ES2383191T3 - Métodos y composiciones - Google Patents

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Abstract

Complejo que comprende una partícula de fago, comprendiendo dicha partícula de fago (i) un ácido nucleico que codifica un polipéptido; (ii) el polipéptido expresado por el ácido nucleico de (i) y expuesto en la superficie del fago; (iii) un compuesto conector unido a dicho polipéptido en el que dicho compuesto conector está unido al polipéptido mediante al menos tres enlaces covalentes independientes.

Description

Metodos y composiciones
CAMPO DE LA INVENCION
La invenci6n se refiere a la modificaci6n y al constrenimiento de polipeptidos, en particular a polipeptidos 5 codificados geneticamente en complejos con un acido nucleico que los codifica tal como en el contexto de la exposici6n en fagos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
La generaci6n de las moleculas con afinidad y especificidad elevadas por las dianas biol6gicas es un problema central en la quimica, en la biologia y en las ciencias farmaceuticas. En particular, los ligandos de fijaci6n son
10 importantes para la creaci6n de farmacos que son capaces de interferir con los procesos biol6gicos. La creaci6n de ligandos que se fijan a un ligando diana elegido suele implicar un proceso de generaci6n de una colecci6n de posibles moleculas de fijaci6n y el ensayo de las propiedades de fijaci6n de dichas moleculas.
Mientras que las tecnicas biol6gicas de selecci6n in vitro se utilizaron eficazmente para aislar grandes estructuras biopolimericas, tales como anticuerpos, hasta la fecha eran menos practicables para el aislamiento de farmacos 15 que fueran moleculas pequenas. Las tecnicas biol6gicas de selecci6n in vitro se limitan por lo general a polimeros biol6gicos tales como polipeptidos, ARN o ADN. Los biopolimeros pequenos como, por ejemplo, los peptidos, tambien se pueden fijar a dianas biol6gicas, pero pueden carecer de flexibilidad conformacional y pueden ser propensos a la degradaci6n proteolitica en los liquidos corporales. Ademas esta la debilidad de la afinidad de uni6n de los peptidos lineales pequenos. Se conocen diferentes estrategias de circularizaci6n para constrenir las 20 genotecas de peptidos pequenos codificados geneticamente. Se sabe que los repertorios de peptidos expuestos en fagos, por ejemplo, se circularizan mediante la oxidaci6n de dos restos de cisteina flanqueantes. Se sabe que las genotecas de peptidos ciclicos codificados por ARNm se generan al formar un enlace entre la amina aminoterminal y un resto de lisina del peptido con un reactivo de entrecruzamiento quimico. Esta estrategia se utiliz6 para aislar macrociclos insensibles a la 6xido-reducci6n que se fijan a la proteina de senalizaci6n G±i1 25 (Millward, S. W. et al., ACS Cher. Biol., 2007). Tambien se conocen diferentes estrategias para uso en la incorporaci6n de bloques de construcci6n no naturales en genotecas de polipeptidos codificados geneticamente para expandir la diversidad de las genotecas o para insertar propiedades que no pueden proporcionar los aminoacidos naturales. Sin embargo, las estrategias permitieron s6lo la adici6n de un numero limitado de anadidos organicas pequenos a los polipeptidos lineales codificados geneticamente. Frankel, A. et al., por ejemplo, 30 habian incorporado aminoacidos no naturales a polipeptidos naturales que se codificaron mediante exposici6n de ARNm (Frankel, A et al., Cher. Biol., 2003). Jespers L. et al habian conectado quimicamente una molecula indicadora fluorescente a un lazo hipervariable de un repertorio de anticuerpos expuestos en fagos, y seleccionaron del repertorio los que se fijaban a antigenos (Jespers, L., et al., Prot. Eng., 2004). Dwyer, M. A. et al habian juntado peptidos sinteticos a un repertorio de peptidos expuestos en fagos mediante la ligaci6n quimica nativa para la 35 generaci6n de una colecci6n de inhibidores de proteasas que contenian un aminoacido no natural (Dwyer, M. A. et al., Cheristry & Biology, 2000). Tambien se han conectado moleculas organicas pequenas a repertorios combinatorios de peptidos codificados por ARNm. El equipo de investigaci6n de Roberts, R. W. habia pegado un resto de penicilina a una posici6n fija de una genoteca de peptidos de exposici6n de ARNm para seleccionar los inhibidores de la proteina 2a de fijaci6n a la penicilina en Staphylococcus aureus (Li, S y Roberts, W. R., Cher &
40 Biol., 2003).
Se han propuesto varias metodologias para aplicar la selecci6n in vitro a colecciones combinatorias de compuestos que tienen arquitecturas moleculares mas diversas (p. ej., moleculas ramificadas) y que estan formadas por bloques de construcci6n no naturales. A diferencia de los metodos biol6gicos de selecci6n in vitro, estas metodologias utilizan estrategias quimicas para pegar etiquetas de ADN a las moleculas organicas 45 pequenas. Brenner S y Lerner R. A. habian propuesto un proceso de sintesis combinatoria paralela para codificar cada miembro de una gran quimioteca con secuencias nucleotidicas unicas en perlas (Brenner, S. y Lerner, R. A., PNAS, 1992). Despues de que la entidad quimica se fije a la diana, el c6digo genetico se descodifica por secuenciaci6n de la etiqueta nucleotidica. Liu D. R. y colaboradores habian conjugado una pequena colecci6n de moleculas organicas a oligonucle6tidos de ADN y realizaron selecciones por afinidad con antigenos diferentes 50 (Doyon, J. B. et al., JACS, 2003). Neri D. y colaboradores habian generado grandes repertorios de parejas moleculares mediante el autoensamblaje de subquimiotecas mas pequenas codificadas por ADN mediante la hibridaci6n de dos hebras de ADN (Melkko, S. et al., Nature Biotechnol., 2004). La metodologia se utiliz6 con exito para la maduraci6n de la afinidad de los ligandos que son moleculas pequenas. Halpin D. R. y Harris P. B. desarrollaron una estrategia para la evoluci6n in vitro de quimiotecas combinatorias que implica la amplificaci6n de 55 determinados compuestos para realizar varios ciclos de selecci6n (Halpin, D. R. y Harbury, P. B., PLOS Biology,
2004). Woiwode T. F. et al pegaron colecciones de compuestos sinteticos a las proteinas de la cubierta de las particulas de bacteri6fago de tal forma que la identidad de la estructura quimica esta especificada en el genoma del fago (Woiwode, T. F., Cher. & Biol., 2003). Todas estas estrategias que emplean entidades quimicas especificadas por ADN han resultado ser eficientes en experimentos modelo y algunos incluso han producido
5 nuevas moleculas pequenas aglutinantes. Sin embargo, qued6 muy claro que la codificaci6n de genotecas grandes de compuestos y la amplificaci6n de los compuestos seleccionados es mucho mas exigente que los procedimientos equivalentes en los sistemas biol6gicos de selecci6n.
Jespers et al (2004, «Protein engineering design and selection», volumen 17, n.o 10, paginas 709-713) describen la selecci6n de biosensores 6pticos a partir de colecciones de anticuerpos quimiosinteticos. Este documento trata de 10 la uni6n de una molecula indicadora fluorescente a traves del lazo hipervariable de un repertorio de anticuerpos expuestos en fagos. En particular, este documento describe la conexi6n de una molecula indicadora fluorescente en un lazo hipervariable (regi6n determinante de la complementariedad o CDR) de un repertorio de anticuerpos sinteticos. La molecula indicadora fluorescente esta conectada mediante un enlace covalente unico a un resto de cisteina introducido artificialmente en el lazo hipervariable. Se realiza la uni6n del uno al otro. Los restos cisteina
15 en las particulas de fagos se redujeron con DTT y se retir6 el exceso del agente reductor mediante precipitaci6n convencional con polietilenglicol (PEG) como se conoce bien en la tecnica.
Dwyer et al describen la exposici6n en fagos biosinteticos, que describe una nueva herramienta de ingenieria de proteinas que combina la diversidad quimica y genetica. Dwyer et al (Cher. Biol. 2000, volumen 7, no. 4, paginas 263-274) describen la ligaci6n quimica de un peptido sintetico que tiene un aminoacido no natural a una colecci6n 20 de peptidos sinteticos que comprende los principales restos estructurales de una proteina de interes. La motivaci6n para realizar esto fue para generar un amplio abanico de secuencias de proteasas, y cada una contiene un segmento constante que incorpora un aminoacido no natural. El peptido sintetico que comprende el aminoacido no natural se peg6 simplemente mediante ligaci6n quimica nativa, lo que da lugar al acoplamiento de los dos fragmentos peptidicos juntos. No se describe ningun compuesto conector. No se describe la adhesi6n de ninguna
25 molecula pequena. No se consigui6 ninguna constricci6n ni restricci6n conformacional del peptido resultante. No se describe ninguna formaci6n de enlaces covalentes entre determinados restos y la cadena polipeptidica.
Diferentes equipos de investigaci6n han sujetado previamente polipeptidos con restos de cisteina a una estructura molecular sintetica (Kemp, D. S y McNamara, P. E., J. Org. Cher. 1985; Timmerman, P. et al., CherBioCher, 2005). Meloen y colaboradores habian utilizado tris(bromometil)benceno y moleculas relacionadas para la ciclaci6n
30 cuantitativa y rapida de varios lazos peptidicos sobre armazones sinteticos para la imitaci6n estructural de las superficies proteicas (Timmerman, P. et al., CherBioCher, 2005). Los metodos para generar compuestos farmacol6gicos candidatos en donde dichos compuestos se generan mediante la conexi6n de polipeptidos que contienen cisteina a un armaz6n molecular como, por ejemplo, tris(bromometil)benceno, se describen en las patentes internacionales WO 2004/077062 y WO 2006/078161.
35 Los metodos dados a conocer en las patentes internacionales WO 2004/077062 y WO 2006/078161 se basan en tomar muestras de compuestos individuales, por ejemplo, en un procedimiento de escrutinio. El escrutinio de cada compuesto o de conjuntos pequenos de compuestos es tedioso y puede ser caro si se analizan grandes cantidades de compuestos. El numero de compuestos que se puede ensayar con los ensayos de escrutinio no suelen exceder unos pocos miles. Ademas, las condiciones de reacci6n descritas en la patente internacional WO 2004/077062
40 para sujetar un peptido que contiene cisteina a un armaz6n que contiene halometilo como, por ejemplo, tris(bromometil)benceno, no son adecuadas para modificar un peptido que contiene cisteina codificado geneticamente.
La patente internacional WO 2004/077062 describe un metodo para seleccionar un compuesto farmacol6gico candidato. En particular, este documento describe diferentes armazones moleculares que comprenden un primer y 45 segundo grupo reactivo, y que pone en contacto dicho armaz6n con otra molecula para formar al menos dos enlaces entre el armaz6n y la otra molecula en una reacci6n de acoplamiento. Este metodo adolece de muchas restricciones. Primero, se basa en el uso de peptidos sinteticos y en reacciones quimicas in vitro en recipientes independientes. Por este motivo resulta muy trabajoso. No existe la posibilidad de automatizar ni de aplicar el metodo al escrutinio de muchas variantes peptidicas sin producir manualmente cada variante mediante la
50 realizaci6n de numerosas reacciones independientes en paralelo. No se menciona la diversidad codificada geneticamente en este documento, y ciertamente no se menciona la aplicaci6n a genotecas de fagos codificadas geneticamente. Realmente, las condiciones de reacci6n descritas en este documento dan a entender que seria dificil o imposible realizar las reacciones descritas sobre particulas de fagos.
La patente internacional WO 2006/078161 describe compuestos de fijaci6n, compuestos inmun6genos y
55 peptidomimeticos. Este documento describe la sintesis artificial de diferentes colecciones de peptidos tomados de las proteinas existentes. Luego, estos peptidos se combinan con un peptido sintetico constante al que se han
introducido algunos cambios de aminoacidos para producir colecciones combinatorias. La introducci6n de esta diversidad a traves de enlace quimico con cada peptido que presenta diferentes cambios de aminoacido proporciona un incremento de la probabilidad de encontrar la actividad de fijaci6n deseada. La figura 7 de este documento muestra una representaci6n esquematica de la sintesis de distintas construcciones peptidicas con lazo. 5 No hay ninguna descripci6n de genotecas peptidicas codificadas geneticamente en este documento. No hay ninguna descripci6n del uso de las tecnicas de exposici6n en fagos en este documento. Este documento describe un proceso que se considera que es incompatible con la exposici6n en fagos. Por ejemplo, la quimica establecida en este documento probablemente de lugar a la molecula de conexi6n que reacciona con la cubierta de los fagos. Existe el riesgo de que pudieran entrecruzar particulas de fagos. Es probableque se inactiven las particulas de los
10 fagos (p. ej., perderian su infectividad) si se sometieran a la quimica descrita. Este documento se centra en la manipulaci6n de varios peptidos sinteticos en reacciones independientes de conjugaci6n quimica.
Millward et al (2007 Cherical Biology, volumen 2, n.o 9, paginas 625-634) describen el diseno de peptidos ciclicos que fijan a las superficies proteicas con una afinidad similar a la de los anticuerpos. Este documento describe la ciclaci6n de diferentes peptidos producidos por una genoteca codificada geneticamente. Los polipeptidos se ciclan 15 a traves de la reacci6n de un entrecruzador quimico con la amina del extremo amino y una amina de una lisina del polipeptido. En este documento, la genoteca codificada geneticamente es una genoteca de exposici6n de ARNm. Este documento no describe la adhesi6n de ningun compuesto conector a los polipeptidos resultantes. Este documento trata de la producci6n de peptidos ciclados insensibles a la 6xido-reducci6n. La quimica descrita en este documento es la ciclaci6n a traves de la reacci6n de un entrecruzador quimico con la amina del extremo
20 amino y una amina de una lisina del polipeptido. La reacci6n de ciclaci6n se realiza en tamp6n fosfato a 50 mM a pH 8 por la adici6n de DSG (1 mg/ml en DMF). A lo sumo, este documento describe la uni6n de dos partes de una cadena polipeptidica mediante un resto de entrecruzamiento para proporcionar un peptido ciclico.
La patente de los EE.UU. n.o US 2003/0235852 describe genotecas de exposici6n de peptidos y acidos nucleicos que contienen peptidos con restos de aminoacidos no naturales, y metodos para fabricar estos mediante agentes 25 modificadores de peptidos. En otras palabras, este documento describe genotecas de polipeptidos codificados geneticamente que contienen o bien un aminoacido no natural o bien un aminoacido en donde un bloque de construcci6n no natural (p. ej., penicilina) se pega postranduccionalmente mediante una reacci6n quimica. Este documento se centra en los metodos conocidos para asociar un peptido traducido con el acido nucleico que lo codifica. El otro problema tratado por este documento es c6mo incorporar los aminoacidos no naturales a ese 30 peptido. Esto se consigue principalmente mediante el uso de ARNt supresores para incorporar aminoacidos no naturales en respuesta a codones ambar/ocre/6palo como se conoce bien en la tecnica. En otras realizaciones menores, los aminoacidos no naturales se crean postranduccionalmente mediante el tratamiento del peptido traducido con un «agente modificador de peptidos». Este reactivo tipicamente tiene por objeto alterar un resto de aminoacido existente para convertirlo en un resto de aminoacido no natural, o de si no, convertirlo en 35 funcionalmente reactivo o receptivo a la adhesi6n de otro resto quimico. Especificamente, este documento da a conocer la conjugaci6n postraduccional de un resto de cisteina en el polipeptido de interes al antibi6tico 2lactamico acido 6-bromoacetilpenicilamico. Esto da lugar a la conjugaci6n de este analogo de penicilina con el polipeptido de interes a traves de un solo enlace con la cadena lateral del resto de cisteina. No se describe que la molecula que se va a ligar al polipeptido forme varios enlaces covalentes. No se describe ningun constrenimiento
40 conformacional del polipeptido. Ningun lazo peptidico ni ninguna otra estructura ternaria compleja se forma mediante los metodos descritos en este documento: es simplemente un modo de unir un unico grupo molecular adicional a un polipeptido a traves de un unico enlace. La quimica de conjugaci6n convencional se utiliza en este documento para introducir las modificaciones en los polipeptidos.
COMPENDIO DE LA INVENCION
45 La presente invenci6n permite ventajosamente la combinaci6n de la diversidad geneticamente codificada, en particular de genotecas de polipeptidos codificados geneticamente, con una modificaci6n quimica y un constrenimiento conformacional.
Ademas, las tecnicas descritas en la presente memoria dan a conocer la conexi6n de un compuesto conector a una molecula polipeptidica mediante al menos tres enlaces covalentes. Esto proporciona la ventaja del
50 constrenimiento conformacional del polipeptido, en particular el constrenimiento conformacional de al menos dos segmentos del polipeptido, uno respecto a otro. Por el contrario, el uso de un conector que forma s6lo dos enlaces covalentes constrenira s6lo un unico segmento del polipeptido.
Las ventajas de la invenci6n se deducen de estas caracteristicas tecnicas, por ejemplo, debido a su construcci6n con tres enlaces, las moleculas conjugadas de la invenci6n tienen dos o mas lazos peptidicos que son capaces de
55 interaccionar con una diana. Con varios lazos de fijaci6n se puede conseguir mayor afinidad de fijaci6n que con las moleculas que s6lo tienen un unico lazo peptidico.
Ademas, la superficie de interacci6n de una molecula de la invenci6n con dos o mas lazos de fijaci6n para la interacci6n con una diana es mayor que la de una molecula con un unico lazo peptidico con una diana. La mayor superficie de uni6n puede proporcionar una mejora de la afinidad de fijaci6n, y/o tambien puede proporcionar una mejora de la especificidad.
5 Por lo tanto, en un aspecto, la invenci6n da a conocer un complejo que comprende una particula de fago, comprendiendo dicha particula de fago
(i)
un polipeptido;
(ii)
un acido nucleico que codifica el polipeptido de (i) y que se expone sobre la superficie del fago;
(iii) un compuesto conector unido a dicho polipeptido
10 en donde dicho compuesto conector esta unido al polipeptido mediante al menos tres enlaces covalentes independientes.
Los enlaces covalentes son enlaces covalentes independientes adecuados en el sentido de que cada uno es un enlace distinto entre el compuesto conector y una parte del polipeptido. Por ejemplo, un unico puente entre el polipeptido y el compuesto conector cuyo unico puente esta hecho de tres enlaces covalentes (p. ej., conector -x
15 y -polipeptido, donde «-» representa un enlace covalente) no se consideraria que comprende al menos tres enlaces covalentes independientes porque los tres enlaces no son tres puentes separados ni tres conexiones desde el compuesto conector al polipeptido diana. El principio subyacente es que el compuesto conector/nucleo molecular y el polipeptido esten juntos mediante al menos tres enlaces covalentes de puente independientes.
Convenientemente, cada uno de los al menos tres enlaces covalentes se formado con un resto de aminoacido
20 distinto del polipeptido. En otras palabras, cada resto de aminoacido es convenientemente un resto de aminoacido individual o diferente: se puede formar mas de un enlace con una unica especie o tipo de resto de aminoacido, p. ej., cada uno de los dos enlaces puede estar formado por restos cisteina, pero convenientemente los dos restos de cisteina seran restos cisteina independientes.
La parte compuesto conector-polipeptido del complejo descrito mas arriba se denomina a veces un «conjugado».
25 En algunas realizaciones, el conjugado (a saber, un resto de polipeptido-compuesto conector que corresponde al comprendido por el complejo de la invenci6n) se puede sintetizar por separado. En esta realizaci6n, el conjugado puede no estar formando un complejo con un acido nucleico. Esto se explica mas detalladamente a continuaci6n.
Convenientemente, «codificar» tiene su significado natural en la tecnica, a saber, codificar en el sentido del c6digo universal de tripletes para convertir una secuencia de nucle6tidos en una secuencia polipeptidica. En la tecnica 30 anterior, «codificar» podria haberse utilizado en el sentido de «etiquetar» o «desconvolucionar», p. ej., cuando se utiliza una unica secuencia de nucle6tidos para etiquetar un resto y que ese conocimiento de la secuencia de nucle6tidos sea capaz de «descodificar», a saber, decir al usuario que resto etiquetado estaba presente, incluso sin que tenga ninguna relaci6n biol6gica con su estructura. Sin embargo, en la presente invenci6n, «codificar» y «descodificar» se utilizan de la manera natural tradicional para referirse a codificar en el sentido de la traducci6n
35 desde la secuencia de nucle6tidos a la secuencia de aminoacidos.
Convenientemente, el compuesto conector comprende una molecula organica. Convenientemente, el compuesto conector comprende una molecula organica pequena.
Convenientemente, los enlaces covalentes se forman entre el compuesto conector y los restos de aminoacidos del polipeptido.
40 Convenientemente, dicho polipeptido comprende un resto de cisteina, y convenientemente al menos uno de dichos tres enlaces covalentes independientes que unen dicho compuesto conector al polipeptido comprende un enlace con dicho resto de cisteina.
Convenientemente, el compuesto conector tiene una simetria molecular que corresponde al numero de enlaces covalentes mediante los cuales esta unido al polipeptido.
45 Convenientemente, el compuesto conector posee una simetria molecular ternaria y el compuesto conector esta unido al polipeptido mediante tres enlaces covalentes.
Convenientemente, el compuesto conector comprende un grupo quimico estructuralmente rigido.
Convenientemente el compuesto conector comprende tris-(bromometil)benceno (TBMB).
El acido nucleico tiene su significado usual en la tecnica y puede comprender ADN, ARN o cualquier otro acido nucleico adecuado. El acido nucleico puede comprender oligonucle6tido(s) o genoma(s) de fagos o cualquier otro ejemplo adecuado de acidos nucleicos conocidos por el experto en la tecnica.
Dicho acido nucleico esta comprendido por dicha particula de fago.
5 En otro aspecto, la invenci6n se refiere a una genoteca de polipeptidos codificados geneticamente que comprende al menos dos complejos diferentes como los descritos mas arriba.
En otro aspecto, la invenci6n se refiere a un metodo para construir un complejo, comprendiendo dicho metodo
(i) proporcionar una particula fagica que comprende un acido nucleico, y un polipeptido expresado por el acido nucleico y expuesto sobre la particula del fago
10 (ii) proporcionar un compuesto conector
(iii) unir dicho compuesto conector a dicho polipeptido mediante la formaci6n de al menos tres enlaces covalentes entre dicho compuesto conector y el polipeptido.
Convenientemente, se reducen los grupos reactivos del polipeptido expuestos sobre la particula del fago y, convenientemente, la particula de fago que expone el polipeptido que comprende grupos reactivos reducidos se
15 purifica mediante filtraci6n antes de la etapa (iii). Convenientemente, cuando los grupos reactivos comprenden cisteina, estan reducidos; en esta realizaci6n, la purificaci6n es purificaci6n para retirar el agente reductor, por ejemplo mediante filtraci6n.
Convenientemente, despues de la etapa de purificaci6n por filtraci6n, el polipeptido se mantiene en el estado reducido para formar un enlace con el compuesto conector mediante la incubaci6n en un tamp6n desgasificado y
20 en presencia de un quelante.
Convenientemente, la etapa (iii) comprende la incubaci6n del polipeptido y del compuesto conector juntos a 30 oC a pH 8 en tamp6n acuoso que comprende acetonitrilo.
Convenientemente, el compuesto conector comprende tris-(bromometil)benceno (TBMB).
Convenientemente, el tris-(bromometil)benceno esta presente a 10 IM.
25 Convenientemente, el tris-(bromometil)benceno esta presente a 10 IM, el quelante es acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), el acetonitrilo esta presente al 20% y la etapa de incubaci6n (iii) se realiza durante 1 hora.
Convenientemente, dicho metodo comprende otra etapa (iv) de escisi6n de uno o mas enlaces de la cadena polipeptidica. Esto tiene la ventaja de modificar la cadena polipeptidica. Por ejemplo, esto puede tener el beneficio
30 de producir varios polipeptidos unidos a un solo compuesto conector, p. ej., cuando la escisi6n tiene lugar en la cadena polipeptidica entre enlaces entre el polipeptido y el compuesto conector. Convenientemente, dicha etapa de escisi6n comprende poner en contacto dicho polipeptido con una proteasa.
