleadas pueden lograr un efecto deseado para el mismo propósito (por ejemplo, los anticuerpos de DV útiles para tratar, prevenir y/o retrasar la aparición de la infección por DV se pueden administrar simultáneamente con otro agente útil para tratar, prevenir y/o retrasar la aparición de la infección por DV), o pueden lograr diferentes efectos (por ejemplo, control de cualquier efecto adverso). En el presente documento se abarca el suministro de composiciones farmacéuticas en combinación con agentes que pueden mejorar su biodisponibilidad, reducir y/o modificar su metabolismo, inhibir su excreción y/o modificar su distribución dentro del cuerpo.

En algunas realizaciones, los agentes utilizados en combinación se utilizarán a niveles que no excedan los niveles a los que se utilizan individualmente. En algunas realizaciones, los niveles utilizados en combinación serán más bajos que aquellos utilizados individualmente.

En algunas realizaciones, los anticuerpos de DV de acuerdo con la invención se pueden administrar con interferón, con inhibidores de polimerasa de ARN o con inhibidores de interferón y de polimerasa ARN.

En algunas realizaciones, la terapia de combinación puede implicar la administración de una pluralidad de agentes de anticuerpos dirigidos a un solo epítopo (por ejemplo, un solo epítopo conformacional). En algunas realizaciones, la terapia de combinación puede comprender una pluralidad de agentes de anticuerpos que reconocen distintos epítopos (por ejemplo, En la misma proteína de la envoltura viral o en diferentes proteínas de la envoltura viral, donde los epítopos pueden o no ser conformacionales), por ejemplo para interferir simultáneamente con múltiples mecanismos en el proceso infeccioso.

En ciertas realizaciones, las composiciones comprenden exactamente un agente de anticuerpo contra la región de la cadena A. En ciertas realizaciones, las composiciones incluyen y/o la terapia de combinación utiliza exactamente dos agentes de anticuerpos de la región de la cadena A de DV.

Un experto en la técnica apreciará que cualquier permutación o combinación de agentes de anticuerpos de acuerdo con la presente invención se puede combinar con cualquier otro agente de anticuerpos para formular composiciones y/o regímenes de terapia de combinación que comprenden una pluralidad de diferentes agentes de anticuerpos. Métodos de administración

Los agentes de anticuerpos de DV de acuerdo con la invención y las composiciones farmacéuticas de los mismos de acuerdo con la presente invención se pueden administrar de acuerdo con cualquier ruta y régimen apropiados. En algunas realizaciones, una ruta o régimen es uno que se ha correlacionado con un beneficio terapéutico positivo. En algunas realizaciones, una ruta o régimen es uno que ha sido aprobado por la FDA y/o EP.

En algunas realizaciones, la cantidad exacta administrada puede variar de un sujeto a sujeto, dependiendo de uno o más factores, como es bien conocido en la técnica médica. Dichos factores pueden incluir, por ejemplo, una o más especies, edad, estado general del sujeto, gravedad de la infección, composición particular, su modo de administración, su modo de actividad, el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del agente de anticuerpo de DV específico empleado; la composición farmacéutica específica administrada; la vida media de la composición después de la administración; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto; el momento de administración, la ruta de administración y la tasa de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; fármacos utilizados en combinación o coincidentemente con el compuesto específico empleado y similares. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. Sin embargo, se entenderá que el médico tratante decidirá el uso diario total de las composiciones de la presente invención dentro del alcance del buen juicio médico.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar por cualquier ruta, como apreciarán aquellos expertos en la técnica. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran por vía oral (PO), intravenosa (IV), intramuscular (IM), intraarterial, intramedular, intratecal, subcutánea (SQ), intraventricular, transdérmica, interdérmica, intradérmica, rectal (PR), vaginal, intraperitoneal (IP), intragástrica (IG), tópica (por ejemplo, mediante polvos, ungüentos, cremas, geles, lociones y/o gotas), de mucosa, intranasal, bucal, enteral, vítreo, sublingual; por instilación intratraqueal, instilación bronquial y/o inhalación; como un pulverizador oral, pulverizador nasal y/o aerosol, y/o a través de un catéter en la vena porta. En realizaciones específicas, los agentes de anticuerpo de DV de acuerdo con la presente invención y/o composiciones de los mismos se pueden administrar por vía intravenosa, por ejemplo, mediante infusión de intravenosa. En realizaciones específicas, los agentes de anticuerpo de DV de acuerdo con la presente invención y/o composiciones de los mismos se pueden administrar mediante inyección intramuscular. En realizaciones específicas, los agentes de anticuerpo de DV de acuerdo con la presente invención y/o composiciones de los mismos se pueden administrar mediante inyección subcutánea. En realizaciones específicas, los agentes de anticuerpo de DV de acuerdo con la presente invención y/o composiciones de los mismos se pueden administrar a través del catéter de vena portal. Sin embargo, se abarca en el presente documento el suministro de agentes de anticuerpo de DV de acuerdo con la presente invención y/o composiciones farmacéuticas de los mismos mediante cualquier ruta apropiada teniendo en cuenta los probables avances en las ciencias del suministro de fármacos. En ciertas realizaciones, los agentes de anticuerpo de DV de acuerdo con la presente invención y/o composiciones farmacéuticas de los mismos de acuerdo con la invención se puede administrar a niveles de dosificación suficientes para suministrar desde aproximadamente 0.001 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg, desde aproximadamente 0.01 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg, desde aproximadamente 0.1 mg/kg hasta aproximadamente 40 mg/kg, desde aproximadamente 0.5 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 0.01 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg, desde aproximadamente 0.1 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg, o desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 25 mg/kg del peso corporal de sujeto por día para obtener el efecto terapéutico deseado. La dosificación deseada se puede suministrar más de tres veces al día, tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, cada dos días, cada tercer día, cada semana, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas, cada dos meses, cada seis meses o cada doce meses. En ciertas realizaciones, la dosificación deseada se puede suministrar utilizando múltiples administraciones (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o más administraciones).

Aplicaciones profilácticas

En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpos de DV de acuerdo con la invención se pueden utilizar para aplicaciones profilácticas. En algunas realizaciones, las aplicaciones profilácticas implican sistemas y métodos para prevenir, inhibir la progresión y/o retrasar la aparición de la infección por DV y/o cualquier otra afección asociada a DV en individuos susceptibles y/o que presenten síntomas de infección por DV. En algunas realizaciones, las aplicaciones profilácticas implican sistemas y métodos para prevenir, inhibir la progresión y/o retrasar la aparición de la infección del cerebro. En algunas realizaciones, las aplicaciones profilácticas implican sistemas y métodos para prevenir, inhibir la progresión de y/o retrasar el deterioro de órganos vitales (por ejemplo, hígado).

Aplicaciones de diagnóstico

En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpos de DV de acuerdo con la invención se utilizan para aplicaciones de diagnóstico. Por ejemplo, en virtud de la variedad de perfiles de unión de los agentes de anticuerpos de DV, se pueden emplear ensayos de diagnóstico que detecten una pluralidad de serotipos de DV, para proporcionar un agente de anticuerpos pan-DV, mientras que al mismo tiempo pueden diseccionar serotipos individuales mediante análisis sustractivo.

Para fines de diagnóstico, se pueden utilizar los agentes de anticuerpos en una amplia variedad de formatos para detectar la región de la cadena A de la glicoproteína de la envoltura, discernir los serotipos de DV, detectar viriones y anticuerpos (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos número 5,695,390). Los agentes de anticuerpos se pueden utilizar individualmente o en combinación con otros anticuerpos del grupo sujeto u otros anticuerpos o con lectinas que se unen a los grupos glicosilo presentes en las proteínas de la envoltura de DV. Para fines de diagnóstico, se puede emplear una amplia variedad de marcadores, que en su mayor parte se han mencionado anteriormente. Estos incluyen, pero no se limitan a, fluoróforos, fracciones quimioluminiscentes, radioisótopos, enzimas, partículas (por ejemplo, partículas de carbono coloidal, partículas de oro, partículas de látex, etc.), ligandos para los que existen receptores de alta afinidad y promarcas, que pueden ser activadas para proporcionar una señal detectable.

