CN104768574A - 抗登革病毒抗体和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明尤其提供结合于DV表位的抗体药剂(例如抗体和/或其抗原结合片段)以及含有其的组合物和设计、提供、调配、使用、鉴别和/或表征其的方法。在一些实施例中，所提供的抗体药剂展示出显著结合于多种DV血清型。在一些实施例中，所提供的抗体药剂展示出显著结合于所有四种DV血清型。所述抗体药剂适用于例如预防、治疗、诊断和/或研究DV。

Description

抗登革病毒抗体和其用途
相关申请案的交叉参考
本申请案根据35 U.S.C.§ 119(e)要求2012年8月7日提交的美国临时申请案第61/680,385号和2013年3月13日提交的美国临时申请案第61/780,209号的权益，所述申请案各自内容以全文引用的方式并入本文中。
政府支持
本发明在政府支持下在由美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号R37 GM057073下进行。政府拥有本发明的某些权利。
序列表
本说明书提及序列表(在2013年7月25日以电子形式作为命名为“SequenceListing.txt”的.txt文档提交)。所述.txt文档是在2013年7月22日生成的且大小是12.6kb。序列表的全部内容以引用的方式并入本文中。
背景技术
登革病毒(Dengue virus，DV)是病毒科黄病毒科(Falviviridae)的成员并通过伊蚊属(genus Aedes)内的若干种蚊子(主要是埃及伊蚊(Aedes aegypti))传播给人。全世界超过36亿人处于被DV感染的风险中，并且全球每年发生估计超过2亿DV感染(麦克布赖德(McBride)等人,2000微生物与感染(Microbes&Infection)2:1041-1050，古兹曼(Guzman)等人,2010自然评论·微生物学(Nature Rev.Microbiol.)8:S7-16)。登革热是人类最医学相关的虫媒病毒病。登革显著增加的发病率、地域拓展和疾病病例的严重度使得DV成为主要的人类病原体。令人遗憾的是，目前无可用的有效治疗方案；大部分有效的当前预防措施在于控制蚊子。
发明内容
本发明提供用于治疗和/或预防DV感染的方法和组合物。本发明尤其提供中和所有四种DV血清型的抗体药剂。在一些实施例中，所提供的抗体药剂为参考抗体4E11的变异体；在一些所述实施例中，所提供的抗体药剂具有展示出与4E11的氨基酸序列的较高总体序列一致性的氨基酸序列或其相关片段，但包括与4E11相比的特定序列变异并且与对4E11观察到的相比在中和至少一种DV血清型方面展示出显著改进。
本发明提供以下见解：参考抗体4E11具有某些所需属性，包括结合于所有四种DV血清型并且对四种DV血清型中的三种具有强力中和能力，但还缺乏有效中和第四种DV血清型的能力。本发明找到了4E11不能有效中和这第四种DV血清型的问题来源。具体来说，本发明定义了结构特征修饰，与缺乏所述修饰的4E11的能力相比，所述修饰改进序列含有所述修饰的抗体药剂中和相关DV血清型的能力。本发明因此定义并提供具有包括相关结构特征修饰的结构(但可另外与4E11的结构实质上一致)并且特征在于中和DV血清型4(DV4)的能力的抗体。在一些实施例中，所提供的抗体药剂展示中和其它三种DV血清型中的每一者的能力，所述能力与4E11的能力相比并未显著降低。实际上，在一些实施例中，所提供的抗体药剂的特征在于与在4E11下观察到的相比对于其它三种DV血清型(DV1-4)中的一或多者的中和能力的惊人的提高。
本发明提供用于定义赋予多肽以所关注的生物活性的结构修饰同时维持保留其它活性所需的结构特征的技术。
在一些实施例中，本发明提供结合于DV表位的抗体药剂以及含有其的组合物和设计、提供、调配、使用、鉴别和/或表征其的方法。在一些实施例中，所提供的抗体药剂展示显著结合于多种DV血清型。在一些实施例中，所提供的抗体药剂展示显著结合于所有四种DV血清型。所提供的抗体药剂例如适用于预防、治疗、诊断和/或研究DV。
在一些实施例中，所提供的抗体药剂与一或多种先前所述的参考抗DV抗体交叉竞争。在一些实施例中，所提供的抗体药剂结合于表位，所述表位为或包含以下各者内的氨基酸序列：SEQ ID NO.17(EDIII-DV1)、SEQ ID NO.18(EDIII-DV2)、SEQ ID NO.19(EDIII-DV3)、SEQ ID NO.20(EDIII-DV4)和/或其组合。在一些实施例中，所提供的抗体药剂不与一或多种具体先前所述的抗DV抗体显著交叉竞争。
在一些实施例中，所提供的抗体药剂在所建立的模型系统中以与一或多种先前所述的参考抗DV抗体相比更大的效力中和DV。本发明尤其涵盖以下认识：所提供的抗体药剂与先前所述的抗DV抗体相比可提供更大的治疗和/或预防益处。
所提供的抗体药剂适用于多种情形，包括例如治疗、预防、诊断和/或研究应用。在一些实施例中，所提供的抗体药剂适用于治疗慢性和/或急性DV感染，例如通过向罹患或易患所述感染的个体投与治疗有效量的一或多种所提供的所述所提供的抗体药剂来治疗。在一些实施例中，治疗有效量是足以实现一或多种具体生物作用的量，包括(但不限于)(i)在易患或罹患DV感染的个体中降低DV感染的一或多种症状或特征的严重度或频率和/或延缓DV感染的一或多种症状或特征的发作或复发；和/或(ii)在暴露于DV感染或处于暴露于DV感染风险中的个体中降低感染和/或发展DV感染的一或多种症状或特征的风险。在一些实施例中，DV感染的一或多种症状或特征为或包含高热和至少一或多种例如选自以下各者的其它症状：重度头痛；重度眼痛；关节疼痛；肌肉疼痛；骨痛；皮疹；轻度出血表现(例如鼻或牙龈出血、皮下血斑症、容易瘀伤)；腹痛；呕吐；黑色焦油状粪便；嗜眠或易怒；皮肤苍白、冷或湿冷；呼吸困难；白细胞计数低；个体或其一或多种组织(例如血液、骨髓)或器官(例如肝)中有循环病毒粒子。在一些实施例中，罹患DV感染的个体展示出高热和至少两种所述其它症状。
在一些实施例中，所提供的抗体药剂可用于预防DV感染的一或多种症状或特征、减少其复发和/或延缓其发作。在一些实施例中，所提供的抗体药剂可例如用于近期暴露于DV或处于暴露于DV风险中的个体、DV阳性母亲产下的新生婴儿和/或肝移植患者(例如预防所述患者可能的复发性DV感染)的被动免疫接种。
在一些实施例中，本发明提供病毒模拟剂，其结构包括某些DV抗原的一或多种例如足以允许病毒模拟剂模拟相关DV抗原的一或多种生物活性的保守元件。在一些实施例中，所述病毒模拟剂包括例如本文所定义的DV抗原的所述保守结构元件，并缺乏所述DV抗原的一或多种其它结构元件。在一些实施例中，所提供的病毒模拟剂为或包含一或多种多肽。在一些实施例中，所提供的病毒模拟剂多肽具有包括来自DV抗原的一或多种保守序列元件的氨基酸序列；在一些实施例中，所提供的病毒模拟剂多肽缺乏来自所述DV抗原的一或多种其它序列元件。举例来说，在一些实施例中，所提供的病毒模拟剂多肽为或包含DV抗原的片段。
在一些实施例中，本发明提供治疗的治疗性方法，在出现DV感染的一或多种症状之后使用。在一些实施例中，本发明提供预防的治疗性方法，在出现DV感染的一或多种症状之前和/或在暴露于DV、DV感染或其风险之前使用。在一些具体实施例中，本发明提供被动免疫接种技术。
在一些实施例中，本发明提供在如临床、环境和/或研究样品的样品中检测DV和/或以其它方式表征所述样品的诊断方法。
本发明提供用于设计、鉴别和/或表征适用的抗DV抗体药剂的系统。举例来说，在一些实施例中，本发明提供捕获蛋白质界面共同的具体物理化学特征的经验计算方法。在一些实施例中，所述方法允许预测蛋白质-蛋白质相互作用(例如抗原-抗体相互作用)，包括例如预测哪些氨基酸序列可能展示出特别高的相互作用亲和力。在一些实施例中，所提供的方法有效地应用于设计、鉴别和/或表征序列，所述序列不同于参考序列并在其蛋白质-蛋白质相互作用方面展示出一或多种改进的特征(例如改进的亲和力)。
本发明提供基于患者对DV的免疫反应将患者分层的系统。本发明提供用于鉴别那些很可能对DV免疫疗法良好反应的患者的方法。举例来说，患者的血清可用于测试针对DV的具体表位(例如所提供的抗体药剂特异性地与其结合的表位)的抗体的存在。如果患者不具有足够水平的针对所述表位的抗体，那么可将一或多种所提供的DV抗体药剂投与患者。患者的自身免疫反应可用所提供的DV抗体药剂补充。在一些实施例中，免疫疗法有助于清除DV病毒和/或解除DV感染。在一些实施例中，根据本发明的免疫疗法治疗和/或预防慢性DV感染。
在一些实施例中，本发明提供设计、鉴别和/或表征适用的抗体药剂的方法。举例来说，在一些实施例中，所述方法涉及确定测试抗体药剂是否与一或多种参考抗DV抗体和/或其它抗体药剂竞争抗原结合。在一些实施例中，测试抗体药剂在其与一或多种参考DV抗体交叉竞争时被鉴别为适用的抗体药剂。
在一些实施例中，所提供的抗体药剂与一或多种其它医药学上可接受的物质组合以得到医药组合物。本发明提供用于治疗、预防、诊断和/或表征DV感染的医药组合物。
在一些实施例中，医药组合物包含抗体药剂，所述抗体药剂为或包含例如体外结合于任何DV血清型并中和DV感染的人类抗体或其片段或变异体。在一些实施例中，医药组合物包含抗体药剂，所述抗体药剂为或包含例如体内结合于任何DV血清型并中和DV感染的人类抗体或其片段或变异体。在一些实施例中，所提供的抗体药剂在体外系统中所引起的DV中和与所提供的抗体药剂在体内(例如在人类和/或其它哺乳动物中)所引起的DV中和相关和/或预测此类DV中和。
在一些实施例中，所提供的抗体药剂可与一或多种其它疗法一起使用以用于对DV感染或其一或多种症状或特征进行治疗、降低其发病率、频率或严重度和/或延缓其发作。举例来说，在一些实施例中，所提供的抗体药剂与一或多种抗病毒剂、消炎剂、疼痛缓解剂、免疫调节治疗剂和组合疗法(其优选地涉及其它DV目标)一起使用。举例来说，在一些实施例中，在一些实施例中，所提供的抗体药剂与以下各者组合投与：一或多种干扰素(例如干扰素α-2b、干扰素-γ等)、镇痛剂(优选地含有对乙酰氨基酚且非阿司匹林(aspirin)和/或布洛芬(ibuprofen))、抗DV单克隆抗体、抗DV多克隆抗体、RNA聚合酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、核苷类似物、解螺旋酶抑制剂、免疫调节剂、反义化合物、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、RNA适体、核酶和其组合。
因此，在一些实施例中，本发明专门提供结合并中和登革病毒血清型D1、D2、D3和D4中的每一者的抗体药剂。在一些实施例中，抗体药剂结合于表位，所述表位为或包含以下各者内的氨基酸序列：SEQ ID NO.17(EDIII-DV1)、SEQ ID NO.18(EDIII-DV2)、SEQ ID NO.19(EDIII-DV3)、SEQ ID NO.20(EDIII-DV4)或其组合。在一些实施例中，抗体药剂在登革病毒的包膜糖蛋白的A股区中结合于表位。
在一些实施例中，表位包含一或多个对应于在SEQ ID NO.17-20中的任一者的选自由以下组成的群组的位置处的残基的残基：305、306、307、308、309、310、311、312、323、325、327、329、360、361、362、363、364、385、387、388、389、390、391和其组合。在一些实施例中，在位置305处的对应的残基选自由以下组成的群组：丝氨酸、赖氨酸和苏氨酸。在一些实施例中，在位置310处的对应的残基为赖氨酸。在一些实施例中，在位置311处的对应的残基为赖氨酸。在一些实施例中，在位置323处的对应的残基选自由以下组成的群组：精氨酸、赖氨酸和谷氨酰胺。在一些实施例中，在位置327处的对应的残基选自由以下组成的群组：赖氨酸和谷氨酸。在一些实施例中，在位置329处的对应的残基选自由以下组成的群组：精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和苏氨酸。
在一些实施例中，本发明提供一种抗体药剂，其重链可变区和/或轻链可变区包括至少一个互补决定区(CDR)，所述至少一个互补决定区与参考抗体4E11的CDR具有至少80％序列一致性，但因所述CDR内的至少一个氨基残基的取代而不同。在一些实施例中，抗体药剂包括至少一个CDR，所述至少一个CDR与抗体4E11的参考CDR实质上一致，因为其或者与所述参考CDR一致或者包括所述参考CDR内的氨基酸的在1到5个之间的取代。在一些实施例中，参考CDR选自由以下组成的群组：发现于4E11重链(SEQ IDNO.1)的残基27与33之间的参考CDR，发现于4E11重链(SEQ ID NO.1)的残基53与58之间的参考CDR，发现于4E11重链(SEQ ID NO.1)的残基100与106之间的参考CDR，发现于4E11轻链(SEQ ID NO.2)的残基24与38之间的参考CDR，发现于4E11轻链(SEQID NO.2)的残基54与60之间的参考CDR，发现于4E11轻链(SEQ ID NO.2)的残基93与101之间的参考CDR；和其组合。在一些实施例中，抗体药剂包括至少一个CDR，所述至少一个CDR与下方阐述的参考CDR实质上一致，因为其或者与所述参考CDR一致或者包括所述参考CDR内的氨基酸的在1到5个之间的取代：参考CDR：GFNIKDT(SEQ ID NO.7)、DPANGD(SEQ ID NO.8)、GWEGFAY(SEQ ID NO.9)、RASENVDKYGNSFMH(SEQ ID NO.14)、RASNLES(SEQ ID NO.15)和/或QRSNEVPWT(SEQ ID NO.16)。在一些实施例中，参考CDR是重链CDR。在一些实施例中，参考CDR是轻链CDR。在一些实施例中，抗体药剂包括至少一个与重链参考CDR实质上一致的重链CDR并且还包括至少一个与轻链参考CDR一致的轻链CDR。在一些实施例中，抗体药剂中的CDR中的每一者与参考CDR中的一者实质上一致。
在一些实施例中，本发明提供一种抗体药剂，其重链可变区包括至少一个互补决定区(CDR)，所述至少一个互补决定区与参考抗体4E11的CDR具有至少95％序列一致性，但因所述CDR内的至少一个氨基酸残基的取代而不同。在一些实施例中，抗体药剂包括至少一个CDR，所述至少一个CDR与抗体4E11的参考CDR实质上一致，因为其或者与所述参考CDR一致或者包括所述参考CDR内的氨基酸的在1到5个之间的取代。在一些实施例中，参考CDR选自由以下组成的群组：发现于4E11重链(SEQ ID NO.1)的残基27与33之间的参考CDR，发现于4E11重链(SEQ ID NO.1)的残基53与58之间的参考CDR，发现于4E11重链(SEQ ID NO.1)的残基100与106之间的参考CDR，发现于4E11轻链(SEQ ID NO.2)的残基24与38之间的参考CDR，发现于4E11轻链(SEQID NO.2)的残基54与60之间的参考CDR，发现于4E11轻链(SEQ ID NO.2)的残基93与101之间的参考CDR，和其组合。在一些实施例中，抗体药剂包括至少一个CDR，所述至少一个CDR与下方阐述的参考CDR实质上一致，因为其或者与所述参考CDR一致或者包括所述参考CDR内的氨基酸的在1到5个之间的取代：参考CDR：GFNIKDT(SEQ ID NO.7)、DPANGD(SEQ ID NO.8)、GWEGFAY(SEQ ID NO.9)、RASENVDKYGNSFMH(SEQ ID NO.14)、RASNLES(SEQ ID NO.15)和/或QRSNEVPWT(SEQ ID NO.16)。在一些实施例中，参考CDR是重链CDR。在一些实施例中，参考CDR是轻链CDR。在一些实施例中，抗体药剂包括至少一个与重链参考CDR实质上一致的重链CDR并且还包括至少一个与轻链参考CDR一致的轻链CDR。在一些实施例中，抗体药剂中的CDR中的每一者与参考CDR中的一者实质上一致。在一些实施例中，重链可变区CDR在位置55处具有氨基酸残基的取代。在一些实施例中，位置55处的取代氨基酸选自由谷氨酸和天冬氨酸组成的群组。在一些实施例中，轻链可变区CDR在选自由以下组成的群组的位置处具有氨基酸残基的取代：31、57、59、60和其组合。在一些实施例中，位置31处的取代氨基酸残基为赖氨酸。在一些实施例中，位置57处的取代氨基酸残基选自由谷氨酸和丝氨酸组成的群组。在一些实施例中，位置59处的取代氨基酸残基选自由谷氨酰胺和天冬酰胺组成的群组。在一些实施例中，位置60处的取代氨基酸残基选自由色氨酸、酪氨酸和精氨酸组成的群组。
在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其是IgG。在一些实施例中，抗体药剂是单克隆抗体。在一些实施例中，抗体药剂选自由以下组成的群组：小鼠抗体、人类化抗体、人类抗体、经纯化抗体、经分离抗体、嵌合抗体、多克隆抗体和其组合。在一些实施例中，提供抗体药剂，其中抗原结合片段选自由以下组成的群组：Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb片段、scFv片段、经分离CDR区、dsFv双功能抗体、单链抗体和其组合。
在一些实施例中，本发明提供一种细胞系，其表达对登革病毒具有特异性的抗体药剂，其中所述抗体药剂结合并中和登革病毒血清型D1、D2、D3和D4中的每一者。在一些实施例中，本发明提供一种医药组合物，其包括一或多种抗体药剂和医药学上可接受的赋形剂，其中所述抗体药剂结合并中和登革病毒血清型D1、D2、D3和D4中的每一者。在一些实施例中，医药组合物进一步包括至少一种其它抗病毒剂。
在一些实施例中，本发明提供治疗有需要的个体的方法，其包括投与抗体药剂的步骤，其中所述抗体药剂结合并中和登革病毒血清型D1、D2、D3和D4中的每一者。在一些实施例中，本发明提供试剂盒，其包括至少一种抗体药剂、用于向个体投与所述至少一种抗体或片段的注射器、针或施用器以及使用说明书，其中所述抗体药剂结合并中和登革病毒血清型D1、D2、D3和D4中的每一者。
在一些实施例中，本发明提供制造医药组合物的方法，所述方法包括以下步骤：提供抗体药剂，其中所述抗体药剂结合并中和登革病毒血清型D1、D2、D3和D4中的每一者；和将所述抗体药剂与至少一种医药学上可接受的载剂调配，以便产生医药组合物。在一些实施例中，医药组合物是液体组合物。在一些实施例中，医药组合物经调配以用于肠胃外投与。在一些实施例中，医药组合物经调配以用于静脉内投与。在一些实施例中，医药组合物经调配以用于静脉内投与儿童。
附图说明
附图的图式仅用于说明目的，而不是为了限制。
图1：图1展示窗口大小对预测准确性的影响。窗口大小代表所预测的阳性数目。预测准确性利用正确预测的测试用例结构的数目(总共37个)来测定。当窗口大小是一时(即，当101种结构中的一者被预测为阳性时)，如果结构是任意选择的，那么几乎一半的x射线结构(约48％，37个中的18个)被正确鉴别，其二项式概率为1.46E-26(n＝37，p＝0.009，成功数＝18)。可见MLR方法的预测准确性为窗口大小的对数性增加函数，且准确性在窗口大小为5时达到85％且在窗口大小为10时达到100％。相反地，ZRANK即使在窗口大小为20时也未能预测100％的结构。
图2：图2A-C说明局部搜索的对接结果。对于此评估，类天然结构被定义为具有来自x射线结构中配体的小于3埃针对固定受体内的配体原子所计算。的结构被称为非天然结构。(A)曲面图上的每一点代表对接诱饵。x轴展示ZRANK分数；Y轴代表x射线结构的RMSD(以为单位)；Z轴代表基于MLR的预测概率。类天然结构的ZRANK分数在-60到-30Kcal/mol之间变化。(B)ZRANK分数(x轴)与RMSD(y轴)之间的相关性。虚线圆圈内的数据点接近天然x射线结构。(C)基于MLR的概率与RMSD之间的相关性。预测概率与RMSD之间有显著相关性，但ZRANK与RMSD之间不存在此类相关性。
图3：图3展示4E11抗体的亲和力和体外活性。
图4：图4展示抗体设计方法的流程图。
图5：图5展示固定EDIII上最好的五种对接模型的叠加。EDIII域呈现为球体；4E11展示为各模型中的表面。
图6：图6A-B说明不佳DV4结合的序列和结构决定子。(A)四种血清型的EDIII域区的序列比对。推定单抗结合残基加灰色阴影。307、329、361、364、385、388和390处的残基区分DV4与序列的其余部分；这些残基经编号。利用五种单抗突变得到的残基接触加方框。值得注意的是，6种新的接触中的5种针对A和B股的保守表位残基形成。这解释了新的突变为何对DV1-3结合不会不利。(B)4E11/EDIII相互作用的结构模型。区分DV4与其它病毒株的序列位置经标记，且其中氨基酸的侧链呈现为棒。
图7：图7展示出定位于4E11:EDIII-DV4界面外周的亲和力增强性突变。在结合筛选中鉴别的阳性位置被突出显示，且展示在4E11:EDIII-DV4相互作用的结构模型中。所有阳性突变均位于结合界面的外周。两个图代表同一模型的不同视图。EDIII(顶部)、VH(右侧)和VL(左侧)蛋白分别呈现在每个图中。
图8：图8A-H展示出4E11野生型和4E5A与DV1-4的抗原EDIII的表面等离子体子共振(SPR)传感图。
图9：图9说明通过灶减少中和测试(FRNT)评估的抗体的体外中和活性。中和分析使用DV1-4和抗体4E11野生型、m4E11野生型、4E5A和4G2进行。将抗体的连续稀释液与等量病毒混合且与粘性覆层一起添加到Vero细胞单层。在4-6天之后，细胞固定，且对灶进行免疫染色和计数。数据点代表重复的平均值，且误差条代表标准偏差。标准四参数对数模型使用最小平方回归拟合数据。4E5A展示出对DV1-3与4E11和m4E11类似的中和活性以及对DV4中和活性的实质性增加。4G2(一种代表性黄病毒融合环特异性抗体)展示出相对于4E5A对DV1-3较低的中和活性以及对DV4仅略微较高的活性。
图10：图10展示出体内预防性DV2攻击模型。数据展示在病毒攻击之后第3天时AF129小鼠血清中的病毒。在病毒攻击之前1天用AB1或安慰剂处理小鼠。从小鼠血清提取的RNA通过QRT-PCR扩增，且基于来自从已知效价样品获取的对照RNA的曲线外推大致的Log10CCID50效价。虚线代表大致的检测限。
图11：图11展示互补位和表位中的氨基酸频率。数据从77种抗原-抗体复合体产生。
具体实施方式
定义
为了使本发明更易于理解，首先在下文定义某些术语；所属领域的技术人员将了解并理解如下文定义和/或在本文中以其它方式使用的这些术语的用途和范围。
成人：如本文中所用，术语“成人”是指年龄为十八岁或更年长的人类。成人之间的体重可大幅变化，且典型范围为90磅到250磅。
亲和力：如此项技术中已知，“亲和力”为特定配体(例如抗体)与其搭配物(例如表位)结合的紧密性的量度。亲和力可以不同方式测量。
氨基酸：如本文中所用，术语“氨基酸”在其最广泛意义上是指任何可并入多肽链中的化合物和/或物质。在一些实施例中，氨基酸具有通用结构H2N-C(H)(R)-COOH。在一些实施例中，氨基酸为天然存在的氨基酸。在一些实施例中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施例中，氨基酸是d-氨基酸；在一些实施例中，氨基酸是l-氨基酸。“标准氨基酸”是指天然存在的肽中常见的二十种标准l-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸外的任何氨基酸，不考虑其是以合成方式制备还是从天然来源获得。如本文中所用，“合成氨基酸”涵盖经化学修饰的氨基酸，包括(但不限于)盐、氨基酸衍生物(诸如酰胺)和/或取代。肽中包括羧基和/或氨基末端氨基酸在内的氨基酸可通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基和/或以其它化学基团取代来进行修饰，这些修饰可改变肽的循环半衰期，而不会对其活性产生不利影响。氨基酸可参与二硫键。氨基酸可包含一个或翻译后修饰，如与一或多种化学实体(例如甲基、乙酸酯基、乙酰基、磷酸酯基、甲酰基部分、类异戊二烯基、硫酸酯基、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分等)结合。术语“氨基酸”与“氨基酸残基”可互换使用且可以指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。从使用所述术语的上下文中显而易见，其不是指游离氨基酸，就是指肽的残基。
动物：如本文中所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施例中，“动物”是指任一性别且处于任何发育阶段的人类。在一些实施例中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施例中，非人类动物为哺乳动物(例如啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施例中，动物包括(但不限于)哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在某些实施例中，动物易受DV感染。在一些实施例中，动物可以是转基因动物、遗传工程化的动物和/或克隆动物。
抗体药剂：如本文中所用，术语“抗体药剂”是指特异性结合于特定抗原的药剂。在一些实施例中，所述术语涵盖具有足以赋予特异性结合的免疫球蛋白结构元件的任何多肽。适合的抗体包括(但不限于)人类抗体、灵长类化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人类化抗体、缀合抗体(即缀合或融合于其它蛋白质、放射性标记、细胞毒素的抗体)、小型模块化免疫药物(“SMIPsTM”)、单链抗体、骆驼抗体以及抗体片段。如本文中所用，术语“抗体”还包括完整单克隆抗体、多克隆抗体、单域抗体(例如鲨鱼单域抗体(例如IgNAR或其片段))、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要这些抗体片段展现所需生物活性即可。在一些实施例中，所述术语涵盖订书肽。在一些实施例中，所述术语涵盖一或多种抗体样结合肽模拟物。在一些实施例中，所述术语涵盖一或多种抗体样结合骨架蛋白质。在一些实施例中，所述术语涵盖单功能抗体或纤连蛋白。在许多实施例中，抗体药剂为或包含氨基酸序列包括一或多个被所属领域的技术人员识别为互补决定区(CDR)的结构元件的多肽；在一些实施例中，抗体药剂为或包含氨基酸序列包括至少一个与发现于参考抗体中的CDR实质上一致的CDR(例如至少一个重链CDR和/或至少一个轻链CDR)的多肽。在一些实施例中，所包括的CDR与参考CDR实质上一致，因为其与参考CDR相比或者序列一致或者含有在1到5个之间的氨基酸取代。在一些实施例中，所包括的CDR与参考CDR实质上一致，因为其展示出与参考CDR至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性。在一些实施例中，所包括的CDR与参考CDR实质上一致，因为其展示出与参考CDR至少96％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性。在一些实施例中，所包括的CDR与参考CDR实质上一致，因为与参考CDR相比，所包括的CDR内的至少一个氨基酸经缺失、添加或取代，但所包括的CDR具有与参考CDR的氨基酸序列另外一致的氨基酸序列。在一些实施例中，所包括的CDR与参考CDR实质上一致，因为与参考CDR相比，所包括的CDR内的1到5个氨基酸经缺失、添加或取代，但所包括的CDR具有与参考CDR另外一致的氨基酸序列。在一些实施例中，所包括的CDR与参考CDR实质上一致，因为与参考CDR相比，所包括的CDR内的至少一个氨基酸经取代，但所包括的CDR具有与参考CDR的氨基酸序列另外一致的氨基酸序列。在一些实施例中，所包括的CDR与参考CDR实质上一致，因为与参考CDR相比，所包括的CDR内的1到5个氨基酸经缺失、添加或取代，但所包括的CDR具有与参考CDR另外一致的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体药剂为或包含氨基酸序列包括被所属领域的技术人员识别为免疫球蛋白可变域的结构元件的多肽。在一些实施例中，抗体药剂为结合域与免疫球蛋白结合域同源或大部分同源的多肽蛋白质。