En otro aspecto, la invenci6n se refiere a un complejo obtenido mediante un metodo como el descrito mas arriba.
En otro aspecto, la invenci6n se refiere a un metodo para identificar un complejo de acuerdo con una cualquiera de 35 las reivindicaciones precedentes que es capaz de unirse a un ligando, comprendiendo el metodo
(i)
proporcionar un complejo como el descrito mas arriba
(ii)
poner en contacto dicho complejo con el ligando, y
(iii) seleccionar los complejos que se fijan a dicho ligando.
Tal metodo de selecci6n se puede realizar en cualquier formato adecuado. Convenientemente, el ligando esta
40 inmovilizado. A continuaci6n, el complejo se pone en contacto con el ligando inmovilizado. Luego se lavan el o los complejos que no se unieron. De este modo, los complejos que se fijan al ligando inmovilizado se enriquecen o se seleccionan. En una realizaci6n, es posible que los complejos se puedan recuperar mediante la liberaci6n del ligando, a saber, la liberaci6n o la eluci6n del resto de ligando-complejo. Sin embargo, convenientemente, los complejos se recuperan mediante eluci6n (separaci6n) del ligando inmovilizado. En esta realizaci6n, los complejos
45 eluidos ya no estan unidos al ligando en la etapa de eluci6n.
Los complejos, o el o los polipeptidos de dichos complejos, o los conjugados polipeptido-compuesto conector de dichos complejos, pueden ser utiles en otros contextos. Por ejemplo, pueden ser utiles como una base para el diseno de farmacos tales como farmacos pequenos, o pueden ser utiles como CDR o como restos de fijaci6n (p. ej., para etiquetar o detectar su o sus hom6logos de uni6n) u otras aplicaciones donde se puede explotar el
5 conocimiento intimo de la interacci6n.
En otro aspecto, la invenci6n se refiere a un metodo como el descrito mas arriba que ademas comprende determinar la secuencia del acido nucleico de dicho complejo.
En otro aspecto, la invenci6n se refiere a un metodo como el descrito mas arriba que ademas comprende la etapa de fabricar una cantidad del complejo aislado con capacidad para fijarse a dicho ligando.
10 En otro aspecto, la invenci6n se refiere a un metodo como el descrito mas arriba que ademas comprende la etapa de fabricar una cantidad del resto polipeptido-compuesto conector comprendido por el complejo aislado que es capaz de fijarse a dicho ligando. En esta realizaci6n, el resto polipeptido-compuesto conector puede sintetizarse ventajosamente en ausencia de acido nucleico.
En otro aspecto, la invenci6n se refiere a un metodo como el descrito mas arriba que ademas comprende la etapa
15 de fabricar una cantidad de un polipeptido aislado o identificado mediante un metodo de la invenci6n, comprendiendo dicha fabricaci6n la uni6n del compuesto conector al polipeptido, en donde dicho polipeptido se expresa recombinantemente, o se sintetiza quimicamente. En otra realizaci6n, la invenci6n se refiere a un metodo como el descrito mas arriba que ademas comprende la etapa de fabricar una cantidad de un polipeptido aislado o identificado mediante un metodo de la invenci6n, comprendiendo dicha fabricaci6n unir un compuesto conector al
20 polipeptido, en donde el compuesto conector puede ser diferente del compuesto conector unido durante el aislamiento o la identificaci6n del polipeptido, siempre y cuando dicho compuesto conector se una a dicho polipeptido mediante al menos tres enlaces covalentes, y en donde dicho polipeptido se expresa recombinantemente o se sintetiza quimicamente.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
25 La invenci6n trae nuevas caracteristicas y le acompanan ventajas que se pueden explicar con mas detalle en conexi6n con la generaci6n de moleculas geneticamente codificadas con una estructura central. En particular, la invenci6n da a conocer una restricci6n conformacional que no se logra mediante las tecnicas conocidas de ciclaci6n de peptidos. Ademas, el interconector en los sistemas conocidos, tales como los de Roberts (ibii ), no tiene el caracter de un nucleo central/compuesto conector de la presente invenci6n. En los sistemas conocidos, se
30 utiliz6 el interconector simplemente para reemplazar un enlace disulfuro para generar un peptido ciclico insensible a la 6xido-reducci6n. No se menciona ni sugiere el concepto de un nucleo central con varias adiciones tales como un complejo polipeptido-compuesto conector unido por tres enlaces covalentes como se da a conocer en la presente memoria. De hecho, debe notarse que en la presente invenci6n el polipeptido esta conectado a la estructura central mediante al menos tres enlaces covalentes, que proporcionan una diferencia estructural clave
35 comparada con los sistemas conocidos. La conexi6n de una estructura central (compuesto conector) a un polipeptido codificado geneticamente via tres o mas enlaces es una reacci6n compleja que no se ha mostrado antes.
Ademas, la conexi6n de un polipeptido a un compuesto conector a traves de al menos tres enlaces covalentes podria producir varios productos diferentes. Esto podria ocasionar dificultades en el proceso de selecci6n y en el 40 procedimiento descodificador. Sin embargo, de acuerdo con la presente invenci6n, se da a conocer una soluci6n que utiliza un compuesto conector con tres grupos reactivos y, preferentemente una simetria rotacional ternaria, cuya combinaci6n tiene la ventaja de producir un s6lo producto. Por supuesto, el lector experto apreciara que en determinadas circunstancias oscuras, un compuesto conector con una simetria rotacional ternaria puede producir varios productos, muy especialmente en el ejemplo de una molecula tetrahedrica con tres grupos reactivos 45 identicos; esto tambien tiene una simetria rotacional ternaria, pero produciria dos estereois6meros. Sin embargo, para facilitar la comprensi6n, se reconoce que son posibles tales excepciones te6ricas para la formaci6n de un unico producto, produciendo los compuestos conectores adecuados con una simetria rotacional ternaria un unico producto de acuerdo con la presente invenci6n; en las raras circunstancias observadas mas arriba, entonces se elige el polipeptido adecuado para evitar la formaci6n de moleculas tetrahedricas y, por consiguiente, mantener la
50 formaci6n de tan s6lo un unico producto.
El compuesto conector utilizado en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria es diferente de los interconectores bivalentes conocidos (p. ej., como se utiliz6 por Millward et al., ibii ) en el requerimiento clave de que un compuesto conector de la invenci6n tiene al menos tres grupos reactivos que son capaces de formar al menos tres enlaces covalentes con el polipeptido diana. Esta peculiaridad produce numerosos beneficios tecnicos para la invenci6n. Primero, mediante la formaci6n de enlaces entre el compuesto conector y el polipeptido a traves de al menos tres enlaces covalentes se crean al menos dos lazos de polipeptido. Estos lazos se forman entre el primer y el segundo enlace, y entre el segundo y el tercer enlace del compuesto conector con el polipeptido. El conector conocido descrito por Millward et al s6lo puede conectar dos grupos funcionales de un peptido, y no
5 puede formar dos o mas lazos peptidicos constrenidos.
Ventajas del enlace entre compuesto conector y polipeptido
Hay una serie de propiedades que diferencian las moleculas de la invenci6n que tienen 3 o mas enlaces a un compuesto conector desde otras moleculas tales como las que s6lo contienen 2 enlaces. Algunas de ellas se explican a continuaci6n.
10 Primero, se apreciara que las moleculas con dos enlaces a un compuesto conector estan constrenidas al conectar entre si los extremos flexibles de un peptido lineal. Tambien es el caso de las moleculas de acuerdo con la presente invenci6n con tres o mas enlaces covalentes a un compuesto conector. Sin embargo, la conformaci6n de las moleculas de acuerdo con la presente invenci6n con 3 o mas enlaces covalentes a un compuesto conector esta constrenida por dos efectos adicionales que no se aplican a una molecula con solo dos enlaces:
15 (i) El polipeptido unido al compuesto conector a traves de al menos tres enlaces covalentes comprendera al menos dos lazos polipeptidicos constrenidos.
(ii) Los lazos polipeptidicos son capaces de interaccionar entre si a traves de interacciones no covalentes para generar una constricci6n adicional, y
(iii) Cada uno de los lazos ocupa un espacio que no puede ser ocupado por el otro o los otros lazos, lo que 20 adicionalmente restringe su flexibilidad conformacional.
Para ilustrar estos puntos se pueden imaginar las posibles sendas que puede tomar un polipeptido anclado a los puntos A y C a un compuesto conector. La introducci6n de un punto de anclaje B, entre los puntos A y C, y al mismo compuesto conector, limitara ademas las posibles sendas tomadas por el polipeptido y, por este motivo, su entropia conformacional. Como la fijaci6n del peptido a un ligando requiere la perdida de entropia conformacional
25 (y siempre y cuando el peptido pueda adoptar una conformaci6n que es complementaria a un ligando), se espera que la afinidad de uni6n entre el peptido ABC constrenido en el punto B intermedio y el ligando sea mayor que la del peptido AC. Por lo tanto, con la utilizaci6n de las moleculas constrenidas de la presente invenci6n se consiguen mayores afinidades de uni6n de lo que era posible en la tecnica anterior.
Ademas de estos puntos clave, a continuaci6n se presentan mas ventajas de tres o mas enlaces covalentes entre 30 el polipeptido y el compuesto conector.
Las moleculas de la invenci6n pueden fijarse a una diana a traves de la interacci6n de dos o mas lazos peptidicos constrenidos conformacionalmente. Cuantos mas lazos de uni6n, mas elevadas se pueden obtener las afinidades y especificidades. Se produce un efecto paralelo con los anticuerpos: se unen mejor cuando varias CDR interaccionan con la diana. Las moleculas de acuerdo con la presente invenci6n proporcionan por lo tanto
35 ventajosamente este beneficio tecnico de varios lazos para la interacci6n, beneficio que esta ausente en las moleculas con menos de tres enlaces.
Ademas de la provisi6n actual de un segundo (o posterior) lazo peptidico, es importante observar que tal lazo tambien ofrece la ventaja de constrenir conformacionalmente el otro o los otros lazos. Esto puede ocurrir a traves de la ocupaci6n de algunos de los pocos espacios tridimensionales que pueden entonces no estar ocupados por el
40 otro o los otros lazos. Alternativamente, esto puede ocurrir a traves de interacciones no covalentes entre varios lazos.
De estas ventajas tambien se puede observar que los ligandos mas estructurados se fijan generalmente con mayor afinidad (se pierde menos entropia durante la uni6n) y especificidad.
Como se explic6 en la presente memoria, la invenci6n tambien da a conocer la producci6n de estructuras
45 peptidicas con lazos en las cuales cada uno de dos (o mas) lazos tiene una propiedad diferente. Tales estructuras se denominan de «especificidad dual» para reflejar el hecho de que una unica entidad molecular tiene especificidades duales atribuibles a dos partes diferentes (lazos) de la misma estructura global. La ventaja de tales realizaciones es que cada lazo se puede seleccionar o construir para que se fije a una diana diferente (tal como un «antigeno»). Esto representa otra particularidad distintiva de un sistema de tres enlaces de acuerdo con la
50 presente invenci6n.
Ademas de estos efectos, las moleculas de la invenci6n tambien proporcionan la posibilidad de formar un sandwich con un unico antigeno (u otra entidad) entre dos segmentos de la cadena polipeptidica. Esta posibilidad esta por supuesto ausente de las construcciones polipeptidicas con menos de dos lazos. Por supuesto, la disposici6n particular adoptada puede depender de la geometria de la construcci6n particular a utilizar, pero la
5 invenci6n lo hace posible, a diferencia de lo que ocurre con los metodos de la tecnica anterior.
Por supuesto, en la explicaci6n anterior se han mencionado los lazos generados de acuerdo con la presente invenci6n. En algunas realizaciones, los lazos se escinden entonces. Es importante observar que incluso en tales realizaciones se forman los lazos, es simplemente que la molecula con lazo se trata como un intermediario que luego se procesa adicionalmente mediante la escisi6n de los lazos para producir una estructura peptidica lineal con
10 varias fijaciones. En estas realizaciones, debido a que el peptido se conecta inicialmente al compuesto conector a traves de tres o mas enlaces covalentes, las moleculas quedaran decoradas con tres o mas restos peptidicos despues de la escisi6n del polipeptido. Tales moleculas pueden formar mas interacciones con dianas, y se esperan afinidades de uni6n/especificidades mas elevadas, que es un ventaja mas del sistema de tres enlaces de la invenci6n.
15 Es una ventaja que las moleculas de la invenci6n que tienen dos o mas lazos polipeptidicos puedan formar mas interacciones con un ligando diana y, por consiguiente, pueden tener mayor afinidad y/o especificidad que las moleculas polipeptidicas con s6lo un lazo. Por ejemplo, puede ser deseable refinar el segundo lazo para que mejore su afinidad, lo que claramente no es posible para las moleculas con un unico lazo.
Es una ventaja que, en los complejos de la invenci6n, el compuesto conector tenga al menos dos lazos
20 polipeptidicos cercanos en el espacio. Estos dos o mas lazos pueden interaccionar simultaneamente con diferentes epitopos sobre el mismo ligando diana.
Ademas, el beneficio de tener dos o mas lazos se puede explotar para la fabricaci6n de moleculas de «especificidad dual», en donde un lazo tiene, o se seleccionado por ello, una propiedad particular o afinidad de uni6n, y el otro lazo tiene una propiedad o afinidad diferente. Estas moleculas se denominan «biespecificas» o de
25 «especificidad dual». Hay varios tipos posibles. Por ejemplo,
(a)
biespecificas hechas seleccionando el lazo 1 y luego el lazo 2 (o mas)
(b)
dos macrociclos biciclicos unidos
(c)
un macrociclo biciclico mas peptido o farmaco.
Para (a), esto podria tipicamente realizarse haciendo/seleccionando una alicuota de una genoteca contra un primer
30 antigeno, y otra alicuota contra un segundo antigeno. Los lazos seleccionados entonces podrian combinarse por pares, por ejemplo, mediante tecnicas estandares tales como recombinar los segmentos de acidos nucleicos que codifican los dos lazos para proporcionar una nueva genoteca de diferentes combinaciones del primer y segundo lazos. Las moleculas combinadas por pares (p. ej., fago) luego se pueden detectar y/o seleccionar por fijarse a ambos antigenos secuencialmente. De este modo se pueden fabricar biespecificos capaces de fijarse a dos
35 antigenos independientes. Naturalmente, este metodo puede aumentarse con otras etapas opcionales, e igualmente la afinidad de uni6n para cada antigeno podria mejorarse mediante la mutaci6n de cada lazo, que puede ser por mutaci6n dirigida o incluso aleatoria.
En una variaci6n de esta tecnica se podria seleccionar una alicuota de una colecci6n para fijaci6n a un primer antigeno. El lazo mas importante para la fijaci6n podria identificarse, por ejemplo, mediante la inspecci6n de
40 «secuencias consenso» entre las seleccionadas como aglutinantes, y el otro lazo se podria aleatorizar y seleccionar contra el segundo antigeno.
La mayoria de los biespecificos adecuados de este tipo tales como los descritos en (a) se fabricarian en los fagos.
Las moleculas variantes observadas en (b) y (c) mas arriba podrian igualmente realizarse como un fago (de una manera similar a la de mas arriba). Alternativamente, lo mas probable es que las dos entidades unidas se podrian
45 seleccionar por separado y luego fusionarlas en la etapa de la sintesis quimica, lo que podria simplificar su selecci6n/construcci6n.
Otra caracteristica ventajosa significativa mas de los aspectos de la invenci6n es que, ademas del compuesto conector de la invenci6n que sirve para conectar los segmentos del polipeptido mediante enlaces covalentes con los restos de aminoacidos en la base de cada lazo peptidico, el compuesto conector tambien se emplea en otras 50 interacciones no covalentes (tales como enlaces i6nicos, interacciones hidr6fobas, puentes de hidr6geno, interacciones de Van der Waals) con otros elementos de la cadena polipeptidica, tales como otros restos de
aminoacidos. Por el contrario, el conector bivalente de Milward et al. es lineal y muy flexible (propilo) y su unica funci6n es la de conectar dos extremos de un polipeptido para crear un peptido ciclico insensible a la 6xidoreducci6n. No seria esperable que el conector de Millward et al. estableciera interacciones no covalentes significativas con el lazo polipeptidico, al ser pequeno y muy flexible, y desde luego no hay pruebas de que lo haga.
5 Esta ventaja de la invenci6n se ilustra adicionalmente en la secci6n de ejemplos, junto con las pruebas de las interacciones no covalentes ventajosas. Asi pues, convenientemente, el polipeptido se une al compuesto conector mediante una o mas interacciones no covalentes, ademas del o de los enlaces covalentes explicados en la presente memoria. Esto tiene la ventaja adicional de proporcionar otro nivel de constrenimiento estructural al complejo/conjugado de la invenci6n.
10 Es una ventaja de la invenci6n que una molecula con varios lazos peptidicos este por lo general mas estructurada que un polipeptido con un unico lazo peptidico. Las moleculas muy estructuradas tienen a ser mas especificas. Igualmente, las moleculas bien estructuradas tienen por lo general mejor afinidad de uni6n. Ademas, una molecula con varios lazos peptidicos es capaz de formar mas interacciones con un ligado diana que con un polipeptido con un unico lazo peptidico.
15 Es otro beneficio de los aspectos de la invenci6n que el compuesto conector de la invenci6n tambien impone constrenimientos conformacionales que se derivan de su estructura quimica. Por ejemplo, algunos grupos quimicos se sabe que son inflexibles, que impiden la rotaci6n, que proporcionan impedimentos o restricciones estericos, que presentan una estructura rigida o si no, que proporcionan el armaz6n o constrenimiento al complejo. Asi pues, convenientemente, el compuesto conector de la invenci6n comprende un grupo de armaz6n tal como un
20 grupo de armaz6n rigido. La funci6n de este grupo de armaz6n es proporcionar la estructura o constrenimiento molecular al complejo de la invenci6n. En conexi6n con un compuesto conector preferente de la invenci6n, el tris(bromometil)benceno (TBMB), esta peculiaridad se ilustraria con referencia a la estructura plana del grupo benceno del TBMB. Este grupo bencenico es rigido debido a su caracter plano, y asi es capaz de servir de grupo de armaz6n del compuesto conector, en particular un grupo de armaz6n rigido.
25 Asi pues, en una realizaci6n mas preferente de la invenci6n, el compuesto conector proporciona constrenimientos conformacionales al polipeptido impuestos por los al menos tres enlaces covalentes, proporciona estructura adicional a traves de los enlaces no covalentes entre el compuesto conector y el polipeptido, y ademas el compuesto conector de la invenci6n tambien impone constrenimientos conformacionales por la naturaleza de su propia estructura quimica que sirve de armaz6n rigido. Por ejemplo, la estructura plana del grupo bencenico
30 cuando el compuesto conector comprende el mismo, tal como cuando el compuesto conector es tris(bromometil)benceno (TBMB).
COMPUESTO CONECTOR
El compuesto conector se denomina a veces el «nucleo molecular». Convenientemente, el compuesto conector posee simetria molecular. Convenientemente, el compuesto conector posee tres grupos reactivos y posee simetria
35 ternaria. Esto tiene la ventaja de producir solo un unico producto de reacci6n. Si el compuesto conector no es una molecula simetrica, entonces se pueden generar numerosos productos de reacci6n. Esto puede conllevar complicaciones o requerir que el is6mero deseado quede separado de los otros productos de reacci6n. Al usar un compuesto conector que tiene la simetria adecuada, tales problemas se mejoran ventajosamente.
Es una ventaja de la invenci6n que los polipeptidos producidos tengan una mayor complejidad que los peptidos
40 ciclicos de la tecnica anterior. Por ejemplo, los polipeptidos producidos de acuerdo con la presente invenci6n podrian poseer mas de dos lazos para la interacci6n con otras entidades quimicas. Ademas, los polipeptidos producidos de acuerdo con la presente invenci6n disfrutan de un mayor nivel de constrenimiento que los polipeptidos basados en la tecnica anterior. Estos dos efectos juntos crean la ventaja adicional de que varios lazos (o «ciclos») del polipeptido quedan retenidos muy cerca unos de otros a traves de sus enlaces con el compuesto
45 conector comun. Esto proporciona un mayor nivel de constrenimiento sobre la conformaci6n de los polipeptidos.
Tipicamente, los polipeptidos ciclicos de la tecnica anterior se unen mediante varios restos de cisteina tales como dos restos de cisteina de un puente entre dos partes del peptido y mediante lo cual se forma un polipeptido ciclico. Sin embargo, tales moleculas son sensibles a la 6xido-reducci6n. El metodo de Millward et al. esta directamente enfocado a la producci6n de peptidos ciclicos que son insensibles a la 6xido-reducci6n. En este sentido, el metodo
50 de Millward et al. se aparta de la tecnica anterior y da a conocer el uso de las cisteinas como grupos reactivos para la modificaci6n de polipeptidos. Por el contrario, de acuerdo con la presente invenci6n, las cisteinas son los grupos reactivos preferentes.
Cuando hay tres o mas grupos reactivos para al menos tres enlaces covalentes independientes con el compuesto conector, dichos grupos reactivos no necesitan ser cada uno una cisteina. Por ejemplo, los tres grupos reactivos pueden comprender una cisteina y otros dos grupos reactivos adecuados, que por ejemplo podrian comprender lisina, selenocisteina u otro(s). Mas convenientemente, los tres grupos reactivos son cisteina.
Los metodos de la tecnica anterior solo han conducido a la producci6n de polipeptidos con un unico lazo. De acuerdo con la presente invenci6n, se pueden producir al menos dos lazos o incluso mas mediante la sujeci6n de 5 diferentes puntos del polipeptido al compuesto conector.
El metodo de la presente invenci6n implica un minimo de tres enlaces con el polipeptido. Esto tiene la ventaja de un mayor constrenimiento molecular. En esto consiste la ventaja adicional de la presentaci6n de varios lazos polipeptidicos para la interacci6n con otros restos.
En las tecnicas conocidas se ha introducido o unido al polipeptido, tal como un polipeptido codificado
10 geneticamente, un mejor agente de interconexi6n. Por el contrario, la presente invenci6n da a conocer un compuesto conector para la coordinaci6n multiple de diferentes partes del mismo polipeptido.
Convenientemente, el compuesto conector puede ser una molecula pequena. Convenientemente, el compuesto conector es una molecula organica pequena.
Convenientemente, el compuesto conector puede ser mon6meros naturales tales como nucle6sidos, azucares o
15 esteroides, o puede basarse en ellos. Convenientemente, el compuesto conector puede comprender un polimero pequeno de tales entidades, tal como un dimero o un trimero.
Convenientemente, el compuesto conector es un compuesto de toxicidad conocida, convenientemente de baja toxicidad. Ejemplos de compuestos adecuados incluyen colesteroles, nucle6tidos, esteroides o farmacos existentes tal como tamazapan.
20 Convenientemente, el compuesto conector puede ser una macromolecula. Convenientemente, el compuesto conector es una macromolecula compuesta de aminoacidos, nucle6tidos o glucidos.
Convenientemente, el compuesto conector comprende grupos reactivos que son capaces de reaccionar con uno o mas grupos funcionales del polipeptido diana para formar enlaces covalentes.
El compuesto conector puede comprender grupos quimicos como aminas, tioles, alcoholes, cetonas, aldehidos,
25 nitrilos, acidos carboxilicos, esteres, alquenos, alquinos, azidas, anhidridos, succinimidas, maleimidas, haluros de alquilo y haluros de acilo.
Convenientemente, el compuesto conector puede comprender o puede consistir en tris(bromometil)benceno o un derivado del mismo.
Convenientemente, el compuesto conector tiene una simetria rotacional ternaria de tal forma que al hacer
30 reaccionar tres grupos funcionales del polipeptido diana con el compuesto conector se genera un unico is6mero del producto.
En algunas realizaciones, el compuesto conector puede tener geometria tetrahedrica de tal forma que la reacci6n de cuatro grupos funcionales del polipeptido codificado con el compuesto conector genera no mas de dos is6meros del producto.
35 Un compuesto conector adecuado es el 1,3,5-tris(bromometil)benceno (TBMB).
Un compuesto conector adecuado es el 2,4,6-tris(bromometil)mesitileno. Es similar al 1,3,5tris(bromometil)benceno, pero contiene otros tres grupos metilo unidos al anillo bencenico. Esto tiene la ventaja de que los grupos metilo adicionales pueden formar otros contactos con el polipeptido y asi anadir otros constrenimientos estructurales.