En algunas realizaciones, una superficie se recubre con una proteína, que se puede unir a antígenos de DV como proteína libre (por ejemplo, proteínas circulantes) o como parte de un virión intacto o parcialmente intacto. Se pueden utilizar anticuerpos de la presente invención que se unen a múltiples serotipos de DV o a lectinas (por ejemplo, lectina de Galanthus nivalis; “GNA”).

En algunas realizaciones, los ensayos pueden implicar poner en contacto una superficie con un medio, que puede contener proteína o proteínas libres o asociadas a DV, donde el medio puede ser la muestra o una solución de la región de la cadena A conocida de uno o más serotipos. Después de la incubación y el lavado para eliminar la proteína unida de forma no específica, se puede realizar el ensayo de diversas formas dependiendo de lo que se esté ensayando. Cuando se ensaya una muestra de sangre sospechosa de ser seropositiva, se puede aplicar la muestra a la capa de proteína de región de cadena A, incubar y lavar, y se puede determinar la presencia de anticuerpos humanos unidos a la capa de proteína. Se pueden utilizar anticuerpos humanos a marcados (distintos contra el isotipo de los anticuerpos en cuestión, donde los anticuerpos en cuestión se han utilizado inicialmente). En ensayos de anticuerpos en sujetos seropositivos, los anticuerpos en cuestión se pueden utilizar como controles con el mismo reactivo utilizado para detectar cualquier anticuerpo anti-DV humano en el suero de dichos sujetos. La especificidad de los anticuerpos en la muestra se puede confirmar utilizando los anticuerpos en cuestión, que están marcados de forma diferencial con respecto a los anticuerpos antihumanos y determinan si están bloqueados por los anticuerpos en la muestra.

Cuando se ensaya la muestra para la proteína de región de cadena A de DV, la detección emplea anticuerpos en cuestión marcados, la selección depende de si uno está interesado en el genotipado o la detección de la proteína de región de cadena A. Después de eliminar por lavado el anticuerpo unido de forma no específica, la presencia de anticuerpos marcados se determina al detectar la presencia del marcador de acuerdo con técnicas conocidas. Alternativa o adicionalmente, cuando los anticuerpos en cuestión se unen a una superficie, se puede emplear una lectina marcada para la región de cadena A para detectar la presencia de la proteína de región de cadena A.

Los agentes de anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden utilizar para medir la reactividad de otros anticuerpos, que incluyen anticuerpos en suero, anticuerpos monoclonales, anticuerpos expresados como resultado de ingeniería genética, etc. En algunas realizaciones, se utilizan viriones intactos. En algunas realizaciones, se utilizan proteínas de la envoltura conservadas conformacionalmente. Para la captura de viriones, véase, por ejemplo, Kimura et al., 1998, J. Med. Virology, 56:25-32; Morita et al., 1996, Hapato-Gastroenterology, 43:582-585; Sata et al., 1993, Virology, 196:354-357; and Hijikata et al., 1993, J. Virol., 67:1953-1958. Un protocolo implica las etapas de recubrir un soporte sólido con una lectina (por ejemplo, GNA) y luego poner en contacto la superficie con un medio (por ejemplo, suero de un paciente seropositivo) que comprende viriones de DV intactos. Por lo general, se deben evitar los aditivos que puedan destruir los viriones (por ejemplo, detergentes). Después de incubar el medio y lavar para eliminar los componentes del medio unidos de forma no específica, los viriones pueden ponerse en contacto con anticuerpos de acuerdo con la invención y anticuerpos de la muestra. Esto se puede realizar de forma simultánea o consecutiva, donde la muestra se agrega primero. Se utiliza una cantidad del anticuerpo en cuestión que es sensible al desplazamiento por otro anticuerpo. Dicha cantidad se puede determinar empíricamente y se puede desear utilizar diferentes cantidades del anticuerpo en cuestión en una serie de pruebas. Al conocer la señal, que se obtiene en ausencia y presencia de la muestra, se puede determinar la reactividad o afinidad de unión de los anticuerpos en la muestra. Se pueden utilizar varias técnicas para determinar la cantidad de un anticuerpo en cuestión unido a los viriones. Cuando los anticuerpos en cuestión están marcados, por ejemplo, con biotina o digoxigenina, estreptavidina o anti-digoxigenina, marcados con un fluoróforo o enzima cuyo sustrato produce una señal detectable puede servir para determinar la cantidad de los anticuerpos en cuestión.

Se pueden utilizar agentes de anticuerpos en cuestión marcados para ensayar la presencia de DV a partir del material de biopsia. El anticuerpo marcado se puede incubar con material de biopsia inmovilizado, tal como una rodaja de hígado, con una solución de uno o más de los anticuerpos marcados en cuestión. Después de eliminar por lavado los anticuerpos unidos de forma no específica, la presencia de los anticuerpos unidos a las células del tejido biopsiado se puede detectar de acuerdo con la naturaleza del marcado.

En algunas realizaciones, los agentes de anticuerpos de DV de acuerdo con la invención se pueden utilizar para identificar receptores de DV. Aquellos expertos en la técnica apreciarán la multitud de formas en que esto se puede lograr (Sambrook J., Fritsch E. and Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; y Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, 1987). Normalmente, los receptores de proteínas y péptidos se pueden identificar al determinar si un anticuerpo contra la región de la cadena A de la glicoproteína de la envoltura de DV puede inhibir la unión de los viriones de DV a una célula susceptible a la infección por DV. Por tanto, se pueden identificar de esta manera los receptores para péptidos y proteínas de región de cadena A de DV. Se puede incubar una célula susceptible en presencia de DV y anticuerpo de la región de la cadena A anti-DV, y se puede utilizar un ensayo de unión celular para determinar si la unión disminuye en presencia del anticuerpo.

Las células que expresan receptores putativos para DV y/o bibliotecas de receptores putativos para DV se pueden cribar por sus capacidades para unirse a DV. Por ejemplo, las células que expresan un receptor de DV putativo (por ejemplo, Un receptor para la región de la cadena A de DV) pueden ponerse en contacto con una proteína o péptido de DV en presencia de un anticuerpo durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la unión de la proteína o péptido de DV al receptor putativo en la superficie de la célula. Alternativa o adicionalmente, las proteínas, péptidos o viriones de DV se pueden preincubar con el anticuerpo antes de ponerse en contacto con el receptor putativo sobre la superficie celular. La unión se puede detectar por cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo, citometría de flujo, etc. (véase Ausubel et al. O Sambrook et al., Supra). Una disminución en la unión a la superficie de la célula en presencia de anticuerpo en comparación con la unión en ausencia de la célula en ausencia del anticuerpo indica la identificación de un receptor de DV.

En algunas realizaciones, los métodos para identificar receptores de DV incluyen el uso de soportes sólidos, tales como perlas, columnas y similares. Por ejemplo, los receptores para proteínas y péptidos Dv (por ejemplo, se pueden identificar proteínas de región de cadena A y/o fragmentos de las mismas) y/o viriones DV al unir un anticuerpo DV a un soporte sólido y luego contactando el anticuerpo con una proteína DV o péptido durante un tiempo suficiente para que la proteína DV o el péptido se una al anticuerpo. Esto proporciona un ligando de proteína DV para receptores de DV putativos que se pueden poner en contacto con el complejo anticuerpo: ligando sobre el soporte sólido durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la unión de un receptor a la proteína o péptido de DV. Las proteínas se pueden expresar a partir de una biblioteca o proporcionar como un extracto celular o una preparación de proteína purificada a partir de células naturales o recombinantes. Una vez que se forman los complejos de unión específicos entre el péptido de la proteína de DV, las proteínas o péptidos de D^vno unidos, por ejemplo, proteínas de biblioteca o péptidos que no se unieron específicamente a las proteínas o péptidos de DV, se eliminan, por ejemplo, mediante etapas de lavado estándar. A continuación, las proteínas unidas se eluyen e identifican, por ejemplo, mediante electroforesis en gel.

Kits

La invención proporciona una variedad de kits para llevar a cabo de manera conveniente y/o eficaz métodos de acuerdo con la presente divulgación. Los kits comprenden normalmente uno o más agentes de anticuerpos de DV de acuerdo con la invención. En algunas realizaciones, los kits comprenden una colección de diferentes agentes de anticuerpos de DV que se utilizarán para diferentes propósitos (por ejemplo, diagnóstico, tratamiento y/o profilaxis). Normalmente, los kits comprenderán cantidades suficientes de agentes de anticuerpos de DV para permitir a un usuario realizar múltiples administraciones a un sujeto (s) y/o realizar múltiples experimentos. En algunas realizaciones, los kits se suministran con o incluyen uno o más agentes de anticuerpos de DV que han sido especificados por el comprador.