抗体：如此项技术中已知，“抗体”为特异性结合于特定抗原的免疫球蛋白。所述术语涵盖天然产生的免疫球蛋白(因为其是由对抗原产生反应的生物体产生的)，并且还涵盖合成产生或经工程化的免疫球蛋白。抗体可为单克隆或多克隆。抗体可为任何免疫球蛋白类别的成员，包括人类类别IgG、IgM、IgA和IgD中的任一者。已知如此项技术中所理解的典型免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每一四聚体均由两对相同的多肽链组成，每一对具有一个“轻链”(约25kD)和一个“重链”(约50-70kD)。每一链的N端界定具有约100到110种或更多种主要引起抗原识别的氨基酸的可变区。术语“可变轻链”(VL)和“可变重链”(VH)分别是指这些轻链和重链。每一可变区进一步再分成高变区(HV)和框架区(FR)。高变区包含三个称为互补决定区的高变序列区域(CDR 1、CDR 2和CDR3)，其由四个框架区(FR1、FR2、FR2和FR4)间隔开，所述框架区形成β折叠结构且充当骨架以将HV区保持在适当位置上。每一重链和轻链的C端界定由轻链的一个域(CL)和重链的三个域(CH1、CH2和CH3)组成的恒定区。在一些实施例中，术语“全长”用于提及抗体以指其含有两个重链和两个轻链，如在天然产生的抗体下出现般任选地利用二硫键结合。在一些实施例中，抗体由细胞产生。在一些实施例中，抗体通过化学合成产生。在一些实施例中，抗体来源于哺乳动物。在一些实施例中，抗体来源于动物，如(但不限于)小鼠、大鼠、马、猪或山羊。在一些实施例中，抗体使用重组细胞培养系统产生。在一些实施例中，抗体可为经纯化抗体(例如通过免疫亲和色谱法进行)。在一些实施例中，抗体可为人类抗体。在一些实施例中，抗体可为人类化抗体(抗体来自非人类物种，其蛋白质序列已经修饰以增大其与在人类中天然产生的抗体变异体的相似性)。在一些实施例中，抗体可为嵌合抗体(通过将来自非人类来源(例如小鼠、大鼠、马或猪)的遗传物质与来自人类的遗传物质组合而制得的抗体)。
抗体片段：如本文中所用，“抗体片段”包括完整抗体的一部分，如抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；三功能抗体；四功能抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。举例来说，抗体片段包括已分离片段、由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段、轻链和重链可变区域通过肽连接子(“ScFv蛋白”)连接的重组单链多肽分子以及由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位。在许多实施例中，抗体片段含有足够的亲本抗体序列，其中其为结合于与亲本抗体所结合的相同抗原的片段；在一些实施例中，片段以与亲本抗体的亲和力可比的亲和力结合于抗原和/或与亲本抗体竞争结合于抗原。抗体的抗原结合片段的实例包括(但不限于)Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双功能抗体、dAb片段、Fd'片段、Fd片段和经分离互补决定区(CDR)区域。抗体的抗原结合片段可通过任何手段产生。举例来说，抗体的抗原结合片段可通过完整抗体的碎片化以酶促方式或以化学方式产生和/或其可以重组方式由编码部分抗体序列的基因产生。可替代地或另外，抗体的抗原结合片段可完全或部分地以合成方式产生。抗体的抗原结合片段可任选地包含单链抗体片段。可替代地或另外，抗体的抗原结合片段可包含例如利用二硫键连接在一起的多个链。抗体的抗原结合片段可任选地包含多分子复合体。功能性抗体片段通常包含至少约50个氨基酸且更通常包含至少约200个氨基酸。
抗病毒剂：如本文中所用，术语“抗病毒剂”是指一类特异性地用于通过抑制、去活化或破坏病毒粒子来治疗病毒感染的药物。一般来说，抗病毒剂可为或包含任何化学类别(例如小分子、金属、核酸、多肽、脂质和/或碳水化合物)的化合物。在一些实施例中，抗病毒剂为或包含抗体或抗体模拟物。在一些实施例中，抗病毒剂为或包含核酸药剂(例如反义寡核苷酸、siRNA、shRNA等)或其模拟物。在一些实施例中，抗病毒剂为或包含小分子。在一些实施例中，抗病毒剂为或包含天然产生的化合物(例如小分子)。在一些实施例中，抗病毒剂具有通过人工产生和/或修饰的化学结构。
大约：如本文中所用，术语“大约”或“约”在应用于所关注的一或多个值时是指与所述参考值类似的值。在某些实施例中，除非另行说明或另外从上下文显而易见，否则术语“大约”或“约”是指落入所述参考值的任一方向(大于或小于)25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或1％以下之内的一系列值(除了其中所述数目将超过100％的可能值)。
婴儿：如本文中所用，术语“婴儿”是指年龄在两岁以下的人类。婴儿的典型体重在3磅到20磅范围内。
生物活性：如本文中所用，短语“生物活性”是指在生物系统(例如细胞培养物、生物体等)中具有活性的任何物质的特征。举例来说，当向生物体投与时对所述生物体具有生物效应的物质被视为具有生物活性。在具体实施例中，当蛋白质或多肽具有生物活性时，所述蛋白质或多肽的共有蛋白质或多肽的至少一种生物活性的一部分通常被称为“生物活性”部分。
特征部分：如本文中所用，术语“特征部分”在最广泛意义上用于指物质中其存在(或不存在)与所述物质的具体特征、属性或活性的存在(或不存在)相关的一部分。在一些实施例中，物质的特征部分为在所述物质中和在共有所述具体特征、属性或活性的相关物质中而不在不共有所述具体特征、属性或活性的物质中可见的部分。在某些实施例中，特征部分与完整物质共有至少一种功能性特征。举例来说，在一些实施例中，蛋白质或多肽的“特征部分”是含有连续一段氨基酸或连续多段氨基酸集合一起作为蛋白质或多肽的特征的部分。在一些实施例中，每一所述连续段通常含有至少2、5、10、15、20、50个或50个以上氨基酸。一般来说，物质(例如蛋白质、抗体等)的特征部分是与相关完整物质除了具有上文规定的序列和/或结构一致性之外还共有至少一种功能性特征的部分。在一些实施例中，特征部分可具生物活性。
儿童：如本文中所用，术语“儿童”是指年龄在两岁与18岁之间的人类。体重可跨越年龄和特定儿童大幅变化，且典型范围为30磅到150磅。
组合疗法：如本文中所用，术语“组合疗法”是指以重叠方案投与两种或两种以上不同医药剂以使个体同时暴露于两种药剂的那些情形。
可比的：术语“可比的”在本文中用于描述两组(或两组以上)状况或情形彼此充分类似从而允许比较所获得的结果或所观察到的现象。在一些实施例中，可比组的状况或情形的特征在于多个实质上相同的特征和一个或少量变化特征。所属领域的技术人员将了解，状况组在特征在于充足数目和类型的实质上相同的特征时是彼此可比的，从而保证以下合理的结论：在不同组的状况或情形下获得的结果或观察到的现象的差异是由改变的那些特征的变化所引起或指示所述变化。
对应于：如本文中所用，术语“对应于”通常用于指定所关注的多肽中氨基酸残基的位置/身份。所属领域的技术人员将了解，出于简单化的目的，多肽中的残基通常使用标准编号系统(基于参考相关多肽)指定，因此，举例来说，“对应于”位置190处的残基的氨基酸无需实际上为具体氨基酸链中的第190位氨基酸，而是对应于在参考多肽中位置190处发现的残基；所属领域的技术人员易于了解如何鉴别“对应的”氨基酸。
剂型：如本文中所用，术语“剂型”和“单位剂型”是指供待治疗患者用的治疗性蛋白质(例如抗体)的物理上分散的单元。每一单位含有经计算会产生所需治疗作用的预定数量的活性物质。然而，应理解组合物的总剂量将由主治医师在合理医学判断范围内作出决定。
给药方案：“给药方案”(或“治疗方案”)在所述术语在本文中使用时是通常间隔开时间段向个体个别投与的一组单位剂量(通常是一个以上)。在一些实施例中，给定治疗剂具有推荐的给药方案，其可能涉及一或多个剂量。在一些实施例中，给药方案包含多个剂量，其中的每一者彼此间隔开相同长度的时间段；在一些实施例中，给药方案包含多个剂量以及间隔开个别剂量的至少两个不同时间段。在一些实施例中，给药方案内的所有剂量具有相同单位剂量的量。在一些实施例中，给药方案内的不同剂量具有不同量。在一些实施例中，给药方案包含呈第一剂量的量的第一剂量，接着是呈不同于第一剂量的量的第二剂量的量的一或多种其它剂量。在一些实施例中，给药方案包含呈第一剂量的量的第一剂量，接着是呈与第一剂量的量相同的第二剂量的量的一或多种其它剂量。
DV血清型：如本文中所用，术语“血清型”通常是指DV内的独特的变异体。包含DV基因组的四种不同DV血清型(DV1-4)在氨基酸层面彼此相差约25％到40％。DV的四种血清型在致病性方面有所不同，但均在亚洲、非洲、中美洲和南美洲地区很普遍。经这些血清型中的一者感染得到对所述血清型的终身免疫性，然而其也增加在来自异源DV血清型的二次感染时重度疾病的风险。
表位：如本文中所用，术语“表位”具有其如此项技术中所理解的含义。所属领域的技术人员应了解，表位也称作抗原决定子，其是抗原中由免疫系统、确切地说由抗体、B细胞或T细胞识别的分子区域。应进一步了解，表位可以由糖、脂质或氨基酸组成。蛋白质抗原的表位基于其结构和与互补位(抗体中识别表位的部分)的相互作用被分成两个类别：构象表位和线性表位。构象表位由抗原的氨基酸序列的不连续区段组成，且这些表位基于抗原的3D表面特征和形状或三级结构与互补位相互作用。线性表位基于其一级结构与互补位相互作用，且线性表位由来自抗原的氨基酸的连续序列形成。
表达：如本文中所用，核酸序列的“表达”是指以下事件中的一或多者：(1)(例如通过转录)从DNA序列产生RNA模板；(2)(例如通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'端形成)加工RNA转录物；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质；和/或(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
功能性：如本文中所用，“功能性”生物分子是呈展现其特征性特性和/或活性的形式的生物分子。
基因：如本文中所用，术语“基因”具有其如此项技术中所理解的含义。所属领域的技术人员应了解，术语“基因”可以包括基因调节序列(例如启动子、增强子等)和/或内含子序列。应进一步了解，基因的定义包括提及不编码蛋白质但实际上编码功能性RNA分子(如tRNA、RNAi诱导剂等)的核酸。出于明确性的目的，我们应注意到，如本申请案中所使用，术语“基因”通常是指核酸中编码蛋白质的部分；所述术语可任选地涵盖调节序列，如所属领域的技术人员从上下文将清楚。这一定义并不打算排除将术语“基因”应用于非蛋白质编码表达单元，但更确切地说在大多数情况下打算说明如在本文档中所使用的所述术语是指蛋白质编码核酸。
基因产物或表达产物：如本文中所用，术语“基因产物”或“表达产物”通常是指从基因转录的RNA(加工前和/或加工后)或由从所述基因转录的RNA所编码的多肽(修饰前和/或修饰后)。
同源性：如本文中所用，术语“同源性”是指聚合物分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施例中，如果聚合物分子之间的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％一致，那么认为所述分子彼此“同源”。在一些实施例中，如果聚合物分子之间的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％类似，那么认为所述分子彼此“同源”。
一致性：如本文中所用，术语“一致性”是指聚合物分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。举例来说，两个核酸序列的一致性百分比的计算可通过出于最佳比较目的对准两个序列来进行(例如，可将间隙引入第一和第二核酸序列中的一个或两个中以便最佳对准且出于比较目的可以忽略非一致序列)。在某些实施例中，出于比较目的所对准的序列长度为参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或实质上100％。接着比较相应核苷酸位置的核苷酸。当第一序列中的位置未被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据时，则所述分子在那个位置上是一致的。两个序列之间的一致性百分比与所述序列共有的一致位置的数目有关，并且考虑最佳对准两个序列需要引入的间隙的数目和每一间隙的长度。序列的比较和两个序列之间一致性百分比的确定可以使用数学算法实现。举例来说，两个核苷酸序列之间的一致性百分比可使用迈尔(Meyers)和米勒(Miller)(生物科学中的计算机应用(CABIOS),1989,4:11-17)的算法来测定，所述算法已并入使用PAM120权数残基表、间隙长度罚分12和间隙罚分4的ALIGN程序(2.0版)中。可替代地，可以使用GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵确定两个核苷酸序列之间的一致性百分比。
经分离：如本文中所使用，术语“经分离”是指如下物质和/或实体：(1)已与最初产生时与其相关的至少一些组分分离(无论在自然界中和/或在实验环境中)；和/或(2)通过人工产生、制备和/或制造。经分离物质和/或实体可与约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％的与其最初相关的其它组分分离。在一些实施例中，经分离药剂是约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％纯。如本文中所用，物质在其实质上不含其它组分时是“纯的”。如本文中所用，经分离物质和/或实体的纯度百分比的计算不应包括赋形剂(例如缓冲剂、溶剂、水等)。
模拟表位：如本文中所用，术语“模拟表位”是指模拟表位结构的大分子。在一些实施例中，模拟表位引起的抗体反应与其对应的表位所引起的反应一致或相似。在一些实施例中，识别表位的抗体也识别模拟所述表位的模拟表位。在一些实施例中，模拟表位是肽。在一些实施例中，模拟表位是小分子、碳水化合物、脂质或核酸。在一些实施例中，模拟表位是保守DV表位的肽或非肽模拟表位。在一些实施例中，通过模拟所界定的病毒表位的结构，模拟表位干扰DV病毒粒子结合于其天然结合搭配物(例如DV目标受体、Rab5、GRP78)的能力，例如通过结合于天然结合搭配物自身来干扰。
突变体：如本文中所用，术语“突变体”是指这样的实体：其展示出与参考实体的显著结构一致性，但与参考实体相比在一或多种化学部分的存在或水平方面与参考实体结构上不同。在许多实施例中，突变体在功能上也与其参考实体不同。一般来说，具体实体是否被恰当地视为参考实体的“突变体”是基于其与参考实体的结构一致性的程度。如所属领域的技术人员将了解，任何生物或化学参考实体具有某些特征性结构元件。通过定义，突变体是共有一或多种所述特征性结构元件的不同的化学实体。仅举几例，小分子可具有特征性核心结构元件(例如大环核心)和/或一或多个特征性侧位部分，使得小分子的突变体是共有所述核心结构元件和所述特征性侧位部分但在其它侧位部分方面和/或在核心内存在的键的类型(单对双，E对Z等)方面有所不同的一者，多肽可具有包含多个氨基酸的特征性序列元件，所述多个氨基酸在线形或三维空间中相对于彼此具有指定的位置和/或有助于具体生物功能，核酸可具有包含多个核苷酸残基的特征性序列元件，所述多个核苷酸残基在线形或三维空间中相对于彼此具有指定的位置。举例来说，突变体多肽可因氨基酸序列中的一或多个差异和/或共价连接于多肽主链的化学部分(例如碳水化合物、脂质等)中的一或多个差异而不同于参考多肽。在一些实施例中，突变体多肽展示出与参考多肽至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的总体序列一致性。可替代地或另外，在一些实施例中，突变体多肽并不与参考多肽共有至少一种特征性序列元件。在一些实施例中，参考多肽具有一或多种生物活性。在一些实施例中，突变体多肽共有参考多肽的生物活性中的一或多者。在一些实施例中，突变体多肽缺乏参考多肽的生物活性中的一或多者。在一些实施例中，突变体多肽与参考多肽相比展示出一或多种生物活性水平降低。
核酸：如本文中所用，术语“核酸”在其最广泛意义上是指并入或可以并入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，核酸是经由磷酸二酯键并入或可以经由磷酸二酯键并入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。在一些实施例中，“核酸”是指个别核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)。在一些实施例中，“核酸”是指包含个别核酸残基的寡核苷酸链。如本文中所用，术语“寡核苷酸”与“多核苷酸”可互换使用。在一些实施例中，“核酸”涵盖RNA以及单股和/或双股DNA和/或cDNA。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似术语包括核酸类似物，即，具有除磷酸二酯主链之外的类似物。举例来说，此项技术中已知且在主链中具有肽键以代替磷酸二酯键的所谓“肽核酸”被认为在本发明的范围内。术语“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括互为简并形式和/或编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和/或RNA的核苷酸序列可包括内含子。核酸可从天然来源纯化，使用重组表达系统产生并任选地纯化，以化学方式合成等。适当时，例如在以化学方式合成的分子的情况下，核酸可包含核苷类似物，如具有经化学修饰的碱基或糖、主链修饰等的类似物。除非另外指明，否则核酸序列以5'到3'方向呈现。术语“核酸区段”在本文中用于指作为较长核酸序列的一部分的核酸序列。在许多实施例中，核酸区段包含至少3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上残基。在一些实施例中，核酸是以下物质或包含以下物质：天然核苷(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)；核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；经化学修饰的碱基；经生物修饰的碱基(例如甲基化碱基)；插入的碱基；经修饰的糖(例如2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己醣)；和/或经修饰的磷酸酯基(例如硫代磷酸酯和5'-N-亚磷酰胺键联)。在一些实施例中，本发明特别针对“未修饰的核酸”，其意思是未经过化学修饰以促进或实现递送的核酸(例如多核苷酸和残基，包括核苷酸和/或核苷)。
患者：如本文中所用，术语“患者”或“个体”是指可例如出于实验、诊断、预防、美容和/或治疗目的向其投与所提供的组合物的任何生物体。典型患者包括动物(例如哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、非人类灵长类动物和/或人类)。在一些实施例中，患者是人类。人类包括出生前和出生后形式。
医药学上可接受的：如本文中所用，术语“医药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理效益/风险比相称的物质。
医药学上可接受的载剂：如本文中所用，术语“医药学上可接受的载剂”意指医药学上可接受的物质、组合物或媒剂，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂囊封物质，涉及运载或输送主题化合物从一个器官或身体的部分到另一器官或身体的部分。每一载体在与调配物的其它成分相容且对患者无害的意义上必须为“可接受的”。可充当医药学上可接受的载剂的物质的一些实例包括：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原质水；等渗盐水；林格氏溶液(Ringer'ssolution)；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；和在医药调配物中采用的其它无毒相容物质。
医药组合物：如本文中所用，术语“医药组合物”是指与一或多种医药学上可接受的载剂一起调配的活性剂。在一些实施例中，活性剂以适合于投与的单位剂量的量存在于治疗方案中，其在投与相关群体时展示出统计学上显著的实现预定治疗作用的概率。在一些实施例中，医药组合物可专门调配用于以固体或液体形式投与，其包括适合于以下的医药组合物：口服投与，例如顿服药(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂，例如靶向颊内、舌下和全身吸收者、用于向舌施加的大丸剂、散剂、颗粒、糊剂；肠胃外投与，例如作为例如无菌溶液或悬浮液或持续释放调配物通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射投与；局部施加，例如施加到皮肤、肺或口腔的乳膏、软膏或控制释放贴片或喷雾；经阴道内或直肠内，例如作为子宫托、乳膏或发泡体；经舌下；经眼；经皮；或经鼻、经肺和到其它粘膜表面。
多肽：如本文中所用，一般来说，“多肽”为具有至少两个彼此通过肽键连接的氨基酸的链。在一些实施例中，多肽可包括至少3-5个氨基酸，其各自借助于至少一个肽键与其它氨基酸连接。所属领域技术人员将了解，多肽有时包括“非天然”氨基酸或仍能够任选整合入多肽链中的其它实体。
蛋白质：如本文中所用，术语“蛋白质”是指多肽(即，由肽键彼此连接的至少两个氨基酸的串)。蛋白质可包括除氨基酸之外的部分(例如可为糖蛋白、蛋白多糖等)和/或可以其它方式加工或修饰。所属领域的技术人员将了解“蛋白质”可为如由细胞产生的完整多肽链(具有或不具有信号序列)，或可为其特征性部分。所属领域的技术人员将了解蛋白质有时可包括例如由一或多个二硫键连接或通过其它方式缔合的一个以上多肽链。多肽可含有l-氨基酸、d-氨基酸或两者，且可含有此项技术中已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任一者。适用的修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施例中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸和其组合。术语“肽”一般用于指长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸或小于10个氨基酸的多肽。在一些实施例中，蛋白质是抗体、抗体片段、其生物活性部分，和/或其特征性部分。
复发性DV感染：如本文中所用，“复发性DV感染”是指感染的临床和/或实验室迹象(例如感染的一或多种症状或循环DV粒子和/或个体肝中DV粒子的存在)的再度出现。
难治性：如本文中所用，术语“难治性”是指如从业医务人员通常观察到的，在投与所提供的组合物之后并不以预期临床功效反应的任何个体。
血清型：一般来说，“血清型”或“血清变型”是指在细菌或病毒物种内或在不同个体的免疫细胞之间的独特变异体。这些微生物通常基于其细胞表面抗原归类在一起，允许将生物体流行病学归类到亚物种水平。
小分子：一般来说，“小分子”是尺寸小于约5千道尔顿(kilodalton，kD)的分子。在一些实施例中，小分子小于约4kD、3kD、约2kD或约1kD。在一些实施例中，小分子小于约800道尔顿(dalton，D)、约600D、约500D、约400D、约300D、约200D或约100D。在一些实施例中，小分子小于约2000g/mol、小于约1500g/mol、小于约1000g/mol、小于约800g/mol或小于约500g/mol。在一些实施例中，小分子是非聚合物。在一些实施例中，根据本发明，小分子不为蛋白质、多肽、寡肽、肽、多核苷酸、寡核苷酸、多糖、糖蛋白、蛋白多糖等。
实质上：如本文中所用，术语“实质上”是指展现全部或接近全部范围或程度的所关注的特征或特性的定性条件。生物学领域的技术人员应理解生物学和化学现象很少(如果发生过)达到完全和/或进行到完全或者实现或避免绝对结果。因此，术语“实质上”在本文中用于捕捉许多生物学和化学现象中所固有的潜在完全性缺乏。
实质性序列同源性：短语“实质性同源性”在本文中用于指氨基酸或核酸序列之间的比较。如所属领域的技术人员将了解，如果两个序列在相应位置中含有同源残基，那么通常认为它们是“实质上同源的”。同源残基可以是相同残基。可替代地，同源残基可以是将适当地具有类似结构和/或功能特征的不相同残基。举例来说，如所属领域的技术人员众所周知的，某些氨基酸通常被归类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸，和/或归类为具有“极性”或“非极性”侧链。一种氨基酸取代相同类型的另一种氨基酸往往可以认为是“同源”取代。典型氨基酸分类概述如下：
丙氨酸 Ala A 非极性 中性 1.8
精氨酸 Arg R 极性 正电性 -4.5
天冬酰胺 Asn N 极性 中性 -3.5
天冬氨酸 Asp D 极性 负电性 -3.5
半胱氨酸 Cys C 非极性 中性 2.5
谷氨酸 Glu E 极性 负电性 -3.5
谷氨酰胺 Gln Q 极性 中性 -3.5
甘氨酸 Gly G 非极性 中性 -0.4
组氨酸 His H 极性 正电性 -3.2
异亮氨酸 Ile I 非极性 中性 4.5
亮氨酸 Leu L 非极性 中性 3.8
赖氨酸 Lys K 极性 正电性 -3.9
甲硫氨酸 Met M 非极性 中性 1.9
苯丙氨酸 Phe F 非极性 中性 2.8
脯氨酸 Pro P 非极性 中性 -1.6
丝氨酸 Ser S 极性 中性 -0.8
苏氨酸 Thr T 极性 中性 -0.7
色氨酸 Trp W 非极性 中性 -0.9
酪氨酸 Tyr Y 极性 中性 -1.3
缬氨酸 Val V 非极性 中性 4.2
不明确氨基酸 3字母 1字母
天冬酰胺或天冬氨酸 Asx B
谷氨酰胺或谷氨酸 Glx Z
亮氨酸或异亮氨酸 Xle J
未规定或未知的氨基酸 Xaa X