40 El compuesto conector de la presente invenci6n se selecciona entre o bien una molecula pequena o bien una estructura macromolecular. Dicho compuesto conector esta formado por componentes organicos, inorganicos u organicos e inorganicos.
En una realizaci6n preferente, el compuesto conector es una molecula organica pequena como por ejemplo, un alcano lineal. Mas convenientemente, el compuesto conector es un alcano ramificado, un alcano ciclico, un alcano
45 policiclico, un aromato, un alcano heterociclico o un aromato heterociclico, lo cual ofrece la ventaja de ser menos flexible (esto es, mas rigido).
En otra realizaci6n, el compuesto conector se selecciona entre una estructura macromolecular como por ejemplo un polipeptido, un polinucle6tido o un polisacarido.
El compuesto conector de la invenci6n contiene grupos quimicos que permiten que los grupos funcionales del polipeptido de la libreria codificada de la invenci6n formen enlaces covalentes con el compuesto conector. Dichos grupos quimicos se seleccionan entre una amplio abanico de grupos funcionales, que incluyen aminas, tioles,
5 alcoholes, cetonas, aldehidos, nitrilos, acidos carboxilicos, esteres, alquenos, alquinos, anhidridos, succinimidas, maleimidas, azidas, haluros de alquilo y haluros de acilo.
En una realizaci6n, el compuesto conector de la invenci6n es tris(bromometil)benceno o un derivado del mismo.
POLIPEPTIDO
Los grupos funcionales de los polipeptidos codificados son convenientemente proporcionados por las cadenas
10 laterales de los aminoacidos naturales y no naturales. Los grupos funcionales de los polipeptidos codificados se seleccionan convenientemente entre grupos tiol, grupos amino, grupos carboxilo, grupos guanidinio, grupos fen6licos o grupos hidroxilo. Los grupos funcionales de los polipeptidos codificados se podrian seleccionar convenientemente entre grupos azida, cetocarbonilo, alquino, vinilo o haluro de arilo. Los grupos funcionales de los polipeptidos codificados con los que unirse a un compuesto conector pueden convenientemente ser el extremo
15 amino o carboxilo del polipeptido.
En algunas realizaciones, cada uno de los grupos funcionales del polipeptido con los que se une al compuesto conector son del mismo tipo. Por ejemplo, cada grupo funcional puede ser un resto de cisteina.
En algunas realizaciones, los grupos funcionales con los que se une al compuesto conector pueden comprender dos o mas tipos diferentes, o pueden comprender tres o mas tipos diferentes. Por ejemplo, los grupos funcionales
20 pueden comprender dos restos de cisteina y un resto de lisina, o pueden comprender un resto de cisteina, un resto de lisina y una amina del extremo amino.
En algunas realizaciones, aminoacidos alternativos, tales como los aminoacidos naturales, pueden resultar adecuados para modificar quimicamente los polipeptidos, tal como los peptidos expuestos en fagos de la invenci6n.
25 La cisteina es el aminoacido mas adecuado porque tiene la ventaja de que su reactividad es la mas diferente entre los aminoacidos. Los grupos reactivos que se pueden usar en el compuesto conector para que reaccionen con los grupos tiol de las cisteinas son haluros de alquilo (o tambien denominados halogenoalcanos o haloalcanos). Ejemplos son el bromometilbenceno (el grupo reactivo de ejemplo en el TBMB) o la yodoacetamida. Las maleimidas son otros grupos reactivos que se usan para conjugar selectivamente los compuestos a las cisteinas
30 de las proteinas. Ejemplos de maleimidas que se pueden usar como compuestos conectores en la invenci6n incluyen: tris-(2-maleimidoetil)amina, tris-(2-maleimidoetil)benceno, tris-(maleimido)benceno. La selenocisteina tambien es un aminoacido natural que tiene una reactividad similar a la cisteina y que se puede usar para las mismas reacciones. Asi pues, siempre que se mencione la cisteina, es tipicamente aceptable su sustituci6n por selenocisteina a menos que el contexto sugiera otra cosa. La cisteina se usa con mas preferencia.
35 Las lisinas (y las aminas primarias del extremo amino de los peptidos) tambien son grupos funcionales adecuados para modificar los peptidos de los fagos mediante la uni6n con un compuesto conector. Sin embargo, en las proteinas de los fagos abundan mas que las cisteinas, y el riesgo de que las particulas de fago se queden entrecruzadas o pierdan su infectividad es elevado. No obstante, encontramos que las lisinas son especialmente utiles en las reacciones intramoleculares (por ejemplo, cuando un compuesto conector ya esta unido al peptido en
40 el fago) para formar un segundo o sucesivos enlaces con el compuesto conector. En este caso, el compuesto conector reacciona preferentemente con las lisinas del peptido expuesto (en particular con las lisinas que esten muy cerca). Los grupos funcionales que reaccionan selectivamente con las aminas primarias son succinimidas, aldehidos o haluros de alquilo. Con respecto a los haluros de alquilo, el lector sabra que existen haluros de alquilo de diferente reactividad. In el grupo bromometilo que hemos usado en una serie de ejemplos acompanantes, los
45 electrones del anillo bencenico son capaces de estabilizar el estado de transici6n cati6nico. Este haluro de alquilo particular es por tanto 100-1000 veces mas reactivo que los haluros de alquilo que no estan conectados a un grupo bencenico. Los ejemplos de succinimidas para uso como compuesto conector incluyen tris(succinimidilaminotriacetato), acido 1,3,5-benciltriacetico. Los ejemplos de aldehidos para uso como compuesto conector incluyen el triformilmetano. Los ejemplos de haluros de alquilo para uso como compuesto conector incluyen 1,3,5
50 tris(bromometil)-2,4,6-trimetilbenceno, 1,3,5-tris(bromometil)benceno, 1,3,5-tris(bromometil)-2,4,6-trietilbenceno.
En algunas realizaciones, los conectores moleculares o las modificaciones se pueden anadir a (o crear en) los grupos funcionales de los polipeptidos codificados antes de que se unan al compuesto conector, en donde dichos conectores o modificaciones son capaces de reaccionar con el compuesto conector.
Los aminoacidos con grupos funcionales para unir a un compuesto conector pueden estar localizados en cualquier posici6n adecuada dentro del polipeptido codificado. Para influir en la creaci6n de lazos o de estructuras particulares, el experto en la tecnica sabe c6mo variar las posiciones de los aminoacidos que tienen los grupos funcionales, por ejemplo mediante manipulaci6n del acido nucleico que codifica el polipeptido para mutar el
5 polipeptido producido.
Cada uno de los aminoacidos del polipeptido codificado puede ser una diana para la mutagenesis (por ejemplo, mutagenesis de variaci6n restringida) de acuerdo con las necesidades del experto o el prop6sito con el que se aplica la invenci6n. Claramente se requiere que el polipeptido de interes presente al menos tres grupos funcionales para formar enlaces con el compuesto conector. Los aminoacidos que no sean los requeridos para formar enlaces
10 con el compuesto conector pueden variar con libertad de acuerdo con las necesidades del operador y se denominan «aminoacidos variables». Dichos aminoacidos variables del polipeptido codificado (por ejemplo, uno o varios miembros de la colecci6n de polipeptidos) pueden estar aleatorizados, parcialmente aleatorizados o constantes.
El polipeptido diana comprende un segmento de fijaci6n al compuesto conector. Esta es la regi6n a la que se une
15 el compuesto conector. Convenientemente, a este segmento de fijaci6n se aplica el comentario con respecto a los grupos funcionales del polipeptido. Convenientemente, el segmento de fijaci6n al compuesto conector que tiene el polipeptido diana comprende de 1 a 20 restos de aminoacidos. Convenientemente, el segmento de fijaci6n al compuesto conector que tiene el polipeptido diana comprende menos de 10 aminoacidos. Esto tiene la ventaja de imponer mas constricciones conformacionales al segmento del polipeptido cuando esta unido al compuesto
20 conector.
El polipeptido diana comprende convenientemente la secuencia AC(X)6C(X)6CG, en la que X se refiere a un aminoacido natural al azar, A es alanina, C es cisteina y G es glicina.
El polipeptido diana comprende convenientemente la secuencia (X)lY(X)mY(X)nY(X)o, en donde Y representa un aminoacido con un grupo funcional, X representa un aminoacido al azar, m y n son numeros entre 1 y 20 que
25 definen la longitud de los segmentos polipeptidicos interpuestos, y l y o son numeros entre 0 y 20 que definen la longitud de los segmentos polipeptidicos flanqueantes.
En algunas realizaciones, el complejo de la invenci6n puede comprender un polipeptido con la secuencia AC(X)6C(X)6CG. En una realizaci6n, un miembro o complejo de una genoteca de la invenci6n puede comprender un compuesto conector mesitileno y un polipeptido con la secuencia AC(X)6C(X)6CG, en donde el polipeptido se
30 sujeta a los grupos metilo exociclicos del compuesto conector mediante los restos de cisteina del polipeptido al formar tres enlaces tioeter con ellos, y en donde X se refiere a un aminoacido (convenientemente un aminoacido natural), A es alanina, C es cisteina y G es glicina.
Convenientemente, el polipeptido diana comprende un inhibidor de la calicreina plasmatica humana y el polipeptido comprende una o mas de las secuencias de aminoacidos
Con secuencia relacionada se quiere decir una secuencia de aminoacidos que tiene al menos una identidad del 50%, convenientemente al menos una identidad del 60%, convenientemente al menos una identidad del 70%, convenientemente al menos una identidad del 80%, convenientemente al menos una identidad del 90%,
40 convenientemente al menos una identidad del 95%, convenientemente al menos una identidad del 98%, convenientemente al menos una identidad del 99%. La identidad se juzga convenientemente a lo largo de un segmento contiguo de al menos 10 aminoacidos, convenientemente al menos 12 aminoacidos, convenientemente al menos 14 aminoacidos, convenientemente al menos 16 aminoacidos, convenientemente al menos 17 aminoacidos o la longitud completa de la secuencia de referencia.
45 Convenientemente, el polipeptido diana comprende un inhibidor de la catepsina G humana y el polipeptido secuencias de aminoacidos
o una secuencia relacionada.
Convenientemente, el polipeptido diana comprende un inhibidor del activador humano del plasmin6geno del tipo urocinasa y el polipeptido comprende una o mas de las secuencias de aminoacidos
o una secuencia relacionada.
Convenientemente, el polipeptido diana esta incluido en una colecci6n de polipeptidos que contiene al menos 105 miembros, mas convenientemente al menos 109 miembros. La invenci6n tambien se refiere a tales colecciones.
GRUPOS REACTIVOS DEL POLIPEPTIDO
El compuesto conector de la invenci6n puede estar fijado al polipeptido a traves de grupos funcionales o reactivos del polipeptido. Estan formados tipicamente por las cadenas laterales de aminoacidos determinados que se encuentran en el polimero polipeptidico. Tales grupos reactivos pueden ser una cadena lateral de cisteina, una
5 cadena lateral de lisina o un grupo amina del extremo amino o cualquier otro grupo reactivo adecuado.
Convenientemente, al menos un grupo funcional es un grupo cisteina. Grupos tales como las aminas de las lisinas
o del extremo amino no suelen ser suficientemente reactivos para formar un enlace con el compuesto conector por si mismos dentro de un intervalo de tiempo conveniente. Sin embargo, una vez que el compuesto conector ha sido atraido o enlazado a al menos una cisteina, entonces la cinetica ordinaria de la reacci6n da a entender que los
10 enlaces de lisina o amina pueden formarse rapida y establemente a partir de ese momento. Por este motivo, convenientemente, al menos uno de los grupos funcionales es un grupo cisteina.
Si fueran deseables los grupos reactivos en el polipeptido diferentes de los grupos de cisteina/lisina/amina, entonces se podria elegir un compuesto conector diferente para acoplarse con los grupos reactivos funcionales determinados de elecci6n en el polipeptido diana.
15 Convenientemente, los grupos cisteina, lisina o amina se utilizan como grupos funcionales o reactivos en el polipeptido de interes.
Convenientemente, se forman al menos tres enlaces covalentes entre el compuesto conector y el polipeptido de interes.
En algunas realizaciones se pueden formar cuatro enlaces o incluso mas entre el compuesto conector y el
20 polipeptido de interes. Sin embargo, si se utilizan mas de cuatro enlaces, entonces tipicamente las mezclas de producto formadas se vuelven cada vez mas complejas y pueden obstaculizar los posteriores usos o aplicaciones. Por este motivo se prefieren tres enlaces o cuatro enlaces entre el compuesto conector y el polipeptido de interes. En cualquier realizaci6n se prefiere que el compuesto conector tenga simetria molecular. Lo mas preferente son los compuestos conectores que tienen tres grupos funcionales o reactivos. Lo mas preferente son los compuestos
25 conectores que tienen una simetria molecular ternaria.
Los grupos funcionales de los polipeptidos codificados geneticamente de la invenci6n son capaces de formar enlaces covalentes con el nucleo molecular/compuesto conector. Los grupos funcionales son grupos especificos de atomos dentro de aminoacidos tanto naturales como no naturales. Preferentemente, los grupos funcionales con una reactividad quimica distintiva se utilizan para conectar el polipeptido al compuesto conector para formar el
30 complejo de la invenci6n. El uso de dichos grupos funcionales distintivos permite que el nucleo molecular/compuesto conector forme enlace exclusivamente con los grupos funcionales designados del polipeptido, pero no con otros grupos quimicos de o bien los distintos elementos del polipeptido, o bien el acido nucleico, o bien otros componentes del complejo.
Los grupos funcionales adecuados de aminoacidos naturales son el grupo tiol de la cisteina, el grupo amino de la
35 lisina, el grupo de carboxilo del aspartato o del glutamato, el grupo guanidinio de la arginina, el grupo fenol de la tirosina o el grupo hidroxilo de la serina. Los aminoacidos no naturales pueden proporcionar un gran abanico de grupos funcionales, entre ellos, una azida, un cetocarbonilo, un alquino, un vinilo o un grupo haluro de arilo. El grupo amino y el carboxilo de los extremos del polipeptido tambien pueden servir de grupos funcionales para formar enlaces covalentes con un compuesto conector/nucleo molecular.
40 Los polipeptidos codificados de la invenci6n contienen convenientemente al menos tres grupos funcionales. Dichos polipeptidos tambien pueden contener cuatro o mas grupos funcionales. Cuantos mas grupos funcionales se utilizan, mas diversidad de segmentos se pueden sujetar al nucleo molecular/compuesto conector. Sin embargo, no se recomienda la uni6n de un numero excesivo de grupos funcionales a un nucleo molecular/compuesto conector porque puede conducir a un numero inmanejable de is6meros de productos. Convenientemente se utilizan
45 tres, cuatro o cinco enlaces covalentes a un compuesto conector; lo mas convenientemente tres o cuatro enlaces covalentes; lo mas convenientemente tres enlaces covalentes.
En una realizaci6n preferente se generan polipeptidos codificados con tres grupos funcionales. La reacci6n de dichos polipeptidos con un nucleo molecular/compuesto conector que tiene una simetria rotacional ternaria genera un unico is6mero del producto. La generaci6n de un unico is6mero del producto es favorable por varias razones. 50 Los acidos nucleicos (a veces denominados los «c6digos geneticos») de las genotecas compuestas codifican s6lo las secuencias primarias del polipeptido, pero no la isomeria de las moleculas que se forman al hacer reaccionar el polipeptido codificado con el nucleo molecular. S6lo en el caso de que se forme un unico is6mero del producto se definira claramente la asignaci6n del acido nucleico al is6mero del producto. Si se forman varios is6meros del
producto, el acido nucleico no puede dar informaci6n sobre la naturaleza del is6mero del producto que se aisl6 en un procedimiento de escrutinio o de selecci6n. La formaci6n de un unico is6mero del producto tambien es ventajosa si se sintetiza un miembro especifico de una genoteca de la invenci6n. En este caso, la reacci6n quimica del polipeptido con el compuesto conector produce un unico is6mero del producto en vez de una mezcla de
5 is6meros.
En otra realizaci6n de la invenci6n, se generan polipeptidos codificados con cuatro grupos funcionales. La reacci6n de dichos polipeptidos con un nucleo molecular/compuesto conector que tiene una simetria tetrahedrica genera dos is6meros del producto. Incluso aunque los dos diferentes is6meros del producto esten codificados por uno y el mismo acido nucleico («c6digo genetico»), la naturaleza isomerica del is6mero aislado se puede determinar
10 mediante la sintesis quimica de ambos is6meros, separando los dos is6meros y comprobando si ambos is6meros se fijan a un ligando diana.
En una realizaci6n de la invenci6n, al menos uno de los grupos funcionales de los polipeptidos es ortogonal a los demas grupos funcionales. El uso de los grupos funcionales ortogonales permite dirigir dichos grupos funcionales ortogonales a sitios especificos del nucleo molecular. Las estrategias de conexi6n que implican grupos funcionales
15 ortogonales se puede utilizar para limitar el numero de is6meros del producto formados. En otras palabras, al elegir grupos funcionales diferentes o distintos para uno o mas de los al menos tres enlaces con los elegidos por el que queda de los al menos tres enlaces, se puede conseguir de manera util un orden determinado de fijaci6n o direcci6n de los grupos funcionales especificos del polipeptido a posiciones especificas del compuesto conector.
En otra realizaci6n, los grupos funcionales del polipeptido codificado de la invenci6n se hacen reaccionar con
20 conectores moleculares, en donde dichos conectores son capaces de reaccionar con un armaz6n molecular/compuesto conector, de modo que el conector se interpondra entre el compuesto conector y el polipeptido en el estado fijado final.
Los aminoacidos adecuados de los miembros de las genotecas combinatorias de entidades quimicas codificadas geneticamente se pueden reemplazar por cualquier aminoacido natural o no natural. Quedan excluidos de estos 25 aminoacidos intercambiables los que albergan grupos funcionales con los que entrecruzar los polipeptidos a un nucleo molecular. Un grupo de aminoacidos adyacentes que puede variar se define como un segmento polipeptidico. El tamano de un unico segmento polipeptidico oscila de 1 a 20 aminoacidos. Los segmentos polipeptidicos tienen secuencias aleatorias, secuencias constantes o secuencias con aminoacidos constantes y aleatorios. Los aminoacidos con grupos funcionales se localizan o bien en posiciones definidas o bien en
30 posiciones aleatorias del polipeptido codificado de la invenci6n.
En una realizaci6n, los segmentos de polipeptido que estan fijados por dos aminoacidos que albergan grupos funcionales para fijarse a un nucleo molecular/compuesto conector son secuencias de aminoacidos cortas de 10 o menos aminoacidos. La reacci6n de dichas secuencias de polipeptidos codificados con un nucleo molecular genera miembros de la genoteca con un constrenimiento conformacional elevado. Los ligandos con
35 constrenimiento conformacional son generalmente mas especificos y tienen mayor afinidad de uni6n. El constrenimiento conformacional tambien puede proteger los ligandos de la degradaci6n proteolitica, por ejemplo en los liquidos corporales.
En una realizaci6n, un polipeptido codificado con tres grupos funcionales tiene la secuencia (X)lY(X)mY(X)nY(X)o, en donde Y representa un aminoacido con un grupo funcional, X representa un aminoacido aleatorio, m y n son
40 numeros entre 1 y 20 que definen la longitud de los segmentos polipeptidicos interpuestos, y l y o son numeros entre 0 y 20 que definen la longitud de los segmentos polipeptidicos flanqueantes.
En una realizaci6n preferente, una genoteca de polipeptidos codificados de la invenci6n tiene la secuencia AC(X)6C(X)6CG, en donde A representa alanina, C representa cisteina, X representa un aminoacido natural al azar y G representa glicina.
45 Se pueden utilizar alternativas a conjugaciones a traves de tioles para unir el compuesto conector al peptido mediante interacciones covalentes. Alternativamente se pueden utilizar estas tecnicas para modificar o unir otros restos (tales como moleculas pequenas de interes que son distintas al compuesto conector) al polipeptido despues de que se haya seleccionado o aislado segun la presente invenci6n; en esta realizaci6n, la uni6n no necesita ser entonces claramente covalente y puede abarcar una uni6n no covalente. Estos metodos se puede utilizar en vez de
50 (o en combinaci6n con) los metodos en los que intervienen tioles mediante la producci6n de fagos que exponen proteinas y peptidos que llevan aminoacidos no naturales con el requisito de grupos funcionales quimicos, en combinaci6n con moleculas pequenas que llevan el grupo funcional complementario, o mediante la incorporaci6n de los aminoacidos no naturales en un polipeptido sintetizado recombinantemente o quimicamente cuando la molecula se fabrica despues de la fase de selecci6n/aislamiento.
Los aminoacidos no naturales incorporados en los peptidos y proteinas expuestos en fagos pueden incluir 1) un grupo funcional cet6nico (como el encontrado en la para-o reta-acetilfenilalanina) que se puede hacer reaccionar especificamente con hidrazinas, hidroxilaminas y sus derivados («Addition of the keto functional group to the genetic code of Escherichia colii. Wang L, Zhang Z, Brock A, Schultz P. G. Proc. Natl. Acai Sci. USA. 2003 Jan 7; 5 100 (1): 56-61; Bioorg. Mei. Cher. Lett. 15 de octubre de 2006; 16 (20): 5356-9. «Genetic introduction of a diketone-containing amino acid into proteins». Zeng H, Xie J, Schultz PG), 2) las azidas (como las encontradas en la p-azido-fenilalanina) que se pueden hacer reaccionar con alquinos mediante la «quimica clic» catalizada por cobre o cicloadiciones (3+2) promovidas por tens6n para formar los correspondientes triazoles («Addition of pazido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli». Chin J. W., Santoro S. W., Martin A. B., King D. S., 10 Wang L., Schultz P. G.. J. Ar. Cher. Soc. 7 de agosto de 2002; 124 (31): 9026-7; «Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharoryces cerevisae». Deiters A, Cropp T. A., Mukherji M., Chin J. W., Anderson J. C., Schultz P. G. J. Ar. Cher. Soc. 1 de octubre de 2003; 125 (39): 11782-3), o azidas que se pueden hacer reaccionar con fosfinas de arilo, mediante una ligaci6n de Staudinger («Selective Staudinger modification of proteins containing p-azidophenylalanine». Tsao M. L., Tian F., Schultz P. G. «Chembiochem.», 15 diciembre de 2005; 6 (12): 2147-9), para formar las correspondientes amidas, 4) alquinos que se pueden hacer reaccionar con azidas para formar el correspondiente triazol («In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Escherichia coli.», Deiters A, Schultz P. G. Bioorg. Mei. Cher. Lett. 1 de marzo de 2005; 15(5): 1521-4), 5) acidos bor6nicos (boronatos) que se pueden hacer reaccionar especificamente con compuestos que contienen mas de un grupo hidroxilo espaciado adecuadamente o que se someten a acoplamiento mediado por paladio con compuestos
20 halogenados (Angew Cher. Int. Ei. Engl. 2008; 47 (43): 8220-3). «A genetically encoded boronate-containing amino acid», Brustad E., Bushey M. L., Lee J. W., Groff D, Liu W, Schultz P. G.), 6) aminoacidos quelantes de metales, incluidos los que llevan bipiridilos, que se pueden coordinar especificamente a un ion metalico (Angew Cher. Int. Ei. Engl. 2007; 46(48): 9239-42. «A genetically encoded bidentate, metal-binding amino acid». Xie J, Liu W, Schultz P. G.).