En ciertas realizaciones, los kits para utilizar de acuerdo con la presente invención pueden incluir una o más muestras de referencia; instrucciones (por ejemplo, para procesar muestras, realizar pruebas, interpretar resultados, solubilizar agentes de anticuerpos de DV, almacenar agentes de anticuerpos de DV, etc.); tampones y/u otros reactivos necesarios para realizar las pruebas. En ciertas realizaciones, los kits pueden comprender paneles de anticuerpos. Otros componentes de los kits pueden incluir células, medios de cultivo celular, tejidos y/o medios de cultivo de tejidos.

Los kits pueden comprender instrucciones para uso. Por ejemplo, las instrucciones pueden informar al usuario del procedimiento adecuado mediante el cual preparar una composición farmacéutica que comprende agentes de anticuerpos de DV y/o el procedimiento adecuado para administrar composiciones farmacéuticas a un sujeto.

En algunas realizaciones, los kits incluyen una serie de dosificaciones unitarias de una composición farmacéutica que comprende agentes de anticuerpos de DV. Se puede proporcionar una ayuda para la memoria, por ejemplo, en forma de números, letras y/u otras marcas y/o con un inserto de calendario, que designa los días/horas en el programa de tratamiento en los que se pueden administrar las dosificaciones. Se pueden incluir dosificaciones de placebo y/o suplementos dietéticos de calcio, ya sea en una forma similar o distinta de las dosificaciones de las composiciones farmacéuticas, para proporcionar un kit en el que se toma una dosificación todos los días.

Los kits pueden comprender uno o más recipientes o contenedores de modo que algunos de los componentes o reactivos individuales se puedan alojar por separado. Los kits pueden comprender un medio para encerrar los contenedores individuales en un confinamiento relativamente estrecho para la venta comercial, por ejemplo, una caja de plástico, en la que se pueden incluir instrucciones, materiales de empaque tales como espuma de poliestireno, etc.

En algunas realizaciones, los kits se utilizan en el tratamiento, diagnóstico y/o profilaxis de un sujeto que padece y/o es susceptible a DV. En algunas realizaciones, dichos kits comprenden (i) al menos un agente de anticuerpo de DV; (ii) una jeringa, aguja, aplicador, etc. para administración de al menos un agente de anticuerpo de DV a un sujeto; e (iii) instrucciones para uso.

En algunas realizaciones, los kits se utilizan en el tratamiento, diagnóstico y/o profilaxis de un sujeto que padece y/o es susceptible a DV. En algunas realizaciones, dichos kits comprenden (i) al menos un agente de anticuerpo de DV proporcionado como un polvo liofilizado; y (ii) un diluyente para reconstituir el polvo liofilizado. Dichos kits pueden comprender opcionalmente una jeringa, aguja, aplicador, etc. para la administración de al menos un agente de anticuerpo de DV a un sujeto; y/o instrucciones para uso.

La presente invención proporciona kits que contienen reactivos para la generación de vacunas que comprenden al menos un agente de anticuerpo de DV. En algunas realizaciones, dichos kits pueden incluir células que expresan anticuerpos de DV, porciones características de los mismos y/o porciones biológicamente activas de los mismos; (ii) medios para hacer crecer las células; y (iii) columnas, resina, tampones, tubos y otras herramientas útiles para la purificación de anticuerpos. En algunas realizaciones, dichos kits pueden incluir (i) plásmidos que contienen nucleótidos que codifican anticuerpos de DV, porciones características de los mismos y/o porciones biológicamente activas de los mismos; (ii) células capaces de transformarse con los plásmidos, tales como estirpes celulares de de mamíferos, que incluyen, pero no se limitan a, estirpes celulares Vero y MDCK; (iii) medios para hacer crecer las células; (iv) plásmidos de expresión que no contienen nucleótidos que codifiquen anticuerpos contra DV como controles negativos; (v) columnas, resina, tampones, tubos y otras herramientas útiles para la purificación de anticuerpos; y (vi) instrucciones para uso.

En algunas realizaciones, se utilizan kits para detectar la presencia de DV en una o más muestras. Dichas muestras pueden ser muestras patológicas, que incluyen, entre otras, sangre, suero/plasma, células mononucleares de sangre periférica/linfocitos de sangre periférica (PBMC/PBL), esputo, orina, heces, frotis de garganta, frotis de lesiones dérmicas, líquido cefalorraquídeo, frotis de cuello uterino, muestras de pus, matrices de alimentos y tejidos de diversas partes del cuerpo tales como el cerebro, bazo e hígado. Dichas muestras pueden ser muestras ambientales, que incluyen, pero no se limitan a, suelo, agua y flora. También pueden ser aplicables otras muestras que no se han incluido en la lista. En algunas realizaciones, dichos kits comprenden (i) al menos un anticuerpo de DV; (ii) una muestra que se sabe que contiene DV, como control positivo; y (iii) una muestra que se sabe que no contiene DV, como control negativo; e (iv) instrucciones para uso.

En algunas realizaciones, se utilizan kits para neutralizar el DV en una o más muestras. Dichos kits pueden proporcionar los materiales necesarios para tratar una muestra que contiene DV con al menos un agente de anticuerpos de DV y para probar la capacidad de la muestra tratada para infectar células cultivadas en relación con la muestra no tratada. Dichos kits pueden incluir (i) al menos un agente de anticuerpo de DV; (ii) células capaces de ser cultivadas e infectadas con DV; (iii) un anticuerpo que es incapaz de unirse y neutralizar el DV, como control negativo; (iv) un anticuerpo que es capaz de unirse ay neutralizar DV, como control positivo; (v) una muestra que se sabe que no contiene DV, como control negativo; (vi) una muestra que se sabe que contiene DV, como control positivo; e (vii) instrucciones para uso.

Ejemplos

La presente invención se comprenderá mejor en relación con los siguientes Ejemplos. Sin embargo, se debe entender que estos ejemplos son solo para fines ilustrativos. Para aquellos expertos en la técnica serán evidentes varios cambios y modificaciones de las realizaciones divulgadas y dichos cambios y modificaciones que incluyen, sin limitación, aquellos relacionados con las formulaciones y/o métodos de la invención.

Ejemplo 1: Predicción de la estructura del complejo proteína-proteína al analizar las características fisicoquímicas de la interacción

Los estudios en este Ejemplo ilustran el desarrollo y uso de características fisicoquímicas clave para modelar una interacción proteína-proteína (por ejemplo, antígeno-anticuerpo). El análisis en este Ejemplo ayuda a distinguir estructuras similares nativas precisas para una interacción antígeno-anticuerpo de estructuras inexactas y, por lo tanto, ayuda a superar las limitaciones de utilizar solo funciones energéticas para clasificar poses, como se realiza en el modelado de la interacción proteína-proteína utilizando modelos de acoplamiento computacional. Adicionalmente, el hecho de no identificar la pose nativa de nueve casos de prueba analizados en este Ejemplo, destaca las limitaciones del algoritmo de búsqueda actual y los desafíos asociados con el diseño de mutaciones mejoradoras de la afinidad para complejos antígeno-anticuerpo.

Para capturar tantas propiedades geométricas y químicas que forman la base de un reconocimiento molecular, se utilizaron trece características de nivel atómico: siete químicas y seis físicas (Tabla 1) para describir una interfaz antígeno-anticuerpo. Adicionalmente, se ensambló un conjunto de datos que comprende 77 estructuras 3D no redundantes de complejos antígeno-anticuerpo (véase sección de Métodos) y se dividió en dos partes, un conjunto de entrenamiento que consta de 40 estructuras y un conjunto de prueba que consta de las 37 estructuras restantes. De acuerdo con cada estructura, se construyeron 100 modelos señuelo utilizando acoplamiento computacional (véase sección de Métodos), lo que arrojó un total de 7,777 estructuras (7,700 señuelo 77 rayos X). En la fase de entrenamiento, se utilizó el análisis de regresión logística multivariante (MLR) para determinar la relación entre cada característica (variable explicativa) y el grado en que puede discriminar con éxito las poses de rayos X frente a las poses de señuelo (variable de resultado). Este análisis ayudó a lograr un subconjunto de todas las variables explicativas que se podrían combinar para predecir el valor de la variable de resultado. Las características de entrada generadas a partir de cada archivo PDB (y sus señuelos) se representaron como puntuaciones Z estandarizadas para evitar el aprendizaje no uniforme, lo que puede conducir a una estimación excesiva (o baja) de la importancia. Para la fase de predicción, se emplearon las características significativas precalculadas para predecir la probabilidad de que una estructura en el conjunto de datos de prueba sea de tipo nativo.