如此项技术中众所周知，可以使用多种算法中的任一种来比较氨基酸或核酸序列，包括在商业计算机程序中可获得的那些算法，如用于核苷酸序列的BLASTN和用于氨基酸序列的BLASTP、间隙BLAST以及PSI-BLAST。示例性所述程序描述于奥特查尔(Altschul)等人,基础局部比对搜索工具(Basic local alignment search tool),分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),215(3):403-410,1990；奥特查尔等人,酶学方法(Methods inEnzymology)；奥特查尔等人,“间隙BLAST和PSI-BLAST：新型蛋白质数据库搜索程序的产生(Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database searchprograms)”,核酸研究(Nucleic Acids Res.),25:3389-3402,1997；巴谢瓦尼斯(Baxevanis)等人,生物信息学：基因和蛋白质分析的实用指南(Bioinformatics:A Practical Guide tothe Analysis of Genes and Proteins),威利出版社(Wiley),1998；以及密申纳(Misener)等人(编),生物信息学方法和方案(Bioinformatics Methods and Protocols)(分子生物学方法(Methods in Molecular Biology),第132卷),胡马纳出版社(Humana Press),1999；所有前述文献均以引用的方式并入本文中。除识别同源序列以外，上述程序通常还指示同源程度。在一些实施例中，如果两个序列中在相关段残基上至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或99％以上的对应残基为同源的，那么认为它们为实质上同源的。在一些实施例中，相关段为整个序列。在一些实施例中，相关段为至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300、至少325、至少350、至少375、至少400、至少425、至少450、至少475、至少500个或500个以上的残基。
实质一致性：短语“实质一致性”在本文中用于指氨基酸或核酸序列之间的比较。如所属领域的技术人员将了解，如果两个序列在对应位置中含有一致残基，那么通常认为它们是“实质上一致的”。如此项技术中众所周知，可以使用多种算法中的任一种来比较氨基酸或核酸序列，包括在商业计算机程序中可获得的那些算法，如用于核苷酸序列的BLASTN和用于氨基酸序列的BLASTP、间隙BLAST以及PSI-BLAST。示例性所述程序描述于奥特查尔等人,基础局部比对搜索工具,分子生物学杂志,215(3):403-410,1990；奥特查尔等人,酶学方法；奥特查尔等人,核酸研究,25:3389-3402,1997；巴谢瓦尼斯等人,生物信息学：基因和蛋白质分析的实用指南,威利出版社,1998；以及密申纳等人(编),生物信息学方法和方案(分子生物学方法,第132卷),胡马纳出版社,1999。除识别一致序列以外，上述程序通常还指示一致程度。在一些实施例中，如果两个序列中在相关段残基上至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或99％以上的对应残基为一致的，那么认为它们为实质上一致的。在一些实施例中，相关段为整个序列。在一些实施例中，相关段为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或500个以上的残基。
罹患：“罹患”疾病、病症或病况(例如DV)的个体已诊断患有所述疾病、病症或病况和/或展现出所述疾病、病症或病况的一或多种症状。DV感染时常是无症状的。在一些实施例中，罹患DV的个体已暴露于和/或感染有DV，但不展示DV感染的任何症状和/或尚未诊断患有DV感染。在一些实施例中，罹患DV的个体是在他/她的血液中具有一或多个DV粒子的个体。
易患：“易患”疾病、病症或病况(例如DV)的个体处于发展所述疾病、病症或病况的风险中。在一些实施例中，易患疾病、病症或病况的个体并未展示所述疾病、病症或病况的任何症状。在一些实施例中，易患疾病、病症或病况的个体尚未诊断出患有所述疾病、病症和/或病况。在一些实施例中，易患疾病、病症或病况的个体是已暴露于与发展所述疾病、病症或病况有关的条件的个体(例如个体已暴露于DV)。在一些实施例中，发展疾病、病症和/或病况的风险是基于人群的风险(例如静脉内药物使用者；在开始对捐献的血液、血液产品和器官进行筛选的1992年之前所述产品的接受者；处理针的医疗工作者；DV感染的母亲产下的婴儿等)。
症状减少：根据本发明，在具体疾病、病症或病况的一或多种症状的量级(例如强度、严重度等)或频率减少时，“症状减少”。出于明确的目的，具体症状的发作延缓被视为降低所述症状的频率的一种形式。仅举几例，DV的示例性症状包括(但不限于)发热的突然发作、高热(通常超过40℃)、肌肉和关节疼痛、头痛、呕吐、腹泻、出现为皮肤潮红或麻疹样皮疹的皮疹、皮下出血斑(由破裂的毛细血管引起的在按压皮肤时不会消失的红色小斑点)、从粘膜出血、低白细胞计数、低血小板、代谢酸中毒、来自肝的转氨酶水平升高、引起血液浓缩(由红细胞压积上升指示)和低白蛋白血症的血浆渗漏、胸腔和腹腔中体液积聚(例如胸膜积液或腹水)、胃肠出血、休克和出血、阳性压脉带测试、低血压、脑或心的感染、重要器官(例如肝)的损伤、神经病症(如横贯性脊髓炎)和/或其组合。本发明不打算仅限于症状被消除的情况。本发明专门涵盖治疗使得一或多种症状即使不被彻底消除，也会被减少(且个体的病况由此得到“改善”)。
治疗剂：如本文中所用，短语“治疗剂”是指在投与生物体时引发所需药理学作用的任何药剂。在一些实施例中，药剂在其在适当群体中展示出统计学上显著的作用时被视为治疗剂。在一些实施例中，适当群体可为模型生物体群体。在一些实施例中，适当群体可利用各种准则界定，如某一年龄组、性别、遗传背景、先前存在的临床病况等。在一些实施例中，治疗剂是可用于缓解、改善、减轻疾病、病症和/或病况的一或多种症状或特征、抑制、预防、延缓其发作、降低其严重度和/或降低发病率的任何物质。
治疗有效量：如本文中所用，术语“治疗有效量”是指以适用于任何医学治疗的合理的效益/风险比对所治疗的个体赋予治疗作用的治疗性蛋白质的量。治疗作用可为客观的(即，可通过一些测试或标记来测量)或主观的(即，个体给出作用的指示或感觉到作用)。具体来说，“治疗有效量”是指如通过改善与疾病有关的症状、预防或延缓疾病的发作和/或减轻疾病的症状的严重度或频率来有效治疗、改善或预防所需疾病或病况、或展现可检测的治疗或预防作用的治疗性蛋白质或组合物的量。治疗有效量通常以可能包含多个单位剂量的给药方案来投与。对于任何具体治疗性蛋白质来说，治疗有效量(和/或在有效给药方案内的适当单位剂量可例如视投药途径、与其它医药剂的组合而变化。用于任何具体患者的特定治疗有效量(和/或单位剂量)也可以视多种因素而定，包括所治疗的病症和病症的严重度；所用特定医药剂的活性；所用的特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；投药时间、投药途径和/或所用特定融合蛋白的排泄或代谢速率；治疗持续时间；和如医学技术中熟知的类似因素。
治疗：如本文中所用，术语“治疗(treatment)”(还有“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指物质(例如所提供的组合物)的任何投与部分或完全地将具体疾病、病症和/或病况(例如DV)的一或多种症状、特征和/或病因缓解、改善、减轻、抑制、延缓发作、降低严重度和/或降低发病率。所述治疗可为对并未展现相关疾病、病症和/或病况的征象的个体的治疗和/或对仅展现疾病、病症和/或病况的早期征象的个体的治疗。可替代地或另外，所述治疗可为对展现相关疾病、病症和/或病况的一或多种确立征象的个体的治疗。在一些实施例中，治疗可为对已诊断为罹患相关疾病、病症和/或病况的个体的治疗。在一些实施例中，治疗可为对已知具有一或多种在统计学上与相关疾病、病症和/或病况发展风险增加相关的易感性因素的个体的治疗。
单位剂量：如本文所用的表述“单位剂量”是指以医药组合物的单个剂量形式和/或在其物理上分散的单位中投与的量。在许多实施例中，单位剂量含有预定数量的活性剂。在一些实施例中，单位剂量含有整个单一剂量的药剂。在一些实施例中，投与一个以上单位剂量以实现总的单一剂量。在一些实施例中，需要或预期需要投与多个单位剂量以便实现既定作用。单位剂量可为例如含有预定数量的一或多种治疗剂的一定体积的液体(例如可接受的载剂)、呈固体形式的预定量的一或多种治疗剂、含有预定量的一或多种治疗剂的持续释放调配物或药物递送装置等。应了解，单位剂量可以除了治疗剂之外还包括多种组分中的任一者的调配物形式存在。举例来说，可接受的载剂(例如医药学上可接受的载剂)、稀释剂、稳定剂、缓冲剂、防腐剂等可如下文所述包括在内。所属领域的技术人员应了解，在许多实施例中，具体治疗剂的总的适当日剂量可包含部分或多个单位剂量，且可例如由主治医师在合理的医学判断范围内决定。在一些实施例中，对于任何具体个体或生物体的特定有效剂量水平可视多种因素而定，包括所治疗的病症和病症的严重度；所用特定活性化合物的活性；所用的特定组合物；个体的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；投药时间和所用特定活性化合物的排泄速率；治疗持续时间；与所用特定化合物组合或同时使用的药物和/或其它疗法和医疗领域中熟知的类似因素。
疫苗接种：如本文中所用，术语“疫苗接种”是指投与一种打算例如对引起疾病的试剂产生免疫反应的组合物。出于本发明的目的，疫苗接种可在暴露于引起疾病的试剂之前、期间和/或之后投与，且在某些实施例中，疫苗接种可在暴露于所述药剂之前、期间和/或之后立即投与。在一些实施例中，疫苗接种包括间隔适当时间的接种疫苗组合物的多次投与。
载体：如本文中所用，“载体”是指一种核酸分子，其能够转运其所结合的另一核酸。在一些实施例中，载体能够在如真核细胞和/或原核细胞等宿主细胞中染色体外复制和/或表达其所连接的核酸。能够引导可操作性连接的基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。
野生型：如本文中所用，术语“野生型”具有其在此项技术中所理解的含义，其是指具有如在自然界中发现的呈“正常”(如与突变体、患病者、改变者等形成对比)状态或情形的结构和/或活性的实体。所属领域的技术人员将了解，野生型基因和多肽通常以多种不同形式(例如等位基因)存在。
DV命名法
所属领域的技术人员众所周知，DV命名法通常使用代表DV基因型的罗马数字(例如“I”、“II”、“III”、“IV”等)和代表DV亚型的小写字母(例如“a”、“b”等)。尽管命名法规则在此项技术中被普遍接受，但所属领域的技术人员认识到命名法规则在出版物、演示、对话等中并不始终被严格地遵循。因此，所属领域的技术人员应认识到，其例如暗示“DV Ia”、“DV基因型Ia”和“DV亚型Ia”可由所属领域的技术人员可互换地使用，且所有这三种术语均打算指DV基因型I亚型a。
如本文中所用，罗马数字(例如“I”、“II”、“III”、“IV”等)用于指DV基因型，且小写字母(例如“a”、“b”等)用于指DV亚型。还应理解，在本文中提及具体基因型的DV时，其意欲涵盖所命名的基因型的所有亚型。仅举一例，“基因型I”在本文中用于指基因型I的所有亚型(例如基因型I亚型a；基因型I亚型b；等)。
如本文中所用，应理解在基因型和亚型名称之后呈现的任何罗马数字(例如“I”、“II”、“III”、“IV”等)是指DV病毒株。
某些实施例的具体实施方式
本发明提供具有具体结构和/或功能特征的适用的抗DV抗体药剂以及与所述抗体药剂相关的组合物和方法。
登革病毒(DV)感染
DV感染代表一种主要的节肢动物传播的病毒疾病，有超过35亿人生活在疾病风险地区，且每年全世界有超过2亿起感染，引起21,000例死亡。值得注意的是，所报导的登革病毒感染的每年平均数、地域拓展和疾病的严重度近年来均显著增加。登革病毒流行可以造成显著的发病率，产生实质性经济花费和医疗保健影响(古兹曼等人,2010自然评论·微生物学8:S7-16)。
DV感染是由主要通过埃及伊蚊传播的四种相关病毒中的任一者引起的并且流行于热带和亚热带地区。哺乳动物中的感染是通过在经感染的伊蚊属蚊子吸血期间注入DV引发的，由此DV主要沉积在血管外组织中。DV在蚊子叮咬之后的潜伏期是在3天到14天之间。树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞是DV的首个目标。在皮肤和淋巴节中的最初复制之后，DV在急性发热阶段过程中出现在血液中，通常是3到5天。
登革病毒感染的常规实验室诊断是基于DV的分离和/或对DV具有特异性的抗体的检测。感染可以引起数种不同的综合症，受到经感染个体的年龄和/或免疫状态影响。原发DV感染可能是无症状的或可能引起登革热。登革热的特征在于通常具有两个阶段的高热和至少一种其它症状，如头痛(通常为重度的)；多个身体部分(例如眼睛、关节、肌肉、骨、腹部)中的任一者的疼痛(其可为重度的)；皮肤出疹或皮疹；轻度出血表现(例如鼻或牙龈出血、皮下血斑症、容易瘀伤)；淋巴结病；呕吐；变色(黑色)粪便；情绪影响(如疲劳、嗜眠或易怒)；苍白、冷或湿冷的皮肤；呼吸困难；白细胞计数低；一或多种生物体组织(例如血液、骨髓等)和/或器官(例如肝)中有循环病毒粒子(参见例如疾病控制中心介绍(Center for Disease Control description)；也参见US 2011/0189226)。时常发生白细胞和血小板数减少。
出血性登革热(DHF)是DV感染的一种潜在致命的并发症。DHF的特征在于极度嗜睡和嗜眠，伴随着与登革热有关的高热和其它症状。增加的血管渗透性和异常的内稳定可以引起血容量减少、低血压，且在严重情况下引起低血容性休克和内出血。在出血性登革热的发生中似乎起主要作用的两个因素是：伴有高水平病毒血症的快速病毒复制；和伴有高水平炎性介体释放的重大炎症反应。在不治疗的情况下，出血性登革热的死亡率可达到10％。
儿童尤其易受DV感染的影响，所述影响可在反复暴露的情况下显著增强。在初次登革病毒感染期间，大部分儿童经历亚临床感染或轻度未分型的发热综合症。在二次登革病毒感染期间，疾病的病理生理学通常显著改变。连续感染可以引起被称为登革休克综合征(DSS)的急性血管渗透性综合症。DSS通常是DHF的进展且时常是致命的。DSS的特征在于快速和低容积脉搏、低血压、肢体发冷和坐立不安。在无医学干预的情况下，DSS的死亡率可以达到40％-50％(蒂利耶(Thullier)等人,1999生物技术杂志(Journal ofBiotechnology)69:183-190)。DSS的严重度是年龄相关的，且血管渗漏在幼龄儿童中最为严重。
成人中的DV感染通常伴随着可导致严重出血的出血倾向。DV感染在其发生于患有哮喘、糖尿病和/或其它慢性疾病的个体时可危及生命(古兹曼等人,2010自然评论·微生物学8:S7-16)。
所提出的阐明二次DV病例中严重疾病风险增加的主要理论为抗体依赖性增强(ADE)。登革病毒(DV)展示出对每一血清型独特的抗体表位以及血清型之间或当中共有的表位。已经历初次DV感染(并且从其恢复)的个体可产生与所有DV血清型(DV1-4)交叉反应的稳健抗体反应。然而，尽管有交叉反应性，但抗体仅通过相同(同源)血清型预防再感染，并且个体易受不同(异源)血清型的后续感染。经历新血清型的二次登革感染的个体面临远为更大的发展DHF的风险，指示预先存在的对DV的免疫性可以加重疾病。DV的ADE理论假定来自第一次感染的弱中和抗体结合于第二血清型并且增强携有FcγR的骨髓细胞(如单核细胞和巨噬细胞)的感染(瓦哈拉(Wahala)等人,2011病毒(Viruses)3:2374-2395)。
已提出至少三种类型的机制来阐明DV感染的严重形式的发展：(i)其可能由特别毒性的病毒株引起；(ii)预先存在的亚中和抗体可增强单核细胞或巨噬细胞对DV的抗体介导的摄取，所述单核细胞或巨噬细胞被称为DV的宿主细胞(例如ADE)；和(iii)针对病毒的非结构蛋白(NS1)的抗体可能与纤维蛋白原、凝血细胞和内皮细胞交叉反应，由此触发出血。
目前，不存在对登革热的特定治疗。推荐疗法解决症状，并且包括卧床休息、经由退热剂和/或镇痛剂控制发热和疼痛以及充分补水。努力集中于平衡体液损失、置换凝血因子以及输注肝素。DV的序列和抗原变异性已对开发有效疫苗或治疗剂的努力形成挑战(怀特黑德(Whitehead)等人.,2007自然评论·微生物学(Nature Reviews Microbiology)5:518-528)。令人遗憾的是，主要疫苗候选物近来在II期研究中展示出仅30％的保护功效(托马斯(Thomas)等人,2011当前传染病观点(Curr Op Infectious Disease)24:442-450；沙差龙(Sabchareon)等人,2012柳叶刀(Lancet)380(9853):1559-1567)。因此，需要发展改进的DV疗法、疫苗。尤其有价值的将是发展适用于所有DV血清型的治疗。所述疗法将对人类健康(尤其在发展中国家中)具有巨大影响。
DV抗原
DV感染是由四种病毒(DV1-4)引起的，这四种病毒具有类似的血清学类型但在抗原上不同。DV是属于黄病毒科内的黄病毒属的正义单股RNA病毒。病毒粒子包含直径为40-50nm的球形粒子，其具有脂多糖包膜。长度约11kb的RNA基因组包含5'I型端但缺乏3'聚A尾。基因组的组织包含以下元件：5'非编码区(NCR)、编码结构蛋白(衣壳(C)、前膜/膜(prM/M)、包膜(E))的区域和编码非结构蛋白(NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5)的区域以及3'NCR。
病毒基因组RNA与衣壳蛋白结合以形成核壳体。作为黄病毒的典型，登革病毒基因组编码不间断编码区，其翻译成会经翻译后加工的单一多蛋白。DV的重要生物特性(包括受体结合、红细胞血凝、诱导中和抗体以及保护性免疫反应)与E蛋白相关(瓦哈拉等人,2011病毒3:2374-2395)。
PrM蛋白，一种约19kDa的糖蛋白，含有形成三个二硫桥键的六个高度保守的半胱氨酸残基，且在成熟期间利用弗林蛋白酶(furin)或弗林蛋白酶样蛋白酶裂解成Pr和M蛋白。
NS1蛋白质，也是一种约40kDa的糖蛋白，含有形成六个二硫桥键的12个高度保守的半胱氨酸残基，且存在于细胞内、细胞表面上和细胞外部(赖(Lai)等人,2008病毒学杂志(Journal of Virology)82(13):6631-43)。
E蛋白，一种约55kDa的糖蛋白，含有形成六个二硫桥键的12个严格保守的半胱氨酸残基，且在病毒粒子成熟之前作为与PrM蛋白的杂二聚体存在。E蛋白的胞外域的X射线晶体学研究已揭示了利用一个螺旋杆锚和两个反向平行跨膜域连接于病毒膜的三个不同的β-桶域。域III(EDIII)采用免疫球蛋白样折叠，且已表明在受体相互作用中起到关键作用。域II(EDII)是由两个长的指状结构组成的细长域且在顶端含有高度保守的13个氨基酸融合环(EDII-FL)并且参与E蛋白的膜融合和二聚化。E的中央域(域I；EDI)是九股β-桶，其分别利用一个和四个柔性连接子连接于EDIII和EDII。E蛋白对于在黄病毒生命周期期间的病毒装配、受体连接、进入、病毒融合以及可能的免疫逃避来说很重要，并且因此是在病毒粒子上采用数种不同构象和排列所需的动态蛋白。此外，E蛋白是中和与增强抗体两者的主要目标(赖等人,2008病毒学杂志82:6631-6643；皮尔逊(Pierson)等人,2008细胞宿主和微生物(Cell Host&Microbe)4:229-38)。
DV装配在内质网(ER)的膜上，且病毒以不成熟病毒粒子形式出芽到ER的管腔中。不同于具有平滑表面的成熟病毒粒子，出芽到ER中的不成熟病毒粒子具有由在病毒包膜上形成六十个具有二十面体对称性的钉状突起的E/prM杂二聚体的三聚体形成的粗糙表面(佩雷拉(Perera)等人,2008抗病毒研究(Antivir.Res.)8011-22)。每个三聚体的E蛋白远离病毒粒子的表面突出且经由包括融合环的EDII的远端与prM相互作用。不成熟病毒粒子上的PrM限制E蛋白在病毒外溢期间在低pH高尔基体衍生的分泌区室中经历寡聚重排的能力，由此预防过早和不定的融合(吉拉库(Guirakhoo)等人,1991病毒学杂志(Journal of Virology)72:1323-1329；海因茨(Heinz)等人,1994病毒学杂志198(1):109-117)。随着不成熟病毒粒子经由跨高尔基体网络(TGN)的酸性区室运输，prM和E蛋白的取向变化揭露了细胞丝氨酸蛋白酶弗林蛋白酶的位点。在此低pH环境中，不成熟病毒粒子的E蛋白形成了抵着病毒粒子表面平放的反向平行二聚体且经安排具有T＝3准二十面体对称性(余(Yu)等人,2009病毒学杂志83(23):12101-12107)。prM蛋白继续掩蔽EDII的融合环直到其在弗林蛋白酶裂解之后被释放为止，且在胞外空间发生pH转变到中性。所得成熟和感染性的病毒是由90个E蛋白二聚体和约70个氨基酸M蛋白的180个拷贝组成的相对光滑粒子。在此构型中，成熟DV上的E蛋白存在于由其与2重、3重或5重对称轴的接近性界定的三个不同环境中(库恩(Kuhn)等人,2002细胞(Cell)108:717-25)。因此，所有E蛋白亚基并不在病毒表面上的相同环境中，且空间和其它考量引起一些E亚基相较于其它E亚基与受体和抗体优先相互作用。
识别E蛋白上高度保守融合环的抗体展示出对所有四种DV血清型的广泛反应性；然而，其中和效力通常是有限的，可能归因于此表位在成熟DV中基本上是不可到达的。识别E蛋白域III(EDIII)的'A'β股的一些抗体已展示出强力中和特定DV病毒株，但已知不针对所有四种血清型有效(洛克(Lok)等人,自然·结构与分子生物学(Nature Structural&Molecular Biol.)15:312-317)。'A'β股是定在EDIII上的位置305-308(DV3编号)中心处的亚复合表位的一部分。
如本文中所述，本发明涵盖以下发现：E抗原，且尤其是EDIII域可以充当适用于广谱抗DV抗体药剂的抗原目标。本发明尤其展示结合于E抗原(例如EDIII域)但不中和所有DV血清型的抗体可经合理地工程化，从而制造中和所有DV血清型1-4的变异体和/或其它抗体药剂(参见例如图3)。此外，本发明展示结合于E抗原(例如EDIII域)并中和一些但非所有DV血清型的抗体可经合理地工程化，从而制造变异体和/或其它抗体药剂，所述变异体和/或其它抗体药剂与亲本抗体相比具有针对一或多种具体病毒株和/或血清型的获得的中和活性，且与亲本抗体相比不显著耗乏其针对某些其它病毒株和/或亚型的活性。
4E11抗体
抗体已被证实为一类有效的抗病毒治疗剂，在某种程度上归因为其较高生物化学特异性和其已获确认的安全性记录。另外，抗体具有较长的血清半衰期(约21天)，使得能够在人中预防性使用，一种对于展示快速爆发的传染性疾病(包括登革病毒)尤其需要的应用。
针对黄病毒感染保护的抗体被认为经由多种机制起作用，包括以下各者中的一或多者：(1)直接中和受体结合，(2)抑制病毒融合，(3)Fc-γ-受体依赖性病毒清除，(4)补体介导的病毒或经感染细胞的裂解，以及(5)经感染细胞的抗体依赖性细胞毒性(皮尔逊(Pierson)等人,2008细胞宿主和微生物(Cell Host&Microbe)4:229-38)。黄病毒中和被认为需要通过多个抗体结合(道得(Dowd)等人,2011病毒学(Virology)411:306-15)。使用E16(一种在连接后期中和西尼罗河病毒(West Nile virus)的EDIII结合单抗)的研究指示需要约30个抗体来结合以实现有效中和。研究表明，抗体结合的亲和力和可到达的表位总数两者促成抗体的中和效力。因此，即使对于以高亲和力结合的抗体来说，抗体在可到达的表位数目低于中和所需的特定水平时仍将无法中和。相反地，较低亲和力抗体可在许多表位是结合可到达的时中和。
如已注意到，登革病毒(DV)展示出对每一血清型独特的抗体表位和血清型之间共有的表位。大多数为了理解抗体如何中和或增强DV而进行的研究已使用小鼠单克隆抗体(单抗)进行。由于E蛋白是病毒粒子表面上暴露的主要抗原，故结合于E蛋白的小鼠单抗已成为许多分析的焦点。尽管中和性小鼠单抗已映射到所有三个域，但最强力的中和性单抗是血清型特异性的并且结合于EDIII(其从病毒粒子表面突出)。EDIII上指示侧脊和A股表位的两个部分重叠表位是中和DV的小鼠单抗的主要目标。
侧脊表位与血清型特异性强力中和抗体相互作用。举例来说，单抗3H5映射到DV血清型2的EDIII-LR，且由这些单抗识别的表位定位于A股(氨基酸304)和FG环(残基383和384)两者上(苏库波尔维-佩蒂(Sukupolvi-Petty)等人,2007病毒学杂志(Journal ofVirology)81(23):12816-12826)。
然而，并非所有结合EDIII的抗体均展现出类型特异性中和活性。结合于A股表位的单抗与DV的一种以上血清型交叉反应，且称为登革病毒亚复合体中和单抗。举例来说，亚复合体特异性单抗1A1D-2识别定在EDIII的侧表面的A股中心处的表位，且可以通过DV血清型1-3(DV1-3)而非DV血清型4(DV4)中和感染(洛克等人,2008自然·结构与分子生物学15(3):312-317；勒里希(Roehrig)等人,1998病毒学(Virology)246(2):317-328；苏库波尔维-佩蒂等人,2007病毒学杂志81(23):12816-12826)。已经研究了这种单抗特异性的分子基础；在1A1D-2表位中心处的三个残基中仅一者在所有四种DV血清型(DV1-4)之间保守。还通过广泛地中和交叉反应性DV单抗4E11来识别类似的A股表位(蒂利耶(Thullier)等人,2001普通病毒学杂志(Journal Gen Virol.)82(8):1885-1892)。然而，迄今为止，实验方法未能得到能够强力中和所有四种DV血清型的抗体。
一种在E糖蛋白的EDIII内结合的称为4E11的特定鼠类单克隆抗体展示出针对DV血清型1-4的强力中和活性。4E11结合于E糖蛋白的DV EDIII上的构象表位并与所有四种血清型交叉反应。4E11通过干扰与宿主细胞连接而强力中和DV1-3。然而，其对DV4的亲和力不佳，并且因此中和活性较弱。
分泌小鼠单克隆抗体4E11的杂交瘤细胞系已寄存在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，登录号：HB-9259。野生型(“wt”)4E11重链(HC；SEQ ID NO.1)和轻链(LC；SEQ ID NO.2)的序列是已知的。野生型4E11框架(FR)和互补决定区(CDR)的序列是已知的(野生型4E11HC FR1是SEQ ID NO.3，野生型4E11HC FR2是SEQ ID NO.4，野生型4E11HC FR3是SEQ ID NO.5，野生型4E11HCFR4是SEQ ID NO.6，野生型4E11HC CDR1是SEQ ID NO.7，野生型4E11HC CDR2是SEQ ID NO.8，野生型4E11HC CDR3是SEQ ID NO.9；野生型4E11LC FR1是SEQID NO.10，野生型4E11LC FR2是SEQ ID NO.11，野生型4E11LC FR3是SEQ ID NO.12，野生型4E11LC FR4是SEQ ID NO.13，野生型4E11LC CDR1是SEQ ID NO.14，野生型4E11LC CDR2是SEQ ID NO.15，野生型4E11LC CDR3是SEQ ID NO.16)。