25 Los aminoacidos no naturales se pueden incorporar en las proteinas o en los peptidos expuestos en fagos mediante la transformaci6n de E. coli con plasmidos o combinaciones de plasmidos que llevan: 1) la aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal y el ARNt que dirige la incorporaci6n del aminoacido no natural en respuesta a un cod6n, 2) El ADN del fago o el plasmido fagemido alterado para contener el cod6n seleccionado en el sitio de la incorporaci6n de los aminoacidos no naturales (Proc. Natl. Acai. Sci. USA, 18 de noviembre de 2008; 105(46):
30 17688-93. «Protein evolution with an expanded genetic code». Liu C. C., Mack A. V., Tsao M. L., Mills J. H., Lee H. S., Choe H, Farzan M, Schultz P. G., Smider V. V.; «A phage display system with unnatural aminoacids». Tian F, Tsao M. L., Schultz P. G. «J. Ar. Cher. Soc.», 15 de diciembre de 2004; 126 (49): 15962-3). La aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal y el ARNt se pueden obtener de la pareja de tirosilos de Methancoccus janaschii o una sintetasa («Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli.», Chin J. W., Martin
35 A. B., King D. S., Wang L., Schultz P. G. Proc. Natl. Acai. Sci. USA, 20 de agosto de 2002; 99 (17): 11020-4) y la pareja del ARNt que incorpora pirrolisina de forma natural («Multistep engineering of pyrrolysyl-tARN synthetase to genetically encode N(epsilon)-o-azidobenzyloxycarbonyl)lysine for site-specific protein modification». Yanagisawa T, Ishii R, Fukunaga R, Kobayashi T, Sakamoto K, Yokoyama, S. Cher. Biol. 24 de noviembre de 2008; 15 (11): 1187-97; «Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins». Neumann H, Peak-Chew S. Y.,
40 Chin J. W., Nat. Cher. Biol., abril de 2008; 4(4): 232-4. Epub, 17 de febrero de 2008). El cod6n para la incorporaci6n puede ser el cod6n ambar (UAG), otro cod6n de parada (UGA, o UAA), alternativamente puede ser un cod6n de cuatro bases. La aminoacil-ARNt sintetasa y el ARNt se pueden sintetizar desde los vectores existentes, entre ellos, la serie de vectores pBK, vectores pSUP («Efficient incorporation of unnatural amino acids into proteins in Escherichia coli.», Ryu Y, Schultz P. G. Nat. Methois, abril de 2006; 3(4): 263-5), y vectores pDULE
45 (Nat. Methois., mayo de 2005, 2(5): 377-84., «Photo-cross-linking interacting proteins with a genetically encoded benzophenone». Farrell I. S., Toroney R., Hazen J. L., Mehl R. A., Chin J. W.). La cepa de E. coli utilizada expresara el pelo F' (generalmente mediante un oper6n tra). Cuando se utiliza la supresi6n ambar, la cepa de E. coli no contendra un gen del ARNt supresor ambar activo. El aminoacido se anadira a los medios de crecimiento, preferentemente a una concentraci6n final de 1 mM o mayor. La eficacia de la incorporaci6n de aminoacidos se
50 puede realzar mediante el uso de una construcci6n de expresi6n con un sitio ortogonal de uni6n del ribosoma y traduciendo el gen con ribo-X («Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion». Wang K, Neumann H, Peak-Chew S. Y., Chin J. W. Nat. Biotechnol. julio de 2007; 25(7): 770-7). Esto puede permitir que el aminoacido no natural que proporciona numerosos sitios de la uni6n del ligando se incorpore con eficacia en varios sitios.
55 PURIFICACION DE FAGOS
Se puede utilizar cualquier medio adecuado para la purificaci6n del fago. Se pueden aplicar tecnicas estandares en la presente invenci6n. Por ejemplo, se pueden purificar fagos mediante la filtraci6n o mediante la precipitaci6n, tal como la precipitaci6n con PEG; se pueden sintetizar particulas de fagos y purificarlas mediante la precipitaci6n con polietilenglicol (PEG) como se describi6 previamente.
En caso de que se necesite mas ayuda, se hace referencia a Jespers et al. (Protein Engineering Design ani Selection, 2004, 17(10): 709-713. «Selection of optical biosensors from chemisynthetic antibody libraries). Convenientemente, se pueden purificar los fagos como se da a conocer en dicha memoria. El texto de esta
5 publicaci6n esta especificamente incorporado en la presentememoria por referencia para el metodo de purificaci6n de fagos; en particular, se hace referencia al apartado de los materiales y metodos que comienza a partir de la columna derecha de la pagina 709 de Jespers et al.
Ademas, se puede purificar el fago como publicaron Marks et al. J. Mol. Biol., vol. 222, pag. 581-597, que se incorpora especificamente en la presente memoria por referencia, para la descripci6n particular de c6mo se realiza
10 la purificaci6n/producci6n de fagos.
En el caso de que se necesite mas ayuda, se puede reducir el fago y purificarlo como sigue. Aproximadamente, 5 x 1012 particulas de fagos se hacen reaccionar con ditiotreitol (DTT) a 1 mM durante 30 minutos a temperatura ambiente, luego se precipitan con PEG. Despues de enjuagar con agua, se resuspende el sedimento en 1 ml de tamp6n de reacci6n (tamp6n de fosfato a 10 mM, EDTA a 1 mM, pH 7,8). A continuaci6n, los fagos se hacen
15 reaccionar opcionalmente con 50 Il de N-[(2-yodoacetoxi)etil]-N-metilamino-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol (NBDIA) a 1,6 mM (Molecular Probes) durante 2 horas a temperatura ambiente, o mas convenientemente se hace reaccionar con el compuesto conector como se describe en la presente memoria. La reacci6n se termina mediante la precipitaci6n con PEG de las particulas de fagos.
Otro modo mas para producir/purificar el fago es como dan a conocer Schreier y Cortese («A fast and simple
20 method for sequencing DNA cloned in the single-stranded bacteriophage M13». Journal of Molecular Biology, 129 (1): 169-72, 1979). Esta publicaci6n trata del procedimiento de secuenciaci6n de ADN de terminaci6n de la cadena de Sanger et al. (1977) que requiere ADN monocatenario como plantilla. El ADN del fago M13 existe como una unica hebra y, por consiguiente, cada secuencia de ADN clonada en M13 se puede obtener facilmente de este modo. Schreier y Cortese muestran que, mediante la simple centrifugaci6n de las particulas de fagos y la
25 extracci6n con fenol, se puede preparar el ADN monocatenario de M13 suficientemente puro como para utilizarlo como plantilla para determinar la secuencia. La publicaci6n de Schreier y Cortese se incorpora especificamente en la presente memoria mediante referencia para el metodo de purificaci6n del fago. Para despejar cualquier duda, la extracci6n con fenol no se realiza para formar complejos de acuerdo con la presente invenci6n, ya que es para el prop6sito de la purificaci6n del acido nucleico. Por lo tanto, la etapa de fenol de Schreier y Cortese se omite
30 convenientemente. El metodo de Schreier y Cortese se sigue s6lo hasta el punto de particulas de fagos purificadas.
Asi pues, hay miles de tecnicas bien conocidas en la tecnica para la purificaci6n de fagos. En el contexto de la presente invenci6n, tal purificaci6n se utiliza para retirar el agente reductor utilizado para la reducci6n de los grupos funcionales del polipeptido de interes para que formen enlace con el compuesto conector, particularmente cuando
35 tal fijaci6n es a traves de los restos de cisteina.
Opcionalmente, las tecnicas especialmente ventajosas para la purificaci6n de fagos se pueden adoptar como se trat6 en el apartado de la quimica de la reacci6n que viene a continuaci6n. Se debe advertir expresamente que estas tecnicas no se consideran esenciales para la invenci6n, pero pueden representar metodos especialmente utiles o incluso el mejor modo de fabricar las particulas de fagos de la invenci6n. Sin embargo, hay que prestar
40 especial atenci6n para evitar la reoxidaci6n de los grupos reactivos/funcionales reducidos del fago en la etapa de la retirada del reductor antes de pegar el compuesto conector, y despues, en principio, se puede utilizar cualquier tecnica para llevar a cabo esto. Las tecnicas de filtraci6n descritas son particularmente eficaces, pero tambien mas complicadas que las tecnicas estandares por lo que el operador elegira la tecnica mejor adaptada a su utilizaci6n particular de la invenci6n. Lo mas convenientemente, se emplea la tecnica de filtraci6n.
45 QUiMICA DE LA REACCION
Ademas de dar a conocer mas conocimientos en conexi6n con los conjugados polipeptido-compuesto conector fijados por tres enlaces y las particulas de fagos de la invenci6n, los inventores tambien han obtenido un conjunto preciso de condiciones quimicas que se pueden desplegar para conseguir la conexi6n quimica al mismo tiempo que se mantiene la integridad de la porci6n geneticamente codificada del producto. Las tecnologias de la tecnica 50 anterior para la modificaci6n de los polipeptidos han implicado una quimica rigurosa y reacciones independientes de modificaci6n del polipeptido. En cambio, la presente invenci6n da a conocer nuevas condiciones quimicas para la modificaci6n de los polipeptidos al mismo tiempo que conserva ventajosamente el funcionamiento o la integridad del elemento codificado geneticamente del producto. Especificamente, cuando el elemento codificado geneticamente es un polipeptido expuesto sobre la superficie de un fago que lo codifica, la quimica ventajosamente
no compromete la integridad biol6gica del fago. Se describe en la presente memoria que hay una estrecha ventana de condiciones para las cuales estas reacciones quimicas se pueden mejorar o facilitar. En particular, como se explicara con mas detalle mas adelante, los solventes y las temperaturas utilizadas son importantes para una reacci6n eficaz. Es mas, la modificaci6n de la concentraci6n de los reactivos utilizados tambien puede favorecer la
5 fijaci6n correcta, mientras que mejora o elimina los entrecruzamientos o el dano de los restos polipeptidicos que se han de modificar.
En particular, se describe que se requiere la reducci6n de las cisteinas en el polipeptido diana para que la reacci6n sea mas eficaz. Claramente, para realizar la uni6n deseada, se debe retirar el agente reductor con el que se reducen quimicamente las cisteinas. Una tecnica conocida es utilizar el ditiotreitol (DTT) para la reducci6n de las 10 cisteinas, y precipitar las particulas, tales como las particulas de fagos, en una reacci6n de precipitaci6n para retirar el reductor. Tales reacciones de precipitaci6n implican tipicamente polietilenglicol (PEG) al 20% junto con NaCI a 2,5 M que conduce a la precipitaci6n de las particulas de fagos. Sin embargo, los inventores describen que, en algunos experimentos, estas condiciones estandares especificas no condujeron a una reacci6n eficaz de los restos de cisteina del polipeptido con el compuesto conector, muy probablemente debido a la reoxidaci6n de una 15 proporci6n de restos cisteina que se habian reducido. Esto no se pudo predecir a partir de los conocimientos de la tecnica anterior. Se deberia advertir que esta tecnica estandar todavia podria encontrar una aplicaci6n en la invenci6n, en particular cuando el experto en la tecnica esta alerta dado que se ha descrito la necesidad de estar vigilante para valorar/evitar la reoxidaci6n. Sin embargo, los inventores han tratado este problema criptico de c6mo retirar el agente reductor al mismo tiempo que se mantienen las cisteinas en su estado reducido. Como se
20 describira con mas detalle a continuaci6n, las soluciones para extraer las particulas en condiciones quimicas favorables se encuentran en un abanico de estrategias que incluyen el uso de tris-carboxietil-fosfina, de tamp6n desgasificado, el uso de quelantes en la mezcla de reacci6n, y la filtraci6n.
Se deben elegir cuidadosamente las condiciones de reacci6n, p. ej., para unir el compuesto conector al polipeptido diana. La elecci6n de las condiciones puede variar segun la aplicaci6n para la cual se ha montado la invenci6n. Se
25 requiere un cuidado particular cuando el polipeptido diana esta comprendido por una particula de fago. Se proporciona ayuda a lo largo de la especificaci6n y el apartado de ejemplos.
Las condiciones de reacci6n como la temperatura de reacci6n, la concentraci6n del compuesto conector, el solvente y/o el pH, se deben elegir para permitir que los grupos funcionales del polipeptido diana reaccionen con eficacia con el compuesto conector, pero dejen el acido nucleico que codifica el polipeptido en una condici6n que
30 permita descodificar (p. ej., para secuenciar) y/o propagar las moleculas aisladas (p. ej., por PCR o mediante la propagaci6n de fagos o por cualquier otra tecnica adecuada). Ademas, las condiciones de reacci6n deben dejar la proteina de la cubierta del fago en una condici6n que le permita propagar el fago.
Los grupos tiol de un polipeptido codificado en fagos se puede reducir con un agente reductor antes de unir el compuesto conector. En tales realizaciones, en particular en las realizaciones de exposici6n en fagos, o en 35 particular cuando el agente reductor es TCEP, el exceso de agente reductor se retira convenientemente por filtraci6n, p, ej., la filtraci6n del fago. Esto es especialmente ventajoso, ya que los presentes inventores describen por primera vez que las tecnicas convencionales para retirar los reductores, tales como la precipitaci6n con PEG/NaCl, puede a veces conducir a la reacci6n sub6ptima con el compuesto conector, probablemente debido a la reoxidaci6n de los grupos laterales funcionales reducidos del polipeptido diana. Por lo tanto, se trata de una
40 ventaja de las realizaciones en las que el polipeptido diana se prepara mediante reducci6n y posterior purificaci6n (se retira el agente reductor) por filtraci6n, con la que se consigue la mejor conservaci6n de los grupos funcionales reducidos (y por lo tanto reactivos) del polipeptido.
En la presente invenci6n se aplican las condiciones de reacci6n que, por una parte, permiten unir eficazmente el polipeptido codificado a un compuesto conector y, por otra parte, dejar el acido nucleico con la adici6n (y las
45 proteinas de la cubierta de los fagos) en una condici6n que permite su propagaci6n o descodificaci6n. Dichas condiciones de reacci6n son, por ejemplo, la temperatura de reacci6n, la concentraci6n del compuesto conector, la composici6n del solventes o el pH.
En una realizaci6n de la presente invenci6n, los grupos tiol de los restos cisteina se utilizan como grupos funcionales para conectar polipeptidos a un nucleo molecular. Para algunas reacciones quimicas, hay que reducir
50 los grupos tiol de los polipeptidos. Los grupos tiol de los polipeptidos expuestos en fagos se reducen eficazmente mediante la adici6n de un reductor como, por ejemplo, tris(carboxietil)fosfina (TCEP). Ya que un exceso de reductor puede interferir con la reacci6n de uni6n, se retira eficazmente mediante la filtraci6n del fago.
La reoxidaci6n de los grupos tiol despues de retirar el TCEP se impide convenientemente con la desgasificaci6n del tamp6n de reacci6n.
La reoxidaci6n de los grupos tiol tambien se impide convenientemente mediante la formaci6n de complejos de iones metalicos por quelaci6n, por ejemplo, la quelaci6n con el acido etilendiaminotetraacetico (EDTA).
Lo mas convenientemente, la reoxidaci6n de los grupos tiol se impide o inhibe mediante la quelaci6n y el uso de tampones desgasificados.
5 En una realizaci6n de la presente invenci6n, la uni6n del polipeptido al compuesto conector se lleva a cabo haciendo reaccionar los grupos reactivos del polipeptido, tales como los grupos tiol de un polipeptido codificado en fago, con el compuesto conector durante una hora.
Convenientemente, se hacen reaccionar a 30 oC.
Convenientemente, se hacen reaccionar con el compuesto conector (tal como tris(bromometil)benceno) a una 10 concentraci6n de 10 IM.
Convenientemente, la reacci6n es en tamp6n acuoso.
Convenientemente, la reacci6n es a pH 8.
Convenientemente, el tamp6n de reacci6n contiene acetonitrilo. Convenientemente el tamp6n de reacci6n contiene acetonitrilo al 20%.
15 Lo mas convenientemente, la reacci6n consta de dos o mas de las condiciones anteriores. Convenientemente, la reacci6n consta de tres o mas de las condiciones anteriores. Convenientemente, la reacci6n consta de cuatro o mas de las condiciones anteriores. Convenientemente, la reacci6n consta de cinco o mas de las condiciones anteriores. Convenientemente, la reacci6n consta de seis o mas de las condiciones anteriores. Convenientemente la reacci6n consta de cada una de las condiciones anteriores.
20 Estas condiciones de reacci6n estan optimizadas para que los grupos tiol de un polipeptido reaccionen cuantitativamente con los grupos reactivos del tris(bromometil)benceno. En las mismas condiciones de reacci6n, aproximadamente el 20% de las particulas de fago permanecen infectantes para llevar el c6digo genetico al interior de las celulas bacterianas para la propagaci6n y descodificaci6n.
En una realizaci6n, el compuesto conector, tal como TBMB, se puede unir al polipeptido diana, tal como un
25 polipeptido codificado en fago, mediante la reacci6n (incubaci6n) de los grupos tiol del polipeptido durante una hora a 30 oC con TBMB (a saber, tris(bromometil)benceno) a una concentraci6n de 10 IM en tamp6n acuoso a pH 8 que contiene acetonitrilo al 20%.
Los inventores tambien describen el efecto de la concentraci6n del compuesto conector en la reacci6n sobre la infectividad de los fagos. En particular, la invenci6n convenientemente disminuye al minimo la concentraci6n del 30 compuesto conector utilizado en la reacci6n. En otras palabras, sera mejor cuanto menor sea la concentraci6n del compuesto conector utilizado en el tiempo de reacci6n con el polipeptido del fago, siempre y cuando se pegue al polipeptido de los fagos una cantidad suficiente del compuesto conector. Las ventajas de disminuir al minimo el compuesto conector presente de este modo es que se conserva mejor la infectividad de los fagos despues de la conjugaci6n del compuesto conector. Por ejemplo, cuando el compuesto conector es TBMB, cualquier
35 concentraci6n del compuesto conector mayor de 100 IM puede comprometer la infectividad. Por lo tanto, convenientemente, cuando el compuesto conector es el TBMB, entonces, convenientemente, la concentraci6n del TBMB presente durante el tiempo de formaci6n de enlace con el polipeptido es de menos de 100 IM. Lo mas convenientemente, la concentraci6n es como se describe en el apartado de los ejemplos.
MODIFICACION DESPUES DE LA UNION
40 En algunas realizaciones, el complejo entre el compuesto conector y el polipeptido se puede modificar en cuanto se termina la uni6n.
En algunas realizaciones, los elementos del polipeptido de la invenci6n se escinden proteoliticamente una vez que se sujetan a un nucleo molecular/compuesto conector. La escisi6n genera ligandos que tienen fragmentos peptidicos independientes inmovilizados en un compuesto conector/nucleo molecular.
45 Por ejemplo, uno o varios de los enlaces amida del polipeptido se pueden escindir proteoliticamente despues de la inmovilizaci6n del polipeptido al nucleo molecular. Esto presenta la ventaja de crear polipeptidos cortos, cada uno unido al compuesto conector mediante al menos un enlace covalente, pero que puede presentar diferentes estructuras moleculares que se conservan en un complejo que comprende el acido nucleico que codifica el polipeptido progenitor. La escisi6n de los polipeptidos esta catalizada por cualquier medio adecuado conocido en la
tecnica, tal como una hidr6lisis controlada o, mas convenientemente, mediante escisi6n enzimatica por una proteasa adecuada. La proteasa puede ser cualquier proteasa adecuada, pero es preferentemente una proteasa con una secuencia o motivo de reconocimiento especifico del polipeptido. Esto conduce ventajosamente a la producci6n de productos de escisi6n polipeptidicos mas definidos y/o mas predecibles. De hecho, en esta 5 realizaci6n, las secuencias de reconocimiento de las proteasas se pueden anadir sistematicamente del polipeptido diana o se pueden retirar de el, por ejemplo, mediante la manipulaci6n del o de los acidos nucleicos que lo codifican. Esto proporciona ventajosamente un mayor grado de control y permite una mayor diversidad para ser sintetizados en las moleculas expuestas de acuerdo con la presente invenci6n. Lo mas convenientemente, el polipeptido comprende al menos un sitio de reconocimiento de la proteasa. Convenientemente, cada dicho sitio de
10 escisi6n esta comprendido dentro de la secuencia o secuencias de aminoacidos entre grupos funcionales del polipeptido utilizado para la uni6n covalente al compuesto conector. Convenientemente, cada dicho sitio de reconocimiento esta comprendido dentro de la secuencia o secuencias de aminoacidos entre grupos funcionales del polipeptido utilizado para la uni6n covalente al compuesto conector.
Los lazos polipeptidicos se escinden convenientemente con una proteasa que reconoce y procesa los polipeptidos
15 en la posici6n de aminoacidos especificos, tales como la tripsina (arginina o lisina en posici6n P1) o la termolisina (cadenas laterales alifaticas en la posici6n P1). La enzima se utiliza a una concentraci6n que permite procesar con eficacia los lazos peptidicos de la molecula expuesta, pero respeta las particulas de fagos. Las condiciones 6ptimas pueden variar segun la longitud de los lazos de los polipeptidos y la proteasa utilizada. La tripsina, por ejemplo, se utiliza tipicamente a 200 nM en tamp6n de TBS-Ca (Tris-HCl a 25 mM, NaCl a 137 mM y CaCl2 a 1
20 mM, pH 7,4) durante 10 minutos a 10 oC. En Kristensen, P, y Winter, G («Proteolytic selection for protein folding using filamentous bacteriophagesi. Fold. Des. 1998; 3(5): 321-8) se describe un amplio abanico de proteasas que son adecuadas para modificar los polipeptidos expuestos, pero que respetan el fago. El procesamiento enzimatico del peptido en fagos puede ser una «prote6lisis parcial» porque no se puede descartar que se escinda un pequeno numero de proteinas de la cubierta de los fagos. Asi pues, en la optimizaci6n de las condiciones se elige
25 convenientemente el mejor equilibrio entre la maxima escisi6n posible de la diana y el maximo respeto de las particulas de los fagos.
Convenientemente, el polipeptido diana comprende al menos un sitio de escisi6n proteolitica. Convenientemente, el polipeptido diana comprende al menos dos sitios de escisi6n proteolitica. Convenientemente, el polipeptido diana comprende al menos tres sitios de escisi6n proteolitica.
30 En cada realizaci6n de prote6lisis, convenientemente, el primero de tales sitios de proteasa esta puesto distal con respecto al primer enlace covalente entre el polipeptido diana y el compuesto conector. Esto tiene la ventaja de que el compuesto conector se conserva en el complejo porque si el polipeptido diana se escinde antes del primer enlace covalente, entonces el complejo polipeptido-compuesto conector se separara del acido nucleico que codifica el polipeptido diana, lo que es indeseable para la mayoria de aplicaciones de la invenci6n.
35 El uso de lazos pequenos (pequeno significa, p. ej., 6 restos de aminoacidos o menos) puede comprender la capacidad de algunas proteasas para escindir dentro de los lazos. En este caso, puede ser deseable seleccionar lazos mas largos que son probablemente mas accesibles a la proteasa. Ademas, despues de la escisi6n de los lazos mediante endoproteasa, puede ser deseable volver a cortar los lazos ademas con otras endoproteasas, o de hecho mediante exoproteasas, tales como carboxipeptidasas o aminopeptidasas.
40 Cuando el polipeptido diana comprende mas de un sitio para tal proteasa, convenientemente cada uno de los sitios esta puesto entre dos enlaces covalentes establecidos entre el polipeptido diana y el compuesto conector. Pueden ponerse varios sitios de escisi6n entre los enlaces si es necesario.
En las realizaciones de escisi6n, convenientemente, el polipeptido progenitor entero se considerara en la valoraci6n de si esta unido o no al compuesto conector mediante al menos tres enlaces covalentes. Mas conveniente, el
45 polipeptido diana se considerara que es el polipeptido intacto (sin escindir) cuando se evalue si se une o no al compuesto conector mediante al menos tres enlaces covalentes. Tales polipeptidos sin escindir seran tipicamente biciclicos.
SiNTESIS
Se debe advertir que una vez que el polipeptido de interes esta aislado o identificado de acuerdo con la presente
50 invenci6n, entonces su sintesis posterior se puede simplificar siempre que sea posible. Por ejemplo, la secuencia del polipeptido de interes se puede determinar, y se puede fabricar sinteticamente, mediante tecnicas estandares tras la reacci6n con un compuesto conector in vitro. Cuando se realiza, se puede utilizar la quimica estandar porque ya no hay ninguna necesidad de conservar la funcionalidad ni la integridad de la particula portadora geneticamente codificada. Esto permite la preparaci6n rapida a gran escala de material soluble para otros experimentos posteriores o la validaci6n. En este sentido, la preparaci6n a gran escala de los candidatos o protagonistas identificados por los metodos de la presente invenci6n podria llevarse a cabo mediante la quimica convencional, tal como la descrita en Meloen y Timberman.