Los resultados del análisis MLR sugirieron que el dominio relativo de las características individuales que afectan la probabilidad de discriminar con precisión las estructuras nativas frente a las estructuras señuelo fue del orden de ZEPII > enlaces H de cadena principal-cadena principal > densidad de enlaces H > porcentaje de grupos cargados > densidad de interacciones catión-pi > área de superficie enterrada > porcentaje de grupos polares neutros > densidad de enlaces iónicos. Se encontró que cada una de las características anteriores era significativa a un nivel alfa de 0.05. Con base en los coeficientes de regresión logística, los enlaces H y la densidad de enlaces iónicos, los enlaces H de cadena principal-cadena principal y el área de superficie enterrada parecen estar sobreestimados en los modelos acoplados. Esto se anticipa ya que el aumento de los valores de las características anteriores tiende a maximizar la función de puntuación. Por el contrario, ZEPII, interacciones catión-pi, porcentaje de grupos polares cargados y neutros parecen estar infrarrepresentados en los modelos acoplados. Las interacciones catión-pi, el porcentaje de grupos polares cargados y neutros no contribuyen significativamente a la función de puntuación de energía; por lo tanto, estas características no se optimizaron en las interfaces acopladas. Adicionalmente, la evaluación de modelos acoplados muestra que el procedimiento de acoplamiento no recapitula fielmente las interacciones por pares comunes a los complejos antígeno-anticuerpo disociables; por lo tanto, se encontró que las interfaces simuladas tenían valores bajos de ZEPII.

A continuación, se utilizó MLR para predecir estructuras de rayos X de 37 interacciones antígeno-anticuerpo en el conjunto de datos de prueba utilizando las características significativas precalculadas, y luego se comparó la sensibilidad de la predicción basada en MLR con aquella de la función de energía de ZRAN^k, utilizada en modelos acoplados (véase sección de Métodos). En general, se mostró que MLR es mejor para predecir estructuras de rayos X que la función de energía de ZRANK (Figura 1), lo que sugiere que el enfoque de MLR produjo mejoras sobre ZRANK en la predicción de poses de unión de tipo nativo. Un examen más detenido de los modelos señuelo, sus puntuaciones ZRANK y las probabilidades de predicción basadas en MLR revelaron conocimientos interesantes (Figura 2). ZDOCK identificó estructuras de tipo nativo para 29 de las 37 estructuras, lo que indica que los algoritmos de búsqueda computacional son muy precisos. Sin embargo, (1) la puntuación ZRANK varió significativamente incluso entre poses estructuralmente similares (Figura 2A); (2) estructuras muy diferentes podrían recibir aproximadamente la misma puntuación, lo que dificulta la discriminación entre soluciones precisas e inexactas (Figura 2A); (3) las soluciones peores e inexactas a menudo recibieron una mejor puntuación que las estructuras de tipo nativo (Figura 2A); (4) mientras que la probabilidad de predicción basada en MLR también varió entre poses estructuralmente similares, las poses no nativas rara vez recibieron una alta probabilidad de predicción, lo que indica que la probabilidad de una predicción de estructura falsa positiva era menor cuando las poses se clasificaban de acuerdo con la probabilidad de predicción. En consecuencia, se observó que la probabilidad de predicción se correlaciona mejor con RMSD en comparación con la puntuación ZRANK (Figuras 2B y 2C).

Ejemplo 2: Uso de características fisicoquímicas para la predicción de mutaciones mejoradoras de afinidad

Los estudios en este Ejemplo muestran el desarrollo de un esquema de puntuación para diseñar mutaciones mejoradoras de la afinidad para interacciones proteína-proteína (por ejemplo, antígeno-anticuerpo).

Específicamente, este Ejemplo describe un modelo matemático desarrollado para cuantificar las propensiones de interacciones de aminoácidos por pares (véase sección de Métodos). Estas propensiones estadísticas se formularon como una matriz de interacción que asigna un peso a cada posible par de aminoácidos. La aptitud de un residuo en una posición de CDR, también llamada aptitud de la interfaz de aminoácidos (AIF), era la propensión combinada de todos los contactos por pares entre proteínas (definidos como dos aminoácidos dentro de una cierta distancia entre sí) que implican ese residuo. Las sustituciones que conducen a una mejora en el valor de AIF sin consecuencias estructurales se consideraron candidatas para la mejora de la afinidad. Las propensiones se determinaron utilizando estadísticas sobre contactos de aminoácidos en una base de datos de estructuras de proteínas conocidas (véase sección de Métodos). Evitar los cortes de distancia múltiples y las etapas de minimización de energía eliminó las dependencias pesadas de las coordenadas atómicas.

De acuerdo con las observaciones realizadas por estudios previos, los datos de propensión mostraron el predominio de tirosina, triptófano, serina y fenilalanina sobre otros residuos en el parátopo (Tabla 2). La métrica AIF se utilizó luego para predecir mutaciones de anticuerpos que mejoran la afinidad en tres sistemas diferentes para los cuales los datos publicados validaron las predicciones. Uno de los casos de prueba fue el fármaco de anticuerpo anti-EGFR cetuximab (Erbitux), en el que se diseñó una mejora de la afinidad de 10 veces hasta 52 pM mediante tres mutaciones en la cadena ligera. Se mostró que dos de estas mutaciones predichas, S26D y T31E, mejoran la afinidad de unión como mutaciones únicas en cetuximab y una inspección más cercana de la tercera mutación (N93A) reveló que Ala se encuentra entre un conjunto de residuos con propensiones de contacto débiles en general. Otro caso de prueba fue el anticuerpo modelo anti-lisozima D44.1, donde se predijo que dieciocho mutaciones serían adecuadas para la mejora de la afinidad. Cuatro de las mutaciones predichas en la cadena pesada, T28D, T58D, E35S, G99D, eran parte de una variante de alta afinidad publicada de D44.1. Otro caso de prueba fue el anticuerpo E2 que se dirige a la serina proteasa asociada al cáncer MTSP1. La métrica AIF predijo ocho mutaciones que incluían T98R, lo que confirma un estudio previo de mejora de la afinidad in silico, que había identificado una única mutación T98R para mejorar la afinidad del anticuerpo 14 veces hasta 340 pM.

Ejemplo 3: Diseño de mutaciones mejoradoras de afinidad en el anticuerpo del Dengue

El análisis en este Ejemplo ilustra que un anticuerpo anti-DV que se une solo a ciertos serotipos de DV puede modificarse mediante ingeniería de modo que se genere una variante que neutralice de forma potente la actividad de los cuatro serotipos de DV. Específicamente, los estudios en este ejemplo muestran que las mutaciones diseñadas racionalmente en un mAb 4E11 de Dengue aumentan su afinidad por el serotipo 4 de DV (DV4) y no afectan significativamente de forma perjudicial su unión a los serotipos 1-3 de Dv (DV1-3).

Los perfiles de actividad de unión y neutralización del mAb 4E11 muestran alta afinidad y potencia inhibidora por DV1-3, pero baja afinidad y actividad neutralizante por DV4 (Figura 3). Para diseñar 4E11 para una potente actividad de neutralización de los cuatro serotipos, el enfoque de diseño (Figura 4) se basó en tres factores importantes: (1) para generar un modelo preciso de la interacción 4E11-EDIII, (2) para comprender los elementos estructurales específicos del serotipo y recapturar los determinantes de afinidad y especificidad, y (3) diseñar sustituciones que confieran una interacción favorable y, por tanto, una afinidad mejorada con DV4.