SEQ ID NO.1：
EVKLLEQSGAELVKPGASVRLSCTASGFNIKDTYMSWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLHLSSLTSGDTAVYYCSRGWEGFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO.2：
ELVMTQTPASLAVSLGQRATISCRASENVDRYGNSFMHWYQQKAGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYFCQRSNEVPWTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO.3：
EVKLLEQSGAELVKPGASVRLSCTAS
SEQ ID NO.4：
YMSWVKQRPEQGLEWIGRI
SEQ ID NO.5：
TKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLHLSSLTSGDTAVYYCSR
SEQ ID NO.6：
WGQGTLVTVSA
SEQ ID NO.7：
GFNIKDT
SEQ ID NO.8：
DPANGD
SEQ ID NO.9：
GWEGFAY
SEQ ID NO.10：
ELVMTQTPASLAVSLGQRATISC
SEQ ID NO.11：
WYQQKAGQPPKLLIY
SEQ ID NO.12：
GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYFC
SEQ ID NO.13：
FGGGTKLEIKR
SEQ ID NO.14：
RASENVDRYGNSFMH
SEQ ID NO.15：
RASNLES
SEQ ID NO.16：
QRSNEVPWT
本发明涵盖所希望的是开发作为野生型4E11的变异体的抗体(或其它抗体药剂)的认识。本发明尤其提供所述抗体和抗体药剂。也就是说，本发明提供各种抗体药剂，其展示出与4E11的显著结构一致性且此外展示出与在野生型4E11下观察到的功能特征相比改进的功能特征(例如DV4的中和)。
本发明为对接抗原-抗体相互作用提供新颖评分量度。评分量度框架根据在分子间界面中观察到的物理化学特征和成对氨基酸相互作用倾向对蛋白质-蛋白质界面进行评级。本发明使用这一框架来修改现有抗体的特性。在一些实施例中，修改抗体对其抗原的特异性和亲和力。在一些实施例中，经修饰的抗体为单克隆抗体。在一些实施例中，公开于本发明中的框架用于工程化对抗DV中和单抗的更广泛特异性和亲和力。
使用对接模型，检查抗DV抗体结合于DV的所有四种血清型(DV1-4)的模式，并鉴别这些抗体对DV4的不佳亲和力的结构基础。在这些抗体的互补位上小心设计突变以改进其对DV4的亲和力，并由此改进其对DV4的中和活性，同时维持对DV1-3的亲和力和中和活性。为了设计突变，一次一个小心地检查单抗的CDR环残基。在给定CDR位置处，除甘氨酸(Gly)和脯氨酸(Pro)以外，“野生型”残基系统地经其余氨基酸取代，且使用统计成对倾向在每一实例处评估置换的概率。Gly和Pro残基不经修饰以避免主链构象的变化。将具有高置换可能性的单一突变模型化，且计算地再评估以寻找这样的突变：(1)不改变值；(2)不掩埋极性基团；和(3)改进H键、盐桥、范德华力(van derWaals)、疏水性接触和堆积。使用高通量间接酶联免疫吸附分析(ELISA)方法来筛选通过计算方法鉴别的有前景的单一突变，从而鉴别改进对DV4EDIII的亲和力同时维持对DV1-3EDIII的亲和力的阳性突变。最后，将阳性单一突变组合以合理地设计高亲和力抗体。进行竞争ELISA实验以测定工程化的抗体与来自四种血清型中的每一者的EDIII之间在平衡和呈溶解状态时的亲和力。使用表面等离子体子共振(SPR)分析验证结合测量值。
在一些实施例中，针对A股表位的抗体可经工程化以结合于DV的所有四种血清型。在一些实施例中，野生型4E11抗DV抗体经修饰以改进其对DV4的亲和力，且由此改进其对DV4的中和活性，同时维持对DV1-3的亲和力。在一些实施例中，经工程化的抗体中的一者在对DV2和DV4的EDIII的亲和力方面分别展示出约15和约450倍改进，同时维持对DV1和DV3的EDIII的原始亲和力。在一些实施例中，与野生型单抗4E11相比，经工程化的抗体对DV4展示出>75倍增加的中和潜力，同时仍维持对其它血清型的“野生型”活性。根据本发明的工程化的4E11抗体代表了令人感兴趣的治疗登革疾病的治疗性抗体的候选物。
所提供的变异DV抗体药剂
应了解，所提供的抗体药剂可以改进抗体药剂的特征和/或活性的方式工程化、产生和/或纯化。举例来说，所提供的抗体药剂的改进的特征尤其包括(但不限于)增加的稳定性、改进的结合亲和力和/或亲合力、增大的结合特异性、增加的产生、减少的聚集、减少的非特异性结合。
一般来说，如本文中所述，所提供的抗体药剂可以为或包括例如多克隆抗体；单克隆抗体或其抗原结合片段；经修饰的抗体，如嵌合抗体、再成形抗体、人类化抗体或其片段(例如Fab'、Fab、F(ab')2)；或生物合成抗体，例如单链抗体、单域抗体(DAB)、Fv、单链Fv(scFv)等。
制造和使用多克隆和单克隆抗体的方法例如描述在哈洛(Harlow)等人,使用抗体：实验室手册：便携式方案I(Using Antibodies:A Laboratory Manual:Portable Protocol I).冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)(1998年12月1日)中。制造经修饰的抗体药剂(如抗体和抗体片段(例如嵌合抗体、再成形抗体、人类化抗体或其片段，例如Fab'、Fab、F(ab')2片段)；或生物合成抗体(例如单链抗体、单域抗体(DAB)、Fv、单链Fv(scFv)等))的方法为此项技术中已知且可见于例如左拉(Zola),单克隆抗体：单克隆抗体和工程化抗体衍生物的制备和使用(Monoclonal Antibodies:Preparation and Use ofMonoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives),斯普林格出版社(SpringerVerlag)(2000年12月15日；第1版)中。
本发明提供结合于DV的所有四种血清型(DV1-4)的抗体药剂。在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其以与另一抗体对DV1的亲和力相比更高的亲和力结合于DV1。在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其以与另一抗体对DV2的亲和力相比更高的亲和力结合于DV2。在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其以与另一抗体对DV3的亲和力相比更高的亲和力结合于DV3。在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其以与另一抗体对DV4的亲和力相比更高的亲和力结合于DV4。在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其以与另一抗体对DV1、DV2、DV3和DV4的亲和力相比更高的亲和力结合于DV1、DV2、DV3和DV4。在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其以与另一抗体对这些DV血清型的亲和力相比更高的亲和力结合于DV4，且保持对DV1、DV2和DV3的结合亲和力。在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其以与另一抗体对这些DV血清型的亲和力相比更高的亲和力结合于DV1和DV4。在一些实施例中，所提供的抗体药剂以与另一抗体对这些DV血清型的亲和力相比更高的亲和力结合于DV1和DV4，且保持其对DV2和DV3的结合亲和力。在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其以与另一抗体对这些DV血清型的亲和力相比更高的亲和力结合于DV2和DV4。在一些实施例中，所提供的抗体药剂以与另一抗体对这些DV血清型的亲和力相比更高的亲和力结合于DV2和DV4，且保持其对DV1和DV3的结合亲和力。在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其以与另一抗体对这些DV血清型的亲和力相比更高的亲和力结合于DV3和DV4。在一些实施例中，所提供的抗体药剂以与另一抗体对这些DV血清型的亲和力相比更高的亲和力结合于DV3和DV4，且保持其对DV1和DV2的结合亲和力。
在一些实施例中，所提供的抗体药剂以与不同抗体对DV1-4中的一或多者的亲和力相比至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或90％以上的亲和力结合于DV1-4中的一或多者。在一些实施例中，所提供的抗体药剂以与不同抗体对DV1-4中的一或多者的亲和力相比至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍或500倍以上亲和力的亲和力结合于DV1-4中的一或多者。在一些实施例中，所提供的抗体药剂对不同DV血清型展示出在彼此亲和力的2倍以内、5倍以内、10倍以内、25倍以内、50倍以内、100倍以内、150倍以内、200倍以内、250倍以内、300倍以内、350倍以内或400倍以内的结合亲和力。
在一些实施例中，所提供的抗体药剂展示在如本文中所述和/或示例的范围内的中和IC50(μg/ml)。在一些实施例中，所提供的抗体药剂展示下限为约0.05μg/ml且上限为约10μg/ml的中和IC50(μg/ml)。在一些实施例中，所提供的抗体药剂展示中和IC50(μg/ml)，其下限选自由以下组成的群组：0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml、0.8μg/ml、0.9μg/ml、1.0μg/ml、1.1μg/ml、1.2μg/ml、1.3μg/ml、1.4μg/ml、1.5μg/ml、1.6μg/ml、1.7μg/ml、1.8μg/ml、1.9μg/ml、2.0μg/ml、2.5μg/ml、3.0μg/ml、3.5μg/ml、4.0μg/ml、4.5μg/ml、5.0μg/ml或5.0μg/ml以上，且其上限比下限高且选自由以下组成的群组：1.5μg/ml、1.6μg/ml、1.7μg/ml、1.8μg/ml、1.9μg/ml、2.0μg/ml、2.5μg/ml、3.0μg/ml、3.5μg/ml、4.0μg/ml、4.5μg/ml、5.0μg/ml、5.5μg/ml、6.0μg/ml、6.5μg/ml、7.0μg/ml、7.5μg/ml、8.0μg/ml、8.5μg/ml、9.0μg/ml、9.5μg/ml、10.0μg/ml或10.0μg/ml以上。
在一些实施例中，所提供的抗体药剂展示以一定的KD(nM)结合于DV1-4，所述KD低于40000nM、低于30000nM、低于20000nM、低于10000nM、低于5000nM、低于2000nM、低于1500nM、低于1000nM、低于500nM、低于250nM、低于225nM、低于200nM、低于175nM、低于150nM、低于125nM、低于100nM、低于75nM、低于50nM、低于25nM、低于15nM、低于10nM、低于5nM、低于2.5nM、低于1nM、低于0.5nM、低于0.25nM、低于0.1nM。
在一些实施例中，所提供的抗体药剂展示以下限为约0.01×105M-1s-1且上限为约5.0×106M-1s-1的Kon(M-1s-1)结合于DV1-4。在一些实施例中，所提供的抗体展示以一定的Kon(M-1s-1)结合于DV1-4，所述Kon的下限选自由以下组成的群组：0.01×105M-1s-1、0.05×105M-1s-1、0.1×105M-1s-1、0.5×105M-1s-1、1.0×105M-1s-1、2.0×105M-1s-1、5.0×105M-1s-1、7.0×105M-1s-1或7.0×105M-1s-1以上，且其上限比下限高且选自由以下组成的群组：1.0×106M-1s-1、1.5×106M-1s-1、2.0×106M-1s-1、2.5×106M-1s-1、3.0×106M-1s-1、3.5×106M-1s-1、4.0×106M-1s-1、4.5×106M-1s-1、5.0×106M-1s-1或5.0×106M-1s-1以上。
在一些实施例中，所提供的抗体药剂展示以下限为约5×10-4s-1且上限为约900×10-4s-1的Koff(s-1)结合于DV1-4。在一些实施例中，所提供的抗体药剂展示以一定的Koff(s-1)结合于DV1-4，所述Koff的下限选自由以下组成的群组：5×10-4s-1、10×10-4s-1、12×10-4s-1、13×10-4s-1、14×10-4s-1、15×10-4s-1、18×10-4s-1、20×10-4s-1或20×10-4s-1以上，且其上限比下限高且选自由以下组成的群组：50×10-4s-1、100×10-4s-1、120×10-4s-1、140×10-4s-1、150×10-4s-1、200×10-4s-1、300×10-4s-1、400×10-4s-1、500×10-4s-1、600×10-4s-1、700×10-4s-1、800×10-4s-1、900×10-4s-1或900×10-4s-1以上。
在一些实施例中，所提供的抗体药剂结合于DV1-4的E糖蛋白。在某些实施例中，所提供的抗体药剂结合于DV1-4的EDIII(SEQ ID NO.17-20)。在一些实施例中，所提供的抗体药剂结合于DV1-4的A股。在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其以更高亲和力结合于DV4的EDIII(SEQ ID NO.20)。在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其以更高亲和力结合于DV4的A股。
SEQ ID NO.17：
MCTGSFKLEKEVAETQHGTVLVQVKYEGTDAPCKIPFSSQDEKGVTQNGRLITANPIVTDKEKPVNIEAEPPFGESYIVVGAGEKALKLSWFK
SEQ ID NO.18：
MCTGKFKVVKEIAETQHGTMVIRVQYEGDDSPCKIPFEIMDLEKKHVLGRLITVNPIVIEKDSPINIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFK
SEQ ID NO.19：
MCTNTFVLKKEVSETQHGTILIKVEYKGEDAPCKIPFSTEDGQGKAHNGRLITANPVVTKKEEPVNIEAEPPFGESNIVIGIGDNALKINWYK
SEQ ID NO.20：
MCSGKFSIDKEMAETQHGTTVVKVKYEGAGAPCKVPIEIRDVNKEKVVGRIISSTPLAENTNSVTNIELEPPFGDSYIVIGVGNSALTLHWFR
在一些实施例中，本发明鉴别出在位置305、306、307、308、309、310、311、312、323、325、327、329、360、361、362、363、364、385、387、388、389、390、391和/或其组合处结合于DV1-4的EDIII(SEQ ID NO.17-20)中的一或多个氨基酸残基的抗体药剂。在一些实施例中，本发明鉴别出在位置305、310、311、323、327、329和/或其组合处结合于DV1-4的EDIII(SEQ ID NO.17-20)中的一或多个氨基酸残基的抗体药剂。在一些实施例中，本发明鉴别出在位置305、310、311、323、327和329处结合DV1-4的EDIII(SEQ ID NO.17-20)中的氨基酸残基的抗体药剂。在一些实施例中，本发明鉴别出在位置305处结合DV1-4的EDIII(SEQ ID NO.17-20)中的氨基酸残基的抗体药剂。在一些实施例中，本发明鉴别出在位置310处结合DV1-4的EDIII(SEQ ID NO.17-20)中的氨基酸残基的抗体药剂。在某些实施例中，本发明鉴别出在位置311处结合DV1-4的EDIII(SEQ ID NO.17-20)中的氨基酸残基的抗体药剂。在一些实施例中，本发明鉴别出在位置323处结合DV1-4的EDIII(SEQ ID NO.17-20)中的氨基酸残基的抗体药剂。在一些实施例中，本发明鉴别出在位置327处结合DV1-4的EDIII(SEQ ID NO.17-20)中的氨基酸残基的抗体药剂。在一些实施例中，本发明鉴别出在位置329处结合DV1-4的EDIII(SEQ ID NO.17-20)中的氨基酸残基的抗体药剂。
在一些实施例中，位置305处的丝氨酸、赖氨酸和/或苏氨酸残基有助于结合于所提供的抗体药剂。在一些实施例中，位置310处的赖氨酸残基有助于结合于所提供的抗体药剂。在一些实施例中，位置311处的赖氨酸残基有助于结合于所提供的抗体药剂。在一些实施例中，位置323处的精氨酸、赖氨酸和/或谷氨酰胺残基有助于结合于所提供的抗体药剂。在一些实施例中，位置327处的丝氨酸和/或谷氨酸残基有助于结合于所提供的抗体药剂。在一些实施例中，位置329处的精氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸残基有助于结合于所提供的抗体药剂。
在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其与野生型(“wt”)DV抗体相比以更高亲和力结合于DV1。在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其与野生型或亲本参考DV抗体相比以更高亲和力结合于DV2。在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其与如野生型DV抗体的参考抗体相比以更高亲和力结合于DV3。在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其与参考DV抗体相比以更高亲和力结合于DV4。在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其与参考DV抗体相比以更高亲和力结合于DV1、DV2、DV3和DV4。在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其与参考DV抗体相比以更高亲和力结合于DV4且保持对DV1、DV2和DV3的结合亲和力。在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其与参考(野生型)DV抗体相比以更高亲和力结合于DV2和DV4。在一些实施例中，所提供的抗体药剂与参考DV抗体相比以更高亲和力结合于DV2和DV4且保持其对DV1和DV3的结合亲和力。在一些实施例中，野生型DV抗体为野生型4E11抗体。
如本文中所述，本发明提供抗体药剂，其展示与4E11的特定结构(即，序列)关系和/或具有特定功能属性，包括例如与野生型4E11相比某些改进的功能属性。
在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其氨基酸序列展示出与野生型4E11的特定水平同源性和/或一致性。在一些实施例中，所提供的抗体药剂展示出与野生型4E11(即，与SEQ ID NO.1-2)至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％一致性。
在一些实施例中，所提供的抗体药剂具有包含序列GFNIKDT(SEQ ID NO.23)的重链(HC；SEQ ID NO.21)CDR1、包含序列DPENGD(SEQ ID NO.24)的HC CDR2、包含序列GWEGFAY(SEQ ID NO.25)的HC CDR3、包含序列RASENVDKYGNSFMH(SEQ IDNO.26)的轻链(LC；SEQ ID NO.22)CDR1、包含序列RASELQW(SEQ ID NO.27)的LCCDR2区和包含序列QRSNEVPWT(SEQ ID NO.28)的LC CDR3区。
SEQ ID NO.21：
EVKLLEQSGAELVKPGASVRLSCTASGFNIKDTYMSWVKQRPEQGLEWIGRIDPENGDTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLHLSSLTSGDTAVYYCSRGWEGFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO.22：
ELVMTQTPASLAVSLGQRATISCRASENVDKYGNSFMHWYQQKAGQPPKLLIYRASELQWGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYFCQRSNEVPWTFGGGTKLEIKR
在一些实施例中，所提供的抗体药剂具有一或多个CDR和/或一或多个FR，其序列与野生型4E11的相应CDR或FR(即，与SEQ ID NO.7-9、14-16或3-6、10-13中的一或多者)一致。在一些实施例中，所提供的抗体药剂具有一或多个CDR和/或FR，其展示出与如下文所论述的野生型4E11的相应CDR和/或FR的特定程度的同源性和/或一致性。在一些实施例中，所提供的抗体药剂的所有CDR和FR均展示出至少特定水平的同源性和/或一致性。在一些实施例中，所提供的抗体药剂具有CDR和FR序列，其与野生型4E11相比共同含有不超过18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。
在一些实施例中，本发明的抗体药剂的互补决定区(CDR)1展示出与野生型4E11(SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.14)至少65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或大于99％的一致性。在一些实施例中，所提供的CDR1具有与野生型4E11的氨基酸序列一致的氨基酸序列和/或与野生型4E11(SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.14)的CDR1相比不含任何氨基酸取代。在一些实施例中，所提供的CDR1与野生型4E11(SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.14)相比具有一或多个氨基酸取代。在一些实施例中，所提供的CDR1与野生型4E11(SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.14)相比将具有两个或两个以上氨基酸取代。在一些实施例中，所提供的CDR与野生型4E11相比具有1、2、3、4或5个取代且在一些实施例中具有1、2或3个取代。
在一些实施例中，本发明的抗体药剂的CDR2展示出与野生型4E11(SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.15)至少65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或大于99％的一致性。在一些实施例中，所提供的CDR2具有与野生型4E11的氨基酸序列一致的氨基酸序列和/或与野生型4E11(SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.15)的CDR2相比不含任何氨基酸取代。在一些实施例中，所提供的CDR2与野生型4E11(SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.15)相比具有一或多个氨基酸取代。在一些实施例中，所提供的CDR2与野生型4E11(SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.15)相比将具有两个或两个以上氨基酸取代。在一些实施例中，所提供的CDR与野生型4E11相比具有1、2、3、4或5个取代且在一些实施例中具有1、2或3个取代。
在一些实施例中，本发明的抗体药剂的CDR3展示出与野生型4E11(SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.16)至少65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或大于99％的一致性。在一些实施例中，所提供的CDR3具有与野生型4E11的氨基酸序列一致的氨基酸序列和/或与野生型4E11(SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.16)的CDR3相比不含任何氨基酸取代。在一些实施例中，所提供的CDR3与野生型4E11(SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.16)相比具有一或多个氨基酸取代。在一些实施例中，所提供的CDR3与野生型4E11(SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.16)相比将具有两个或两个以上氨基酸取代。在一些实施例中，所提供的CDR与野生型4E11相比具有1、2、3、4或5个取代且在一些实施例中具有1、2或3个取代。
在一些实施例中，所提供的本发明的抗体药剂的框架区1(FR1)与野生型4E11(SEQID ID NO.3和SEQ ID NO.10)将具有大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或大于99％的一致性。在一些实施例中，所提供的FR1与野生型4E11(SEQ ID ID NO.3和SEQ ID NO.10)相比将不具有氨基酸取代。在一些实施例中，所提供的FR1与野生型4E11(SEQ ID ID NO.3和SEQ ID NO.10)相比将具有一或多个氨基酸取代。在一些实施例中，所提供的FR1与野生型4E11(SEQ ID ID NO.3和SEQ ID NO.10)相比将具有两个或两个以上氨基酸取代。
在一些实施例中，所提供的本发明的抗体药剂的框架区2(FR2)与野生型4E11(SEQID NO.4和SEQ ID NO.11)将具有大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或大于99％的一致性。在一些实施例中，所提供的FR2与野生型4E11(SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.11)相比将不具有氨基酸取代。在一些实施例中，所提供的FR2与野生型4E11(SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.11)相比将具有一或多个氨基酸取代。在一些实施例中，所提供的FR2与野生型4E11(SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.11)相比将具有两个或两个以上氨基酸取代。