Asi pues, la invenci6n tambien se refiere a la fabricaci6n de polipeptidos o conjugados seleccionados como se ha
5 propuesto en la presente memoria, en donde la fabricaci6n comprende otras etapas funcionales como se explica a continuaci6n. Lo mas convenientemente, estas etapas se llevan a cabo sobre el conjugado/polipeptido del producto final fabricado mediante sintesis quimica, en vez de en el fago.
Opcionalmente, los restos de aminoacidos en el polipeptido de interes pueden contener sustituciones cuando se fabrica un conjugado o un complejo, p. ej., despues de la etapa de aislamiento/identificaci6n inicial.
10 Para ilustrar las modificaciones o adiciones que se describen, es util considerar el ejemplo de selecci6n de un polipeptido que reacciona con un receptor. Puede ser deseable extender el peptido en su extremo amino o en su extremo carboxilo. Esto puede ser util, por ejemplo, al fabricar un peptido macrociclico que se une a una diana, con una cola tal como una cola lineal que se une a una diana, por ejemplo, un peptido que penetra en una celula tal como los derivados de tal como VP22, HIV-Tat, una proteina home6tica de Drosophila (Antennapedia) o
15 proteinas disenadas quimicamente tal como la poliarginina u otro peptido, p. ej., como se describe en (Chen y Harrison, Biocherical Society Transactions (2007), volumen 35, parte 4, pag. 821, «Cell-penetrating peptides in drug development: enabling intracelular targets»). Esto tendria la ventaja de asistir o permitir que un macrociclo que se habia seleccionado contra una diana determinada, tal como una diana intracelular, entre en una celula.
Para extender el peptido se puede simplemente extender quimicamente por su extremo amino o por su extremo
20 carboxilo con el uso de quimica estandar de fase s6lida o de fase liquida. La quimica estandar de proteinas se puede utilizar para introducir un extremo amino o carboxilo activable. Alternativamente, se pueden realizar adiciones de fragmentos mediante condensaci6n o ligaci6n quimica nativa, p. ej, como se describe en (Dawson P. E., Muir T. W., Clark-Lewis I., Kent, S. B. H. 1994 «Synthesis of proteins by native chemical ligation», Science,
266: 776-779), o mediante enzimas, por ejemplo, utilizando la subtiligasa como se describe en («Subtiligase: a tool
25 for semisynthesis of proteins», Chang T. K., Jackson D. Y., Burnier J. P., Wells J. A., Proc. Natl. Acai. Sci. USA, 20 de diciembre de 1994; 91 (26): 12544-8 o en Biorganic & Meiicinal Cheristry Letters, volumen 18, numero 22, 15 de noviembre de 2008, paginas 6000-6003, «Tags for labeling protein N-termini with subtiligase for proteomics», Hikari A. I., Yoshihara, Sami Mahrus y James A. Wells).
Alternativamente, los peptidos se pueden extender o modificar mediante otra conjugaci6n a traves de enlaces
30 disulfuro. Tiene la ventaja adicional de permitir que el primer y el segundo peptido se disocien el uno del otro dentro del entorno reductor de la celula. En este caso, el compuesto conector (p. ej., TBMB) se podria anadir durante la sintesis quimica del primer peptido para que reaccione con los tres grupos cisteina; entonces se podria anadir otra cisteina al extremo amino del primer peptido, de manera que esta cisteina s6lo reaccion6 con una cisteina libre del segundo peptido.
35 Se aplican tecnicas similares del mismo modo a la sintesis o conjugaci6n de dos macrociclos biciclicos.
Ademas, se puede llevar a termino la adici6n de otros farmacos del mismo modo, utilizando la quimica apropiada, conjugandolos al extremo amino o carboxilo, o a traves de las cadenas laterales. Convenientemente, la conjugaci6n se realiza de tal manera que no bloquea la actividad de ninguna entidad.
Asi pues, la invenci6n se refiere ademas a un metodo como el descrito mas arriba que comprende adicionalmente 40 la etapa de extender el polipeptido en uno o mas de los extremos amino o carboxilo del polipeptido.
Asi pues, la invenci6n ademas se refiere a un metodo como el descrito mas arriba que comprende adicionalmente la etapa de conjugar a otro polipeptido dicho complejo o dicho conjugado entre polipeptido y compuesto conector.
Asi pues, la invenci6n ademas se refiere a un metodo como el descrito mas arriba en el que dicha conjugaci6n se realiza mediante
45 (i) la adici6n de otra cisteina al polipeptido despues de unirse covalentemente al compuesto conector, y
(ii) la conjugaci6n de dicho polipeptido a dicho otro polipeptido mediante la formaci6n de enlace disulfuro con dicha cisteina adicional.
DIVERSIDAD CODIFICADA GENETICAMENTE
Los polipeptidos de interes estan codificados geneticamente de una manera conveniente. Esto ofrece la ventaja de 50 favorecer la diversidad junto con la facilidad del manipulaci6n. Convenientemente, los polipeptidos de interes estan codificados geneticamente como una genoteca de exposici6n en fagos.
Por lo tanto, el complejo de la invenci6n comprende una particula de fago. El acido nucleico esta comprendido en el genoma del fago. En estas realizaciones, el polipeptido esta comprendido en la cubierta del fago.
En algunas realizaciones, la invenci6n se puede utilizar para producir una genoteca combinatoria codificada 5 geneticamente de polipeptidos que se generan traduciendo una serie de acidos nucleicos en los correspondientes polipeptidos y formando un enlace entre las moleculas de dicho compuesto conector y dichos polipeptidos.
La genoteca combinatoria codificada geneticamente de los polipeptidos se puede generar mediante la exposici6n en fagos.
Los polipeptidos se exponen en fagos de acuerdo con tecnicas establecidas, tales como las que se describen mas
10 adelante. Lo mas convenientemente, tal exposici6n se lleva a cabo mediante la fusi6n del polipeptido diana de interes con un gen modificado geneticamente que permite la exposici6n externa del polipeptido de interes; convenientemente, dicho gen modificado geneticamente comprende la modificaci6n genetica de un gen 9 (p9 o gen IX), gen 8 (gene VIII), gen 7 (p7 o gen VII), gen 6 (p6 o gen VI) o gen 3 (p3 o gen III) del fago. Estas proteinas ofrecen la ventaja de que contienen pocas o ninguna cisteina que pueda reaccionar con los compuestos
15 conectores, tal como TBMB, y producir productos secundarios. Para p6, es ventajoso mutar la cisteina 84 en serina. Las cisteinas de p7 y p9 estan muy probablemente ocultas y, por lo tanto, pueden no ser necesario mutarlas para retirarlas. p8 ofrece la ventaja de que no contiene ningun resto cisteina. Asi pues, mas convenientemente, dicho gen modificado geneticamente comprende la modificaci6n genetica de un gen 8 (gen VIII), gen 6 (gen VI) o gen 3 (gen III) del fago.
20 Lo mas convenientemente, tal exposici6n se lleva a cabo mediante la fusi6n del polipeptido diana de interes a una proteina del gen 3 modificada geneticamente para que carezca de restos de cisteina en los dominios 1 y 2. Esta fusi6n se puede llevar a cabo mediante cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica, tal como mediante la manipulaci6n del acido nucleico que codifica la proteina del gen III del fago para cambiar los codones que codifican la cisteina por codones que codifican otros aminoacidos, y mediante la inserci6n en fase de una
25 secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido diana en la secuencia codificante del gen III, por lo que se expone como una proteina de fusi6n con la del gen III en el exterior de la particula de fago.
Es un beneficio de la invenci6n que el gen o los genes modificados geneticamente resultantes permitan que el fago sea infectante, a saber, capaz de infectar y propagarse. Incluso cuando el gen modificado geneticamente es un gen diferente al gen 3, (tal como el gen 6 o el gen 8), puede ser deseable aun modificar geneticamente el gen 3 para
30 retirar uno o mas de los restos de cisteina (tal como todos los restos de cisteina).
Mediante exposici6n en fagos se han generado repertorios de polipeptidos codificados que comprenden hasta 1013 miembros diferentes. El numero de ligandos diferentes que se puede generar de acuerdo con la invenci6n supera claramente el numero de moleculas diferentes que se ensayan generalmente en los escrutinios convencionales.
Cuando los fagos se producen en una celula bacteriana, el polipeptido se expresa como una fusi6n de la proteina
35 de la cubierta. Al ensamblarse una particula de fago, el polipeptido queda expuesto en la superficie del fago. Al poner en contacto un repertorio de fagos con un antigeno inmovilizado, algunos fagos permanecen fijados al antigeno, mientras que otros se eliminan con los lavados. El fago se pude eluir y propagar. Se puede secuenciar el ADN que codifica el polipeptido del fago seleccionado. La exposici6n en fagos se puede utilizar para codificar mas de 1010 polipeptidos diferentes. Un aspecto favorable de la exposici6n en fagos es que el c6digo genetico, un ADN
40 monocatenario, esta empaquetado en una cubierta. La cubierta puede proteger el ADN de la reacci6n con el nucleo molecular.
En otra realizaci6n preferente, la genoteca de polipeptidos de la invenci6n se expone en fagos como una fusi6n con la proteina del gen 3. Cada particula de fago tiene unas 3 a 5 copias de la proteina de la cubierta de dicho fago. Como resultado de la exposici6n de varias copias del polipeptido modificado, los ligandos con afinidades en el
45 orden micromolar (fijadores debiles) tambien se pueden aislar en selecciones de fagos. Alternativamente, los fagemidos se utilizan para reducir el numero de polipeptidos por fago para evitar los efectos de avidez y seleccionar los ligandos con las afinidades mas altas.
En otra realizaci6n preferente, el fago con las proteinas modificadas de la cubierta se utiliza para codificar las genotecas de polipeptidos de la invenci6n. En particular se utilizan los fagos que carecen o que tienen un numero 50 reducido de un tipo especifico de aminoacido en las proteinas de la cubierta. La utilizaci6n de dichas proteinas de la cubierta puede ser ventajoso cuando el nucleo molecular es capaz de reaccionar con dicho tipo especifico de aminoacidos. Este es explicitamente el caso cuando los grupos funcionales del polipeptido expuesto para entrecruzar un nucleo molecular son aminoacidos naturales, y el mismo tipo de aminoacido natural esta presente
en una regi6n expuesta de la superficie en la cubierta de los fagos. La utilizaci6n de dichos fagos con proteinas modificadas de la cubierta puede impedir el entrecruzamiento de las particulas de fagos mediante la reacci6n de los aminoacidos de varios fagos con el mismo nucleo molecular. Ademas, la utilizaci6n de dicho fago es capaz de reducir el entrecruzamiento de ambas cadenas laterales de aminoacidos, de los grupos funcionales del polipeptido,
5 y de una proteina de la cubierta del fago con el mismo nucleo molecular.
Aun en otra realizaci6n preferente, el fago con una proteina del gen 3 que carece de los restos cisteina de los puentes disulfuro C7-C36, C46-C53, C188-C201 del dominio 1 y el 2 se utilizan para exponer genotecas de polipeptidos de la invenci6n. Schmidt F. X. y colaboradores (Kather, I et al., J. Mol. Biol., 2005) generaron un fago con mutaciones en dichas posiciones (C7C, C36I, C46I, C53V, C188V, C201A) y 14 mutaciones adicionales en la 10 proteina del gen 3 para compensar la reducci6n de la estabilidad termica (T13l, N15G, R29W, N39K, G55A, T56I, 160V, T101I, Q129H, N138G, L198P, F199L, S207L, D209Y). Los fagos sin grupos tiol en dicha proteina minoritaria de la cubierta son adecuados si son restos de cisteina uno o mas de los aminoacidos funcionales con los que se entrecruzan el polipeptido y un nucleo molecular. La retirada de los restos de cisteina en la proteina de la cubierta del fago impide que interfieran con dicha reacci6n de formaci6n de enlaces entre el polipeptido y el
15 compuesto conector.
Este fago de ejemplo para la aplicaci6n en la invenci6n se describe a continuaci6n con mas detalle.
El fago sin puentes disulfuro de F. X. Schmid (dominios D1-D2) comprende el fago fd procedente del vector fCKCBS (Krebber, C., 1997, J. Mol. Biol.). El vector fCKCBS se basa en un vector del fago fd que procede de la American Type Culture Collection (ATCC: 15669-B2).
20 La secuencia de aminoacidos de los dominios 1 y 2 de la p3 de fago fd de tipo silvestre es publica, por ejemplo, en la base de datos PubMed. Para facilidad de referencia, una secuencia de ejemplo es:
F. X. Schmid y colaboradores han estabilizado evolutivamente la p3 de este fago (Martin, A. y Schmid, F. X., 2003,
J. Mol. Biol.) con la mutaci6n de 4 aminoacidos. En el siguiente trabajo, F. X. Schmid y colaboradores habian
25 mutado 6 cisteinas para eliminar los 3 puentes disulfuro e insertaron otras mutaciones para compensar la perdida de estabilidad (Kather, I. y Schmid F. X., 2005, J. Mol. Biol.). En varios ciclos evolutivos habian generado los clones 19, 20, 21 y 23, que todos tienen una p3 sin puentes disulfuro con una estabilidad termica diferente.
Como se explica con mas detalle en el apartado de los ejemplos, el mutante 21 («clon 21») se puede fabricar como esta descrito, o simplemente obtenerlo de F. X. Schmid y colaboradores. De acuerdo con la publicaci6n de F. X.
30 Schmid, este clon contiene las mutaciones siguientes en los dominios 1 y 2: C7S, T13I, N15G, R29W, C36I, N39K, C46I, C53V, G55A, T101I, Q129H, C188V, F199L, C201A, D209Y. Ademas encontramos las mutaciones siguientes en los dominios 1 y 2 cuando secuenciamos el clon y lo comparamos con el fago fd de tipo silvestre: P11S y P198L. Sin el deseo de comprometernos con la teoria, se supone que estas mutaciones ya estaban presentes en el fago del vector fCKCBS.
35 Los dominios D1 y D2 del clon 21 tienen la siguiente secuencia de aminoacidos:
Se puede generar una genoteca mediante los metodos de acuerdo con la invenci6n.
La invenci6n se puede aplicar al escrutinio de moleculas o entidades que se fijan a un complejo de la invenci6n (o que influyen en su fijaci6n). Un ejemplo de un complejo de la invenci6n es un polipeptido diana con un compuesto 40 conector unido a el. El experto en la tecnica podra adoptar cualquier formato de escrutinio convencional. El formato concreto utilizado dependera de los objetivos del operador. Por ejemplo, si se desea un escrutinio de alto rendimiento, entonces sera primordial un funcionamiento facil y un recambio rapido. Tipicamente, las tecnicas tales como las rondas de criba de fagos, la exposici6n de ARNm y similares se pueden aplicar en la presente invenci6n igual a como se aplican en la tecnica. Los beneficios clave de la invenci6n son la formaci6n de tres
enlaces covalentes del compuesto conector con el polipeptido de interes y el formato determinado en el que se realiza el escrutinio de los complejos resultantes (o el uso de estos complejos como moduladores candidatos de otras interacciones o en otros escrutinios) es una materia de elecci6n para la persona que pone en funcionamiento la invenci6n.
5 En una realizaci6n se puede realizar el escrutinio al poner en contacto una genoteca generada mediante los metodos de acuerdo con la invenci6n con un ligando diana y con el aislamiento de uno o mas miembros de la genoteca que se fijan a dicho ligando.
En otra realizaci6n, cada uno de los miembros de dicha genoteca se ponen en contacto con un ligando diana en un escrutinio y se identifican miembros de dicha genoteca que se fijan a dicho ligando diana.
10 En otra realizaci6n, los miembros de dicha genoteca se ponen en contacto simultaneamente con un ligando diana y se seleccionan los miembros de dicha genoteca que se fijan a dicho ligando diana.
El o los ligandos diana pueden ser un peptido, una proteina, un polisacarido, un lipido, un ADN o un ARN.
El ligando diana puede ser un receptor, un ligando del receptor, una enzima, una hormona o una citocina.
El ligando diana puede ser una proteina procari6tica, una proteina eucari6tica o una proteina de arqueas. Mas
15 especificamente, el ligando diana puede ser una proteina de mamifero o una proteina de insectos o una proteina bacteriana o una proteina fungica o una proteina virica.
El ligando diana puede ser una enzima, tal como una proteasa. Mas especificamente, el ligando diana puede ser una elastasa, la calicreina plasmatica, la catepsina G o el activador del plasmin6geno de tipo urocinasa.
Se debe observar que la invenci6n tambien engloba a miembro(s) de genotecas aislado(s) en un escrutinio de
20 acuerdo con la invenci6n. Convenientemente, el o los metodos de escrutinio de la invenci6n comprenden adicionalmente la etapa de: fabricar una cantidad de ligando aislado que es capaz de fijarse al complejo de la invenci6n. Cuando se realiza el escrutinio en el formato opuesto (esto es, cuando el o los complejos de la invenci6n se identifican en virtud de su capacidad para fijarse a un ligando proporcionado), convenientemente, el o los metodos de escrutinio de la invenci6n comprenden ademas la etapa de: fabricar una cantidad del complejo de la
25 invenci6n aislado que es capaz de unirse a dicho ligando.
La invenci6n tambien se refiere a miembros de genotecas que son, o que son capaces de ser, aislados mediante un escrutinio de acuerdo con la presente invenci6n, en donde dicho miembro se genera o fabrica posteriormente sin el uso adicional del acido nucleico que codific6 dicho polipeptido cuando era parte del complejo de la invenci6n. Por ejemplo, los metodos adecuados de la invenci6n comprenden ademas otra etapa de fabricaci6n de una 30 cantidad de un polipeptido aislado o identificado mediante un metodo de la invenci6n por uni6n del compuesto conector al polipeptido, en donde dicho polipeptido se expresa recombinantemente o se sintetiza quimicamente. Por ejemplo, cuando el polipeptido se sintetiza recombinantemente en esta realizaci6n, el acido nucleico que lo codifica originalmente como parte de un complejo de la invenci6n puede que ya no este directamente presente, pero puede haber estado presente en una etapa intermedia, p. ej, de amplificaci6n por PCR o de clonaci6n del
35 acido nucleico original del complejo, lo que conduce a la producci6n de una plantilla de acido nucleico a partir de la cual se puede sintetizar el polipeptido en esta etapa adicional.
MAS VENTAJAS
Es una ventaja de la invenci6n que los propios complejos sean capaces de propagarse. Por lo tanto, los complejos
o genotecas de la invenci6n pueden -cultivarse-selecionarse-(iterativamente si se desea)-enriquecerse. Esto
40 contrasta con los metodos de la tecnica anterior que necesitan ser desconvolucionados despues de una unica ronda de selecci6n.
La presente invenci6n permite ventajosamente la construcci6n y el escrutinio de genotecas muy grandes.
Convenientemente, el compuesto conector puede ser flexible o rigido, mas convenientemente el compuesto conector es rigido. Esto presenta la ventaja de un constrenimiento molecular mayor sobre la molecula del
45 producto.
En algunas realizaciones, el compuesto conector no s6lo constrine la molecula al sujetarla por tres o mas enlaces, sino tambien por actuar como un armaz6n. Los aminoacidos del peptido son capaces de interaccionar con el armaz6n y formar una estructura compacta. Este fen6meno tambien se puede encontrar en anticuerpos, en donde los aminoacidos de los CDR interaccionan con los aminoacidos del armaz6n. Asi pues, la invenci6n da a conocer 50 esta peculiaridad ventajosa por primera vez en los polipeptidos conjugados, tales como los comprendidos en las
particulas de fagos.
En algunas realizaciones se utilizan los compuestos conectores con una geometria simetrica. Esto presenta la ventaja de que se produce un solo producto en vez de mezclas de productos (p. ej, is6meros).
Las reacciones sinteticas se han establecido para conectar un compuesto conector con un peptido mediante al
5 menos tres enlaces covalentes. Las condiciones de reacci6n quimica de la tecnica anterior no pueden aplicarse facilmente a los peptidos codificados geneticamente. Describimos un conjunto de condiciones especificas que encuentran aplicaci6n en la conjugaci6n, toda vez que se conserva ventajosamente la infectividad.
Es una ventaja de la invenci6n que se obtenga una lectura directa, en particular para una combinaci6n de peptido + entidad quimica (a saber, peptido + compuesto conector).
10 Es una ventaja de la invenci6n la creaci6n de una genoteca de entidades quimicas sinteticas que se pueda propagar. En otras palabras, los metodos de la tecnica anterior han creado genotecas de entidades quimicas en modos en los que no es posible amplificar ni leer la molecula pequena de interes de esta manera, a saber, incluso aunque los acidos nucleicos hayan estado presentes en las genotecas de entidades quimicas de la tecnica anterior, no se ha podido hacer crecer ni propagar, sino que s6lo se ha permitido la hibridaci6n u otras tecnicas.
15 Se deducen ventajas similares de las tecnicas descritas en la presente memoria tales como las condiciones quimicas utilizadas para juntar el compuesto conector al polipeptido a la vez que se conserva ventajosamente la infectividad del complejo cuando el complejo comprende una particula de fago.
MAS APLICACIONES
La invenci6n tambien da a conocer un metodo para generar una genoteca combinatoria de entidades quimicas 20 codificadas geneticamente que comprende polipeptidos sujetos a un nucleo molecular, comprendiendo el metodo:
(a) la generaci6n de una genoteca codificada geneticamente de polipeptidos que comprenden grupos funcionales capaces de formar enlaces covalentes con un nucleo molecular; (b) la conexi6n quimica de dicha genoteca con dicho nucleo mediante al menos tres enlaces covalentes.
En un amplio aspecto, la invenci6n se refiere a un polipeptido que comprende un compuesto conector unido a
25 dicho polipeptido, en donde el compuesto conector esta unido al polipeptido mediante al menos tres enlaces covalentes distintos. En particular, la invenci6n se refiere a tales polipeptidos que se obtienen, o son obtenibles, mediante los metodos de la presente invenci6n.
La invenci6n tambien se puede aplicar al diseno y/o la selecci6n de imitadores de peptidos o imitadores de moleculas pequenas para uso como farmacos o como dianas de farmacos.
30 La invenci6n tambien da a conocer metodos para generar genotecas combinatorias de entidades quimicas codificadas geneticamente y para aislar ligandos de las mismas.
La invenci6n se puede aplicar a la identificaci6n de dianas relevantes a partir de secuenciaci6n del ADN e identificaci6n de secuencias consenso en los peptidos de las dianas recuperadas y luego sintetizar los peptidos. Por ejemplo, con este analisis se puede disenar un peptido consenso, pudiendo tener dicho peptido consenso una
35 secuencia de aminoacidos no necesariamente identica a ninguna de las dianas recuperadas en la fase de escrutinio, y este peptido consenso se puede entonces sintetizar de acuerdo con la presente invenci6n.
El complejo comprende una particula de fago.
Asi pues, se da a conocer un metodo para generar genotecas combinatorias de entidades quimicas codificadas geneticamente, en donde dichas genotecas comprenden polipeptidos sujetos a un nucleo molecular mediante al
40 menos tres enlaces covalentes. Tambien se dan a conocer las genotecas generadas con dicho metodo. Ademas, se da a conocer un metodo para poner en contacto dichas genotecas con un ligando diana y aislar los miembros que se fijan a dicho ligando, pues son miembros de genotecas generadas con dicho metodo.
En marcado contraste con los metodos conocidos de las patentes internacionales WO 2004/077062 y WO 2006/078161, la presente invenci6n da a conocer metodos para generar y ensayar genotecas grandes de
45 complejos. De acuerdo con las patentes internacionales WO 2004/077062 y WO 2004/077062, se dan a conocer metodos reputados para proporcionar y realizar el escrutinio de cientos o miles de compuestos. La presente invenci6n da a conocer metodos para codificar geneticamente genotecas compuestas. Esto permite generar y ensayar millones, miles de millones, o mas, compuestos diferentes.
A diferencia de los metodos conocidos de las patentes internacionales WO 2004/077062 y WO 2006/078161, la presente invenci6n da a conocer metodos para ensayar grandes genotecas compuestas en un unico compartimento de reacci6n utilizando principios de selecci6n in vitro. A diferencia de los compuestos generados de acuerdo con las patentes internacionales WO 2004/077062 y WO 2006/078161, los complejos de la presente invenci6n comprenden un acido nucleico que permite la identificaci6n de los complejos aislados;
5 convenientemente, dicho acido nucleico codifica el polipeptido del complejo.