En ausencia de la estructura cristalina del anticuerpo, se construyó un modelo estructural de la región Fv y el Fv modelado se acopló contra EDIII de DV1 utilizando el software ZDOCK, y los datos funcionales publicados previamente sobre el epítopo y el parátopo CDR H3 (Watanabe et al., 2012 Trends in Microbiology 20: 11-20) se incluyeron como residuos específicos en la interfaz de unión para garantizar que las poses acopladas no se desviaran significativamente del complejo nativo (véase sección de Métodos). Se ejecutó ZDOCK cinco veces con diferentes combinaciones de residuos de la interfaz de entrada y el mejor modelo de clasificación de cada ejecución (Figura 5) se reclasificó utilizando probabilidades MLR (Tabla 3). El modelo superior predicho por el enfoque MLR no coincidió con la predicción del método ZRANK.

El modelo superior predicho por el enfoque MLR se validó mediante la comparación realizada entre los puntos calientes de parátopo predichos computacionalmente por el servidor web ANCHOR [Dosztanyi et al., 2009 Bioinformatics 25: 2745-2746] y los puntos calientes determinados experimentalmente mediante exploración de Ala de cada posición en todos los bucles CDR de 4E11 con evaluación de unión mediante ELISA ED-III (DV1) indirecto. La predicción de puntos calientes del modelo seleccionado identificó correctamente el 61% de los puntos calientes determinados experimentalmente, mientras que las poses restantes tenían precisiones de predicción de puntos calientes de < 45% (rango 28-44%), lo que indica que la pose seleccionada probablemente refleje la verdadera configuración de unión de 4E11/ED-III.

Se utilizó el modelo superior 4E11-ED-III (DV1) para guiar el modelado de la interacción entre 4E11 y una cepa EDIII representativa de cada uno de los otros tres serotipos (véase sección de Métodos). Utilizando los cuatro modelos estructurales, se examinó el modo de unión del anticuerpo a cada uno de los serotipos y se identificó la base molecular de la escasa afinidad hacia el serotipo DV4 utilizando una combinación de secuencia y análisis estructural a nivel de dominio ED-III. El análisis reveló múltiples diferencias de aminoácidos dentro y alrededor de la interfaz de unión de 4E11 entre DV4 y otros serotipos. En particular, la orientación de la cadena A (residuos 305-308) con respecto a las herA p vecinas fue diferente en DV4 debido a una diferencia localizada en la posición 307 (Figura 6). De acuerdo con la baja afinidad y la potencia neutralizante de DV4, la interfaz 4E11-EDIII (DV4) poseía BSA más pequeña, menos enlaces H y contactos de puente de sal.

A continuación, se aplicó el índice AIF para diseñar mutaciones que mejoran la afinidad por la unión de DV4. Esto dio como resultado un conjunto de 87 mutaciones que abarcan 23 posiciones de CDR. Las mutaciones predichas incluían aminoácidos de todo tipo. La elección de los reemplazos de aminoácidos no siempre fue intuitiva (por ejemplo, si la región del epítopo que rodea una posición de ^cD^rparátopo estaba cargada negativamente, Arg y Lys no siempre se favorecieron estadísticamente en esa posición de CDR). Si bien se favorecieron los residuos que mejoran la energía, la ganancia de afinidad podría ocurrir a través de mejoras en la complementariedad electrostática, el empaquetamiento y el área superficial hidrófoba. Se hizo un esfuerzo consciente en el diseño de mutaciones mejoradotas de la afinidad en las posiciones CDR próximas a los residuos específicos del serotipo DV4 (Figura 6). Se dio mayor preferencia a las mutaciones que tenían potencial para mejorar la afinidad de DV4 sin ser perjudiciales para otros serotipos. En un esfuerzo por aprender sobre los efectos de las mutaciones puntuales sobre la afinidad de unión, los mutantes no se limitaron a los residuos con las mayores probabilidades de éxito.

Ejemplo 4: Caracterización experimental de anticuerpos de Dengue diseñados por ingeniería

Los experimentos de este Ejemplo aclaran que las mutaciones dirigidas a un sitio diseñadas por ingeniería específica en un anticuerpo aumentan su afinidad y/o potencia por EDIII de DV4 sin, o con sólo una reducción mínima de la afinidad y/o potencia de unión a EDIII de DV1-3. Los experimentos de este ejemplo también demuestran que las propiedades de unión de los anticuerpos modificados genéticamente también pueden cuantificarse con precisión. Más aún los experimentos en este estudio muestran además que un anticuerpo de Dengue diseñado por ingeniería diseñado al combinar mutaciones únicas exitosas específicas da como resultado un aumento máximo en la afinidad del anticuerpo. Adicionalmente, los experimentos en este Ejemplo confirman que los anticuerpos diseñados por ingeniería diseñados en este estudio no solo exhiben una fuerte actividad inhibidora de los cuatro serotipos de DV, sino que también tienen una potente actividad antiviral in vivo.

Se seleccionaron un total de 87 mutaciones para pruebas experimentales mediante ELISA indirecto utilizando EDIII recombinante purificado de DV1-4 como antígeno recubierto. Los mutantes se generaron mediante mutagénesis dirigida al sitio, se confirmó la secuencia y se expresaron a partir de células 293 mediante transfección transitoria. Se identificaron diez mutaciones con afinidad mejorada por EDIII-DV4 con reducción mínima o nula en la unión a EDIII de DVI-3 (Tabla 3). Estas 10 mutaciones abarcaron cinco posiciones de CDR, con cuatro en VL (R31, N57, E59 y S60) y una en VH (A55). Ocho de las 10 mutaciones estaban en VL, y 7 estaban solo en L2. Las mutaciones exitosas fueron en su mayoría cargadas o de naturaleza polar, y se encontró que residían en la periferia del área de la interfaz del anticuerpo-antígeno (Figura 7). El análisis estructural mostró que las cadenas laterales mutantes crearon contactos con residuos de epítopo altamente conservados, lo que sugiere por qué no eran perjudiciales para la unión de DV 1-3 (Figura 6 y Tabla 5).

Para una cuantificación más precisa de las propiedades de unión de estos 10 mutantes únicos discutidos anteriormente, se realizaron experimentos de ELISA de competición para determinar las afinidades en equilibrio y en solución. La Tabla 6 describe los resultados de afinidad de cinco anticuerpos mutantes únicos, que representan aquellas mutaciones que demostraron el mayor aumento de afinidad por EDIII-DV4 mientras mantenían la afinidad por EDIII de DV1-3. El grado de mejora de la afinidad de DV4 varió entre 1.1 veces (VL-R31K) y 9.2 veces (VH-A55E). Sorprendentemente, dos mutaciones conferían una mayor afinidad por otros serotipos; VH-A55E dio como resultado un aumento de afinidad de 16 y 7 veces a ED-III-DV2 y ED-III-DV3, respectivamente, mientras que VL-N57E demostró un aumento de afinidad de 3 veces a ED-III-DV2. Solo tres de las 15 afinidades medidas por los serotipos 1-3 (con los cinco anticuerpos mutantes únicos) mostraron una disminución mayor a 2 veces, y solo una afinidad anticuerpo-EDIII (VL-E59Q para EDIII-DV3) resultó en más de una disminución de 3 veces la afinidad. Estructuralmente, las cinco posiciones de mejora de la afinidad se mapean a regiones espacialmente distintas del parátopo (Figura 7), lo que sugiere que se podría lograr una mejora adicional al combinar mutaciones únicas exitosas. Se probaron múltiples combinaciones de tres, cuatro y cinco mutantes, y un anticuerpo mutante quíntuplo, denominado 4E5A, mostró el mayor aumento de afinidad. Sorprendentemente, 4E5A estaba compuesto por cinco sustituciones que representan el cambio de aminoácido en cada posición que confiere la mayor mejora de afinidad a EDIII-DV4 como mutante único. En comparación con el mAb original, 4E5A mostró una mejora de 450 veces la afinidad por EDIII-DV4 (Kd = 91 nM) mientras mantenía la afinidad por EDIII de DV1 y DV3 y un aumento de afinidad de 15 veces por DV2 (Tabla 7 y Tabla 8). Significativamente, estos resultados ilustraron que la afinidad de un anticuerpo podría incrementarse de una afinidad micromolar a casi nanomolar. Se utilizó Resonancia de Plasmón de Superficie (SPR) para verificar las medidas de afinidad, así como para obtener los parámetros de unión cinética (Tabla 9 y Figura 8). Los valores de afinidad de SPR coincidieron cuantitativamente con los obtenidos por ELISA de competición, con la excepción de que no se pudo detectar la unión específica de 4E11 WT a EDIII-DV4, lo que indica una afinidad muy baja, que coincidía en general con los resultados de ELISA de competición (Kd = 41 pM). Para determinar si el aumento de la afinidad de 4E5A por EDIII-DV4 se traducía en una actividad mejorada, se utilizó un ensayo de prueba de neutralización de reducción de enfoque (FRNT). En comparación con 4E11 wt, 4E5A mostró un aumento > 75 veces en la potencia neutralizante hacia DV4, y mantuvo la potencia frente a DV1-3 (Figura 9). 4E5A mostró una fuerte actividad inhibidora de los cuatro serotipos, con valores de FRNT50 de 0.19, 0.028, 0.77 y 4.0 pg/ml para DV1-4, respectivamente. Para dilucidar aún más la actividad de 4E5A, se evaluó el anticuerpo en un modelo de ratón AG129 de exposición a DV2, que muestra el pico de viremia en el día 3 después de la infección. Tanto a 1 mg/kg como a 5 mg/kg, 4E5A demostró una reducción significativa de la viremia, con un tratamiento de 5 mg/kg que dio como resultado niveles de título de virus por debajo del límite de detección (Figura 10). En conjunto, estos resultados mostraron que el mAb 4E5A modificado presentaba una fuerte actividad inhibidora de los cuatro serotipos de DV y tenía una potente actividad antiviral in vivo.