在一些实施例中，所提供的本发明的抗体药剂的框架区3(FR3)与野生型4E11(SEQID NO.5和SEQ ID NO.12)将具有大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或大于99％的一致性。在一些实施例中，所提供的FR3与野生型4E11(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.12)相比将不具有氨基酸取代。在一些实施例中，所提供的FR3与野生型4E11(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.12)相比将具有一或多个氨基酸取代。在一些实施例中，所提供的FR3与野生型4E11(SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.12)相比将具有两个或两个以上氨基酸取代。
在一些实施例中，所提供的本发明的抗体药剂的框架区4(FR4)与野生型4E11(SEQID NO.6和SEQ ID NO.13)将具有大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或大于99％的一致性。在一些实施例中，所提供的FR4与野生型4E11(SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.13)相比将不具有氨基酸取代。在一些实施例中，所提供的FR4与野生型4E11(SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.13)相比将具有一或多个氨基酸取代。在一些实施例中，所提供的FR3与野生型4E11(SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.13)相比将具有两个或两个以上氨基酸取代。
在一些实施例中，所提供的抗体药剂的VH CDR展示出与野生型4E11(SEQ ID NO.:7-9)至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％的一致性。在一些实施例中，所提供的抗体药剂的VH CDR展示出与野生型4E11(SEQ ID NO.:7-9)至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％的一致性，但因CDR内的至少一个氨基酸取代的取代而不同。在一些实施例中，所提供的抗体药剂的VH CDR在野生型4E11抗体的位置55处具有相应氨基酸残基的取代。在一些实施例中，位置55处的取代氨基酸残基选自由谷氨酸和天冬氨酸组成的群组。在一些实施例中，位置55处的取代氨基酸残基为谷氨酸。在一些实施例中，所提供的抗体的VH CDR中对应于野生型4E11的位置55处的氨基酸残基的氨基酸残基不为丙氨酸。
在一些实施例中，所提供的抗体药剂的VL CDR展示出与野生型4E11(SEQ ID NO.:14-16)至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％的一致性。在一些实施例中，所提供的抗体药剂的VL CDR展示出与野生型4E11(SEQ ID NO.:14-16)至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％的一致性，但因CDR内的至少一个氨基酸取代的取代而不同。在一些实施例中，所提供的抗体药剂的VLCDR在野生型4E11抗体的位置31、57、59、60和/或其组合处具有相应氨基酸残基的一或多个取代。在一些实施例中，所提供的抗体药剂的VL CDR在野生型4E11抗体的位置31处具有相应氨基酸残基的取代。在一些实施例中，位置31处的取代氨基酸残基为赖氨酸。在一些实施例中，所提供的抗体药剂的VL CDR中对应于野生型4E11的位置55处的氨基酸残基的氨基酸残基不为精氨酸。在一些实施例中，所提供的抗体药剂的VL CDR在野生型4E11抗体的位置57处具有相应氨基酸残基的取代。在一些实施例中，位置57处的取代氨基酸残基选自由谷氨酸和丝氨酸组成的群组。在一些实施例中，位置57处的取代氨基酸残基为谷氨酸。在一些实施例中，所提供的抗体药剂的VL CDR中对应于野生型4E11的位置57处的氨基酸残基的氨基酸残基不为天冬酰胺。在一些实施例中，所提供的抗体药剂的VL CDR在野生型4E11抗体的位置59处具有相应氨基酸残基的取代。在一些实施例中，位置59处的取代氨基酸残基选自由谷氨酰胺和天冬酰胺组成的群组。在一些实施例中，位置59处的取代氨基酸残基为谷氨酰胺。在一些实施例中，所提供的抗体药剂的VL CDR中对应于野生型4E11的位置59处的氨基酸残基的氨基酸残基不为谷氨酸。在一些实施例中，所提供的抗体药剂的VL CDR在野生型4E11抗体的位置60处具有相应氨基酸残基的取代。在一些实施例中，位置60处的取代氨基酸残基选自由色氨酸、酪氨酸和精氨酸组成的群组。在一些实施例中，位置60处的取代氨基酸残基为色氨酸。在一些实施例中，所提供的抗体药剂的VL CDR中对应于野生型4E11的位置60处的氨基酸残基的氨基酸残基不为丝氨酸。
在一些实施例中，所提供的抗体药剂的VH和VL CDR展示出与野生型4E11(分别为SEQ ID NO.:7-9和14-16)至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％的一致性。在一些实施例中，所提供的抗体药剂的VH和VL CDR展示出与野生型4E11(分别为SEQ ID NO.:7-9和14-16)至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％的一致性，但因CDR内至少一个氨基酸取代的取代而不同。在一些实施例中，所提供的抗体药剂的VH CDR在位置55处具有相应氨基酸残基的取代，且所提供的抗体药剂的VL CDR在野生型4E11抗体的位置31、57、59和60处具有相应氨基酸残基的取代。在一些实施例中，位置55处的取代氨基酸残基为谷氨酸。在一些实施例中，位置31处的取代氨基酸残基为赖氨酸。在一些实施例中，位置57处的取代氨基酸残基为谷氨酸。在一些实施例中，位置59处的取代氨基酸残基为谷氨酰胺。在一些实施例中，位置60处的取代氨基酸残基为色氨酸。
在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其展示以一定的KD(nM)结合于EDIII-DV4(SEQ ID NO.20)，所述KD低于40000nM、低于30000nM、低于20000nM、低于15000nM、低于10000nM、低于8000nM、低于5000nM、低于4000nM、低于3000nM、低于2000nM、低于1500nM、低于1000nM、低于500nM、低于250nM、低于225nM、低于200nM、低于175nM、低于150nM、低于125nM、低于100nM、低于75nM或低于50nM。
在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其展示以一定的KD(nM)结合于EDIII-DV1(SEQ ID NO.17)，所述KD低于3nM、低于2.5nM、低于2nM、低于1.5nM、低于1.0nM、低于0.5nM、低于0.4nM、低于0.3nM、低于0.2nM、低于0.1nM或低于0.05nM。
在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其展示以一定的KD(nM)结合于EDIII-DV2(SEQ ID NO.18)，所述KD低于15nM、低于12nM、低于10nM、低于8nM、低于7nM、低于5nM、低于2.5nM、低于2nM、低于1.5nM、低于1nM、低于0.5nM、低于0.4nM、低于0.3nM、低于0.2nM或低于0.1nM。
在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其展示以一定的KD(nM)结合于EDIII-DV3(SEQ ID NO.19)，所述KD低于120nM、低于100nM、低于50nM、低于40nM、低于35nM、低于30nM、低于25nM、低于20nM、低于15nM、低于10nM、低于5nM、低于2.5nM或低于1.0nM。
在一些实施例中，本发明提供与野生型4E11相比对结合于EDIII-DV4具有至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍或500倍以上亲和力的抗体药剂。
在一些实施例中，本发明提供与野生型4E11相比对结合于EDIII-DV2具有至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或90倍以上亲和力的抗体药剂。
在一些实施例中，本发明提供与野生型4E11相比对结合于EDIII-DV1和/或EDIII-DV3具有至少1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍或60倍以上亲和力的抗体药剂。
在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其展示60μg/ml或60μg/ml以下、50μg/ml或50μg/ml以下、40μg/ml或40μg/ml以下、30μg/ml或30μg/ml以下、20μg/ml或20μg/ml以下、10μg/ml或10μg/ml以下、5μg/ml或5μg/ml以下、4μg/ml或4μg/ml以下、3μg/ml或3μg/ml以下、2μg/ml或2μg/ml以下的EDIII-DV4(SEQ ID NO.20)的中和IC50(μg/ml)。
在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其展示7.0μg/ml或7.0μg/ml以下、6.0μg/ml或6.0μg/ml以下、5.0μg/ml或5.0μg/ml以下、4.0μg/ml或4.0μg/ml以下、3.0μg/ml或3.0μg/ml以下、2.0μg/ml或2.0μg/ml以下、1.5μg/ml或1.5μg/ml以下、1.0μg/ml或1.0μg/ml以下、0.90μg/ml或0.90μg/ml以下、0.80μg/ml或0.80μg/ml以下、0.70μg/ml或0.70μg/ml以下、0.60μg/ml或0.60μg/ml以下、0.50μg/ml或0.50μg/ml以下的EDIII-DV3(SEQ ID NO.19)的中和IC50(μg/ml)。
在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其展示0.2μg/ml或0.2μg/ml以下、0.19μg/ml或0.19μg/ml以下、0.18μg/ml或0.18μg/ml以下、0.17μg/ml或0.17μg/ml以下、0.16μg/ml或0.16μg/ml以下、0.15μg/ml或0.15μg/ml以下、0.14μg/ml或0.14μg/ml以下、0.13μg/ml或0.13μg/ml以下、0.12μg/ml或0.12μg/ml以下、0.11μg/ml或0.11μg/ml以下、0.10μg/ml或0.10μg/ml以下、0.09μg/ml或0.09μg/ml以下、0.07μg/ml或0.07μg/ml以下、0.06μg/ml或0.06μg/ml以下、0.05μg/ml或0.05μg/ml以下、0.04μg/ml或0.04μg/ml以下、0.03μg/ml或0.03μg/ml以下、0.02μg/ml或0.02μg/ml以下、0.01μg/ml或0.01μg/ml以下的EDIII-DV2(SEQ ID NO.18)的中和IC50(μg/ml)。
在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其展示5.0μg/ml或5.0μg/ml以下、4.0μg/ml或4.0μg/ml以下、3.0μg/ml或3.0μg/ml以下、2.5μg/ml或2.5μg/ml以下、2.0μg/ml或2.0μg/ml以下、1.5μg/ml或1.5μg/ml以下、1.0μg/ml或1.0μg/ml以下、0.90μg/ml或0.90μg/ml以下、0.70μg/ml或0.70μg/ml以下、0.50μg/ml或0.50μg/ml以下、0.40μg/ml或0.40μg/ml以下、0.30μg/ml或0.30μg/ml以下、0.20μg/ml或0.20μg/ml以下、0.10μg/ml或0.10μg/ml以下的EDIII-DV1(SEQ ID NO.17)的中和IC50(μg/ml)。
在一些实施例中，本发明提供与野生型4E11相比对EDIII-DV4的中和具有至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、400倍、500倍或500倍以上减少的IC50的抗体药剂。
在一些实施例中，本发明提供与野生型4E11相比对EDIII-DV2的中和具有至少1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍或60倍以上减少的IC50的抗体药剂。
在一些实施例中，本发明提供与野生型4E11相比对EDIII-DV1和/或EDIII-DV3的中和具有至少1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍或60倍以上减少的IC50的抗体药剂。
在一些实施例中，所提供的抗体药剂中的一或多个序列已经工程化(例如通过亲和力成熟或其它优化方法工程化)来改进如此项技术中已知的一或多种特征或活性(例如增大稳定性、减少聚集、减小免疫原性等)。
在一些实施例中，抗体药剂通过聚乙二醇化、甲基化、唾液酸化、胺化或硫酸化来修饰。在一些实施例中，抗体药剂缀合于两亲性核/壳以产生聚合胶束。在一些实施例中，抗体药剂缀合于超支化大分子(即树枝状聚合物)。在一些实施例中，抗体药剂缀合于天然聚合物，所述天然聚合物选自由以下组成的群组：白蛋白、壳聚糖、肝素、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、聚-(L-谷氨酸)、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)、聚-(L-丙交酯)(PLA)、聚(酰胺胺)(PAMAM)叶酸和/或其组合。在一些实施例中，抗体药剂包含亲水性氨基酸的一或多个长的非结构化尾(rPEG)。在一些实施例中，预期使用不改变抗体组合位点的反应条件通过在免疫球蛋白的Fc区中选择性引入巯基来衍生免疫球蛋白。根据这一方法产生的抗体缀合物可展现改进的长寿命、特异性和敏感性(美国专利第5,196,066号，其以引用的方式并入本文中)。其中报导或效应分子缀合于Fc区中的碳水化合物残基的效应或报导分子的位点特异性连接也已公开于文献(奥香内西(O'Shannessy)等人,1987)中。
抗体和/或抗体片段
在一些实施例中，所提供的DV抗体药剂为或包含抗体或其片段。在一些实施例中，所提供的DV抗体药剂为或包含单克隆抗体或其片段。在一些实施例中，所提供的DV抗体药剂为或包含多克隆抗体或其片段。在一些实施例中，DV抗体药剂为或包含“全长”抗体，因为其含有两个重链和两个轻链，如在天然产生的抗体下出现般任选地利用二硫键结合。在一些实施例中，DV抗体药剂为或包含全长抗体的片段，因为其含有一些但非所有全长抗体中可见的序列。举例来说，在一些实施例中，DV抗体药剂为或包含抗体片段，其包括(但不限于)Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv双功能抗体和Fd片段。在一些实施例中，所提供的DV抗体药剂为或包含作为选自由IgG、IgM、IgA、IgD、IgE组成的群组的抗体类别的成员的抗体或其片段。在一些实施例中，所提供的DV抗体药剂为或包含通过化学合成产生的抗体。在一些实施例中，所提供的DV抗体药剂为或包含利用细胞产生的抗体。在一些实施例中，所提供的DV抗体药剂为或包含使用重组细胞培养系统产生的抗体。在一些实施例中，所提供的DV抗体药剂为或包含嵌合抗体，例如来自小鼠、大鼠、马、猪或其它物种，携有人类恒定和/或可变区域。
在一些实施例中，DV抗体药剂包括一或多种抗体片段，包括(但不限于)Fab'、Fab、F(ab')2、单域抗体(DAB)、Fv、scFv(单链Fv)、具有抗体CDR的多肽、展示CDR(例如抗运载蛋白)的骨架域或纳米抗体。举例来说，所提供的抗体可为仅包含重链的VHH(即，抗原特异性VHH)抗体。所述抗体分子可来源于羊驼或其它骆驼科抗体(例如骆驼科IgG2或IgG3，或来自所述骆驼科Ig的CDR呈现框架)或来源于鲨鱼抗体。在一些实施例中，DV抗体药剂为或包含avibody(双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体)。制备和使用各种基于抗体的构筑体和片段的技术是在此项技术中熟知的。制备和表征抗体的手段也是在此项技术中熟知的(参见例如，抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual),冷泉港实验室,1988；以引用的方式并入本文中)。
在一些实施例中，所提供的DV抗体药剂包括一或多种“微抗体”或“微型抗体”。微型抗体是sFv多肽链，其在其C端包括寡聚域，利用铰链区与sFv分离(帕克(Pack)等人(1992)生物化学(Biochem)31:1579-1584)。寡聚域包含自缔合α-螺旋，例如亮氨酸拉链，其可利用其它二硫键进一步稳定。寡聚域经设计以与跨膜的矢量折叠(一种被认为有助于多肽体内折叠成功能性结合蛋白的过程)相容。微型抗体通常使用此项技术中熟知的重组方法产生。参见例如帕克(Pack)等人(1992)生物化学(Biochem)31:1579-1584；康伯(Cumber)等人(1992)免疫学杂志(J Immunology)149B:120-126。
抗体药剂缀合物
在一些实施例中，所提供的DV抗体药剂为或包含缀合物，其中抗体部分包含或其组成为具有缀合部分的抗体或其功能性部分。在一些具体实施例中，如本文中所述的DV抗体药剂与一或多种活性剂或“有效负载(payload)”(如治疗剂或检测剂)结合提供和/或使用。在一些所述实施例中，DV抗体药剂与活性剂和/或有效负载之间的结合包含至少一种共价相互作用以便提供DV抗体缀合物。
在一些实施例中，抗体药剂为治疗性有效负载药剂，其为具有所需活性(例如抗病毒活性、消炎活性、细胞毒性活性等)的效应实体。治疗剂可为或包含任何类别的化学实体，包括例如蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸、小有机分子、非生物聚合物、金属、离子、放射性同位素等。在一些实施例中，根据本发明使用的治疗剂可具有与治疗DV感染的一或多种症状或病因有关的生物活性(例如抗病毒、减轻疼痛、消炎、免疫调节、诱导睡眠活性等)。在一些实施例中，根据本发明使用的治疗剂具有一或多种其它活性。
在一些实施例中，抗体药剂为有效负载检测剂，其为或包含任何例如因其特定功能特性和/或化学特征而可使用分析检测的部分。所述药剂的非限制性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、光亲和性分子、有色粒子或配体(如生物素)。
许多适当的有效负载检测剂是此项技术中已知的，用于其与抗体连接的系统也是此项技术中已知的(参见例如美国专利第5,021,236号、第4,938,948号和第4,472,509号，其各自以引用的方式并入本文中)。此类有效负载检测剂的实例尤其包括顺磁离子、放射性同位素、荧光染料、NMR可检测物质、X射线成像剂。举例来说，在一些实施例中，顺磁离子为以下各者中的一或多者：铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)、镧(III)、金(III)、铅(II)和/或铋(III)。
在一些实施例中，放射性同位素为以下各者中的一或多者：砹211、14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、铜67、152Eu、镓67、3氢、碘123、碘125、碘131、铟111、59铁、32磷、镭223、铼186、铼188、75硒、35硫、锝99m、钍227和/或钇90。放射性标记的抗体药剂可根据在此项技术中众所周知的方法产生。举例来说，单克隆抗体可通过与碘化钠和/或碘化钾以及化学氧化剂(如次氯酸钠)或酶促氧化剂(如乳过氧化酶)接触来碘化。所提供的抗体药剂可通过配体交换过程来经锝99m标记，例如通过以下方式进行：用亚锡溶液还原高锝酸盐，将还原的锝螯合到Sephadex柱上，并将抗体施加到这一柱中。在一些实施例中，所提供的DV抗体药剂使用直接标记技术，例如通过培育高锝酸盐、还原剂(如SNCl2)、缓冲溶液(如邻苯二甲酸钠钾溶液)和抗体来标记。通常用于将以金属离子形式存在的放射性同位素与抗体结合的中间官能团是二亚乙三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
在一些实施例中，荧光标记尤其为或包含以下各者中的一或多者：Alexa 350、Alexa430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、级联蓝(Cascade Blue)、Cy3、Cy5,6-FAM、荧光素异硫氰酸酯、HEX、6-JOE、俄勒冈绿(Oregon Green)488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝(Pacific Blue)、REG、罗丹明绿(Rhodamine Green)、罗丹明红(Rhodamine Red)、肾造影剂(Renographin)、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明(Tetramethylrhodamine)和/或德克萨斯红(Texas Red)。
此项技术中已知数种用于将抗体药剂连接或缀合于有效负载的方法。一些连接方法涉及使用金属螯合复合体，其利用例如有机螯合剂(如二亚乙三胺五乙酸酐(DTPA)；乙三胺四乙酸；N-氯-对甲苯磺酰胺；和/或四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3)连接于抗体(美国专利第4,472,509号和第4,938,948号，其各自以引用的方式并入本文中)。所提供的DV抗体药剂也可与酶在偶合剂(如戊二醛或高碘酸盐)的存在下反应。与荧光素标记物的缀合物在这些偶合剂的存在下或通过与异硫氰酸酯的反应进行制备。
制造抗体
所提供的包括抗体和/或其特征部分或编码其的核酸的抗体药剂可通过任何可利用的手段制造。用于产生抗体(例如单克隆抗体和/或多克隆抗体)的方法是此项技术中熟知的。应了解，广泛范围的动物物种可用于制造抗血清，包括兔、小鼠、大鼠、仓鼠、天竺鼠或山羊。如所属领域的技术人员应已知的，动物的选择可根据操纵的简易性、成本或所需的血清量决定。应了解，抗体药剂也可经由产生针对所关注的免疫球蛋白重链和轻链序列转基因的哺乳动物或植物并从其制造呈可回收形式的抗体来以转基因的方式制造。结合哺乳动物中的转基因制造，抗体可在山羊、牛或其它哺乳动物的乳汁中制造并从所述乳汁中回收。参见例如，美国专利第5,827,690号、第5,756,687号、第5,750,172号和第5,741,957号。
所提供的抗体药剂(包括抗体和/或特征部分)可例如通过使用经工程化以表达本发明抗体编码核酸的宿主细胞系统制造。可替代地或另外，所提供的抗体药剂可部分或完全通过化学合成(例如使用自动肽合成仪)制备。
适于本发明的抗体药剂制剂的示例性来源包括(但不限于)：从培养表达所关注的蛋白的重组细胞系获得的条件培养基、或来自例如抗体产生细胞、细菌、真菌细胞、昆虫细胞、转基因植物或植物细胞、转基因动物或动物细胞的细胞提取物、或动物血清、腹水液、杂交瘤或骨髓瘤上清液。适合的细菌细胞包括(但不限于)大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞。适合的大肠杆菌菌株的实例包括：HB101、DH5α、GM2929、JM109、KW251、NM538、NM539和任何无法裂解外来DNA的大肠杆菌菌株。可使用的适合的真菌宿主细胞包括(但不限于)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、甲醇酵母(Pichia pastoris)和曲霉(Aspergillus)细胞。适合的昆虫细胞包括(但不限于)S2施耐德细胞(S2Schneider cell)、D.Mel-2细胞、SF9、SF21、High-5TM、Mimic TM-SF9、MG1和KC1细胞。适合的示例性重组细胞系包括(但不限于)BALB/c小鼠骨髓瘤系、人类视网膜母细胞(PER.C6)、猴肾细胞、人类胚胎肾脏系(293)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠塞特利氏细胞(mouse sertoli cell)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人类宫颈癌细胞(HeLa)、犬肾细胞、布法罗大鼠肝细胞(buffalo rat liver cell)、人类肺细胞、人类肝细胞、小鼠乳房肿瘤细胞、TRI细胞、MRC 5细胞、FS4细胞和人类肝癌系(Hep G2)。
所关注的抗体药剂可使用此项技术中已知的各种载体(例如病毒载体)表达，并且细胞可在此项技术中已知的各种条件(例如分批进料)下培养。基因工程化细胞以产生抗体的各种方法是此项技术中熟知的。参见例如，奥斯贝(Ausubel)等人,编,(1990),最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology)(纽约威利(Wiley,NewYork))。
必要时，所提供的抗体药剂可使用过滤、离心和/或各种色谱方法(如HPLC或亲和色谱法)纯化。在一些实施例中，所提供的抗体药剂的片段是通过包括用酶(如胃蛋白酶木瓜蛋白酶)消化的方法和/或通过化学还原裂解二硫键来获得的。
核酸
在某些实施例中，本发明提供编码抗体药剂的核酸。在一些实施例中，本发明提供与编码抗体药剂的核酸互补的核酸。
在一些实施例中，本发明提供与编码抗体药剂的核酸杂交的核酸分子。所述核酸可以例如用作引物或探针。仅举几例，所述核酸可以用作聚合酶链反应(PCR)中的引物、用作用于杂交(包括原位杂交)的探针和/或用作用于反转录-PCR(RT-PCR)的引物。
在某些实施例中，核酸可以为DNA或RNA，并且可以为单股或双股的。在一些实施例中，核酸可包括一或多个非天然核苷酸；在一些实施例中，核酸仅包括天然核苷酸。
DV相关药剂的表征和/或鉴别
在一些实施例中，本发明提供抗体药剂，其可用于鉴别和/或表征一或多种模拟DV表位或药剂和/或诱发对DV的强力抗体反应的药剂。