La presente invenci6n da a conocer condiciones de reacci6n tales como la concentraci6n del compuesto conector, el tiempo de reacci6n, la temperatura de reacci6n, y similares, que respetan el acido nucleico del complejo como, por ejemplo, una particula de fago y, en particular, respetan la infectividad de la particula de fago. En otras palabras, la quimica presentada en la presente memoria conserva la funci6n del acido nucleico del complejo y
10 conserva la funci6n biol6gica del complejo. En el ejemplo del complejo que comprende una particula de fago, la quimica presentada en la presente memoria refuerza ventajosamente la conservaci6n de la funcionalidad de la particula de fago, y hace posible, o mas posible, que se pueda utilizar en la propagaci6n del acido nucleico despues de la formaci6n del complejo.
La presente invenci6n comprende tambien genotecas combinatorias de compuestos codificadas geneticamente 15 que se generan con los metodos descritos.
Tambien se conciben polipeptidos triciclicos unidos a un compuesto conector. Se pueden crear, por ejemplo, uniendo los extremos amino y carboxilo de un polipeptido biciclico unido a un compuesto conector de acuerdo con la presente invenci6n. De este modo, los extremos amino y carboxilo unidos crean un tercer lazo, haciendo un polipeptido triciclico. Esta realizaci6n no se realiza convenientemente en el fago, sino que se realiza 20 convenientemente en un conjugado de la invenci6n entre el polipeptido y el compuesto conector. La uni6n de los extremos amino y carboxilo es un asunto cotidiano de la quimica de peptidos. En el caso de que se necesite alguna ayuda, se puede activar el extremo carboxilo y/o se pueden extender los extremos amino y carboxilo, por ejemplo, para anadir una cisteina a cada extremo, y luego unirlos mediante un puente disulfuro. Alternativamente, la uni6n se puede llevar a cabo mediante el uso de una regi6n conectora incorporada en los extremos amino o 25 carboxilo. Alternativamente, los extremos amino y carboxilo se pueden unir mediante un enlace peptidico convencional. Alternativamente, se puede emplear cualquier otro medio adecuado para unir los extremos amino y carboxilo, por ejemplo, la N-C-ciclaci6n se podria realizar mediante tecnicas estandares, por ejemplo, como se describe en Linde et al., Peptiie Science, 90, 671-682 (2008). «Structure-activity relationship and metabolic stability studies of backbone cyclization and N-methylation of melanocortin peptides», o como en Hess et al. J. 30 Mei. Cher. 51, 1026-1034 (2008) «Backbone cyclic peptidomimetic melanocortin-4 receptor agonist as a novel orally administered drug lead for treating obesity». Una ventaja de tales moleculas triciclicas es evitar la degradaci6n proteolitica de los extremos libres, en particular mediante la acci6n exoproteasica. Otra ventaja de un polipeptido triciclico de esta naturaleza es que el tercer lazo se puede utilizar para funciones aplicables de forma general, tales como la fijaci6n de SAB, la entrada en las celulas o los efectos de transporte, el etiquetado o
35 cualquier otro uso. Se observara que este tercer lazo tipicamente no estara disponible para la selecci6n (porque no se produce en el fago, sino s6lo en el conjugado entre el polipeptido y el compuesto conector) y, por lo tanto, su uso para otras funciones biol6gicas aun deja ventajosamente ambos lazos 1 y 2 para la selecci6n/creaci6n de la especificidad. Asi pues, la invenci6n tambien se refiere a tales polipeptidos triciclicos y a su fabricaci6n y usos.
La presente invenci6n da a conocer mas metodos para poner en contacto las genotecas compuestas codificadas
40 geneticamente con un ligando diana y para identificar los ligandos que se fijan a dicho ligando diana. Las genotecas compuestas codificadas geneticamente se ensayan mediante procedimientos de selecci6n o de escrutinio.
En un procedimiento de escrutinio se ensaya cada miembro de la genoteca. Por ejemplo, varias copias de un miembro determinado de la genoteca se incuban, por ejemplo, con un ligando diana. El ligando diana se inmoviliza
45 antes o despues de ponerlo en contacto con los miembros de la genoteca y los miembros sin unir se retiran por lavado. Los ligandos unidos se detectan, por ejemplo, en un enzimoinmunoensayo de adsorci6n (ELISA). La secuencia de aminoacidos de los miembros de la genoteca que se fijan al ligando diana se determina mediante la secuenciaci6n del c6digo genetico.
En un procedimiento de selecci6n, varios miembros de la genoteca compuesta codificada se ponen en contacto
50 con un ligando diana. El ligando diana se inmoviliza antes o despues de ponerlo en contacto los miembros de la genoteca, y los miembros sin unir se retiran por lavado. Se secuencia el c6digo genetico de los ligandos unidos. Los ligandos seleccionados se propagan alternativamente para realizar mas rondas de selecci6n.
En una realizaci6n de la invenci6n, las genotecas compuestas estan codificadas por exposici6n en fagos y se realizan las selecciones mediante rondas de criba de fagos.
El ligando diana de la presente invenci6n puede ser una proteina, un ADN, un ARN o un polisacarido. La proteina puede ser un receptor, una enzima, una hormona, una citocina o una proteina virica. Un posible ligando diana proteico es una proteasa, en donde dicha proteasa puede ser elastasa, calicreina plasmatica, catepsina G o activador del plasmin6geno de tipo urocinasa.
5 La presente invenci6n comprende tambien miembros de las genotecas combinatorias de entidades quimicas codificadas que se aislan con los metodos de la invenci6n. Dichos miembros se pueden sintetizar con o sin el c6digo genetico adjunto. En una realizaci6n preferente, dichos miembros que carecen del acido nucleico se utilizan como farmacos o precursores de farmacos.
Con un metodo de la presente invenci6n se aislaron varios miembros de las genotecas combinatorias de entidades
10 quimicas codificadas que son capaces de fijarse al ligando diana. Dichos miembros estan compuestos por un nucleo de mesitileno y por un polipeptido con la secuencia AC(X)6C(X)6CG, en donde el polipeptido esta sujeto por los grupos metilo exociclicos del nucleo a traves de los restos de cisteina que forman tres enlaces tioeter, y en donde X se refiere a un aminoacido natural, A es alanina, C es cisteina y G es glicina. La porci6n peptidica de dichos miembros se puede expresar recombinantemente o se puede sintetizar quimicamente.
15 Los inhibidores de la calicreina plasmatica humana se pueden aislar con los metodos de la invenci6n a partir de las genotecas combinatorias de entidades quimicas codificadas de la invenci6n. Dichos inhibidores tienen o bien polipeptidicas
, o bien secuencias relacionadas, en donde 20 los grupos tiol de las cisteinas estan unidos a los nucleos mesitileno.
Los inhibidores de la catepsina G humana se pueden aislar con los metodos de la invenci6n a partir de las genotecas combinatorias de entidades quimicas codificadas de la invenci6n. Dichos inhibidores tienen o bien las secuencias polipeptidicas , o bien secuencias relacionadas, en donde los grupos tiol de las cisteinas estan unidos a los nucleos mesitileno.
25 Los inhibidores del activador del plasmin6geno humano de tipo urocinasa se pueden aislar con los metodos de la
inhibidores tienen o bien las secuencias polipeptidicas
secuencias relacionadas, en donde los grupos tiol de las cisteinas estan unidos a los nucleos de mesitileno.
DIANAS BIOLOGICAS
30 Es importante crear y ensayar tantas moleculas como sea posible, ya que la probabilidad de identificar un ligando con las propiedades deseadas aumenta cuando se comprueban mas moleculas. De igual forma, en general, los ligandos con mayor afinidad se obtienen cuando se ensayan los mayores repertorios de moleculas.
Tipicamente, los investigadores evaluan las moleculas mediante metodologias de selecci6n o de escrutinio. El escrutinio es un procedimiento mediante el cual a los compuestos se les ensaya por separado su capacidad para 35 modificar una diana. Los procedimientos de escrutinio son versatiles y permiten el ensayo de repertorios de moleculas que tienen estructuras muy distintas. No obstante, el escrutinio mediante ensayos por separado puede llevar mucho tiempo y el numero de moleculas unicas a las que se puede comprobar la fijaci6n a una diana especifica no suele exceder por lo general 106 entidades quimicas. Por el contrario, los metodos de selecci6n suelen permitir el muestreo de un numero mucho mayor de moleculas diferentes. Asi pues, los metodos de 40 selecci6n se usan mas convenientemente en las aplicaciones de la invenci6n. En los procedimientos de selecci6n, las moleculas se ensayan en un unico recipiente de reacci6n y las que tienen propiedades favorables (por ejemplo, fijaci6n) se separan fisicamente de las moleculas inactivas. Las estrategias de selecci6n que estan disponibles permiten generar y ensayar simultaneamente mas de 1013 compuestos distintos. Los ejemplos de tecnicas poderosas de selecci6n por afinidad son la exposici6n en fagos, la exposici6n en ribosomas, la exposici6n de 45 ARNm, la exposici6n en levaduras, la exposici6n en bacterias y los metodos de aptameros de ADN/ARN. Estos metodos de selecci6n biol6gica in vitro tienen en comun que los repertorios de ligandos estan codificados por ADN
o ARN. Permiten la propagaci6n y la identificaci6n por secuenciaci6n de los ligandos seleccionados. La tecnologia de exposici6n en fagos se ha usado por ejemplo para el aislamiento de anticuerpos con afinidad de uni6n muy alta por virtualmente cualquier diana.
50 APLICACION INDUSTRIAL
La presente invenci6n es aplicable al descubrimiento de moleculas que son utiles en los campos de la biologia, la biotecnologia y las ciencias farmaceuticas. En particular, la presente invenci6n se refiere a los metodos para la generaci6n de farmacos o precursores de farmacos.
La presente invenci6n comprende metodos para la generaci6n de genotecas combinatorias de entidades quimicas codificadas geneticamente y metodos para el aislamiento de miembros de dichas genotecas. Ademas, la invenci6n comprende genotecas generadas con dichos metodos y miembros de las genotecas aisladas con dichos metodos.
La presente invenci6n da a conocer un metodo para la generaci6n de genotecas combinatorias de entidades
5 quimicas codificadas geneticamente, en donde los miembros de dichas genotecas comprenden un nucleo molecular central y una gran diversidad de elementos que se anaden a dicho nucleo. Dichas genotecas codificadas geneticamente se generan en dos etapas: en la primera etapa se generan las genotecas de polipeptidos codificadas geneticamente que comprenden grupos funcionales capaces de formar enlaces covalentes con un nucleo molecular. En la segunda etapa, las genotecas de polipeptidos codificadas geneticamente se entrecruzan
10 quimicamente con dicho nucleo molecular al menos mediante tres enlaces covalentes.
Las moleculas de las genotecas combinatorias de entidades quimicas codificadas geneticamente de la presente invenci6n tienen una estructura central que se expande mediante diferentes anadidos. A diferencia del estado actual de las genotecas combinatorias de entidades quimicas codificadas geneticamente que se generan por metodos biol6gicos, las genotecas de la presente invenci6n proporcionan moleculas con arquitecturas ramificadas,
15 no lineales. Las moleculas con tales estructuras ramificadas son adecuadas para la fijaci6n a los ligandos diana, ya que son capaces de fijarse a la diana mediante la interacci6n de los diferentes anadidos que apuntan hacia afuera del nucleo central.
A diferencia de las estructuras polimericas lineales, los complejos de la presente invenci6n tienen menos flexibilidad conformacional. En soluci6n, adoptan solo un conjunto limitado de conformaciones. Como
20 consecuencia, la fijaci6n de dichos complejos o polipeptidos a un ligando diana no esta asociada a una perdida espectacular de entropia y se pueden obtener afinidades de uni6n elevadas.
Los polipeptidos de los complejos/genotecas de la invenci6n estan codificados geneticamente. Esto permite que se puedan aplicar para su producci6n los poderosos metodos biol6gicos de codificaci6n, como por ejemplo exposici6n en fagos, exposici6n en ribosomas, exposici6n en levaduras, exposici6n en bacterias o exposici6n de ARNm, lo
25 que permite generar genotecas de ligandos que contienen millones, miles de millones, o mas, de miembros diferentes.
Se puede variar la secuencia de los anadidos a los polipeptidos de los miembros de las genotecas combinatorias de entidades quimicas codificadas geneticamente. Las excepciones son los aminoacidos que portan grupos funcionales para entrecruzar el polipeptido con un nucleo molecular, lo que se explica con mas detalle en la
30 presente memoria. Los anadidos a los polipeptidos pueden comprender un diversidad combinatoria muy grande. Es importante que los repertorios combinatorios tengan una gran representaci6n, ya que la probabilidad de aislar fijadores de gran afinidad por los ligandos diana aumenta con el tamano de la genoteca.
A diferencia de los biopolimeros lineales como polipeptidos y aptameros ADN o ARN, los complejos y miembros de las genotecas combinatorias de entidades quimicas codificadas geneticamente de la invenci6n no forman
35 estructuras ternarias complejas. Los complejos y miembros de las genotecas combinatorias de entidades quimicas codificadas geneticamente de la invenci6n disfrutan de un riesgo muy reducido de inactivaci6n por culpa del desplegamiento irreversible. La formaci6n de agregados debido al desplegamiento es, por tanto, improbable, ventajosamente.
Las genotecas codificadas geneticamente de la invenci6n convenientemente comprenden al menos 105 miembros
40 distintos. Preferentemente, dichas genotecas comprenden millones o miles de millones, o mas, de miembros distintos. El tamano de dichas genotecas esta determinado por los metodos que se usan para conectar el acido nucleico que codifica un polipeptido con dicho polipeptido. En una realizaci6n preferente de la invenci6n, se usan los metodos biol6gicos para generar repertorios de polipeptidos codificados geneticamente. El numero de miembros diferentes de polipeptidos que se conectan al c6digo polinucleotidico codificante puede exceder 1013,
45 segun los metodos usados.
La invenci6n se describe ahora mediante ejemplos en los que se hace referencia a las siguientes figuras:
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
En la figura 1 se muestra la generaci6n de genotecas combinatorias de entidades quimicas pequenas codificadas geneticamente. Un peptido codificado en fago con tres restos de cisteina se sujeta al compuesto trifuncional tris
50 (bromometil)benceno en una reacci6n de sustituci6n nucle6fila. Las entidades quimicas resultantes se pueden modificar adicionalmente mediante reacciones enzimaticas.
En la figura 2 se muestra la valoraci6n de las condiciones de reacci6n para unir los peptidos expuestos en fagos con el tris-(bromometil)benceno (TBMB). A) Masa molecular de la proteina de fusi6n y despues de la reacci6n con TBMB a 10 IM en NH4HCO3 a 20 mM, EDTA a 5 mM, pH 8, y ACN al 20% a 30 oC durante 1 hora, determinada por espectrometria de masas. La diferencia de masa de la proteina de fusi6n con el peptido que reaccion6 y que no reaccion6 corresponde a la masa del mesitileno, el nucleo molecular pequeno. C)
5 Titulos (unidades de transducci6n) de los fagos reducidos y tratados con diferentes concentraciones de TBMB en NH4HCO3 a 20 mM, EDTA a 5 mM, pH 8, y ACN al 20% a 30 oC durante 1 hora. Se muestran los titulos de los fagos de fdg3p0ss21 (negro) y de la genoteca 1 (blanco).
En la figura 3 se muestra el diseno de la genoteca en fagos y las secuencias de los clones seleccionados. A) Secuencia de aminoacidos de las proteinas de fusi6n con peptidos expresadas por los clones de la genoteca 1. El 10 peptido lider se elimina al secretar la proteina gracias a una proteasa de E. coli que deja el peptido con una alanina aminoterminal, dos secuencias de 6 aminoacidos aleatorios flanqueadas por tres cisteinas y un conector de Gly-Gly-Ser-Gly que conecta el peptido con la proteina del gen 3. B y C) Secuencias de aminoacidos de los clones seleccionados con la calicreina plasmatica (B) y la catepsina G (C) humanas. Se indica la actividad inhibidora de las proteinas de fusi6n peptido-D1-D2 modificadas con TBMB. Las similitudes de las secuencias se resaltan con
15 colores.
En la figura 4 se muestra la maduraci6n de la afinidad de los inhibidores de la calicreina plasmatica humana. A) Diseno de las genotecas 2, 3 y 4. En cada genoteca, uno de los lazos peptidicos tiene la secuencia de un motivo consenso identificado en las primeras selecciones y el otro contiene seis aminoacidos al azar. B) Secuencias de aminoacidos de los clones seleccionados con la calicreina plasmatica humana. Todos los clones proceden de la
20 genoteca 2. Se indica la actividad inhibidora de las proteinas de fusi6n peptido-D1-D2 modificadas con TBMB. Los colores resaltan las similitudes de las secuencias del segundo lazo de fijaci6n.
En la figura 5 se muestra la inhibici6n de la calicreina plasmatica humana por los peptidos sinteticos modificados con TBMB. La actividad inhibidora se expresa como la fracci6n de actividad (indice de inhibici6n/indice de no inhibici6n) a diferentes concentraciones de inhibidor.
25 En la figura 6 se muestra una estructura en soluci6n representativa por RMN del peptido PK15 modificado con TBMB mostrado como una estructura en «salchicha». Los lazos peptidicos se muestran en azul (lazo 1) y verde (lazo 2). Los atomos de carbono ± de los aminoacidos del lazo peptidico y del extremo se muestran como esferas.
En la figura 7 se muestra la reacci6n quimica del compuesto trifuncional TBMB con peptidos que contienen una o dos cisteinas. A) Posible mecanismo de reacci6n del TBMB con una proteina de fusi6n al peptido que contiene dos
30 restos de cisteina. B) Espectro de masas de una proteina de fusi6n al peptido con dos cisteinas antes y despues de la reacci6n con el TBMB. C) Posible mecanismo de reacci6n del TBMB con una proteina de fusi6n al peptido que contiene un resto de cisteina. D) Espectro de masas de una proteina de fusi6n al peptido con una cisteina antes y despues de la reacci6n con el TBMB.
En la figura 8 se muestra la inhibici6n de la activaci6n por contacto en el plasma humano mediante la aprotinina y
35 el peptido PK15 modificado con TBMB. Efecto de la aprotinina (A) y del peptido PK15 modificado con TBMB (B) sobre la generaci6n de trombina desencadenada por la actina. Ambos inhibidores ocasionan una prolongaci6n del tiempo de latencia dependiente de la dosis en comparaci6n con la muestra de control. (C) La suma de las actividades del factor Xlla y de la calicreina plasmatica se midi6 con el sustrato colorimetrico H-D-Pro-Phe-ArgpNA en el plasma humano de tres donantes diferentes tratados con diferentes concentraciones del inhibidor. Se
40 inici6 la activaci6n por contacto anadiendo caolin. Se indican los valores medios y las desviaciones estandares.
En la figura 9 se muestra (a) la generaci6n de genotecas combinatorias de entidades quimicas pequenas codificadas en fagos. Un peptido codificado por fago con tres restos de cisteina se sujet6 al compuesto trifuncional tris-(bromometil)benceno mediante una reacci6n de sustituci6n nucle6fila. Las entidades quimicas resultantes se podrian modificar adicionalmente a traves de reacciones enzimaticas. (b) Estructura quimica de un inhibidor
45 macrociclico de la calicreina plasmatica aislado mediante la exposici6n en fagos (PK15).
despues de la reacci6n con TBMB a 10 IM en NH4HCO3 a 20 mM, EDTA a 5 mM, pH 8, y ACN al 20% a 30 oC durante 1 hora se determin6 mediante espectrometria de masas. La diferencia de masa de la proteina de fusi6n al
50 peptido que reaccionaron y sin reaccionar corresponde a la masa del nucleo del mesitileno, un nucleo molecular pequeno. (b) Las titulaciones (unidades de transducci6n) de los fagos que se redujeron y se trataron con diferentes concentraciones de TBMB en NH4HCO3 a 20 mM, EDTA a 5 mM, pH 8, y ACN al 20% a 30 oC durante 1 hora. Se muestran los titulos de fagos de fdg3p0ss21 (negro) y de la genoteca 1 (blanco).
En la figura 11 se muestra el diseno de las genotecas en fagos y las secuencias de los clones seleccionados. (a) La secuencia de aminoacidos de proteinas de fusi6n con peptidos expresadas por clones de la genoteca 1. La secuencia lider se elimina durante la secreci6n de la proteina mediante una proteasa de E. coli que deja un peptido con una alanina en el extremo amino, dos secuencias aleatorias de 6 aminoacidos flanqueadas por tres cisteinas y
5 un conector de Gly-Gly-Ser-Gly que conecta el peptido a la proteina del gen 3. (b y c) Secuencias de aminoacidos de los clones seleccionados con la calicreina plasmatica (b) y la catepsina G (c) humanas. Se indican las actividades inhibidoras de las proteinas de fusi6n peptido-D1-D2 modificadas con TBMB. Se resaltan las similitudes de secuencia con colores.
En la figura 12 se muestra la maduraci6n de la afinidad de los inhibidores de la calicreina plasmatica humana. (a)
10 Diseno de las genotecas 2, 3 y 4. En cada genoteca, uno de los lazos peptidicos tiene la secuencia de un motivo consenso identificado en las primeras selecciones y el otro contiene seis aminoacidos aleatorios. (b) Secuencias de aminoacidos de los clones seleccionados con calicreina plasmatica humana. Todos los clones proceden de la genoteca 2. Se indican las actividades inhibidoras de las proteinas de fusi6n peptido-D1-D2 modificadas con TBMB. Los colores resaltan las similitudes de secuencia en el segundo lazo de fijaci6n.
15 En la figura 13 se muestra la inhibici6n de la calicreina plasmatica humana mediante peptidos sinteticos modificados con TBMB. La actividad inhibidora se expresa como la fracci6n de actividad (velocidad inhibida/velocidad no inhibida) en concentraciones diferentes de inhibidor. Los clones PK2, PK4, PK6 y PK13 se aislaron en selecciones de fagos con la genoteca 1. PK15 procede de la genoteca 2 y es un inhibidor de afinidad madurada.
20 En la figura 14 se muestra la estructura en soluci6n por NMR del peptido PK15 modificado con TBMB. Los lazos del peptido se muestran en amarillo (lazo 1) y naranja (lazo 2). El nucleo de mesitileno, los tres restos de cisteina y la alanina (extremo amino) y glicina (extremo carboxilo) terminales se muestran en gris. Los atomos del esqueleto del peptido se representan como salchichas y las cadenas laterales de los aminoacidos se muestran como varillas.
En la figura 15 se muestra la reacci6n quimica del compuesto trifuncional TBMB con peptidos que contienen uno o
25 dos restos de cisteina. (a) unidos de reacci6n del TBMB con una proteina de fusi6n a peptido que contiene dos restos de cisteina. (b) La espectrometria de masas de una proteina de fusi6n a peptido con dos cisteinas antes y despues de la reacci6n con TBMB. (c) Posible mecanismo de reacci6n del TBMB con una proteina de fusi6n a peptido que contiene una cisteina y un resto de lisina. (d) La espectrometria de masas de una proteina de fusi6n a peptido con una cisteina y un resto de lisina antes y despues de la reacci6n con TBMB.
30 En la figura 16 se muestra la supresi6n de la activaci6n del factor XII en el plasma humano a traves de la inhibici6n de la calicreina plasmatica con la aprotonina o con el peptido PK15 modificado con TBMB. La via de coagulaci6n intrinseca en el plasma humano de tres donantes diferentes se inici6 mediante la adici6n de caolin. La superficie cargada negativamente del caolin activa cantidades pequenas del factor XII. La precalicreina se convierte en calicreina mediante el factor XII activado (XIIa), y la calicreina ejerce una retroalimentaci6n positiva para activar
35 mas factor XII. La actividad del factor XIIa se midi6 con el sustrato colorimetrico H-D-Pro-Phe-Arg-pNA. Se indican los valores medios y las desviaciones estandares de la actividad del factor XIIa.
Los siguientes ejemplos pretenden tener una naturaleza ilustrativa y no pretenden limitar el alcance de las reivindicaciones anexas.