Los anticuerpos modificados genéticamente que se pueden diseñar en base a este estudio (por ejemplo, 4E5A) representan importantes candidatos a fármacos y, adicionalmente, se pueden utilizar para rondas adicionales de maduración por afinidad y humanización como se conoce en la técnica. La estructura cristalina del complejo 4E11/ED-NI se publicó antes de la presentación de la presente solicitud de patente, lo que permitió comparar el modelo estructural discutido en este estudio con la estructura compleja publicada y, de hecho, una excelente correspondencia entre las dos estructuras con C-alfa. Se observó un valor de RMSd de 1.4 ángstrom, lo que confirma adicionalmente la importancia de este estudio.

Discusión

Los enfoques tradicionales para descubrir anticuerpos de interés terapéutico se basan en métodos experimentales tales como técnicas de presentación de fagos. Sin embargo, estos enfoques son costosos, técnicamente desafiantes y requieren mucho tiempo. Por ejemplo, el mAb de la influenza FI6, que neutraliza los virus de clado 1 y 2, se identificó mediante el cribado de 104,000 células B. Una estrategia alternativa sería modificar las propiedades de un anticuerpo existente mediante ingeniería racional. En este estudio, se presentaron métodos computacionales para el modelado ab initio y el rediseño de anticuerpos. En las ejecuciones de prueba, la sensibilidad del método de predicción MLR en la selección de estructuras de rayos X (de varios modelos de señuelos) pareció superior a ZRANK. Adicionalmente, se demostró que la métrica AIF podría capturar mutaciones conocidas que mejoran la afinidad en múltiples sistemas. Este marco se aplicó luego para diseñar una especificidad y afinidad más amplias para un mAb neutralizante anti-dengue. Los resultados obtenidos por este estudio fueron importantes porque: (1) sólo unos pocos estudios han intentado mejorar la reactividad cruzada de un anticuerpo; (2) este es el primer estudio que ha empleado un enfoque empírico hacia el rediseño de anticuerpos y la mejora de la afinidad; y (3) se predijeron mutaciones mejoradotas de la afinidad sin la estructura cristalina del complejo anticuerpo-antígeno (también conocida como predicción ciega). Este estudio mostró por primera vez que la aplicación de un enfoque computacional condujo mejora de ~400 veces en la afinidad de un anticuerpo (Tabla 10). Dada la simplicidad de estos métodos computacionales, podrían emplearse ampliamente para la ingeniería de anticuerpos y, a diferencia de los enfoques energéticos basados en la física, no se ven afectados por la ubicación precisa de las coordenadas del átomo de la estructura inicial.

La solución de acoplamiento superior de ZRANK era estructuralmente muy diferente de la estructura nativa, lo que indica que cualquier esfuerzo de mejora de la afinidad siguiendo el modelo ZRANK superior no habría conducido a resultados fructíferos. Las mutaciones mejoradoras de afinidad también se predijeron utilizando la estructura de rayos X mediante un enfoque energético y los resultados destacaron los desafíos en la discriminación de mutaciones estabilizadoras y neutrales (Tabla 11). Más significativamente, las mutaciones mejoradoras de afinidad N57E, N57S y E59N se clasificaron como desestabilizadoras (Tabla 11). Dado que ZRANK se utiliza ampliamente y ha mostrado un éxito considerable en los experimentos CAPRI, el método presentado en este estudio funcionaría comparativamente bien cuando se compara con otros algoritmos de acoplamiento. El hecho de que ZEPII apareciera de manera significativa, indicó que la composición de aminoácidos y los contactos entre residuos contenían poder discriminatorio. Curiosamente, algunas características geométricas también tienen el poder predictivo de discriminar interfaces nativas de señuelos. Esto se correlacionó con la observación realizada por estudios previos de que las interfaces antígeno-anticuerpo eran más planas y significativamente bien ordenadas o empacadas. Entre las diferentes combinaciones de residuos de interfaz que se utilizaron para generar los cinco modelos diferentes, el modelo exacto se produjo al utilizar todos los residuos de interfaz de epítopo y parátopo conocidos, ya que agregar más contexto redujo el espacio de búsqueda y, por lo tanto, aumentó las posibilidades de encontrar una estructura casi compleja nativa.

Los métodos de presentación de fagos y evolución dirigida aleatorizaron bucles de CDR seleccionados, especialmente bucles de VH-CDR, ya que representaban la mayoría de los contactos estabilizadores. Los resultados del 4E11 mostraron que las estrategias de diversificación deben utilizar un enfoque racional e involucrar bucles VL para una diversificación específica. La observación de que las mutaciones mejoradoras de afinidad eran principalmente de naturaleza polar y estaban presentes en la periferia de la interfaz de unión era coherente con los datos conocidos. Es probable que estas mutaciones aumentaran la tasa de asociación al aumentar la eficiencia de la colisión. La tasa de éxito en la predicción de mutaciones con actividades dirigidas es del 12% (10/87). Estos resultados fueron alentadores dada la complejidad del problema de diseño (es decir, la participación de múltiples antígenos) y considerando que las mutaciones aleatorias tendrían en promedio un efecto perjudicial sobre la afinidad de unión.

Los estudios han mostrado que la estirpe germinal de murino alberga segmentos de genes con una capacidad inherente de unión de alta afinidad al dominio EDIII (Ref 24, 32). A pesar del efecto beneficioso de las 5 mutaciones, estas mutaciones no han coevolucionado in vivo. El análisis a nivel de codón mostró que los reemplazos de aminoácidos en N57E y S60W requerían al menos dos cambios de base que resaltan las limitaciones a nivel genómico. Estudios previos han mostrado que los epítopos reconocidos por los anticuerpos anti-DV caen en tres regiones diferentes: (1) epítopo de cresta lateral sobre ED-III (potentes neutralizadores específicos de serotipo); (2) cadena A de DIII (neutralizadores específicos de subcomplejos); y (3) otros epítopos DII y DIII (neutralizadores moderadamente potentes de reacción cruzada de flavivirus específicos del complejo). En este estudio, se demostró por primera vez que el anticuerpo contra el epítopo de la cadena A se podría modificar para unirse a los cuatro serotipos con una buena potencia in vitro. En conjunto, 4E5A exhibió un interesante perfil de neutralización de amplio espectro y sería un anticuerpo de interés para el desarrollo terapéutico potencial para el tratamiento de la enfermedad del Dengue. Las terapias de mAb contra el DV en humanos podrían enfrentar obstáculos regulatorios debido a la mejora dependiente de anticuerpos. Sin embargo, estudios recientes han mostrado que las modificaciones en la región Fc de los anticuerpos anti-DV recombinantes previenen el ADE in vivo, presentando de esta manera oportunidades para estos enfoques complementarios más nuevos. El grado de conservación del epítopo de mAb puede ser un factor significativo para determinar el espectro de neutralización y la protección in vivo. El análisis filogenético de los virus DV4 ha revelado la existencia de cuatro genotipos distintos: I (Sudeste de Asia), II (Indonesia), III y IV (Sylvatic o Malasia). Dentro del genotipo II, los virus se agrupan en dos clados distintos previamente definidos como IIa y IIb. El análisis de secuencia de la región del epítopo de 4E11-5A reveló un alto grado de conservación en los genotipos IIa, IIb y 4, mientras que una conservación relativamente menor en el genotipo I, lo que sugiere a los presentes inventores que el anticuerpo modificado probablemente sería eficaz contra la mayoría de los virus DV4.