在一些实施例中，所述药剂包括一或多种抗体样结合肽模拟物。刘(Liu)等人细胞分子生物学(Cell Mol Biol)(诺伊斯-勒-格兰德(Noisy-le-grand)).2003年3月；49(2):209-16描述了“抗体样结合肽模拟物”(ABiP)，其是充当简化抗体的肽，并且具有更长血清半衰期以及更不繁琐的合成方法的某些优点。同样，在一些方面中，抗体样分子是环状或双环肽。举例来说，用于分离抗原结合双环肽(例如通过噬菌体展示进行)和使用所述肽的方法提供在美国专利公开案第20100317547号中，所述公开案以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，所述药剂包括一或多种抗体样结合骨架蛋白质。举例来说，在一些实施例中，一或多个从抗体产生的CDR可接枝到蛋白质骨架上。一般来说，蛋白质骨架可符合最大数目的以下准则：(斯凯拉A.(Skerra A.),分子识别杂志(J.Mol.Recogn.),2000,13:167-187)：良好的系统发生保守；已知的三维结构(如例如通过晶体学、NMR光谱法或所属领域的技术人员已知的任何其它技术测定)；小尺寸；几乎没有或没有转录后修饰；和/或易于制造、表达和纯化。所述蛋白质骨架的来源可为(但不限于)纤维粘连蛋白(例如纤维粘连蛋白III型域10)、脂质运载蛋白、抗运载蛋白(斯凯拉A.生物技术杂志(J.Biotechnol.),2001,74(4):257-75)、从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的域B产生的蛋白Z、硫氧还蛋白A或具有重复基元(如“锚蛋白重复序列”(科尔(Kohl)等人,美国国家科学院院刊(PNAS),2003,第100卷,第4期,1700-1705)、“犰狳重复序列”、“富亮氨酸重复序列”和“三十四肽重复序列”)的蛋白质。举例来说，抗运载蛋白或脂质运载蛋白衍生物描述在美国专利公开案第20100285564号、第20060058510号、第20060088908号、第20050106660号和PCT公开案第WO2006/056464号中，所述公开案以引用的方式并入本文中。来源于毒素(如例如来自蝎子、昆虫、植物、软体动物等的毒素)的骨架和神经元NO合成酶的蛋白抑制剂(PIN)也可以根据本发明使用。
在一些实施例中，所述药剂包括模拟表位，其可用于破坏流感病毒与HA多肽受体之间的相互作用。在一些实施例中，模拟表位用于引发与其对应的目标表位所引发的抗体反应相同或类似的抗体反应。在一些实施例中，目标表位是在一种以上DV血清型间保守的序列。在一些实施例中，保守表位是在DV血清型1-4间保守的序列。在一些实施例中，表位是位于E糖蛋白的A股区内的保守序列。在一些实施例中，模拟表位是肽。在一些实施例中，模拟表位是小分子、碳水化合物、脂质或核酸。在一些实施例中，模拟表位是保守流感表位的肽或非肽模拟表位。在一些实施例中，通过模拟所界定的病毒表位的结构，模拟表位干扰DV粒子结合于其天然结合搭配物的能力，例如通过结合于天然结合搭配物自身来干扰。
在一些实施例中，所述药剂是订书肽。在一些实施例中，订书肽包含编码一或多个CDR和/或FR的氨基酸序列，所述一或多个CDR和/或FR包含与抗DV抗体(例如4E11)的相应CDR和/或FR至少大于65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性和/或一致性。在一些实施例中，订书肽包含编码一或多个VH和/或VL链序列的氨基酸序列，所述一或多个VH和/或VL链序列包含与抗DV抗体(例如4E11)的对应的VH和VL链至少大于65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性和/或一致性。
在某些实施例中，所述药剂为或包含核酸，如DNA或RNA。在某些实施例中，核酸可以为DNA或RNA，并且可以为单股或双股的。在一些实施例中，核酸可包括一或多个非天然核苷酸。在一些实施例中，核酸仅包括天然核苷酸。在一些实施例中，核酸经设计以模拟DV多肽内的表位。在一些实施例中，核酸经设计以模拟一或多种DV血清型内的保守表位。在一些实施例中，所述药剂为或包含一或多种寡核苷酸。在一些实施例中，所述药剂为或包含一或多种寡核苷酸，所述一或多种寡核苷酸包含如环、发夹、折叠或其组合的二级结构。在一些实施例中，所述药剂为或包含一或多种寡核苷酸，所述一或多种寡核苷酸包含高级(三级或四级)结构。在一些实施例中，所述药剂为或包含适体。
在一些实施例中，可以将疫苗设计成诱导产生已经发现患者所缺乏的抗体。在一些实施例中，疫苗组合物宜包含具有天然构象、介导保护性反应(例如补体活化、病毒中和等)和/或可诱发强烈的抗体反应的抗原。在一些实施例中，疫苗含有个体体内无法对其自然产生抗体的表位或其模拟表位。举例来说，用DV抗体(例如识别多种血清型的DV抗体)分离的合成肽模拟表位具有诱发与用于模拟表位原始分离的抗体类似的强力免疫反应的潜力。投与此类疫苗可能诱使患者的免疫系统开始产生一组针对所投与的表位的抗体。应了解，本发明的模拟表位(或表位)可以单独或与重组蛋白、失活的DV病毒、杀死的DV病毒组合和/或以数种不同模拟表位的混合物形式使用。
在一些实施例中，可以利用针对DV的疫苗进行主动免疫接种(即，对个体投与微生物、蛋白质、肽、表位、模拟表位等进行的免疫接种)。在一些实施例中，可使用针对DV的疫苗，其可包含模拟DV包膜糖蛋白的DV A股区的至少一种构象表位的任何药剂。举例来说，所述药剂可为肽、蛋白质、糖肽、糖蛋白、小分子、模拟表位、有机化合物、脂质、糖类、有机金属化合物、无机化合物等。在一些实施例中，以疫苗形式提供的表位包括针对已知会预防感染的抗体的表位。在一些实施例中，根据本发明以疫苗形式提供的表位包括在不同病毒基因型和/或亚型间或不同病毒株间保守的表位。在一些实施例中，将含有DV的A股区的构象界定的表位的肽或蛋白用于疫苗调配物，从而预防由DV引起的感染、延缓其发作、对其进行治疗、改善其症状和/或降低其严重度。在一些实施例中，DV A股区表位可为线性表位。在一些实施例中，A股区表位可为线形和构象表位的混合物。在一些实施例中，A股区表位可为构象表位。在一些实施例中，肽表位的长度小于100个氨基酸。在某些实施例中，肽表位的长度小于50、小于40、小于30、小于20或小于10个氨基酸。在一些实施例中，用于调配疫苗的肽是DV的A股区蛋白的肽片段。通常使用肽，所述肽以与其在天然A股区蛋白中的三维折叠类似的方式折叠，由此保存构象表位的三维结构。
用于鉴别和/或表征DV结合剂的系统
本发明提供用于测试、表征和/或鉴别DV抗体药剂的多种系统。在一些实施例中，所提供的DV抗体药剂用于鉴别和/或表征其它DV结合剂(例如抗体、多肽、小分子等)。
在一些实施例中，所提供的DV结合剂通过所述系统和方法表征，所述系统和方法涉及使DV结合剂与一或多种候选底物(如DV多肽区、DV多肽上的N-聚糖、DV受体、唾液酸化DV受体和/或唾液酸化DV受体上的聚糖)接触。
在一些实施例中，可使用计算方法测试、表征和/或鉴别DV结合剂(例如交叉反应性抗体)。在一些实施例中，计算方法涉及使用蛋白质-蛋白质(例如抗体-抗原)相互作用共有的物理化学特征来预测蛋白质-蛋白质相互作用和亲和力增强性突变。举例来说，在中和DV中使用这一方法产生的抗体的效力可接着通过此项技术中已知的各种分析(例如斑减少中和测试、ELISA、血凝分析和蛋白质印迹法(Western blot))加以预测。
在一些实施例中，DV结合剂和/或候选底物可游离于溶液中、固定于支撑物、和/或在细胞中和/或在细胞表面上表达。候选底物和/或药剂可经标记，由此允许检测结合。或者DV结合剂或者候选底物是经标记的物质。可进行其中一种物质经标记的竞争结合形式，并且可测量游离标记相较于结合标签的量以测定对结合的作用。
在一些实施例中，结合分析例如涉及使候选底物暴露于DV结合剂并且检测所述候选底物与所述药剂之间的结合。结合分析可在体外(例如在实质上仅包含所提及的组分的候选试管中；在无细胞提取物中；和/或在实质上纯化的组分中)执行。可替代地或另外，结合分析可在细胞中和/或在体内(例如在细胞、组织、器官和/或生物体内；下文进一步详细描述)执行。
在某些实施例中，使至少一种DV结合剂与至少一种候选底物接触并检测作用。在一些实施例中，举例来说，使DV结合剂与候选底物接触，并且监测两种实体之间的结合。在一些实施例中，分析可能涉及使候选底物与药剂的特征部分接触。检测DV药剂与候选底物的结合。应了解，可使用DV结合剂的片段、部分、同系物、变异体和/或衍生物，其限制条件为其包含结合一或多种候选底物的能力。
DV药剂与候选底物的结合可利用此项技术中熟知的多种方法测定。在一些实施例中，结合测量可使用SPR分析执行。在一些实施例中，SPR分析可用于测量DV结合剂的亲和力和动力学结合参数。在一些实施例中，可使用涉及固相结合的DV药剂并检测其与一或多种候选底物的相互作用的分析。因此，DV结合剂可包含可检测标记物，如放射性、荧光和/或发光标记。此外，候选底物可与允许间接检测(例如借助于利用会使用显色底物的酶和/或借助于结合可检测抗体)的物质偶联。由于与候选底物的相互作用而引起的DV结合剂的构象变化可例如通过可检测标记物的发射光变化来检测。可替代地或另外，固相结合的蛋白质复合体可借助于质谱进行分析。
在一些实施例中，DV结合剂可为非固定的。在一些实施例中，非固定的组分可经标记(例如经放射性标记、表位标签、酶-抗体缀合物等标记)。可替代地或另外，结合可利用免疫检测技术测定。举例来说，反应混合物可经历蛋白质印迹法，且印迹用检测非固定组分的抗体探测。可替代地或另外，ELISA可用于针对结合的分析。在一些实施例中，DV药剂对候选底物的结合亲和力可通过使用高通量间接ELISA分析来测定。
在一些实施例中，灶减少中和测试(FRNT)分析可用于测量DV结合剂的活性或中和效力。在一些实施例中，动物宿主可用于测量体内抗DV活性。
在某些实施例中，可针对DV药剂与候选底物之间的结合直接分析细胞。免疫组织化学技术、共聚焦技术和/或评估结合的其它技术是所属领域的技术人员所熟知的。各种细胞系可用于此类筛选分析，包括为此目的专门工程化的细胞。筛选分析中所用细胞的实例包括哺乳动物细胞、真菌细胞、细菌细胞或病毒细胞。细胞可为经刺激细胞，如用生长因子刺激的细胞。所属领域的技术人员应理解，本文所公开的本发明涵盖多种用于测量DV结合剂结合于候选底物的能力的细胞内分析。
视分析而定，可能需要细胞和/或组织培养物。细胞可使用多种不同生理分析中的任一者检查。可替代地或另外，可进行分子分析，包括(但不限于)监测蛋白质表达和/或测试蛋白质-蛋白质相互作用的蛋白质印迹法；监测其它化学修饰的质谱；等。
在一些实施例中，本文中所述的结合分析可使用一系列浓度的DV结合剂和/或候选底物进行。在一些实施例中，本文中所述的结合分析用于评估候选底物结合于在抗体浓度范围内(例如大于约100μg/ml、约100μg/ml、约50μg/ml、约40μg/ml、约30μg/ml、约20μg/ml、约10μg/ml、约5μg/ml、约4μg/ml、约3μg/ml、约2μg/ml、约1.75μg/ml、约1.5μg/ml、约1.25μg/ml、约1.0μg/ml、约0.9μg/ml、约0.8μg/ml、约0.7μg/ml、约0.6μg/ml、约0.5μg/ml、约0.4μg/ml、约0.3μg/ml、约0.2μg/ml、约0.1μg/ml、约0.05μg/ml、约0.01μg/ml和/或小于约0.01μg/ml)的DV药剂的能力。
在一些实施例中，本文中所述的结合研究中的任一者可以高通量方式执行。使用高通量分析，可在一天内筛选高达数千种药剂。在一些实施例中，微量滴定板的每一孔均可用于运作针对所选候选底物的独立分析，或者，如果欲观察浓度和/或孵育时间影响，那么每5-10孔可以测试单一候选底物。因此，单个标准微量滴定板可以分析药剂与候选底物之间的最多96个结合相互作用；如果使用1536孔板，那么单个板可以分析药剂与候选底物之间的最多1536个结合相互作用；等等。每天可分析许多板。举例来说，可使用根据本发明的高通量系统对抗体与候选底物之间的结合相互作用进行高达约6,000、约20,000、约50,000或超过约100,000次分析筛选。
在一些实施例中，所述方法使用动物宿主。如本文中所用，“动物宿主”包括适于流感研究的任何动物模型。举例来说，适于本发明的动物宿主可为任何哺乳动物宿主，包括灵长类动物、雪貂、猫、狗、牛、马、啮齿动物(如小鼠、仓鼠、兔和大鼠)。在某些实施例中，用于本发明的动物宿主是雪貂。具体来说，在一些实施例中，动物宿主在投与药剂(任选地呈本发明组合物形式)之前未经受病毒暴露或感染。在一些实施例中，动物宿主在投与药剂之前或同时接种、感染或以其它方式暴露于病毒。用于本发明实践中的动物宿主可以通过此项技术中已知的任何方法接种、感染或以其它方式暴露于病毒。在一些实施例中，动物宿主可以经鼻内接种、感染或暴露于病毒。
可以使用未经处理和/或已接种的动物来进行多种研究中的任一种。举例来说，如此项技术中已知，所述动物模型可以用于病毒传播研究。预期在病毒传播研究中使用雪貂可以充当关于人类病毒传播的可靠预报因子。病毒传播研究可用于测试药剂。举例来说，DV结合剂可在病毒传播研究之前、期间或之后投与适合的动物宿主，以便测定所述药剂在阻断动物宿主中的病毒结合和/或感染力方面的功效。使用从动物宿主中的病毒传播研究搜集的信息，可预测药剂在阻断人类宿主中的病毒结合和/或感染力方面的功效。
医药组合物
本发明提供包含一或多种所提供的抗体药剂的组合物。在一些实施例中，本发明提供至少一种抗体和至少一种医药学上可接受的赋形剂。所述医药组合物可任选地包含一或多种其它治疗活性物质和/或与其组合投与。在一些实施例中，所提供的医药组合物适用于药物。在一些实施例中，所提供的医药组合物在治疗或预防DV感染或与DV感染关联或相关的负面影响中适用作预防性药剂(即疫苗)。在一些实施例中，所提供的医药组合物适用于治疗性应用，例如在罹患或易患DV感染的个体中。在一些实施例中，医药组合物被调配成用于投与人类。
举例来说，本文提供的医药组合物可以无菌可注射形式(例如适于皮下注射或静脉内输注的形式)提供。举例来说，在一些实施例中，医药组合物以适于注射的液体剂型提供。在一些实施例中，医药组合物以粉末(例如冻干和/或灭菌粉末)形式任选地在真空下提供，其在注射之前用水性稀释剂(例如水、缓冲液、盐溶液等)复原。在一些实施例中，医药组合物在水、氯化钠溶液、乙酸钠溶液、苯甲醇溶液、磷酸盐缓冲盐水等中稀释和/或复原。在一些实施例中，粉末应轻轻地与水性稀释剂混合(例如不振荡)。
在一些实施例中，所提供的医药组合物包含一或多种医药学上可接受的赋形剂(例如防腐剂、惰性稀释剂、分散剂、表面活性剂和/或乳化剂、缓冲剂等)。在一些实施例中，医药组合物包含一或多种防腐剂。在一些实施例中，医药组合物不包含防腐剂。
在一些实施例中，医药组合物以可冷藏和/或冷冻的形式提供。在一些实施例中，医药组合物以不可冷藏和/或冷冻的形式提供。在一些实施例中，复原的溶液和/或液体剂型在复原之后可储存一定的时间段(例如2小时、12小时、24小时、2天、5天、7天、10天、2周、一个月、两个月或更长)。
液体剂型和/或复原溶液在投与之前可包含微粒物质和/或变色。在一些实施例中，如果变色或混浊和/或如果在过滤之后微粒物质保留，那么不应使用溶液。
本文中所述的医药组合物的调配物可通过药理学领域中已知或此后发展的任何方法制备。在一些实施例中，所述制备方法包括以下步骤：使活性成分与一或多种赋形剂和/或一或多种其它附加成分结合，且接着必要时和/或需要时，将产品成形和/或包装到所需单剂量或多剂量单位中。
根据本发明的医药组合物可以散装、以单一单位剂量形式和/或以多个单一单位剂量形式制备、包装和/或出售。如本文中所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的医药组合物的个别量。活性成分的量通常等于将投与个体的剂量和/或所述剂量的方便分数，如例如所述剂量的二分之一或三分之一。
根据本发明的医药组合物的活性成分、医药学上可接受的赋形剂和/或任何其它成分的相对量可变化，取决于所治疗的个体的身份、身材和/或情况和/或取决于投与组合物的途径。作为举例，组合物可包含在0.1％与100％(w/w)之间的活性成分。
本发明的医药组合物可另外包含医药学上可接受的赋形剂，其如本文中所用可为或包含溶剂、分散介质、稀释剂、或其它液体媒剂、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等张剂、增稠或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，如适于所需具体剂型。雷明顿氏药学科学和实践(Remington's The Science and Practice of Pharmacy),第21版,A.R.根纳罗(A.R.Gennaro),(马里兰州巴尔的摩的利平科特威廉姆斯和威尔金斯公司(Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD),2006)公开了用于调配医药组合物的各种赋形剂和用于制备其的已知技术。除非任何常规赋形剂介质均不与物质或其衍生物相容，如因产生任何非所需生物作用，或另外与医药组合物的任何其它组分以有害方式相互作用，否则预期其使用在本发明的范围内。
疫苗
在一些实施例中，本发明提供疫苗组合物，其用于在罹患或易患DV感染的个体的被动免疫接种(即，向个体投与抗体的免疫接种)中使用和/或检查。在一些实施例中，在怀孕期间在抗体从母亲转移到胎儿时发生被动免疫接种。在一些实施例中，被动免疫接种包括向个体直接投与抗体药剂(例如通过注射、口服、经鼻等进行)。
在一些实施例中，预防应用可包括投与疫苗。在一些实施例中，针对个别患者定制疫苗接种。举例来说，如下文所述，可从患者收集血清，且针对DV的存在，且在一些实施例中针对一或多种具体DV血清型对其进行测试。在一些实施例中，所提供的疫苗的适当接受者是罹患或易患具有一或多种会被所提供的抗体结合和/或中和的DV血清型的感染的个体。
在一些实施例中，疫苗是口服、鼻内、皮下、肌内、皮内或经由任何其它医学上适当的投与途径投与的。应了解，每种投与途径可能需要独特的调配物或递送机制，且所述可变参数被涵盖在本发明的范围内。在一些实施例中，投与的途径和/或调配物可在某种程度上由个体的年龄和/或状况决定。举例来说，向婴儿投与疫苗可经由注射到大腿的前外侧(因为肌肉质量较大)来进行。在一些实施例中，当个体是儿童或成人时，向三角肌投与疫苗可为优选的。应理解，合理的医学判断应用于确定向具体个体投与的适当途径和/或调配物。
在一些实施例中，疫苗组合物包含至少一种佐剂。根据本发明，可以使用任何佐剂。大量佐剂是已知的；许多此类化合物的适用纲要由美国国家卫生研究院拟制且可见于www.niaid.nih.gov/daids/vaccine/pdf/compendium.pdf；也参见艾利森(Allison)(1998,生物标准化进展(Dev.Biol.Stand.),92:3-11；以引用的方式并入本文中)、翁克莱斯(Unkeless)等人(1998,免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.),6:251-281；以引用的方式并入本文中)和菲利浦(Phillips)等人(1992,疫苗(Vaccine),10:151-158；以引用的方式并入本文中)。此项技术中已知数百种不同的佐剂，并且都可用于实施本发明。可根据本发明使用的示例性佐剂包括(但不限于)细胞因子、凝胶型佐剂(例如氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙等)；微生物佐剂(例如包括CpG基元的免疫调节DNA序列；内毒素，如单磷酰脂质A；外毒素，如霍乱毒素、大肠杆菌不耐热毒素和百日咳毒素；胞壁酰二肽等)；基于油-乳液和乳化剂的佐剂(例如弗氏佐剂(Freund's Adjuvant)、MF59[诺华公司(Novartis)]、SAF等)；微粒状佐剂(例如脂质体、生物可降解微球体、皂苷等)；合成佐剂(例如非离子型嵌段共聚物、胞壁酰肽类似物、聚磷腈、合成多核苷酸等)；和/或其组合。其它示例性佐剂包括一些聚合物(例如聚磷腈；描述在美国专利5,500,161中，其以引用的方式并入本文中)、Q57、QS21、角鲨烯、四氯十氧化物等。先前已在上文标题为“医药组合物”的部分中进一步详细描述了医药学上可接受的赋形剂。
组合疗法
应了解，根据本发明的DV抗体药剂和/或其医药组合物可用于组合疗法。“与……组合”并不打算暗示所述药剂必须同时投与或调配用于一起递送，不过这些递送方法也在本发明的范围内。组合物可在一种或多种其它所需治疗剂或医学程序的同时、之前或之后投与。应了解，组合中所用的治疗活性剂可同时以单一组合物投与或分别以不同组合物投与。一般来说，各药剂将按照对于所述药剂所确定的剂量和/或时间表来投与。
用于组合方案中的疗法(例如治疗剂或程序)的具体组合应考虑所需治疗剂和/或程序的相容性以及需要获得的治疗作用。还应了解，本发明的医药组合物可用于组合疗法(例如组合疫苗疗法)，也就是说，医药组合物可在一或多种其它所需治疗和/或疫苗接种程序的同时、之前或之后投与。
根据本发明的抗体药剂的治疗有效量与所提供的医药组合物和至少一种其它活性成分组合使用。在一些实施例中，活性成分是抗病毒剂，如(但不限于)干扰素(例如干扰素α-2b、干扰素-γ等)、抗DV单克隆抗体、抗DV多克隆抗体、RNA聚合酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、解螺旋酶抑制剂、免疫调节剂、反义化合物、短干扰RNA、短发夹RNA、微RNA、RNA适体、核酶和其组合。用于组合方案中的具体疗法组合通常将考虑所需治疗剂和/或程序的相容性和所需获得的治疗作用。还应了解，所用疗法和/或疫苗可对同一病症实现所需作用(例如本发明抗原可与另一DV疫苗同时投与)，或其可实现不同作用。
应了解，所用疗法可为了同一目的实现所需作用(例如适用于治疗、预防DV感染和/或延缓其发作的DV抗体可与适用于治疗、预防DV感染和/或延缓其发作的另一药剂同时投与)，或其可实现不同作用(例如控制任何不良作用)。本发明涵盖医药组合物与可提高其生物可用性、减少和/或改变其代谢、抑制其排泄和/或改变其体内分布的药剂的组合的递送。
在一些实施例中，组合使用的药剂以不超过其单独使用时的水平的水平使用。在一些实施例中，组合使用的水平将低于单独使用的水平。
在一些实施例中，根据本发明的DV抗体可与干扰素、与RNA聚合酶抑制剂或与干扰素和RNA聚合酶抑制剂两者一起投与。
在一些实施例中，组合疗法可涉及投与针对单个表位(例如单个构象表位)的多种抗体药剂。在一些实施例中，组合疗法可包含识别不同表位(例如在同一病毒包膜蛋白上或在不同病毒包膜蛋白上，其中表位可能是或可能不是构象的)的多种抗体药剂，例如从而同时干扰感染过程中的多种机制。
在某些实施例中，根据本发明的组合物恰好包含针对A股区的一种抗体药剂。在某些实施例中，组合物包括和/或组合疗法使用恰好两种DV A股区抗体药剂。
所属领域的技术人员应了解，根据本发明的抗体药剂的任何排列或组合可与任何其它抗体药剂组合以调配包含多种不同抗体药剂的组合物和/或组合疗法方案。
投与方法
根据本发明的DV抗体药剂和根据本发明的其医药组合物可根据任何适当途径和方案投与。在一些实施例中，途径或方案是已与阳性治疗效益相关的途径或方案。在一些实施例中，途径或方案是已由FDA和/或EP批准的途径或方案。
在一些实施例中，确切投与量可能在个体与个体间变化，视医学领域中众所周知的一或多种因素而定。所述因素可包括例如以下各者中的一或多者：个体的种类、年龄、一般状况、感染的严重度、具体组合物、其投与模式、其活性模式、所治疗的病症和病症的严重度；所用特定DV抗体药剂的活性；所投与的特定医药组合物；组合物在投与之后的半衰期；个体的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；投与时间、投与途径和所用特定化合物的排泄速率；治疗持续时间；与所用特定化合物组合或同时使用的药物等。医药组合物可以单位剂型形式调配以易于投药且使剂量均一。然而，应了解，本发明的组合物的总日用量将由主治医生在合理的医学判断范围内决定。
本发明的医药组合物可利用任何途径投与，如所属领域的技术人员将了解。在一些实施例中，本发明的医药组合物通过口服(PO)、静脉内(IV)、肌内(IM)、动脉内、髓内、鞘内、皮下(SQ)、心室内、经皮、皮内、皮内、经直肠(PR)、经阴道、腹膜内(IP)、胃内(IG)、局部(例如利用粉末、软膏、乳膏、凝胶、洗剂和/或滴剂)、粘膜、鼻内、颊内、经肠、玻璃体、舌下；通过气管内滴入、支气管滴入和/或吸入；作为口服喷雾、经鼻喷雾和/或气溶胶和/或经由门静脉导管投与。
在特定实施例中，根据本发明的DV抗体药剂和/或其医药组合物可例如通过静脉内输注来静脉内投与。在特定实施例中，根据本发明的DV抗体药剂和/或其医药组合物可通过肌内注射来投与。在特定实施例中，根据本发明的DV抗体药剂和/或其医药组合物可通过皮下注射来投与。在特定实施例中，根据本发明的DV抗体药剂和/或其医药组合物可经由门静脉导管投与。然而，考虑到药物递送科学中可能的进展，本发明涵盖通过任何适当途径递送根据本发明的DV抗体药剂和/或其医药组合物。
在某些实施例中，根据本发明的DV抗体药剂和/或根据本发明的其医药组合物可以足以递送每天每千克个体体重约0.001mg到约100mg、约0.01mg到约50mg、约0.1mg到约40mg、约0.5mg到约30mg、约0.01mg到约10mg、约0.1mg到约10mg或约1mg到约25mg的剂量水平投与，从而获得所需治疗作用。可每天超过三次、每天三次、每天两次、每天一次、每隔一天、每隔两天、每隔一周、每隔两周、每隔三周、每隔四周、每隔两个月、每隔六个月或每隔十二个月递送所需剂量。在某些实施例中，所需剂量可使用多次投与(例如两、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四次或十四次以上投与)递送。
预防应用
在一些实施例中，根据本发明的DV抗体药剂可用于预防应用。在一些实施例中，预防应用涉及用于在易患DV感染和/或呈现DV感染症状的个体中对DV感染和/或任何其它DV相关病况进行预防、抑制其进展和/或延缓其发作的系统和方法。在一些实施例中，预防应用涉及用于预防脑感染、抑制其进展和/或延缓其发作的系统和方法。在一些实施例中，预防应用涉及用于预防重要器官(例如肝)损伤、抑制其进展和/或延缓重要器官损伤的系统和方法。
诊断应用
在一些实施例中，根据本发明的DV抗体药剂用于诊断应用。举例来说，借助于DV抗体药剂的结合特征曲线的多样性，可采用诊断分析，其将检测多种DV血清型的，以便提供泛DV抗体药剂，而同时能够通过减去分析来详细分析个别血清型。
出于诊断目的，抗体药剂可以多种形式用于检测包膜糖蛋白的A股区，辨别DV血清型，检测病毒粒子和抗体(参见例如美国专利第5,695,390号；以引用的方式并入本文中)。抗体药剂可单独或与主题群组的其它抗体或者其它抗体或与和存在于DV包膜蛋白上的糖基结合的凝集素组合使用。出于诊断目的，可以使用多种标记，其中大部分先前已经提到过。这些标记包括(但不限于)荧光团、化学发光部分、放射性同位素、酶、粒子(例如胶态碳粒子、金粒子、乳胶粒子等)、存在高亲和力受体的配体，和前标记(prolabel)，其可经活化而提供可检测的信号。