Ejemplos
40 Vision general
En estos ejemplos mostramos la fabricaci6n de genotecas combinatorias de entidades quimicas codificadas en fagos.
El descubrimiento de las moleculas sinteticas con una elevada afinidad y especificidad por dianas biol6gicas es un problema central en el descubrimiento de farmacos. Mientras que recientemente ha sido posible aislar grandes 45 estructuras moleculares como anticuerpos u aptameros a virtualmente cualquier diana mediante tecnicas de selecci6n in vitro, la generaci6n de aglutinantes organicos pequenos con gran afinidad seguia siendo un gran reto. En esta invenci6n describimos una estrategia para aislar estructuras de moleculas pequenas que estan formadas por un nucleo de molecula organica (compuesto conector) que esta decorado con restos peptidicos (p. ej., polipeptido(s)). Por comodidad en estos ejemplos, se utiliz6 la tecnologia de exposici6n en fagos para codificar la 50 fracci6n de peptido de las moleculas pequenas que permiten generar y seleccionar repertorios combinatorios de entidades quimicas muy grandes. Se eligieron las condiciones de reacci6n para sujetar selectivamente un peptido de 17 aminoacidos mediante tres enlaces tioeter a una molecula de benceno, pero que respeta las proteinas de la cubierta de las particulas de fagos. Se obtuvieron aglutinantes muy especificos con afinidades del orden
submicromolar contra las dos serina proteasas humanas calicreina plasmatica y catepsina G. Un inhibidor de afinidad madurada por la calicreina plasmatica humana con una KI aparente de 1,5 nM suprimi6 con eficacia la activaci6n por contacto en el plasma humano.
Antecedentes de los ejemplos
5 Se necesitan moleculas con gran afinidad y especificidad por dianas biol6gicas para desarrollar tratamientos eficientes y selectivos contra un amplio abanico de enfermedades. El procedimiento de encontrar una nueva molecula organica pequena contra una diana elegida suele implicar el escrutinio de alto rendimiento, en donde se ensayan grandes genotecas de entidades quimicas por su capacidad para modificar la diana. Sin embargo, el procedimiento tarda mucho tiempo y es costoso, y el numero de moleculas unicas que se pueden ensayar contra
10 una diana especifica por lo general no supera un mill6n de entidades quimicas. Los escrutinios a menudo s6lo proporcionan precursores, que luego requieren mas mejora mediante metodos empiricos o mediante el diseno quimico. Los metodos mas poderosos para generar moleculas de fijaci6n son las tecnicas biol6gicas de selecci6n in vitro, como exposici6n en fagos, exposici6n en ribosomas, exposici6n de ARNm o tecnicas de aptameros de ARN/ADN. Permiten la generaci6n rapida de grandes repertorios combinatorios (109-1013) de polipeptidos, ARN o
15 ADN, y el aislamiento posterior de aglutinantes de gran afinidad. Sin embargo, la restricci6n de tales metodos a estructuras biopolimericas grandes como anticuerpos o aptameros imposibilita su utilizaci6n para el descubrimiento de moleculas pequenas.
Para aplicar la selecci6n in vitro a genotecas combinatorias de entidades quimicas se han propuesto diferentes metodologias para asociar moleculas organicas con una etiqueta que especifica su estructura. La mayoria de las 20 estrategias propusieron el uso de etiquetas de ADN para identificar las moleculas organicas pequenas despues de la selecci6n por afinidad. Se ha propuesto un procedimiento de sintesis combinatoria paralela para codificar cada uno de los miembros de una gran genoteca de entidades quimicas con secuencias de nucle6tidos unicas sobre perlas (Brenner, S., y Lerner, R. A., PNAS, 1992). Despues de que se fije la entidad de quimica a la diana, el c6digo genetico se descodifica secuenciando la etiqueta nucleotidica. Se ha conjugado una colecci6n pequena de 25 moleculas organicas a oligonucle6tidos de ADN y se han realizado selecciones de afinidad con diferentes antigenos (Doyon, J. B et al., JACS, 2003). Neri D. y colaboradores habian generado repertorios grandes de parejas de moleculas mediante el autoensamblaje de subgenotecas mas pequenas de entidades quimicas codificadas por ADN mediante la hibridaci6n de dos hebras de ADN (Melkko, S et al., Nature Biotechnol., 2004). La metodologia se utiliz6 exitosamente para la maduraci6n de la afinidad de ligandos de moleculas pequenas. Halpin 30 D. R. y Harris P. B. desarrollaron una estrategia para la evoluci6n in vitro de genotecas combinatorias de entidades quimicas que implica la amplificaci6n de los compuestos seleccionados para realizar varias rondas de selecci6n (Halpin, D. R y Harbury, P. B., PLOS Biology, 2004). Woiwode T. F. et al. unieron genotecas de compuestos sinteticos a las proteinas de la cubierta de particulas de bacteri6fagos de tal forma que la identidad de la estructura quimica esta codificada en el genoma del fago (Woiwode, T. F., Cher & Biol., 2003). Todas estas estrategias que
35 emplean entidades quimicas codificadas por ADN que se ha demostrado que han resultado ser eficientes en experimentos con modelos y algunas incluso han producido nuevas moleculas pequenas aglutinantes Sin embargo, se hizo evidente que codificar genotecas grandes de compuestos y la amplificaci6n de los compuestos seleccionados exige mucho mas que los procedimientos equivalentes en los sistemas biol6gicos de selecci6n.
En esta invenci6n damos a conocer una estrategia para codificar estructuras hibridas de moleculas pequenas
40 peptidos que estan formadas por varios fragmentos polipeptidicos sujetos a una molecula organica pequena central. La porci6n peptidica esta codificada por particulas de fago que permiten generar y seleccionar diversidades grandes y complejas. Imaginamos los siguientes procedimientos de reacci6n para conectar fragmentos peptidicos a una molecula pequena (esquematicamente representado en la figura 1). Una estructura quimica equipada con grupos reactivos se incuba con un peptido expuesto en fago. Los aminoacidos especificos
45 del peptido (p. ej., cisteinas) reaccionan con grupos funcionales de la molecula pequena para formar enlaces covalentes, en donde un primer enlace acelera los enlaces posteriores. A continuaci6n, las moleculas resultantes se someten a selecciones por afinidad. Alternativamente, determinados enlaces peptidicos de la estructura multiciclica se escinden enzimaticamente para obtener estructuras quimicas pequenas decoradas con entidades peptidicas diferentes. La adhesi6n de los repertorios de polipeptidos expuestos en fagos a estructuras moleculares
50 pequenas no es trivial, ya que la reacci6n necesita ser especifica y selectiva para producir un unico producto. De igual forma, los reactivos no deben deteriorar convenientemente la particula de fago. Ademas, la conexi6n a moleculas pequenas a traves de varios sitios a un peptido anade un nivel adicional de complejidad, ya que podrian generarse facilmente mezclas de los productos o se podrian entrecruzar las particulas de fagos. De hecho, no se conoce ningun ejemplo en la tecnica donde se conectara una molecula pequena a un polipeptido expuesto sobre
55 fago a traves de mas de un enlace.
Materiales y metodos
Uni6n quirica ie las proteinas ie fusi6n peptiio-D12 a un arraz6n quirico
Se expresaron en E. coli los dominios D1-D2 de g3p (que comprende los restos de aminoacidos 2 a 217 de la fdg3p madura) con y sin el peptido fusionado al extremo amino. El vector de expresi6n basado en pUC119 con una secuencia lider y el gen de D1-D2 con una etiqueta de seis histidinas en el extremo carboxilo 5 (denominado aqui pUC119H6D12) fue proporcionado amablemente por Phil Holliger del Laboratorio de Biologia Molecular (LMB) en Cambridge. Un plasmido para la expresi6n de D1-D2 con el peptido en el extremo amino se clon6 mediante amplificaci6n por PCR a partir del gen de D1-D2 con los cebadores pepd12ba (que codifica la secuencia peptidica) y d12fo, y la ligaci6n en el pUC119H6D12 digerido con SfilINotI. El gen para la expresi6n de D1-D2 sin puentes disulfuro con un total de 20 mutaciones de aminoacidos fue amablemente proporcionado por 10 Insa Kather y Franz Xaver Schmid de la Universidad de Bayreuth. El gen se amplific6 por PCR a partir del vector fdg3p0ss21 con alguna de las parejas de cebadores d120ssba/d120ssfo, pepd120ssba/d120ssfo,
puentes disulfuro se exprese con y sin los peptidos fusionados en el extremo amino. Las 6 proteinas se expresaron en las celulas TG1 de E. coli a 30 oC durante 8
15 horas y se purific6 la fracci6n periplasmica por etapas mediante cromatografia de afinidad de Ni y filtraci6n en gel en una columna Superdex 75 en NH4HCO3 a 20 mM, pH 7,4. Los grupos sulfhidrilo oxidados se redujeron mediante la incubaci6n de la proteina (1 a 10 IM) con TCEP a 1 mM en NH4HCO3 a 20 mM, pH 8 a 42 oC durante 1 hora. Se retir6 el agente reductor en un filtro Vivaspin 20 que tenia un MWCO de 10 000 (Vivascience, Stonehouse, UK) utilizando el tamp6n de NH4HCO3 a 20 mM y EDTA a 5 mM a pH 8. Los grupos tiol de las
20 proteinas se hicieron reaccionar mediante incubaci6n con TBMB a 10 IM en tamp6n de reacci6n (NH4HCO3 a 20 mM, EDTA a 5 mM, pH 8, y ACN al 20%) a 30 oC durante 1 hora. Para retirar el TBMB que no reaccion6 y concentrar, se filtr6 la proteina con un microcon YM-30 (Millipore, Bedford, MA). Se determin6 la masa molecular de las proteinas (5 a 20 IM) mediante desnaturalizaci6n en 4 volumenes de MeOH al 50% y acido f6rmico al 1%, y analisis en un espectr6metro de masas de tiempo de vuelo con ionizaci6n por electropulverizaci6n (Micromass,
25 Mildford, MA, USA). Se obtuvieron las masas moleculares desconvolucionando varios espectros de masas de proteinas cargadas mediante la versi6n 4.1 de MassLynx. El rendimiento de la reacci6n de modificaci6n quimica en presencia del fago se evalu6 mediante la adici6n de fago purificado en PEG a una concentraci6n final de 1010
u.t. para la proteina antes de la reducci6n con TCEP. Se retir6 el fago mediante filtraci6n en gel con una columna de PD-10 (Amersham Pharmacia, Uppsala, Suecia) despues de la reacci6n con TBMB.
30 Creaci6n ie una genoteca ie peptiios en fagos
Los genes que codifican un peptido semialeatorio con la secuencia Ala-Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys, el conector Gly-Gly-Ser-Gly y los dos dominios sin puentes disulfuro D1 y D2 se clonaron en la orientaci6n correcta en el vector fagico fd0D12 para obtener la genoteca 1 de fagos. El vector fd0D12, que carece de los genes de los dominios D1 y D2 del gen 3 y que tiene un segundo sitio de restricci6n Sfil se cre6 previamente mediante la 35 amplificaci6n por PCR del plasmido completo de fdg3p0ss21 (Kather, I et al., J. Mol. Biol., 2005) con los cebadores ecoG3pNba y pelbsfiecofo. Los genes que codifican el repertorio de peptidos y los dos dominios del gen 3 se crearon por etapas en dos PCR consecutivas. Primero, se amplificaron por PCR los genes de D1 y D2 con los dos cebadores prepcr y sfi2fo con el vector fdg3p0ss21 como plantilla. Segundo, el ADN que codifica los peptidos aleatorios se anadi6 en una PCR con los cebadores sficx6ba y sfi2fo. La ligaci6n de 33 y 9 Ig del plasmido fd0D12
40 digerido con Sfil y el producto de PCR produjo 4,4 x 109 colonias sobre 12 placas de 20 x 20 cm de 2YT con cloranfenicol (30 Ig/ml). Se recuperaron las colonias de las placas con el medio 2YT, se complement6 con glicerol al 15% y se almacenaron a 80 oC. Se diluyeron las reservas a una DO600 = 0,1 en cultivos de un litro de 2YT/cloranfenicol (30 Ig/ml) y los fagos se expresaron a 30 oC durante una noche (12 a 16 horas).
Uni6n quirica entre un peptiio expuesto en fago y una rolecula pequefa
45 Tipicamente, 1011-1012 u.t. del fago purificado en PEG se redujeron en 20 ml de NH4HCO3 a 20 mM, pH 8, con TCEP a 1 mM a 42 oC durante 1 hora. Los fagos se centrifugaron a 4000 rpm en un filtro Vivaspin 20 (MWCO de 10 000) para reducir el volumen a 1 ml y se lavaron dos veces con 10 ml de tamp6n de reacci6n enfriado en hielo (NH4HCO3 a 20 mM y EDTA a 5 mM, pH 8). El volumen del fago reducido se ajust6 a 32 ml con el tamp6n de reacci6n y se anadieron 8 ml de TBMB a 50 IM en ACN para obtener una concentraci6n final de 10 IM. La
50 reacci6n se incub6 a 30 oC durante 1 hora antes de que el TBMB sin reaccionar se retirase mediante precipitaci6n del fago con 1/5 de volumen de PEG al 20% y NaCl a 2,5 M en hielo, y centrifugaci6n a 4000 rpm durante 30 minutos.
Selecci6n ie fagos con calicreina plasratica y catepsina G huranas
La calicreina plasmatica de humano (activada con el factor XIIa) se compr6 a Innovative Research (Southfiled, MI, 55 EE.UU.) y se biotinil6 a una concentraci6n de 1,2 IM con un exceso molar de 5 veces de Sulfo-NHS-LC-biotina
(Pierce, Rockford, IL, EE.UU.) en PBS, pH 7,4 y DMSO al 5% a TA durante 1 hora. La proteina biotinilada se purific6 en una columna PD-10 con un tamp6n de NaAc a 50 mM, pH 5,5, y NaCl a 200 mM. Mas facil de obtener, la catepsina G humana biotinilada se compr6 a Lee Biosolutions (St. Louis, MI, EE.UU.). Se incubaron los antigenos biotinilados (de 5 a 20 Ig) con 50 Il de perlas magneticas de estreptavidina (Dynal, M-280 de Invitrogen, 5 Paisley, Reino Unido) durante 20 minutos a 4 oC. Las perlas revestidas de antigeno se lavaron dos veces con tamp6n de lavado (Tris-HCl a 10 mM, pH 7,4, NaCl a 150 mM, MgCl2 a 10 mM y CaCl2 a 1 mM) y se bloquearon en 0,5 ml de tamp6n de lavado que contenia SAB al 1% y Tween 20 al 0,1% durante 30 minutos. El fago modificado quimicamente (tipicamente 1010-1011 u.t. disueltos en 2 ml de tamp6n de lavado) se bloque6 mediante la adici6n de 1 ml de tamp6n de lavado que contenia SAB al 3% y Tween 20 al 0,3%. Se pipetearon 3 ml de fagos 10 bloqueados en 0,5 ml de perlas magneticas bloqueadas y se incubaron en una rueda giratoria a TA. Las perlas se lavaron 8 veces con tamp6n de lavado que contenia Tween 20 al 0,1% y dos veces con tamp6n de lavado antes de la incubaci6n con 100 Il de glicina a 50 IM, pH 2,2, durante 5 minutos. Los fagos eluidos se transfirieron a 50 Il de Tris-HCl a 1 M, pH 8, para la neutralizaci6n, se incubaron con 50 ml de celulas TG1 a una DO600 = 0,4 durante 90 minutos a 37 oC, y las celulas se sembraron en placas grandes de 2YT/cloranfenicol. Se realizaron dos rondas
15 adicionales de criba con los mismos procedimientos. En la segunda ronda de selecci6n se utilizaron perlas magneticas revestidas de neutravidina para impedir el enriquecimiento de peptidos especificos de estreptavidina. Las perlas de neutravidina se prepararon haciendo reaccionar 0,8 mg de neutravidina (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.) con 0,5 ml de perlas magneticas activadas con tosilo (Dynal, M-280 de Invitrogen, Paisley, Reino Unido) segun las instrucciones del proveedor.
20 Proceiiriento ie escrutinio para iientificar inhibiiores ie las proteasas
El ADN plasmidico de los clones seleccionados despues de la segunda y tercera rondas del biocribado se amplific6 por PCR en un unico tubo con los cebadores 21seqba y flagfo, y se clonaron en el vector pUC119H6D12 en los sitios Sfil y Notl para la expresi6n periplasmatica de los peptidos fusionados con los dominios D1 y D2 sin puentes disulfuro con una etiqueta FLAG y una etiqueta de seis histidinas en el extremo carboxilo. Los plasmidos ligados se 25 electroporaron en las celulas TG1 y se sembraron en placas de 2YT/ampicilina (100 Ig/ml). Los clones que expresan la proteina recombinante se identificaron como sigue: los cultivos de 1 ml de 2YT/ampicilina (100 Ig/ml) en placas de 96 pocillos profundos se inocularon con celulas de colonias diferentes y se incubaron a 37 oC. La expresi6n de la proteina se indujo con IPTG a 1 mM cuando los cultivos estaban turbios y las placas se agitaron a 300 rpm a 30 oC durante una noche. Las celulas se sedimentaron por centrifugaci6n a 3500 rpm durante 30 30 minutos, se lisaron con tamp6n de lavado que contenia lisozima a 1 mg/ml, y se centrifugaron a 3500 rpm para sedimentar los desechos celulares. Los sobrenadantes se transfirieron a placas de 96 pocillos Polysorp (Nunc, Roskilde, Dinamarca) para la adsorci6n inespecifica. Los pocillos se enjuagaron dos veces con tamp6n de lavado que contenia Tween 20 al 0,1% y se bloquearon con tamp6n de lavado que contenia SAB al 1% y Tween 20 al 0,1% durante 1 hora. El anticuerpo anti-FLAG M2 conjugado a peroxidasa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) 35 se diluy6 1:5000 y se bloque6 en tamp6n de lavado con SAB al 1% y Tween 20 al 0,1%, y se anadi6 a las placas durante 1 hora. Los pocillos se lavaron (5 veces con tamp6n de lavado que contenia Tween 20 al 0,1% y una vez sin el detergente) y se detect6 la peroxidasa unida con la soluci6n del sustrato TMB (eBiosciences, San Diego, EE.UU.). Se secuenci6 el ADN plasmidico de los clones que expresaban la proteina (Geneservice, Cambridge, Reino Unido). Los clones seleccionados se expresaron en una escala de 800 ml y se purificaron por cromatografia 40 de afinidad de Ni y filtraci6n en gel como se describe mas arriba. Los peptidos se modificaron quimicamente con el procedimiento descrito mas arriba y la concentraci6n de los productos se determin6 con la medici6n de la absorci6n 6ptica a 280 nm. Se midi6 la CI50 mediante la inoculaci6n de distintas concentraciones de las proteinas de fusi6n con el peptido modificado (diluciones a la mitad) con la calicreina (0,1 nM) o con la catepsina G (20 nM) de plasma humano, y se determin6 la actividad residual en Tris-HCl a 10 mM, pH 7,4, NaCl a 150 mM, MgCl2 a 10 45 mM, CaCl2 a 1 mM, SAB al 0,1% y Triton X-100 al 0,01%. La actividad de la calicreina plasmatica humana se midi6 con el sustrato fluor6geno Z-Phe-Arg-AMC (Bachem, Bubendorf, Suiza) a una concentraci6n de 100 IM en un lector de placas de fluorescencia Spectramax Gemini (excitaci6n a 355 nm, lectura de emisi6n a 460 nm; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.). La actividad de la catepsina G humana se midi6 con el sustrato colorimetrico N-Suc-Ala-Ala-Phe-Pro-pNA (Bachem, Bubendorf, Suiza) a una concentraci6n de 1 mM con el lector
50 de placas de absorci6n Sptramax (lectura a 410 nm; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.).
Selecci6n ie fagos ie inhibiiores ie la calicreina plasratica hurana por raiuraci6n ie la afiniiai
Se crearon tres genotecas de peptidos en fagos esencialmente como la genoteca 1 (vease mas arriba), pero usando los cebadores degenerados sficx6abc (genoteca 2), sficx6abb (genoteca 3) y sficx6aba (genoteca 4) en lugar del sficx6ba. La electroporaci6n de las reacciones de ligaci6n en las celulas TG1 produjo 9,5 x 108 (genoteca
55 2), 1,1 x 109 (genoteca 3) y 1,2 x 109 (genoteca 4) transformantes. Los fagos de cada genoteca se amplificaron en cultivos de 1 l, se purificaron, se reunieron y se hicieron reaccionar con TBMB. Se realizaron tres rondas de criba esencialmente como en las selecciones descritas mas arriba, pero con la calicreina plasmatica humana biotinilada a la concentraci6n mas baja (1 mM en la 1.a y 2.a rondas, y 200 pM en la 3.a ronda). 33
Sintesis quirica ie peptiios biciclicos
Los peptidos con una amina libre en el extremo amino y una amida en el extremo carboxilo se sintetizaron quimicamente a una escala de 25 mg con quimica de fase s6lida (JPT Peptide Technologies, Berlin, Alemania). Los peptidos brutos en 1 ml de NH4HCO3 al 60%, pH 8, y ACN al 30% (1 mM) se hicieron reaccionar con TBMB
5 (1,2 mM) durante 1 hora a TA. El producto de reacci6n se purific6 por cromatografia liquida de alta resoluci6n (HPLC) en fase inversa con una columna C18 y gradiente de eluci6n con una fase m6vil compuesta por una soluci6n de ACN y acido trifluoroacetico (TFA) al 0,1% a una velocidad de flujo de 2 ml/min. Los peptidos purificados se liofilizaron y se disolvieron en DMSO o un tamp6n de Tris-HCl a 50 mM, pH 7,8, y NaCl a 150 mM para medir la actividad.
10 Meiici6n ie la activiiai y ie la especificiiai ie los inhibiiores ie la calicreina plasratica hurana
Se determin6 la actividad inhibidora (CI50) mediante la medici6n de la actividad residual de la enzima tras la incubaci6n (30 min a TA) con diferentes concentraciones del inhibidor (que oscilan tipicamente de 10 IM a 0,5 pM). La actividad de la calicreina plasmatica humana (0,1 nM) y del factor XIa (0,8 nM; Innovative Research, Southfiled, MI, EE.UU.) se midi6 con Z-Phe-Arg-AMC (100 IM), y la actividad de la trombina humana (2 nM; 15 Innovative Research, Southfiled, MI, EE.UU.) con Boc-Phe-Ser-Arg-AMC (100 IM) en Tris-HCl a 10 mM, pH 7,4, NaCl a 150 mM, MgCl2 a 10 mM, CaCl2 a 1 mM, SAB al 0,1%, Triton X-100 al 0,01% y DMSO al 5%. La calicreina recombinante plasmatica de rat6n de R&D Systems (Minneapolis, MN, EE.UU.) con un peptido senal se activ6 proteoliticamente con termolisina a 0,5 mg/ml a 37 oC durante 1 hora. La actividad de la calicreina plasmatica de rat6n (3 mM) se midi6 con Z-Phe-Arg-AMC (100 IM) en Tris-HCl a 50 mM, pH 7,4, NaCl a 250 mM, CaCl2 a 10
20 mM, SAB al 0,1%, Triton X-100 al 0,01% y DMSO al 5%. El inhibidor hidrolizado en un lazo de fijaci6n se gener6 por incubaci6n del peptido PK15 modificado con TBMB con la calicreina plasmatica humana a una relaci6n molar de 5:1 durante 24 horas a 37 oC y posterior inactivaci6n por calor de la enzima a 60 oC (30 min). Los valores de Ki aparente se calcularon de acuerdo con la ecuaci6n de Cheng y Prusoff (Cheng, Y. y Prusoff, W. H. Biocher. Pharracol. 1973).