Tabla 1. Descripción de las características fisicoquímicas.

Tabla 2. La matriz de propensidad de aminoácido 20X20. Los aminoácidos del parátopo se indican sobre el lado izquierdo y los aminoácidos del epítopo se indican sobre el lado superior. Los datos de propensidad se generaron utilizando 77 complejos de antígeno-anticuerpo no redundantes

Tabla 4. Mutaciones que condujeron a un aumento de la afinidad de EDMI-DV4 manteniendo la afinidad de EDIII-DV1-3 ori inal.

Tabla 5 Contactos realizados or mutaciones meoradoras de afinidad

Tabla 6. Afinidades de anticuerpo de mutante único con afinidad de EDIII-DV4 aumentada y afinidades de EDIII-DV1-3 con relación a 4E11 WT. Las mutaciones incluidas son aquellas que para cada posición identificada, demuestran afinidad de EDIII-DV4 mayor mientras que aproximadamente mantienen afinidad EDIII-DV1-3. Los valores Kd representan el promedio de al menos dos experimentos independientes

Tabla 7. Afinidad de la combinación mutante 4E11-5A.

Tabla 8. Los cálculos energéticos de 4E5A que muestran mutaciones tienen un efecto aditivo sobre la energía de enlace.

Tabla 10. Com aración de los resultados de varios estudios de meora de la afinidad de anticuer os^ in silico.

Tabla 11. Mutaciones de anticuerpos predichas usando un enfoque energético Las mutaciones que aumentan la afinidad de 4E11 están sombreadas.

continuación

Métodos

Un modelo matemático para estimar las propensiones de contacto de los aminoácidos en la interfaz antígenoanticuerpo

Brevemente, en una interfaz antígeno-anticuerpo, presumiblemente un par de residuos interaccionan si tuvieran energías de interacción favorables o por casualidad. La propensión a la interacción de aminoácidos se calculó al computar el número de interacciones esperadas por azar, es decir, la frecuencia esperada, y dividir la frecuencia observada por este número.

Si dos aminoácidos, uno de cada lado de la interfaz antígeno-anticuerpo, estaban dentro de 4.5 A (es decir, la distancia más corta que no es del átomo de H es menor de 4.5 A) entre sí, se definieron como pares de residuos. Si el número total de interacciones por pares entre los residuos x (antígeno) e y (anticuerpo) en la interfaz era N (x, y), entonces su frecuencia de concurrencia, F (x, y), se definió de la siguiente manera:

El denominador de la ecuación anterior indica la suma de las interacciones por pares de todos los pares de residuos en la interfaz.

Se debe calcular la frecuencia de aparición de cada aminoácido en el parátopo y el epítopo. La frecuencia de un aminoácido x particular en el epítopo, Fepítop°(x), se definió como sigue:

pepítopo (x ) N (x )

W W )

En la ecuación anterior, N (x) denota el recuento de aminoácidos x en el epítopo. El denominador representa el número total de todos los aminoácidos en los epítopos.

De manera similar, la frecuencia de aparición del aminoácido y en el parátopo, Fparátop°(y), se definió como sigue:

_ppsrstopo (y) _ N{y)

2 & N ( i )

En la ecuación anterior, N (y) denota el número de aminoácidos y en el parátopo. El denominador indica el número total de todos los aminoácidos en los parátopos.

Los parámetros F (x,y), Fepítopo(x) y Fparátop°(y) se determinaron utilizando las setenta y siete estructuras de antígenoanticuerpo comparadas en el conjunto de datos. De acuerdo con las observaciones realizadas en estudios anteriores, la tirosina, serina, glicina y asparagina fueron los residuos de parátopo más abundantes, mientras que la lisina, la arginina, la leucina y la glicina fueron los residuos de epítopo más abundantes (Figura 11). Si las apariciones de los aminoácidos x y y fueran independientes, EFep't°p°■pa^at°p°(x,y) definido en la siguiente ecuación era una tasa de frecuencia esperada en la que los aminoácidos x y y aparecen al mismo tiempo.

V. F(X, ^{y ) =} f^topo [x )p^topo^

Si la tasa de concurrencia de los aminoácidos x y y en la interfaz para el antígeno fue mayor que la tasa esperada, la siguiente razón RAa(x,y) se vuelve mayor que 1.

^F ( * , y )

RA (x, y)

E F (x ,y )

Los RAs(x,y) eran una matriz de 20X20. A continuación se sugieren aplicaciones de ejemplo de RAs(x,y).

Se utiliza RA(x y) para determinar el AIF de un residuo de CDR. El AIF de un residuo de CDR en la interfaz se definió como la suma del RA(x,y) con sus vecinos. Los vecinos se definieron mediante un criterio de distancia (4.5 A).

Se determina la elección óptima de aminoácidos en una posición de interfaz (reingeniería de parátopos). Dado un complejo de antígeno-anticuerpos, se computaron las preferencias de aminoácidos en una posición de CDR utilizando la puntuación de potencial de contacto. Específicamente, en una posición de CDR dada, el residuo de tipo silvestre (WT) se sustituyó sistemáticamente por los aminoácidos restantes, excluyendo la glicina y prolina (para evitar alteraciones de la conformación de la estructura principal) y se evaluó la probabilidad de reemplazo en cada instancia utilizando la métrica AIF. Las mutaciones individuales con un potencial de reemplazo mayor que el residuo de tipo silvestre se reevaluaron computacionalmente para encontrar mutaciones que: (a) no entierran grupos polares y (b) no causan impedimento estérico.

Se utiliza RA(x, y) para cuantificar la fuerza de interacción de la interfaz antígeno-anticuerpo (el Índice de Interfaz Epítopo-Parátopo). La interacción entre un antígeno y un anticuerpo resulta de la formación de numerosos enlaces no covalentes. Por lo tanto, la afinidad de interacción se relacionó directamente con la suma de las fuerzas atractivas y repulsivas (interacciones de van der Waals, enlaces de hidrógeno, puentes salinos y fuerza hidrófoba). En el presente documento, se investigó cuantitativamente la fuerza de interacción de una interfaz anticuerpo-antígeno mediante una combinación lineal de RAs para todas las combinaciones de pares de aminoácidos. Un índice que expresa la fuerza de una interfaz 'i' de antígeno-anticuerpo (llamado Índice de Interfaz Epítopo-Parátopo (EPII)) se definió mediante:

En la ecuación anterior Fi(x,y) denota la frecuencia de concurrencia de aminoácidos x (x pertenece a grupos estructurales secundarios) y y en la interfaz i.

Se utiliza EPII para discriminar una verdadera interacción antígeno-anticuerpo de los señuelos de acoplamiento. Para distinguir una interfaz con el mayor potencial de otras interfaces señuelo generadas por acoplamiento computacional, los valores de EPII deben ser normalizados por todas las interfaces en la proteína. Se utilizaron EPII con puntuación Z para este propósito. Si se encontraron interfaces M en una proteína, la EPII con puntuación Z para la interfaz i se calculó de la siguiente manera:

, donde

La puntuación Z^epiiíera un indicador de la probabilidad de unión del anticuerpo a una interfaz determinada. La interfaz con la puntuación Zepiií más alta (o con Zepiií por encima del valor de consenso establecido para la interacción antígeno-anticuerpo (discutida anteriormente)) en una proteína fue el sitio más probable para la unión del anticuerpo.

Conjunto de datos de complejos estructurales antígeno-anticuerpo no redundantes y acoplamiento computacional para generar modelos señuelo

Se analizaron un total de 568 complejos antígeno-anticuerpo del Protein Data Bank. Con el fin de garantizar la enumeración adecuada de las características de la interfaz geométrica (planaridad, área superficial enterrada, etc.), se excluyeron las estructuras en las que la longitud del antígeno era inferior a 20 aminoácidos. Adicionalmente, muchas estructuras contenían antígenos iguales o similares, lo que podría sesgar los estudios, dando mayor peso a los factores derivados de antígenos proteicos representados de forma múltiple. Para eliminar las estructuras redundantes del conjunto de datos, las estructuras que tienen antígeno homólogo (definido por BLAST ENREF_40 valor P 10e27) y comparten 50% de residuos de epítopo se clasificaron en el mismo grupo y la estructura con la resolución más alta se seleccionó como representante. Esto condujo a setenta y siete estructuras complejas antígeno-anticuerpo no redundantes.