在一些实施例中，表面涂布有蛋白质，所述蛋白质可作为游离蛋白(例如循环蛋白)或作为完整或部分完整病毒粒子的一部分结合于DV抗原。可使用结合于多种DV血清型或凝集素(例如雪滴花(Galanthus nivalis)凝集素；“GNA”)的本发明抗体。
在一些实施例中，分析可涉及使表面与可能含有游离或DV缔合蛋白的介质接触，其中所述介质可为样品或一或多种血清型的已知A股区的溶液。在孵育并洗涤以去除非特异性结合的蛋白质后，可视所分析的目的而定，以各种方式继续进行所述分析。当分析怀疑血清反应呈阳性的血液样品时，可将样品施加到A股区蛋白层，孵育并洗涤，且测定结合于蛋白层的人类抗体的存在。可使用标记的α-人类抗体(不是针对主题抗体的同种型，其中最初已使用主题抗体)。在针对血清反应呈阳性的个体体内抗体的分析中，主题抗体可用作对照，使用相同试剂来检测所述个体血清中的任何人抗DV抗体。样品中抗体的特异性可以通过使用主题抗体来确认，其标记与抗人类抗体的标记不同，并确定其是否被样品中的抗体阻断。
当针对DV A股区蛋白分析样品时，检测采用标记的主题抗体，选择取决于所关注的是基因分型还是检测A股区蛋白。在洗掉非特异性结合的抗体后，通过根据已知技术检测标记的存在来确定经标记抗体的存在。可替代地或另外，当主题抗体结合于表面时，A股区的标记的凝集素可用于检测A股区蛋白的存在。
根据本发明的抗体药剂可用于测量其它抗体(包括血清中的抗体、单克隆抗体、作为基因工程化结果表达的抗体等)的反应性。在一些实施例中，使用完整病毒粒子。在一些实施例中，使用构象保守的包膜蛋白。有关病毒粒子的捕捉，例如参见木村(Kimura)等人,1998,医学病毒学杂志(J.Med.Virology),56:25-32；莫瑞塔(Morita)等人,1996,肝脏及胃肠病学(Hapato-Gastroenterology),43:582-585；撒塔(Sata)等人,1993,病毒学(Virology),196:354-357；和土方(Hijikata)等人,1993,病毒学杂志(J.Virol.),67:1953-1958；所述文献均以引用的方式并入本文中。一种方案涉及用凝集素(例如GNA)涂布固体支撑物且接着使表面与包含完整DV病毒粒子的介质(例如血清反应呈阳性的患者的血清)接触的步骤。通常应避免可能破坏病毒粒子的添加剂(例如清洁剂)。在孵育介质并洗涤以去除非特异性结合的介质组分后，可以使病毒粒子与根据本发明的抗体和样品的抗体接触。这可以同时或连续进行，其中首先添加样品。所用主题抗体的量应易于被另一抗体所代替。所述量可凭经验确定，并且可能希望在一系列测试中使用不同量的主题抗体。由于已知在存在和不存在样品情况下得到的信号，使得可测定样品中抗体的反应性或结合亲和力。可以使用各种技术来测定结合于病毒粒子的主题抗体的量。在主题抗体经例如生物素或地高辛(digoxigenin)标记的情况下，用荧光团或底物会产生可检测信号的酶标记的抗生蛋白链菌素或抗地高辛可用来测定主题抗体的量。
标记的主题抗体药剂可用于从活检材料分析DV的存在。可以将经标记抗体与固定的活检材料(如肝切片)、与一或多种主题经标记抗体的溶液一起孵育。在洗掉非特异性结合的抗体后，可以根据标记的性质，检测结合于活检组织的细胞的抗体的存在。
在一些实施例中，根据本发明的DV抗体药剂可用于鉴别DV受体。所属领域的技术人员应了解，这可以多种方式实现(萨姆布鲁克J.(Sambrook J.),弗里奇E.(Fritsch E.)和马尼亚迪斯T.(Maniatis T.)分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A LaboratoryManual).冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press),冷泉港(Cold Spring Harbor),纽约州(NY),1989；和奥斯贝等人,编,最新分子生物学实验方法汇编,1987；所述文献均以引用的方式并入本文中)。通常，蛋白质和肽受体可以通过测定DV包膜糖蛋白的A股区的抗体是否可以抑制DV病毒粒子与易受DV感染的细胞连接来鉴别。因此，可以此方式鉴别DV A股区蛋白和肽的受体。易感细胞可以在DV和抗DV A股区抗体的存在下孵育，并且可以使用细胞结合分析来测定在抗体存在下连接是否减少。
可针对表达DV的推定受体和/或DV的推定受体的文库的细胞结合DV的能力对其进行筛选。举例来说，表达推定DV受体(例如DV A股区的受体)的细胞可以在抗体存在下和在足以允许DV蛋白或肽结合于细胞表面上推定受体的条件下与DV蛋白或肽接触一段时间。可替代地或另外，DV蛋白、肽或病毒粒子可以在接触细胞表面上的推定受体之前预先与抗体一起孵育。结合的检测可以用例如流式细胞术等此项技术中已知的任何方式进行(参见奥斯贝等人或萨姆布鲁克等人,同上文)。与不存在细胞且不存在抗体情况下的结合相比较，在抗体存在下与细胞表面的结合减少，将指示DV受体的鉴别结果。
在一些实施例中，鉴别DV受体的方法包括使用固体支撑物(如珠粒、柱等)。举例来说，DV蛋白和肽(例如A股区蛋白和/或其片段)和/或DV病毒粒子的受体可以通过以下方式鉴别：使DV抗体连接于固体支撑物，并接着使所述抗体与DV蛋白或肽接触足以使DV蛋白或肽结合于抗体的时间。这提供了推定DV受体的DV蛋白配体，其可在固体支撑物上并在足以允许受体与DV蛋白或肽结合的条件下与抗体:配体复合体接触一段时间。蛋白质可由文库表达，或者以来自天然或重组细胞的细胞提取物或纯化的蛋白质制剂形式提供。一旦形成DV蛋白肽之间的特异性结合复合体，就例如通过标准洗涤步骤去除未结合的DV蛋白或肽(例如不特异性结合于DV蛋白或肽的文库蛋白或肽)。接着洗脱并鉴别结合的蛋白质，例如通过凝胶电泳进行。
试剂盒
本发明提供多种试剂盒，以便利地和/或有效地进行本发明的方法。试剂盒通常包含一或多种本发明的DV抗体药剂。在一些实施例中，试剂盒包含待用于不同目的(例如诊断、治疗和/或预防)的不同DV抗体药剂的集合。试剂盒通常将包含充足量的DV抗体药剂以允许使用者对个体进行多次投与和/或进行多次实验。在一些实施例中，试剂盒提供有或包括已由购买者指定的一或多种DV抗体药剂。
在某些实施例中，根据本发明使用的试剂盒可包括一或多种参考样品；说明书(例如关于加工样品，关于执行测试，关于解释结果，关于增溶DV抗体药剂，关于储存DV抗体药剂等)；缓冲液；和/或执行测试必需的其它试剂。在某些实施例中，试剂盒可包含数组抗体。试剂盒中的其它组分可包括细胞、细胞培养基、组织和/或组织培养基。
试剂盒可包含使用说明书。举例来说，说明书可告知使用者制备包含DV抗体药剂的医药组合物的适当程序和/或向个体投与医药组合物的适当程序。
在一些实施例中，试剂盒包括多个单位剂量的包含DV抗体药剂的医药组合物。可以提供记忆辅助物，其例如为数字、字母和/或其它标记形式，和/或带有日历插页，指定在可投与剂量的治疗时程中的天数/时间。可以包括安慰剂量，和/或钙饮食补充剂，其形式可类似于或不同于医药组合物的剂量，由此提供的试剂盒中具有每天服用的剂量。
试剂盒可包含一或多个器皿或容器，以便能分开收纳某些个别组分或试剂。试剂盒可包含将个别容器封装于相对封闭的界限内以便上市销售的构件，例如塑料盒，其中可封装有说明书、包装材料(如发泡胶(styrofoam))等。
在一些实施例中，试剂盒用于治疗、诊断和/或预防罹患和/或易患DV的个体。在一些实施例中，所述试剂盒包含(i)至少一种DV抗体药剂；(ii)用于向个体投与至少一种DV抗体药剂的注射器、针、施用器等；和(iii)使用说明书。
在一些实施例中，试剂盒用于治疗、诊断和/或预防罹患和/或易患DV的个体。在一些实施例中，所述试剂盒包含(i)以冻干粉末形式提供的至少一种DV抗体药剂；和(ii)用于将冻干粉末复水的稀释剂。所述试剂盒可任选地包含用于向个体投与至少一种DV抗体药剂的注射器、针、施用器等；和/或使用说明书。
本发明提供试剂盒，其含有用于产生包含至少一种DV抗体药剂的疫苗的试剂。在一些实施例中，所述试剂盒可包括表达DV抗体、其特征性部分，和/或其生物活性部分的细胞；(ii)供细胞生长的培养基；和(iii)适用于抗体纯化的柱、树脂、缓冲剂、试管和其它工具。在一些实施例中，所述试剂盒可包括(i)质粒，其含有编码DV抗体、其特征性部分和/或其生物活性部分的核苷酸；(ii)能够用所述质粒转化的细胞，如哺乳动物细胞系，包括(但不限于)Vero和MDCK细胞系；(iii)供细胞生长的培养基；(iv)不含编码DV抗体的核苷酸的表达质粒，其作为阴性对照；(v)适用于抗体纯化的柱、树脂、缓冲剂、试管和其它工具；和(vi)使用说明书。
在一些实施例中，试剂盒用于检测一或多个样品中DV的存在。所述样品可以是病理样品，包括(但不限于)血液、血清/血浆、外周血单核细胞/外周血淋巴细胞(PBMC/PBL)、痰液、尿液、粪便、喉拭子、皮肤病变拭子、脑脊髓液、宫颈刮片、脓汁样品、食品基质，以及来自身体各部分的组织，如脑、脾和肝。所述样品可以是环境样品，包括(但不限于)土壤、水和植物群。其它未列出的样品也可为适用的。在一些实施例中，所述试剂盒包含(i)至少一种DV抗体；(ii)已知含有DV的样品，其作为阳性对照；和(iii)已知不含有DV的样品，其作为阴性对照；和(iv)使用说明书。
在一些实施例中，试剂盒用于中和一或多个样品中的DV。所述试剂盒可提供用至少一种DV抗体药剂处理含DV样品所必需的物质和测试经处理样品相对于未经处理样品感染经培养细胞的能力所必需的物质。所述试剂盒可包括(i)至少一种DV抗体药剂；(ii)能够被培养并经DV感染的细胞；(iii)不能结合并中和DV的抗体，其作为阴性对照；(iv)能够结合并中和DV的抗体，其作为阳性对照；(v)已知不含有DV的样品，其作为阴性对照；(vi)已知含有DV的样品，其作为阳性对照；和(vii)使用说明书。
实例
结合以下实例将更好地理解本发明。然而，应理解这些实例仅出于说明性目的且不意欲限制本发明的范围。所属领域的技术人员将清楚所公开的实施例的各种变化和修改，且可在不脱离本发明精神和所附权利要求书范围的情况下作出所述变化和修改，包括(但不限于)与本发明的调配物和/或方法相关的变化和修改。
实例1：通过分析相互作用的物理化学特征来预测蛋白质-蛋白质复合体结构
这个实例中的研究说明了模型化蛋白质-蛋白质(例如抗原-抗体)相互作用的关键物理化学特征的发展和使用。这个实例中的分析辅助区分抗原-抗体相互作用的准确类天然结构(native-like structure)与不准确结构，且由此有助于克服仅使用能量函数对位姿(pose)定等级的限制，如使用计算对接模型在蛋白质-蛋白质相互作用的建模中所进行般。此外，未能鉴别在这个实例中分析的九个测试案例的天然位姿强调了当前搜索算法的局限性以及与设计抗原-抗体复合体的亲和力增强性突变相关的挑战。
为了捕捉一样多的形成分子识别基础的几何和化学特性，十三种原子水平特征：七种化学特征和六种物理特征(表1)用于描述抗原-抗体界面。此外，将包含抗原-抗体复合体的77种非冗余3D结构的数据组组合(参见方法部分)并分成两个部分；由40种结构组成的训练组和由其余37种结构组成的测试组。对应于每一结构，使用计算对接构建100个诱饵模型(参见方法部分)，得到总共7,777种结构(7,700种诱饵+77种x射线)。在训练阶段中，多变量逻辑回归分析(MLR)用于测定每一特征(解释性变量)与其可成功地区分x射线与诱饵位姿的程度(结果变量)之间的关系。这一分析辅助获得可组合以预测结果变量的值的所有解释性变量的子组。从每一PDB文档(和其诱饵)产生的输入特征呈现为标准化Z分数，从而防止可引起高估(或低估)显著性的不均匀学习。对于预测阶段，预先计算的显著特征用于预测测试数据组中的结构是类天然的概率。
来自MLR分析的结果表明，会影响准确区别天然与诱饵结构的概率的个别特征的相对优势度的次序是ZEPII>主链-主链H键>H键密度>带电荷基团百分比>阳离子-π相互作用的密度>掩埋的表面积>中性极性基团百分比>离子键的密度。发现上述特征中的每一者在0.05的α水平下显著。基于逻辑回归系数，H键和离子键密度、主链-主链H键以及掩埋的表面积在对接模型中似乎被高估。预期这是因为增加上述特征的值倾向于使评分函数达到最大。相反地，ZEPII、阳离子-π相互作用、带电荷基团和中性极性基团百分比在对接模型中似乎被低度代表。阳离子-π相互作用、带电荷基团和中性极性基团百分比不显著贡献于能量评分函数；因此这些特征在对接界面中不被优化。此外，对接模型的评估展示出对接程序并不如实地概括可离解的抗原-抗体复合体共有的成对相互作用；因此发现模拟界面具有低ZEPII值。
接着，MLR用于使用预先计算的显著特征预测测试数据组中37种抗原-抗体相互作用的x射线结构，且接着将基于MLR的预测的灵敏度与在对接模型中使用的ZRANK能量函数的灵敏度相比较(参见方法部分)。总的来说，MLR展示出与ZRANK能量函数相比在预测x射线结构时更好(图1)，表明MLR方法在预测类天然结合位姿方面产生优于ZRANK的改进。对诱饵模型、其ZRANK分数和基于MLR的预测概率的更仔细检查揭示了令人感兴趣的见解(图2)。ZDOCK鉴别出37种结构中的29种的类天然结构，指示计算搜索算法极其准确。然而，(1)ZRANK分数即使在结构上类似的位姿之间也会显著变化(图2A)；(2)极其不同的结构可得到大致相同的分数，使得难以区分准确与不准确的解组(solution)(图2A)；(3)较差的不准确的解组通常得到比类天然结构好的分数(图2A)；(4)虽然基于MLR的预测概率也在结构上类似的位姿之间变化，但非天然位姿很少得到高预测概率，指示假阳性结构预测的可能性在位姿根据预测概率定等级时降低。因此，可见预测概率在与ZRANK分数相比时与RMSD更好地相关(图2B和图2C)。
实例2：使用物理化学特征来预测亲和力增强性突变
这个实例中的研究展示出用于设计蛋白质-蛋白质(例如抗原-抗体)相互作用的亲和力增强性突变的评分流程的发展。
具体来说，这个实例描述了经发展以定量成对氨基酸相互作用的倾向的数学模型(参见方法部分)。将这些统计倾向制定成向每一可能的氨基酸对分配权重的相互作用矩阵。残基在CDR位置处的适合度(也称为氨基酸界面适合度(AIF))是涉及所述残基的所有蛋白质间成对接触(被定义为彼此特定距离内的两个氨基酸)的组合倾向。引起AIF值提高而无任何结构后果的取代被视为亲和力增强的候选者。倾向使用已知蛋白质结构数据库中对氨基酸接触的统计来测定(参见方法部分)。避免多个距离截断值和能量最小化步骤消除了重链对原子座标的依赖性。
与通过先前研究得到的观察结果一致，倾向数据展示出在互补位中酪氨酸、色氨酸、丝氨酸和苯丙氨酸优于其它残基的优势度(表2)。AIF量度接着用于预测抗体在三个不同系统中的亲和力增强性突变，对于其来说，公开的数据验证了预测。测试用例之一是抗EGFR抗体药物西妥昔单抗(cetuximab，爱必妥(Erbitux))，其中达到52pM的10倍亲和力提高利用轻链上的三个突变来工程化。这些预测的突变中的两者(S26D和T31E)展示出如西妥昔单抗中的单一突变般提高结合亲和力，且对第三个突变(N93A)的更仔细检查揭示了Ala是在具有总体弱接触倾向的一组残基之中。另一测试用例是抗溶菌酶模型抗体D44.1，其中十八个突变被预测适于亲和力增强。重链上预测的突变中的四者(T28D、T58D、E35S、G99D)是D44.1的公开的高亲和力变异体的一部分。另一测试用例是靶向癌症相关的丝氨酸蛋白酶MT-SP1的抗体E2。AIF量度预测了包括T98R的八个突变，证实了先前的计算机模拟亲和力增强研究，所述研究已鉴别出使抗体亲和力提高14倍达到340pM的单一突变T98R。
实例3：登革抗体中亲和力增强性突变的设计
这个实例中的分析说明了仅结合某些DV血清型的抗DV抗体可经由工程化修饰，以便产生强力中和DV的所有四种血清型的活性的变异体。具体来说，这个实例中的研究展示出登革单抗4E11中合理设计的突变加强了其对DV血清型4(DV4)的亲和力，且不显著不利影响其对DV血清型1-3(DV1-3)的结合。
单抗4E11的结合和中和活性特征曲线展示出对DV1-3的高亲和力和抑制效力，但对DV4有着低亲和力和中和活性(图3)。为了工程化4E11以实现对所有四种血清型的强力中和活性，设计方法(图4)依赖于三个重要因素：(1)生成4E11-EDIII相互作用的准确模型，(2)理解血清型特异性结构元件且再捕捉亲和力和特异性的决定子，以及(3)设计赋予有利相互作用且因此提高与DV4的亲和力的取代。
在不存在抗体晶体结构的情况下，构建Fv区的结构模型，且使用ZDOCK软件将模型化的Fv针对DV1的EDIII对接，且将先前公开的关于表位和CDR H3互补位的功能数据(渡边(Watanabe)等人,2012微生物学趋势(Trends in Microbiology)20:11-20)作为结合界面中的特定残基包括在内以确保对接位姿不显著偏离天然复合体(参见方法部分)。ZDOCK使用不同的输入界面残基组合运行五次，且来自每次运行的等级最佳的模型(图5)使用MLR概率再定等级(表3)。利用MLR方法预测的最好的模型与ZRANK方法的预测不匹配。
利用MLR方法预测的最好的模型通过以下方式验证：在利用网络服务器ANCHOR[多斯塔尼(Dosztanyi)等人,2009生物信息学(Bioinformatics)25:2745-2746]以计算方式预测的互补位热点与通过4E11的所有CDR环中每一位置的Ala扫描以实验方式确定的热点之间进行的比较与利用间接ED-III(DV1)ELISA进行的结合评估。所选模型的热点预测正确鉴别出61％以实验方式确定的热点，而其余位姿具有<45％(范围28％-44％)的热点预测准确性，由此指示所选位姿很可能反映了真正的4E11/ED-III结合构型。
将最好的4E11-ED-III(DV1)模型用于指导4E11与来自其它三种血清型中的每一者的代表性EDIII病毒株之间的相互作用的建模(参见方法部分)。使用四种结构模型，检查抗体结合于每种血清型的模式，且使用序列与ED-III域水平结构分析的组合鉴别对DV4血清型不佳亲和力的分子基础。分析揭示了DV4与其它血清型之间在4E11结合界面之内和周围的多个氨基酸差异。值得注意的是，A股(残基305-308)相对于邻近β股的取向由于在位置307处的局部差异而在DV4中有所不同(图6)。与对DV4的低亲和力和中和效力一致，4E11-EDIII(DV4)界面具有较小BSA、较少H键和盐桥接触。
接着，将AIF指数应用于设计会增强对DV4结合的亲和力的突变。这产生了一组跨越23个CDR位置的87个突变。所预测的突变包括所有类型的氨基酸。氨基酸置换的选择并非始终凭直觉(例如，如果围绕互补位CDR位置的表位区是带负电荷的，那么Arg和Lys在所述CDR位置处并不始终在统计学上有利)。虽然改进能量学的残基是有利的，但亲和力增加可经由改进静电互补性、堆积和疏水性表面积发生。在设计接近DV4血清型特异性残基的CDR位置处的亲和力增强性突变中采取有意识的努力(图6)。具有提高DV4亲和力的潜力而不会对其它血清型不利的突变被给予更高优先权。在努力学习关于点突变对结合亲和力的影响的过程中，突变体不限于具有最高成功概率的残基。
实例4：工程化登革抗体的实验表征
这个实例中的实验阐明了抗体中的特定工程化定点突变增强其对DV4的EDIII的亲和力和/或效力，而对DV1-3的EDIII的结合亲和力和/或效力没有或仅有最低限度的减少。这个实例中的实验还展示了工程化抗体的结合特性也可被准确定量。此外，这一研究中的实验展示了通过将特定成功单一突变组合而设计的工程化登革抗体引起抗体亲和力的最大增加。此外，这个实例中的实验证实了在这一研究中设计的工程化抗体不仅展现出对DV的所有四种血清型的强力抑制活性，而且在体内具有强力抗病毒活性。
使用DV1-4的经纯化的重组EDIII作为涂布的抗原通过间接ELISA选择实验性测试的总共87个突变。突变体通过定点诱变产生，证实序列，且通过瞬时转染由293细胞表达。鉴别出EDIII-DV4亲和力增强且对DV1-3的EDIII的结合没有或有最低限度减少的十个突变(表3)。这10个突变跨越五个CDR位置，其中四个在VL中(R31、N57、E59和S60)且一个在VH中(A55)。这10个突变中的八个在VL中，其中7个在单独L2中。成功的突变大多是带电荷的或性质上是极性的，且发现存在于抗体-抗原界面区域的外周(图7)。结构分析展示出突变体侧链形成与高度保守表位残基的接触，表明其为何对DV 1-3结合并无不利(图6和表5)。
为了进一步准确定量上文所论述的这10个单一突变体的结合特性，进行竞争ELISA实验以测定在平衡和呈溶解状态时的亲和力。表6概述了来自五个单一突变体抗体的亲和力结果，呈现了展示出最大EDIII-DV4亲和力增强同时维持对DV1-3的EDIII的亲和力的那些突变。DV4亲和力增强的程度在1.1倍(VL-R31K)到9.2倍(VH-A55E)范围内。出人意料地，两个突变赋予对其它血清型的增加的亲和力；VH-A55E对ED-III-DV2和ED-III-DV3分别产生16倍和7倍亲和力增加，而VL-N57E对ED-III-DV2展示出3倍亲和力增加。对血清型1-3测量的15种亲和力(使用五种单一突变体抗体)中仅三者展示出大于2倍的减少，且仅一种抗体-EDIII亲和力(EDIII-DV3的VL-E59Q)产生大于3倍的亲和力减少。
结构上，五个亲和力增强性位置映射到互补位的空间不同区域(图7)，表明可通过组合成功的单一突变来获得额外增强。测试多重的三个、四个和五个突变体组合，且五元组突变体抗体(称为4E5A)展示出亲和力的最大增加。出人意料地，4E5A由五个代表每一位置处的氨基酸变化的取代组成，其以单一突变体形式赋予对EDIII-DV4的最大亲和力提高。与亲本单抗相比，4E5A展示出对EDIII-DV4的亲和力提高450倍(KD＝91nM)，同时维持对DV1和DV3的EDIII的亲和力并且对DV2的亲和力增加15倍(表7和表8)。值得注目地，这些结果说明抗体的亲和力可从微摩尔增加到接近纳摩尔的亲和力。表面等离子体子共振(SPR)用于验证亲和力测量值以及获得动力学结合参数(表9和图8)。来自SPR的亲和力值与通过竞争ELISA获得的值定量上良好一致，例外是4E11野生型对EDIII-DV4的特异性结合不可检测，指示极低亲和力，这与竞争ELISA结果(KD＝41μM)大体一致。
为了确定4E5A对EDIII-DV4增加的亲和力是否转化成增强的活性，使用灶减少中和测试(FRNT)分析。与野生型4E11相比，4E5A在对DV4的中和效力方面展示出>75倍增加，并且其维持对DV1-3的效力(图9)。4E5A展示出对所有四种血清型的强力抑制活性，其中对DV1-4的FRNT50值分别为0.19、0.028、0.77和4.0μg/ml。为了进一步阐明4E5A活性，在DV2攻击的AG129小鼠模型中评估抗体，其在感染后第3天展示出峰值病毒血症。在1mg/kg和5mg/kg两者下，4E5A展示出病毒血症显著减少，且5mg/kg治疗引起病毒效价水平低于检测限(图10)。总起来说，这些结果展示了工程化单抗4E5A展示出对DV的所有四种血清型的强力抑制活性并且在体内具有强力抗病毒活性。
可基于这项研究设计的工程化抗体(例如4E5A)代表重要药物候选物，并且另外可被采用以用于其它轮的如此项技术中已知的亲和力成熟和人类化。4E11/ED-III复合体的晶体结构在提交本专利申请案之前已被公开，这允许将这一研究中论述的结构模型与公开的复合体结构进行比较，并且的确观察到C-αRMSD值为1.4埃的两个结构之间的极佳对应关系，进一步证实了这项研究的重要性。
讨论
发现治疗相关抗体的传统方法依赖于如噬菌体展示技术的实验方法。然而，这些方法代价大，技术上具挑战性且耗费时间。举例来说，中和进化枝1和2病毒的流感FI6单抗是通过筛选104,000个B细胞来鉴别的。一种替代策略将为经由合理工程化修改现有抗体的特性。在这一研究中，呈现了用于从头建模和抗体再设计的计算方法。在测试运行中，MLR预测方法在(从数种诱饵模型中)挑选X射线结构方面的灵敏度似乎优于ZRANK。此外，展示了AIF量度可在多个系统中捕捉已知的亲和力增强性突变。接着，将这一框架应用于工程化对抗登革中和单抗的更广泛特异性和亲和力。由这一研究获得的结果因以下各点而重要：(1)仅少数研究尝试了改进抗体的交叉反应性；(2)这是第一个针对抗体再设计和亲和力增强使用经验方法的研究；以及(3)在无抗体-抗原复合体的晶体结构的情况下预测亲和力增强性突变(也称为盲式预测)。这项研究首次展示了计算方法的应用引起抗体亲和力提高超过约400倍(表10)。鉴于这些计算方法的简单性，其可广泛地用于抗体工程化，且不同于基于物理学的能量方法，其不受开始结构的原子座标的精确位置影响。
来自ZRANK的最好的对接解组在结构上与天然结构极其不同，指示遵循最好的ZRANK模型的任何亲和力增强努力将不会产生富有成效的结果。亲和力增强性突变也使用X射线结构通过能量学方法预测，且结果突出了在区分稳定和中性突变方面的挑战(表11)。更值得注目地，亲和力增强性突变N57E、N57S和E59N被归类为不稳定(表11)。由于ZRANK被广泛使用且在CAPRI实验中已展示出相当大的成功，故这一研究中呈现的方法将在针对其它对接算法堆叠时比较好地进行。ZEPII显著呈现的事实指示氨基酸组成和残基间接触含有判别能力。有趣的是，一些几何特征也具有区分天然界面与诱饵的预测能力。这与由先前研究得到的抗原-抗体界面更平坦且显著良好排序或堆积的观察结果相关。在用于生成五种不同模型的界面残基的不同组合之间，准确模型通过使用所有已知表位和互补位界面残基来产生，由于加入更多情形，使搜索空间变窄，并且因此增加发现近天然复合体结构的几率。
噬菌体展示和定向进化方法随机化选择CDR环，尤其是VH-CDR环，因为其负责大部分的稳定接触。4E11的结果展示了多样化策略必须使用合理方法且涉及靶向多样化的VL环。亲和力增强性突变在性质上主要是极性的且存在于结合界面的外周的观察结果与已知数据一致。很可能这些突变通过增加碰撞效率来增加结合速率。预测具有靶向活性的突变的成功率是12％(10/87)。鉴于设计问题的复杂性(即，涉及多种抗原)且考虑到随机突变将平均地对结合亲和力具有不利作用，这些结果是令人鼓舞的。
研究已展示鼠类生殖系包含具有固有的以高亲和力结合EDIII域的能力的基因区段(参考24,32)。尽管5种突变具有益作用，但这些突变尚未在体内共进化。密码子水平分析展示出在N57E和S60W处的氨基酸置换需要至少两个碱基变化，突出了在基因组水平下的局限性。先前研究已展示由抗DV抗体识别的表位落入三个不同的区域中：(1)ED-III上的侧脊表位(血清型特异性强力中和剂)；(2)DIII的A股(亚复合体特异性中和剂)；和(3)其它DII和DIII表位(复合体特异性或黄病毒交叉反应性中等强力中和剂)。在这一研究中，首次展示了针对A股表位的抗体可经工程化从而以良好的体外效力结合所有四种血清型。总起来说，4E5A展示出令人感兴趣广谱中和概况，且将是因治疗登革疾病的潜在治疗发展而受关注的抗体。人类中针对DV的单抗治疗剂可能因抗体依赖性增强而面临调节障碍。然而，近来的研究已展示对重组抗DV抗体的Fc区的修饰防止体内ADE，由此为这些较新的互补方法呈现机会。单抗表位的保守程度可为测定中和谱和体内保护的重要因素。DV4病毒的系统发生分析已揭示了存在四种不同的基因型：I(东南亚)、II(印度尼西亚(Indonesia))、III和IV(森林(Sylvatic)或马来西亚(Malaysia))。在基因型II内，进入两个不同进化枝的病毒簇先前被定义为IIa和IIb。4E11-5A的表位区的序列分析揭示了基因型IIa、IIb和4中的高度保守，而在基因型I中的相对较低保守，向本发明人表明经工程化的抗体将可能有效针对大部分DV4病毒。
表1.物理化学特征的描述.
表2.20×20氨基酸倾向矩阵.互补位氨基酸指示在左侧，而表位氨基酸指示在上侧。倾向数据使用77个非冗余抗原-抗体复合体产生。
ALA ARG ASN ASP CYS GLU GLN GLY HIS ILE LEU LYS MET PHE PRO SER THR TRP TYR VAL
ALA 0.25 0.59 0.14 0.53 0 0.28 0.6 0.35 1.33 0.68 1.1 0.33 2.3 2.94 0.77 0.25 0.38 1.49 0.59 1
ARG 0.58 0.87 1.11 2.29 0 1.75 0.87 0.67 0.95 1.03 0.99 0.44 0.79 0.75 0.15 0.5 0.66 0.29 2.24 0.57
ASN 0.74 1.32 1.04 0.94 0.72 1.28 1.32 1.08 1.94 1.03 0.33 1.05 1.53 0.54 0.74 0.78 0.58 0.83 0.82 0.41
ASP 0.23 1.68 0.81 0.6 0 0.75 0.54 0.79 1.04 0.4 1.27 2.2 0.62 0.58 0.51 0.84 1.08 0.89 1.05 0.27
CYS 5.29 0 0 5.59 36.02 0 0 2.46 0 0 0 0 0 6.85 2.68 0 0 0 0 4.17
GLU 0.22 1.41 0.6 0.23 0 0.36 0.39 0.2 0.57 0.39 0.14 0.85 0.39 0.56 0.44 0.75 0.55 0.85 0.17 0.34
GLN 0.44 0.2 0.72 0.23 0 0.48 0.26 0.61 0 0.78 0.82 0.38 0 0.57 0.44 0.65 0.44 0 1.02 0
GLY 0.31 1.01 0.57 0.49 1.06 1.37 0.99 0.72 0.68 0.56 0.39 0.9 0.76 0.94 0.89 0.51 0.84 0.61 0.97 0.74
HIS 0.55 0.64 0.76 0.87 0 0.91 1.15 0.51 0.73 0.49 0.52 0.6 1 0 0.84 0.27 0.56 0 0.43 0.65
ILE 0.31 0.57 0.17 0.32 0 0.34 0.73 0.14 1.2 0.55 1.33 0.66 2.22 1.58 0.31 0.45 0.92 3 2.36 1.2
LEU 0.42 0.88 0.7 0.22 0.72 0.7 0.63 0.59 1.12 1.51 1.98 0.83 1.16 1.37 0.86 0.52 0.43 2.09 1.64 1
LYS 0 0.31 0.37 0.71 0 1.86 0.4 0.16 0.89 0 0.42 0.59 0 1.31 0.17 0.67 0.17 1.33 0 0.27
MET 0 0.99 1.17 0 0 1.17 0.64 0.5 1.4 0.95 0 0 3.88 0 0.54 0 0 2.1 1.65 0.84
PHE 1.81 1.36 0.74 0.72 0.77 0.87 1.22 1.16 2.98 0.81 1.41 1.17 0.82 2.05 1.49 0.67 1.03 1.78 0.35 1.6
PRO 0.75 1.04 0.41 0.2 0 0.41 1.12 0.17 1.97 1 1.4 0.49 2.72 1.94 0.38 0.55 0.57 0.74 1.16 0
SER 1.12 1.27 0.62 0.93 1.37 1.64 1.54 0.6 1.16 0.43 1.25 0.97 1.02 1.04 0.73 0.83 0.93 1.42 1.43 0.82
THR 0.84 1.17 0.79 1.14 0 1.06 1.15 0.34 1.42 0.54 0.37 0.83 1.31 0.16 0.79 0.77 1.03 0.24 0.56 0.76
TRP 1.27 1.71 1.16 1.05 3.37 0.47 2.03 0.99 2.61 0.51 1.06 1.78 1.03 0.73 1 1.12 0.86 0.56 1.86 1.56
TYR 1.48 2.21 1.83 1.56 2.04 1.96 1.6 1.73 2.01 1.9 2.38 1.78 1.89 2.69 1.88 1.35 1.21 1.4 1.36 1.46
VAL 0.3 1.1 0.49 0.78 1.01 1.3 0.88 0.28 1.56 0.79 1.11 0.26 0.54 1.15 0.3 0.59 0.45 2.92 0.69 0.47
表3.前五名对接结构模型的物理化学特性.第2-9列提供对接模型的预先计算的显著特征的值。p值和比值比(OR)列在列标题中。特征的MLR回归系数列在表的最后一行中。第10和11列分别提供基于MLR的预测概率和ZRANK分数。
表4.引起EDIII-DV4亲和力增加同时维持原始EDIII-DV1-3亲和力的突变.
链 CDR 位置 野生型残基 突变
VH H2 55 Ala Glu
VH H2 55 Ala Asp
VL L1 31 Arg Lys
VL L2 57 Asn Glu
VL L2 57 Asn Ser
VL L2 59 Glu Gln
VL L2 59 Glu Asn
VL L2 60 Ser Trp
VL L2 60 Ser Tyr
VL L2 60 Ser Arg
表5.通过亲和力增强性突变得到的接触.
表6.具有相对于4E11野生型增加的EDIII-DV4亲和力和类似的EDIII-DV1-3亲和力的单一突变体抗体的亲和力.所包括的突变是针对每一所鉴别的位置展示出最大EDIII-DV4亲和力同时大致维持EDIII-DV1-3亲和力的突变。KD值代表至少两次独立实验的平均值。
相对于野生型的亲和力
表7.组合突变体4E11-5A的亲和力.
表8.展示出突变对结合能具有加性效应的4E5A的能量计算.
抗体 EDIII-DV4ΔG(kcal/mol)a EDIII-DV4ΔΔG(kcal/mol)b
4E11野生型 -5.98 ---
VH-A55E -7.29 -1.31
VL-R31K -6.03 -0.05
VL-N57E -6.92 -0.93
VL-E59Q -6.76 -0.77
VL-S60W -6.24 -0.26
4E5A -9.59 -3.61
a在25℃下利用ΔG＝RTln(KD)计算的自由能
bΔΔG＝ΔG突变-ΔG野生型
表9.利用SPR测量的4E11和4E5A的动力学结合参数.
akon值表示为(×106M-1s-1)
bkoff值表示为(×10-4s-1)
cN.B.，无结合
表10.各种计算机模拟抗体亲和力增强研究的结果的比较.
表11.使用能量学方法预测的抗体突变.增加4E11的亲和力的突变加阴影。
方法
用于估计抗原-抗体界面中氨基酸的接触倾向的数学模型
简单来说，在抗原-抗体界面中，一对残基在其具备有利的相互作用能量学时可能相互作用或偶然出现相互作用。氨基酸相互作用的倾向通过计算偶然预期的相互作用数(即预期的频率)并用观察到的频率除以此数来计算。
如果两个氨基酸(每一者来自抗原-抗体界面的每一侧)彼此相距在内(即，最短非H原子距离小于)，那么其被定义为成对残基。如果界面处的残基x(抗原)与y(抗体)之间的成对相互作用总数为N(x,y)，那么其同时发生频率F(x,y)定义如下：
F ( x , y ) = N ( x , y ) &Sigma; l = 1 20 &Sigma; m = 1 20 N ( l , m )
上述方程式的分母指示界面中所有残基对的成对相互作用的总和。
必须计算互补位和表位处的每一氨基酸的发生频率。表位中的具体氨基酸x的频率F表位(x)定义如下：
在上述方程式中，N(x)表示表位中氨基酸x的计数。分母代表表位中所有氨基酸的总数。
类似地，互补位中氨基酸y的出现频率F互补位(y)定义如下：
在上述方程式中，N(y)表示互补位中氨基酸y的数目。分母指示互补位中所有氨基酸的总数。
参数F(x,y)、F表位(x)和F互补位(y)使用数据组中的所有七十七种基准抗原-抗体结构测定。与先前研究得到的观察结果一致，酪氨酸、丝氨酸、甘氨酸和天冬酰胺是最丰富的互补位残基，而赖氨酸、精氨酸、亮氨酸和甘氨酸是最丰富的表位残基(图11)。如果氨基酸x和y的出现是独立的，那么以下方程式中定义的EF表位-互补位(x,y)是氨基酸x和y同时出现的预期的频率。
EF(x,y)＝F表位(x)F互补位(y)
如果抗原界面处的氨基酸x和y的同时出现率超过预期的比率，那么以下比率RAa(x,y)变得大于1。
RA ( x , y ) = F ( x , y ) EF ( x , y )
RAs(x,y)是20×20矩阵。下文建议RAs(x,y)的示例性应用。
使用RA(x,y)来测定CDR残基的AIF。界面中CDR残基的AIF被定义为RA(x,y)与其近邻的总和。近邻由距离准则定义。
确定界面位置处氨基酸的最佳选择(互补位再工程化)。鉴于抗原-抗体复合体，在CDR位置处的氨基酸偏好使用接触潜力分数计算。具体来说，在给定CDR位置处，除甘氨酸和脯氨酸(以避免主链构象变化)以外，野生型(WT)残基系统地经其余氨基酸取代，且使用AIF量度在每一实例处评估置换的概率。置换潜力比野生型残基高的单一突变以计算的方式再评估以寻找(a)不掩埋极性基团和(b)不引起位阻的突变。
使用RA(x,y)来定量抗原-抗体界面相互作用的强度(表位-互补位界面指数)。抗原与抗体之间的相互作用由形成许多非共价键产生。因此，相互作用亲和力与吸引力和排斥力(范德华力相互作用、氢键、盐桥和疏水性力)的总和直接相关。本文中，抗体-抗原界面的相互作用强度通过所有氨基酸对组合的RA的线形组合定量研究。表示抗原-抗体界面‘i’的强度的指数(称为表位-互补位界面指数(EPII))由以下定义：
EPII i = &Sigma; x = 1 20 &Sigma; y = 1 20 F i ( x , y ) RA ( x , y ) &Sigma; x = 1 20 &Sigma; y = 1 20 F i ( x , y )
在上文方程式中，Fi(x,y)表示界面i处的氨基酸x(x属于二级结构基团)和y的同时出现频率。
使用EPII来区分真正的抗原-抗体相互作用与对接诱饵。为了区分具有最大潜力的界面与通过计算对接产生的其它诱饵界面，应通过蛋白质中的所有界面标准化EPII值。Z评分的EPII用于这一目的。如果在蛋白质中发现M界面，那么界面i和Z评分的EPII计算如下：
Z EPII i = EPII i - &mu; &sigma; ,
其中
&mu; = &Sigma; i = 1 M EPII i M
&sigma; = &Sigma; i = 1 M ( EPII i - &mu; ) * ( EPII i - &mu; ) M
分数指示抗体结合于给定界面的概率。蛋白质中分数最高(或高于为抗原抗体相互作用(如上所述)确立的共识值)的界面为抗体结合最可能的位点。
非冗余抗原-抗体结构复合体的数据组和用于生成诱饵模型的计算对接
分析来自蛋白质数据库的总共568种抗原-抗体复合体。为了确保几何界面特征(平坦度、掩埋表面积等)的适当枚举，排除了其中抗原长度小于20个氨基酸的结构。另外，许多结构含有相同或类似抗原(其可能使研究有倾向性)，给予来源于多次呈现的蛋白质抗原的因子较高权重。为了从数据组去除冗余结构，将具有同源抗原(通过BLAST_ENREF_40P值10e27界定)并共有50％表位残基的结构归类在同一群组下，并选择具有最高分辨率的结构作为代表。这产生了七十七种非冗余抗原-抗体复合体结构。
ZDOCK用于生成抗原-抗体相互作用的诱饵计算模型。为所有七十七种结构复合体生成诱饵模型的方案是相同的。仅抗体的可变域用于对接。两个分子中的较大分子被视为受体，而较小分子被视为配体。配体取向在每一步骤旋转6°以取样各种构象。由于初始对接程序探索相对较大区域，故设置表位和互补位上推定的热点残基之间的距离限制以确保所产生的模型不与天然位姿显著偏移。在任一侧上选择两个热点残基以确保在结构预测下面对的挑战相当于4E11情形。在所有诱饵模型中，推定的表位和互补位热点彼此相距在10埃内。热点使用网络服务器ANCHOR鉴别。初始对接程序产生2,000个位姿，其接着基于先前描述的所有对所有RMSD矩阵聚类。两个对接位姿之间的RMSD基于结合界面7埃内的配体残基计算。代表簇中心的对接的蛋白质位姿被视为诱饵模型。ZDOCK使用形状互补性以及去溶剂化和静电能量术语(‘ZRANK’)将对接的位姿定等级。这些诱饵中的每一者使用CHARMm最小化进一步改进。
X射线结构与诱饵模型组合以评估预测方法的灵敏度。
4E11 Fv的同源建模
4E11 Fv的结构模型使用SIWW-MODEL同源建模服务器构建。研究指示将高变CDR建模的整体准确性在以下情况时是适当的：(1)目标与模板之间的序列相似性程度较高，(2)CDR环L1、L2、L3、H1、H2的主链构象遵循“典型结构”以及(3)重链CDR3(H3)并非特别长。
产生4E11-EDIII(DV 1-4)位姿的计算对接
模型化Fv使用ZDOCK针对所选DV1病毒株的EDIII对接。使用DV1抗原，因为单抗4E11最初是从经DV1病毒感染的小鼠中分离的。DV1抗原的结构使用SWISSMODEL同源建模服务器建模，将DV1 EDIII(PDB：3IRC)的解析的晶体结构保持为模板。ZDOCK使用形状互补性以及去溶剂化和静电能量术语(‘ZRANK’)将对接的位姿定等级。为了确保对接的位姿不显著偏离天然复合体，将文献中发现的映射的表位和互补位残基强制包括在结合界面中。界面中包括的残基是307K、389L和391W(表位；如3IRC中的DV1编号)以及101W、102E(互补位；基于序列位置的编号)。
4E11与DV 2、3、4(EDIII)复合的结构使用4E11-DV1 EDIII结构模型作为模板建模。
等效物和范围
所属领域的技术人员顶多使用常规实验即可识别或能够确定本文中所述的本发明的具体实施例的许多等效物。本发明的范围并不打算限于以上说明书，而实际上是如所附权利要求书中所阐述。
在权利要求书中，除非相反地指示或另外从上下文显而易见，否则如“一个(a/an)”和“所述”的冠词可能意指一或多个。除非相反地指示或另外从上下文显而易见，否则如果一个、一个以上或所有的群组成员存在、使用于给定产品或方法中或另外与其有关，那么在群组的一或多个成员之间包括“或”的权利要求书或说明书被视为满足。本发明包括恰好一个群组成员存在、使用于给定产品或方法中或另外与其有关的实施例。本发明包括一个以上或所有的群组成员存在、使用于给定产品或方法中或另外与其有关的实施例。此外，应理解本发明涵盖其中来自一或多个所列权利要求的一或多个限制、要素、条款、描述性术语等被引入到另一权利要求中的所有变化形式、组合以及排列。举例来说，附属于另一权利要求的任何权利要求可经修改以包括在附属于同一基本权利要求的任何其它权利要求中可见的一或多个限制。此外，在权利要求列举组合物时，应理解，除非另外指明，或者除非所属领域的技术人员将显而易见会产生矛盾或不一致，否则包括出于本文中所公开的任一目的使用组合物的方法，且包括根据本文中所公开的任一制造方法或此项技术中已知的其它方法制造组合物的方法。
在要素作为清单(例如以马库西群组(Markush group)形式)呈现时，应理解所述要素的各子组也被公开，且任何元素都可从群组中去除。应理解，一般来说，在本发明或本发明的方面被称为包含具体要素、特征等时，本发明的或本发明的方面的某些实施例由所述要素、特征等组成或主要由所述要素、特征等组成。出于简单的目的，那些实施例尚未专门地以这些词语阐述在本文中。应指出，术语“包含”打算是开放的且允许包括额外要素或步骤。
在给出范围时，包括终点。此外，应理解除非另外指明或另外从上下文显而易见且为所属领域的技术人员所理解，否则表达为范围的值可在本发明的不同实施例中采用所述范围内的任何特定值或子范围，达到所述范围的下限单位的十分之一，除非上下文另外明确规定。
另外，应理解，处于现有技术内的本发明的任何具体实施例可从任何一或多个权利要求中明确排除。由于所述实施例被认为是所属领域的技术人员已知的，故其可被排除，即使所述排除在本文中并未明确阐述。
本文上文和通篇论述的出版物只是提供本申请案申请日期之前的公开内容。本文中无任何内容可解释为承认本发明者无权先于根据先前发明的所述公开内容。
所属领域的技术人员顶多使用常规实验即可识别或能够确定本文中所述的本发明的具体实施例的许多等效物。本发明的范围不打算限于上述具体实施方式，而是如随附权利要求书中所述。

Claims (64)

1.一种对登革病毒具有特异性的抗体药剂，其中所述抗体药剂结合并中和登革病毒血清型D1、D2、D3和D4中的每一者。
2.根据权利要求1所述的抗体药剂，其中所述抗体药剂结合于表位，所述表位为或包含以下各者内的氨基酸序列：SEQ ID NO.17(EDIII-DV1)、SEQ ID NO.18(EDIII-DV2)、SEQ ID NO.19(EDIII-DV3)、SEQ ID NO.20(EDIII-DV4)或其组合。
3.根据权利要求1所述的抗体药剂，其中所述药剂结合于登革病毒的包膜糖蛋白的A股区中的表位。
4.根据权利要求2所述的抗体药剂，其中所述表位包含一或多个对应于在SEQ ID NO.17-20中的任一者的选自由以下组成的群组的位置处的残基的残基：305、306、307、308、309、310、311、312、323、325、327、329、360、361、362、363、364、385、387、388、389、390、391和其组合。
5.根据权利要求4所述的抗体药剂，其中所述表位包含一或多个对应于在SEQ ID NO.17-20中的任一者的选自由以下组成的群组的位置处的残基的残基：305、310、311、323、327、329和其组合。
6.根据权利要求4所述的抗体药剂，其中所述表位包含对应于在SEQ ID NO.17-20中的任一者的位置305处的残基的残基。
7.根据权利要求4所述的抗体药剂，其中所述表位包含对应于在SEQ ID NO.17-20中的任一者的位置310处的残基的残基。
8.根据权利要求4所述的抗体药剂，其中所述表位包含对应于在SEQ ID NO.17-20中的任一者的位置311处的残基的残基。
9.根据权利要求4所述的抗体药剂，其中所述表位包含对应于在SEQ ID NO.17-20中的任一者的位置323处的残基的残基。
10.根据权利要求4所述的抗体药剂，其中所述表位包含对应于在SEQ ID NO.17-20中的任一者的位置327处的残基的残基。
11.根据权利要求4所述的抗体药剂，其中所述表位包含对应于在SEQ ID NO.17-20中的任一者的位置329处的残基的残基。
12.根据权利要求6所述的抗体药剂，其中所述对应的残基选自由以下组成的群组：丝氨酸、赖氨酸和苏氨酸。
13.根据权利要求7所述的抗体药剂，其中所述对应的残基为赖氨酸。
14.根据权利要求8所述的抗体药剂，其中所述对应的残基为赖氨酸。
15.根据权利要求9所述的抗体药剂，其中所述对应的残基选自由以下组成的群组：精氨酸、赖氨酸和谷氨酰胺。
16.根据权利要求10所述的抗体药剂，其中所述对应的残基选自由以下组成的群组：赖氨酸和谷氨酸。
17.根据权利要求11所述的抗体药剂，其中所述对应的残基选自由以下组成的群组：精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和苏氨酸。
18.根据权利要求1所述的抗体药剂，其重链可变区和/或轻链可变区包括至少一个互补决定区CDR，所述至少一个互补决定区与抗体4E11的参考CDR具有至少80％序列一致性，但因所述CDR内的至少一个氨基残基的取代而不同，使得所述抗体药剂强力中和所有四种DV血清型。
19.根据权利要求18所述的抗体药剂，所述抗体药剂包括至少一个CDR，所述至少一个CDR与抗体4E11的参考CDR实质上一致，因为其与所述参考CDR一致或者包括所述参考CDR内的氨基酸的1到5个之间的取代。
20.根据权利要求19所述的抗体药剂，其中所述参考CDR选自由以下组成的群组：
发现于4E11重链(SEQ ID NO.1)的残基27与33之间的参考CDR；
发现于4E11重链(SEQ ID NO.1)的残基53与58之间的参考CDR；
发现于4E11重链(SEQ ID NO.1)的残基100与106之间的参考CDR；
发现于4E11轻链(SEQ ID NO.2)的残基24与38之间的参考CDR；
发现于4E11轻链(SEQ ID NO.2)的残基54与60之间的参考CDR；
发现于4E11轻链(SEQ ID NO.2)的残基93与101之间的参考CDR；和
其组合。
21.根据权利要求19所述的抗体药剂，所述抗体药剂包括至少一个CDR，所述至少一个CDR与以下阐述的参考CDR实质上一致，因为其与所述参考CDR一致或者包括所述参考CDR内的氨基酸的1到5个之间的取代：
参考CDR：GFNIKDT(SEQ ID NO.7)、DPANGD(SEQ ID NO.8)、GWEGFAY(SEQ ID NO.9)、RASENVDRYGNSFMH(SEQ ID NO.14)、RASNLES(SEQ IDNO.15)和/或QRSNEVPWT(SEQ ID NO.16)。
22.根据权利要求19所述的抗体药剂，其中所述参考CDR为重链CDR。
23.根据权利要求19所述的抗体药剂，其中所述参考CDR为轻链CDR。
24.根据权利要求19所述的抗体药剂，其中所述抗体药剂包括至少一个与重链参考CDR实质上一致的重链CDR并且还包括至少一个与轻链参考CDR一致的轻链CDR。
25.根据权利要求19所述的抗体药剂，其中所述抗体药剂中的所述CDR中的每一者与所述参考CDR中的一者实质上一致。
26.根据权利要求1所述的抗体药剂，其重链可变区和/或轻链可变区包括至少一个互补决定区CDR，所述至少一个互补决定区与抗体4E11的参考CDR具有至少95％序列一致性，但因所述CDR内的至少一个氨基酸残基的取代而不同，使得所述抗体药剂强力中和所有四种DV血清型。
27.根据权利要求26所述的抗体药剂，所述抗体药剂包括至少一个CDR，所述至少一个CDR与抗体4E11的参考CDR实质上一致，因为其与所述参考CDR一致或者包括所述参考CDR内的氨基酸的1到5个之间的取代。
28.根据权利要求27所述的抗体药剂，其中所述参考CDR选自由以下组成的群组：
发现于4E11重链(SEQ ID NO.1)的残基27与33之间的参考CDR；
发现于4E11重链(SEQ ID NO.1)的残基53与58之间的参考CDR；
发现于4E11重链(SEQ ID NO.1)的残基100与106之间的参考CDR；
发现于4E11轻链(SEQ ID NO.2)的残基24与38之间的参考CDR；
发现于4E11轻链(SEQ ID NO.2)的残基54与60之间的参考CDR；
发现于4E11轻链(SEQ ID NO.2)的残基93与101之间的参考CDR；和
其组合。
29.根据权利要求27所述的抗体药剂，所述抗体药剂包括至少一个CDR，所述至少一个CDR与以下阐述的参考CDR实质上一致，因为其与所述参考CDR一致或者包括所述参考CDR内的氨基酸的1到5个之间的取代：
参考CDR：GFNIKDT(SEQ ID NO.7)、DPANGD(SEQ ID NO.8)、GWEGFAY(SEQ ID NO.9)、RASENVDRYGNSFMH(SEQ ID NO.14)、RASNLES(SEQ IDNO.15)和/或QRSNEVPWT(SEQ ID NO.16)。
30.根据权利要求27所述的抗体药剂，其中所述参考CDR为重链CDR。
31.根据权利要求27所述的抗体药剂，其中所述参考CDR为轻链CDR。
32.根据权利要求27所述的抗体药剂，其中所述抗体药剂包括至少一个与重链参考CDR实质上一致的重链CDR并且还包括至少一个与轻链参考CDR一致的轻链CDR。
33.根据权利要求27所述的抗体药剂，其中所述抗体药剂中的所述CDR中的每一者与所述参考CDR中的一者实质上一致。
34.根据权利要求18或26中任一权利要求所述的抗体药剂，其中所述重链可变区CDR在位置55处具有所述氨基酸残基的取代。
35.根据权利要求34所述的抗体药剂，其中在位置55处的所述取代氨基酸残基选自由以下组成的群组：谷氨酸和天冬氨酸。
36.根据权利要求34所述的抗体药剂，其中在位置55处的所述取代氨基酸残基为谷氨酸。
37.根据权利要求18或26中任一权利要求所述的抗体药剂，其中所述轻链可变区CDR在选自由以下组成的群组的位置处具有所述氨基酸残基的取代：31、57、59、60和其组合。
38.根据权利要求37所述的抗体药剂，其中所述轻链可变区CDR在位置31处具有所述氨基酸残基的取代。
39.根据权利要求38所述的抗体药剂，其中在位置31处的所述取代氨基酸残基为赖氨酸。
40.根据权利要求37所述的抗体药剂，其中所述轻链可变区CDR在位置57处具有所述氨基酸残基的取代。
41.根据权利要求40所述的抗体药剂，其中在位置57处的所述取代氨基酸残基选自由以下组成的群组：谷氨酸和丝氨酸。
42.根据权利要求40所述的抗体药剂，其中在位置57处的所述取代氨基酸残基为谷氨酸。
43.根据权利要求37所述的抗体药剂，其中所述轻链可变区CDR在位置59处具有所述氨基酸残基的取代。
44.根据权利要求43所述的抗体药剂，其中在位置59处的所述取代氨基酸残基选自由以下组成的群组：谷氨酰胺和天冬酰胺。
45.根据权利要求43所述的抗体药剂，其中在位置59处的所述取代氨基酸残基为谷氨酰胺。
46.根据权利要求37所述的抗体药剂，其中所述轻链可变区CDR在位置60处具有所述氨基酸残基的取代。
47.根据权利要求46所述的抗体药剂，其中在位置60处的所述取代氨基酸残基选自由以下组成的群组：色氨酸、酪氨酸和精氨酸。
48.根据权利要求46所述的抗体药剂，其中在位置60处的所述取代氨基酸残基为色氨酸。
49.根据权利要求1所述的抗体药剂，其为IgG。
50.根据权利要求1所述的抗体药剂，其为单克隆抗体。
51.根据权利要求1所述的抗体药剂，其中所述抗体药剂选自由以下组成的群组：小鼠抗体、人类化抗体、人类抗体、经纯化抗体、经分离抗体、嵌合抗体、多克隆抗体和其组合。
52.根据权利要求1所述的抗体药剂，其中所述抗体药剂选自由以下组成的群组：Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fd片段、Fd′片段、Fv片段、dAb片段、scFv片段、经分离CDR区、dsFv双功能抗体、单链抗体和其组合。
53.一种细胞系，其表达根据权利要求1所述的抗体药剂。
54.一种医药组合物，其包含：
一或多种根据权利要求1所述的抗体药剂；和
医药学上可接受的载剂或赋形剂。
55.根据权利要求54所述的医药组合物，其进一步包含至少一种其它抗病毒剂。
56.一种治疗有需要的个体的方法，其包含投与根据权利要求1所述的抗体药剂。
57.一种试剂盒，其包含：
至少一种根据权利要求1所述的抗体药剂；
用于向个体投与所述至少一种抗体或片段的注射器、针或施用器；和使用说明书。
58.一种制造医药组合物的方法，所述方法包含以下步骤：
提供根据权利要求1所述的抗体药剂；和
将所述抗体药剂与至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂调配，
以便产生医药组合物。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述医药组合物为液体组合物。
60.根据权利要求58所述的方法，其中所述医药组合物经调配以用于肠胃外投与。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述医药组合物经调配以用于静脉内投与。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述医药组合物经调配以用于静脉内投与儿童。
63.一种抗体药剂，其重链为或包含SEQ ID NO.：21内的氨基酸序列且其轻链为或包含SEQ ID NO.：22内的氨基酸序列。
64.一种抗体药剂，其具有至少一个CDR，所述至少一个CDR具有选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO.：23、SEQ ID NO.：24、SEQ ID NO.：25、SEQ ID NO.：26、SEQ ID NO.：27、SEQ ID NO.：28。
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