Se utilizó ZDOCK para generar modelos computacionales señuelo de interacción antígeno-anticuerpo. El protocolo para generar los modelos señuelos fue el mismo para los setenta y siete complejos estructurales. Solo se utilizó el dominio variable del anticuerpo para el acoplamiento. La más grande de las dos moléculas se consideró el receptor, mientras que la molécula más pequeña se consideró el ligando. La orientación del ligando se rotó 6 grados en cada etapa para muestrear las diversas conformaciones. Dado que el procedimiento de acoplamiento inicial explora un área relativamente grande, se establecieron restricciones de distancia entre los residuos putativos de puntos calientes sobre el epítopo y el parátopo para garantizar que los modelos generados no cambiaran significativamente de la pose nativa. Se seleccionaron dos residuos de puntos calientes a cada lado para garantizar que los desafíos enfrentados con la predicción de la estructura fueran equivalentes al escenario 4E11. En todos los modelos de señuelos, el epítopo putativo y los puntos calientes del parátopo estaban a 10 ángstrom entre sí. Los puntos calientes se identificaron mediante el servidor web ANCHOR. El procedimiento de acoplamiento inicial generó 2,000 poses que luego se agruparon en función de una matriz RMSD de todos contra todos, descrita anteriormente. La RMSD entre dos poses acopladas se calculó basándose en los residuos de ligando dentro de los 7 ángstrom de la interfaz de unión. Las poses de proteínas acopladas que representan los centros de los grupos se consideraron modelos señuelo. ZDOCK utiliza la complementariedad de formas junto con términos de desolvatación y energía electrostática ('ZRANK') para clasificar las poses acopladas. Cada uno de estos señuelos se refinó aún más utilizando la minimización de CHARMm.

Las estructuras de rayos X se combinaron con los modelos señuelo para evaluar la sensibilidad de los métodos de predicción.

Modelado de homología de 4E11 Fv

El modelo estructural de 4E11 Fv se construyó utilizando el servidor de modelado de homología SIWW-MODEL. Los estudios indicaron que la precisión general del modelado de la CDR hipervariable era apropiada cuando (1) el grado de similitud de secuencia entre la diana y la plantilla era alto, (2) las conformaciones de la cadena principal de los bucles de CDR L1, L2, L3, HI, H2 siguen la “estructura canónica” y (3) la cadena pesada CDR3 (H3) no era inusualmente larga.

Acoplamiento computacional para generar poses 4E11-EDMI (DV 1-4)

El Fv modelado se acopló contra EDIII de una cepa de DV1 seleccionada utilizando ZDOCK. Se utilizó el antígeno de DV1 porque el mAb 4E11 se aisló originalmente de un ratón infectado con un virus DV1. La estructura del antígeno de DV1 se modeló utilizando el servidor de modelado de homología SWISS MODEL manteniendo la estructura cristalina resuelta de DV1 EDIII (PDB: 3IRC) como plantilla. ZDOCK utiliza la complementariedad de forma junto con términos de desolvatación y energía electrostática ('ZRANK') para clasificar las poses acopladas. Con el fin de garantizar que las poses acopladas no se desvíen significativamente del complejo nativo, se obligó a incluir en la interfaz de unión el epítopo mapeado y los residuos de parátopo que se encuentran en la literatura. Los residuos incluidos en la interfaz fueron 307K, 389L y 391W (epítopo; numeración DV1 como en 3IRC) y 101W, 102E (parátopo; numeración basada sobre la posición de secuencia).

Las estructuras de 4E11 en complejo con DV 2, 3, 4 (EDIII) se modelaron utilizando el modelo estructural 4E11-DV1 EDIII como plantilla.

Equivalentes y alcance

Aquellos expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar utilizando únicamente experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención, descritas en el presente documento. No se pretende que el alcance de la presente invención se limite a la Descripción anterior, sino que es como se establece en las reivindicaciones adjuntas.

En las reivindicaciones, artículos tales como “un”, “una” y “el” pueden significar uno o más de uno a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto. Las afirmaciones o descripciones que incluyen “o” entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno o todos los miembros del grupo están presentes, empleados o son relevantes para un producto o proceso determinado, a menos que se indique lo contrario o de otra manera evidente por el contexto. La invención incluye realizaciones en las que exactamente un miembro del grupo está presente, empleado o de otra manera relevante para un producto o proceso dado. La invención incluye realizaciones en las que más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes, empleados o de otra manera relevantes para un producto o proceso dado. Adicionalmente, se debe entender que la invención abarca todas las variaciones, combinaciones y permutaciones en las que una o más limitaciones, elementos, cláusulas, términos descriptivos, etc., de una o más de las reivindicaciones enumeradas se introducen en otra reivindicación. Por ejemplo, cualquier reivindicación que dependa de otra reivindicación se puede modificar para incluir una o más limitaciones encontradas en cualquier otra reivindicación que dependa de la misma reivindicación base. Adicionalmente, cuando las reivindicaciones mencionan una composición, se debe entender que se incluyen métodos de uso de la composición para cualquiera de los propósitos divulgados en el presente documento, y se incluyen métodos para preparar la composición de acuerdo con cualquiera de los métodos de elaboración divulgados en el presente documento u otros métodos conocidos en la técnica, a menos que se indique lo contrario o que sea evidente para un experto en la técnica que surgiría una contradicción o inconsistencia.

Cuando los elementos se presentan como listas, por ejemplo, en formato de grupo Markush, se debe entender que cada subgrupo de los elementos también se divulga, y cualquier elemento (s) puede eliminarse del grupo. Se debe

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un agente de anticuerpo específico al virus de Dengue, en el que el agente de anticuerpo se une a y neutraliza cada uno de los serotipos D1, D2 ,D3 y D4 del virus de Dengue, cuyo agente de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en la que la región de marco 1 (FR1), región de marco 2 (FR2), región de marco 3 (FR3), y región de marco 4 (FR4) de cadena pesada tienen más de 90% de identidad con la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4;SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente y la FR1, FR2, FR3 y FR4 de cadena ligera tienen más de 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:11; SEQ iD NO:12 y SEQ ID NO:13 respectivamente, en la que la región variable de cadena pesada comprende una CDR1, una CDR2 y una CDR3 cuyas secuencias de aminoácidos se establecen en la SEQ iD NO.: 23, SEQ ID NO.: 24, SEQ ID NO.: 25, respectivamente y la región variable de cadena ligera comprende una CDR1, una CDR2 y una CDR3 cuyas secuencias de aminoácidos se establecen en la SEQ ID NO.: 26, SEQ ID NO.: 27 y SeQ ID NO.: 28, respectivamente.

2. El agente de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, que es una IgG.

3. El agente de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el agente de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo de ratón, anticuerpo humanizado y un anticuerpo quimérico.

4. El agente de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el agente de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fd, un fragmento Fd', un fragmento Fv, un fragmento scFvy un anticuerpo de cadena sencilla.

5. El agente de anticuerpo como se establece en una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en el que la FR1, FR2, FR3, y FR4 de cadena pesada tiene más de 95% de identidad con la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente y la FR1, FR2, FR3, y FR4 de cadena ligera tiene más de 95% de identidad de secuencia con la s Eq ID NO:10; SeQ ID NO:11; SEQ iD NO:12 y SEQ ID NO:13, respectivamente.

6. El agente de anticuerpo como se establece en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, cuya cadena pesada es o comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO.: 21 y cuya cadena ligera es o comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO.: 22.

7. Un kit que comprende:

al menos un agente de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1;

una jeringa, aguja, o aplicador para administración de al menos un anticuerpo o fragmento a un sujeto; e instrucciones para uso.

8. Un método para fabricar una composición farmacéutica, el método comprende las etapas de:

proporcionar un agente de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1; y

formular el agente de anticuerpo con al menos un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable,

de tal manera que se genera una composición farmacéutica.