25 Meiici6n ie la activaci6n por contacto en el plasra hurano
El plasma humano normal de donantes individuales se adquiri6 en 3H Biomedical (Uppsala, Suecia). El plasma se centrifug6 a 1500xg a 20 oC durante 15 minutos para obtener plasma con pocas plaquetas (PPP). Las alicuotas del PPP se guardaron en tubos de propileno a 80 oC. Se prepararon muestras de 60 Il de PPP que contenian 5, 50, 500 o 5000 nM de aprotinina (Roche, Mannheim, Alemania) o del peptido PK15 modificado con TBMB. El tiempo 30 de activaci6n de la trombina se midi6 a 37 oC con la adici6n de 20 Il de actina FS diluida 1:10 (Dade Behring, Marburg, Alemania) y 20 Il de tamp6n HEPES a 20 mM, pH 7,4, CaCl2 a 100 mM, SAB a 50 mg/ml y Z-Gly-Gly-Arg-AMC a 1 mM a la muestra de plasma, y siguiendo la intensidad de la fluorescencia con un lector de placas de fluorescencia (excitaci6n a 355 nm, lectura de emisi6n a 460 nm; PHERAStar, Labtech, Offenburg, Alemania). La activaci6n del factor XIIa y de la calicreina plasmatica humana se midi6 como se indica a continuaci6n. Se
35 anadieron 2 Ig de caolin a las muestras de plasma, se mezcl6 bien y se incub6 durante 20 min a 37 oC. Se diluyeron las muestras 250 veces en Tris-HCl a 50 mM, pH 7,8 y NaCl a 150 mM. La actividad similar a la de la calicreina plasmatica se midi6 con el sustrato crom6geno H-D-Pro-Phe-Arg-pNA (100 IM; Bachem, Bubendorf, Suiza) con un lector de placas de absorci6n (absorci6n a 450 nm; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.).
Deterrinaci6n ie la estructura iel peptiio PK15 roiificaio con TBMB
40 Se disolvi6 1 mg del peptido PK15 modificado con TBMB en 550 Il de Tris-HCl deuterado a 10 mM, pH 6,6, NaCl a 150 mM, MgCl2 a 10 mM y CaCl2 a 1 mM para obtener una concentraci6n de inhibidor de 1 mM. El espectro de los inhibidores se ley6 a 800 MHz (Bruker Avance con criosonda TCI). Las asignaciones de espectro se basaron en los espectros TOCSY (espectroscopia de correlaci6n total) y NOESY (espectroscopia del efecto nuclear de Overhauser). Las restricciones de distancias eran del espectro NOESY. Se calcularon 50 conform6meros
45 estructurales. El programa PyMOL se us6 para analizar y visualizar la estructura de los modelos moleculares.
EJEMPLO 1: Fabricacion de un complejo
En este ejemplo mostramos la uni6n a moleculas pequenas de los peptidos expuestos en fagos. El polipeptido de este ejemplo es un peptido expuesto en fago. El acido nucleico esta comprendido en la particula de fago. El compuesto conector de este ejemplo es una molecula pequena (TBMB en este ejemplo).
50 Usamos la molecula organica pequena tris-(bromometil)benceno (TBMB) como armaz6n para anclar los peptidos que contienen tres restos de cisteina (Kemp, D. S. y McNamara, P. E., J. Org Cher. 1985; figura 1B). Los halogenuros de alcano conjugados a un armaz6n aromatico reaccionan especificamente con los grupos tiol de las cisteinas en solventes acuosos a temperatura ambiente (Stefanova, H. I., Biocheristry, 1993). Meloen y colaboradores habian utilizado previamente armazones sinteticos sustituidos con bromometilo para la inmovilizaci6n de los peptidos con varias cisteinas (Timmerman, P. et al., CherBioCher, 2005). Las condiciones suaves que se necesitan para la reacci6n de sustituci6n son las ventajosas para respetar la funcionalidad del fago (Olofsson, L. et al., J. of Molecular Recognition, 1998). Elegimos las cisteinas como puntos de anclaje porque su
5 cadena lateral tiene la actividad mas distintiva entre los 20 aminoacidos naturales. De igual forma, los restos de cisteina son poco frecuentes en las proteinas de la cubierta del fago (8 cisteinas en pIII, una cisteina en pVI, pVII y pIX; Petrenko V. A. y Smith, G. P., Phage Display in Biotechnology ani Drug Discovery, 2005). La simetria rotacional ternaria de la molecula de TBMB garantiza la formaci6n de un unico is6mero espacial y estructural tras la reacci6n con tres cisteinas de un peptido.
10 Las condiciones de reacci6n para la modificaci6n de un peptido en un fago se elaboran a continuaci6n. Como con las tecnicas disponibles resulta dificil detectar sobre el fago el peptido modificado quimicamente, expresamos el peptido como una fusi6n aminoterminal con los dos dominios solubles D1 y D2 de la proteina pIII minoritaria de la cubierta del fago y analizamos la masa molecular de la proteina antes y despues de la reacci6n con el TBMB mediante espectrometria de masas. Fallaron los intentos por conectar selectivamente las
15 tres cisteinas del peptido con el armaz6n a la vez que se respetaban los tres puentes disulfuro de los dominios D1 y D2 de pIII (C7-C36, C46-C53, C188-C201). Esto nos llev6 a aprovecharnos de la proteina del gen 3 sin puentes disulfuro recientemente desarrollada por Schmidt F. X. y colaboradores (Kather, I. et al. J. Mol. Biol. 2005). El peptido fusionado al dominio aminoterminal de la proteina pIII sin cisteinas se redujo con tris(carboxietil)fosfina (TCEP). Como se comprob6 que el reductor hacia reacci6n con los grupos bromometilo del armaz6n de TBMB, se
20 retir6 antes de anadir el TBMB a la proteina. La reoxidaci6n de los grupos tiol despues de retirar el TCEP se podria evitar con la desgasificaci6n del tamp6n de reacci6n y la formaci6n de complejos de iones metalicos con EDTA 5 mM. La reacci6n de los grupos tiol con el TBMB a distintas concentraciones y el analisis de espectrometria de masas del producto revel6 que una concentraci6n de TBMB de 10 IM es suficiente para la modificaci6n cuantitativa del peptido a 30 oC en una hora. Se formaba predominantemente un producto con la masa molecular
25 esperada (f masa esperada = 114 Da; figura 2A). Cuando el D1-D2 sin puentes disulfuro y sin fusionar a peptido se incub6 con el TBMB, la masa no cambi6, lo que indicaba que no se habian producido reacciones inespecificas con otros aminoacidos. La adici6n de particulas de fago a las reacciones (1010 u.t. por mililitro) revel6 que la alta densidad de proteinas de la cubierta del fago en el recipiente no entorpecia la reacci6n del polipeptido con el TBMB. Inesperadamente, encontramos que la reacci6n del TBMB con los peptidos que contenian solo dos restos
30 de cisteina producia un producto con una masa molecular que era coherente con la reacci6n del grupo bromometilo restante con la amina primaria del extremo amino (figuras 7A y 7B). De igual forma, la reacci6n del TBMB con un peptido que tiene una cisteina y una lisina
con los dos grupos bromometilo restantes (figuras 7C y 7D).
35 A continuaci6n comprobamos si el fago modificado con TBMB todavia tenia capacidad de infectar las bacterias. Encontramos que, a medida que subia la concentraci6n del TBMB en la reacci6n, menos fago permanecia infectante (figura 2B). En las condiciones de reacci6n que permiten la modificaci6n cuantitativa del peptido (TBMB a 10 IM, 30 oC, reacci6n durante 1 hora), el numero de fagos infectantes caia a la quinta parte.
EJEMPLO 2: Escrutinio
40 Este ejemplo muestra la selecci6n por afinidad de inhibidores de la calicreina plasmatica de la catepsina G humanas.
La viabilidad de seleccionar estructuras de hibridos de moleculas pequenas y peptidos codificadas por fagos se aplic6 al ensayo que utiliza los dos antigenos humanos calicreina plasmatica y catespina G. Se cre6 una genoteca de exposici6n de peptidos en fagos sobre la proteina minoritaria plll de la cubierta con una complejidad de 4,4 x 45 109 variantes. Los peptidos se disenaron para que tuvieran dos secuencias de seis aminoacidos aleatorios flanqueados por tres cisteinas (Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys; figura 3A). Se anadi6 una alanina al extremo amino del peptido para asegurar un procesamiento correcto de la secuencia senal. Se coloc6 el conector Gly-Gly-Ser-Gly entre la tercera cisteina y la proteina del gen 3. Como el fago con la proteina del gen 3 sin puentes disulfuro tenia aproximadamente la infectividad 100 veces menor en comparaci6n con el fago de tipo silvestre, se produjo gran 50 cantidad de particulas de fagos. Un cultivo de 1 litro incubado durante una noche a 30 oC produjo tipicamente de 1011 a 1012 particulas infectantes. Aproximadamente 1012 particulas infectantes de fago purificadas se modificaron quimicamente con el armaz6n de TBMB y se incubaron con cada una de las dos proteasas biotiniladas. Los fagos fijados se capturaron en perlas magneticas de estreptavidina y se sometieron a dos ciclos de selecci6n mas. El incremento de la cifra de fagos capturados en la segunda o en la tercera ronda de selecci6n indic6 que se 55 enriquecieron en aglutinantes especificos. La secuenciaci6n de los peptidos revel6 diferentes secuencias consenso bien en uno o incluso ambos lazos (figuras 38 y 3C). Se amplific6 por PCR el ADN de los peptidos seleccionados
de la poblaci6n y se insert6 en un nuevo plasmido para la expresi6n periplasmatica de los peptidos como proteina de fusi6n con D1-D2. Las proteinas de fusi6n con peptidos que mostraron o bien similitudes de secuencia con otros clones seleccionados o bien que se encontraron en varias copias, se expresaron, se purificaron, se modificaron quimicamente y se les ensay6 su actividad inhibidora. Los mejores inhibidores de la calicreina
5 plasmatica y de la catepsina G tenian una CI50 de 400 nM (PK2 y PK4) y 100 nM (CG2 y CG4), respectivamente, cuando se ensayaron como una fusi6n con D1-D2.
Ejemplo 3: Escrutinio
En este ejemplo se describe la maduraci6n de la afinidad de los inhibidores de la calicreina plasmatica humana. La comparaci6n de la secuencia de aminoacidos de los clones seleccionados contra la calicreina plasmatica humana 10 revel6 que diferentes grupos de clones tenian una gran similitud de secuencia principalmente en uno de los posibles lazos de fijaci6n. Suponemos que las moleculas biciclicas interaccionan predominantemente con el lazo de fijaci6n conservado, mientras que los lazos con diferentes composiciones de aminoacidos no habian evolucionado para la interacci6n 6ptima con la proteasa. Por consiguiente, se crearon nuevas genotecas de fagos con peptidos que tenian tanto un lazo con una secuencia de una de las tres regiones consenso encontradas en la
15 selecci6n con la calicreina plasmatica, como un lazo con seis aminoacidos aleatorios (figura 4A). El cribado de fagos con una presi6n selectiva mas elevada mediante el uso de concentraciones bajas (de 1 nM a 200 pM) de antigeno produjeron clones que tenian una secuencia consenso en el segundo lazo de interacci6n (figura 4B). Los ensayos de inhibici6n revelaron que la CI50 del mejor inhibidor (PK15) se mejor6 aproximadamente en un factor de 20 (20 nM) cuando se ensay6 como una fusi6n con D1-D2.
20 Ejemplo 4: Caracterizacion de los complejos
Se investig6 la actividad y la especificidad de los inhibidores sintetizados quimicamente.
Los peptidos sinteticos de los cuatro mejores inhibidores de la calicreina plasmatica humana que se aislaron en la primera selecci6n (PK2, PK4, PK6, PK13) y el mejor inhibidor de la selecci6n por maduraci6n de la afinidad (PK15) se produjeron mediante sintesis en fase s6lida. Se disenaron los peptidos para que tuvieran una alanina con un 25 grupo amino libre en el extremo amino y una glicina amidada en el extremo carboxilo para representar exactamente la carga y el entorno quimico de los peptidos expuestos en los fagos. Los peptidos sinteticos que reaccionan con el TBMB se vio que tenian una CI50 unas 10 veces menor que los correspondientes peptidos de fusi6n con D1-D2 que reaccionaron con TBMB (tabla A; figura 5). La menor afinidad de los peptidos como una fusi6n con D1-D2 puede tener su origen en la fijaci6n intramolecular del peptido a los dominios de la proteina del 30 gen 3 y, por lo tanto, en una concentraci6n aparente de inhibidor mas baja. La Ki aparente del peptido PK15 modificado con TBMB se calcul6 mediante la ecuaci6n de Chang y Prusoff y se encontr6 que era 1,5 nM (Cheng.
Y. y Prusoff, W. H., Biocher. Pharracol, 1973). La IC50 de los peptidos lineales sin constrenir es al menos 250 veces mayor que la de los peptidos modificados con TBMB (tabla A):
Tabla A
Clon
Secuencia de aminoacidos Masa (Da) CI50 (nM)
Peptido lineal
Peptido biciclico Peptido lineal Peptido biciclico
PK2
1871,2 1985,3 > 10 000 28,6
PK4
1942,9 2055,9 7181 33
PK6
1974,8 2088,7 5707 21,2
PK13
1764,8 1879,1 > 10 000 39,1
PK15
1825 1939,4 > 10 000 1,7
El analisis por espectrometria de masas del inhibidor incubado con calicreina plasmatica humana mostr6 un descenso de la masa de 18 Da, lo que sugiere que se hidroliz6 un enlace peptidico en uno de los lazos del inhibidor. Sin embargo, la actividad inhibidora (CI50) del inhibidor tratado con calicreina era tan buena como la del peptido intacto PK15 modificado con TBMB biciclico.
La especificidad de los cinco inhibidores se ensay6 con la medici6n de la actividad inhibidora frente a la calicreina plasmatica de rat6n (identidad de secuencia del 79%) o las serina proteasas humanas hom6logas factor XIa (que comparten la identidad de secuencia mas elevada con la calicreina plasmatica humana dentro de las serina proteasas humanas; 63%) y trombina (identidad de secuencia del 36%). Ni la calicreina plasmatica de rat6n ni
5 ninguna de las proteasas hom6logas del suero humano se inhibieron a la concentraci6n mas elevada ensayada (10 IM).
Ejemplo 5: Uso de las entidades identificadas en los metodos de la invencion
En este ejemplo se muestra la inhibici6n de la activaci6n por contacto en el plasma humano mediante un inhibidor de la calicreina plasmatica humana.
10 La calicreina plasmatica humana desempena una funci6n clave en los primeros acontecimientos de la activaci6n por contacto. La capacidad del peptido PK15 modificado con TBMB para inhibir la activaci6n por contacto se ensay6 con la medici6n de la prolongaci6n del tiempo de activaci6n de la trombina en el plasma humano en presencia de diferentes concentraciones del inhibidor. La trombina es la ultima enzima que se activa en la cascada de activaci6n de la via de la coagulaci6n sanguinea. A una concentraci6n del inhibidor de 50 nM, el peptido PK15
15 modificado con TBMB retras6 la formaci6n de trombina, mientras que la aprotinina, un inhibidor proteico de 6 kDa de la calicreina plasmatica humana, no produjo ningun efecto (figuras 8A y 7B). A una concentraci6n elevada del inhibidor de 5 IM, la demora de la activaci6n de la trombina fue mas prolongada con la aprotinina que con la molecula pequena inhibidora. La aprotinina es un inhibidor de amplio espectro y puede inhibir otras proteasas en la via intrinseca cuando se utilizaba a una concentraci6n elevada. En un ensayo diferente, comprobamos si el peptido
20 PK15 modificado con TBMB es capaz de suprimir la activaci6n del factor XIIa y de la calicreina plasmatica en el plasma humano de tres donantes diferentes. La activaci6n de dos proteasas podria suprimirse esencialmente a 5 IM del peptido PK15 modificado con TBMB. Estimamos que se necesita una concentraci6n unas 30 veces mas elevada de aprotinina para obtener un mismo efecto de inhibici6n (figura 8C).
Ejemplo 6: determinacion de la estructura del peptido PK15 modificado con TBMB.
25 Se determin6 la conformaci6n del peptido PK15 modificado con TBMB mediante espectroscopia 2D de 1H-RMN en soluci6n acuosa a pH 6,6. Se consiguieron asignaciones de desplazamiento quimico mediante los metodos estandares. El analisis de los espectros NOESY prob6 que la conformaci6n del esqueleto estaba bien definida. Son notables los desplazamientos quimicos de los tres protones del anillo central de benceno que se podian resolver como resultado de las diferencias en su entorno espacial. Las estructuras medias en disoluci6n se calcularon
30 utilizando limitaciones de la distancia procedentes de la NOESY (figura 6).
Resumen de los ejemplos 1 a 6
Hemos demostrado que la invenci6n con referencia a la tecnologia de exposici6n en fagos codifica la fracci6n peptidica de estructuras moleculares pequenas no naturales (a saber, complejos de acuerdo con la presente invenci6n). La codificaci6n genetica permite facilmente generar, seleccionar y amplificar repertorios combinatorios 35 muy grandes. Una dificultad importante de este metodo fue inmovilizar los repertorios de peptidos codificados por fagos al nucleo de moleculas pequenas. Desarrollamos una estrategia de sintesis c6moda y establecimos unas condiciones de reacci6n 6ptimas en una serie de experimentos. Se han tenido que escoger cuidadosamente la concentraci6n de los reactivos, la composici6n del solvente y la temperatura de reacci6n para unir especificamente los peptidos lineales del fago con las moleculas pequenas al mismo tiempo que se respetan las particulas de
40 fagos. Se utiliz6 un fago especifico con proteinas del gen 3 sin puentes disulfuro para ayudar a impedir la generaci6n de mezclas de productos a lo largo de la reacci6n de la molecula pequena con los restos de cisteina de la cubierta del fago.
Hemos elegido la calicreina plasmatica y la catepsina G humanas como dianas para ensayar la eficacia de las tecnicas de selecci6n in vitro de la invenci6n. Se aislaron frente a ambas dianas las moleculas cuya afinidad esta 45 en el intervalo nanomolar inferior y se confirm6 que la estrategia de selecci6n y el diseno de moleculas propuestos son capaces de producir unos aglutinantes con gran afinidad. Cuando evaluamos la especificidad de los inhibidores de la calicreina plasmatica humana, encontramos que no se inhibieron ni la calicreina plasmatica de rat6n, ni las proteasas plasmaticas humanas hom6logas como el factor XIa o la trombina. Este hallazgo fue atractivo porque no resulta trivial la generaci6n de los inhibidores de masa molecular pequena especificos de la
50 calicreina plasmatica humana (Young, W. B. et al., Biorganic ani Meiicinal Cheristry Letters, 2006) y de otras serina proteasas humanas (revisado en Abbenante, G, y Fairlie, D. P., Meiicinal Cheristry, 2005 y Turk, B., Nature Rev. Drug Discovery, 2006). El acceso de las estructuras de moleculas pequenas a la sintesis quimica permite reemplazar determinados aminoacidos por bloques de construcci6n no naturales y, por lo tanto, mejorar adicionalmente la afinidad de los inhibidores.
La determinaci6n de la estructura de uno de los inhibidores de la calicreina plasmatica en soluci6n mediante RMN sugiri6 que la molecula tiene el esqueleto en conformaci6n definida. Como se anticip6, el anillo de benceno hidr6fobo forma el nucleo de la molecula. Sin embargo, ninguna de las cadenas laterales de aminoacidos densamente empaquetadas con el anillo de benceno para esta combinaci6n de compuesto conector y un unico
5 polipeptido particular. Se pueden utilizar ventajosamente armazones alternativos con estructuras quimicas que ofrecen mas posibilidades de interaccionar con el esqueleto peptidico o con las cadenas laterales de los aminoacidos para obtener un empaquetamiento mas denso de la fracci6n de peptido si se desea. Los atomos de hidr6geno del armaz6n de 1,3,5-tris-(bromometil)-benceno en las posiciones del anillo 2, 4 y 6 podrian, por ejemplo, reemplazarse por tres sustituyentes quimicos identicos.
10 En las selecciones demostradas en la presente memoria utilizamos un diseno de molecula en el cual se inmoviliza un peptido a traves de tres enlaces con un armaz6n de molecula pequena para obtener una estructura peptidica biciclica. Por supuesto, en las realizaciones de selecci6n/escrutinio tambien se puede utilizar la creaci6n de arquitecturas moleculares alternativas en las que los lazos peptidicos los escinden las proteasas antes de la selecci6n para obtener moleculas pequenas con restos peptidicos independientes. De hecho, en este trabajo se
15 generaron las estructuras con dos restos peptidicos independientes cuando se escindi6 el inhibidor PK15 modificado por TBMB mediante la calicreina plasmatica humana al incubarlo con la enzima. La molecula digerida individualmente se encontr6 que tenia una actividad inhibidora que era tan buena como la de la forma no hidrolizada. La escisi6n de los lazos peptidicos tambien ofrece la posibilidad de unir otras estructuras quimicas a los extremos nacientes amino o carboxilo mediante otras reacciones quimicas.
20 Hemos valorado el potencial terapeutico del inhibidor evolucionado de la calicreina plasmatica humana mediante la comprobaci6n de su capacidad para inhibir la activaci6n por contacto en el plasma humano. En la cirugia cardiaca que implica una circulaci6n extracorporal, el contacto de la sangre con la superficie artificial de la maquina de circulaci6n extracorporal y la intubaci6n activa varias vias de proteasas plasmaticas. Pueden sucederse complicaciones graves, entre ellas el sindrome de respuesta inflamatoria sistemica (SIRS, por su nombre en
25 ingles), un estado inflamatorio pancorporal que puede afectar al funcionamiento del coraz6n y del pulm6n en los pacientes (Miller, B. E. et al., J. Of Cariiothoracic ani �ascular Anesthesia, 1997). La calicreina plasmatica desempena una funci6n clave en los primeros acontecimientos de la activaci6n por contacto y en la amplificaci6n de otras vias de proteasas, tales como el sistema fibrinolitico y el sistema del complemento. Una estrategia habitual para suprimir la activaci6n por contacto durante la intervenci6n cardiaca es bloquear la actividad de la
30 calicreina plasmatica con la aprotinina, un inhibidor de proteasas de amplio espectro de 6 kDa procedente de tejido de pulm6n bovino. El inhibidor se fija a la calicreina plasmatica con una Ki de 30 nM y, por consiguiente, interrumpe la via de coagulaci6n intrinseca mediante la supresi6n de la activaci6n del factor XII. Ademas, la inhibici6n de la calicreina plasmatica disminuye la conversi6n del plasmin6geno en plasmina y, por consiguiente, reduce la fibrin6lisis y la hemorragia que le acompana. La aprotinina es tambien un inhibidor directo de la plasmina
35 (Ki H 3 nM). Se cree que la inhibici6n directa de la plasmina es el mecanismo principal por el que los efectos antifibrinoliticos conducen a la reducci6n de la perdida de sangre y a la disminuci6n de la necesidad de transfusi6n. El farmaco tambien tiene efectos adversos como la anafilaxis y la toxicidad renal (revisado por Mahdy
A. M. y Webster N. R., Br. J. Anaesth., 2004). Se ha desarrollado recientemente un inhibidor alternativo de la calicreina plasmatica basado en el armaz6n del dominio Kunitz humano (6 kDa) (Markland, W. et al, Biocheristry, 40 1996). El farmaco tiene una afinidad (Ki = 30 pM) y especificidad significativamente mas elevadas por la calicreina plasmatica y se espera que sea menos inmun6geno debido a su marco estructural humano. Actualmente se esta comprobando en ensayos clinicos de fase 2 (Dyax Corp., www.dyax.com). Incluso aunque nuestro inhibidor precursor recien desarrollado tenga una afinidad casi 50 veces menor por la calicreina plasmatica humana que el producto inhibidor basado en el dominio Kunitz, se comprob6 que suprimia de manera eficaz la activaci6n por
45 contacto ex vivo. Su menor tamano (2 kDa) permite no s6lo que se sintetice quimicamente con facilidad, sino que tambien disminuye ventajosamente al minimo el riesgo de una reacci6n inmun6gena y hace al compuesto un inhibidor novedoso y atractivo para su desarrollo o su uso en las circulaciones extracorporales.
Ejemplo �: interacciones no covalentes
El compuesto conector de la invenci6n proporciona la ventaja adicional de influir/establecer o imponer
50 constrenimientos conformacionales en el polipeptido diana por medio de enlaces no covalentes formados entre el compuesto conector y el polipeptido diana. Estos se proporcionan ventajosamente ademas de los enlaces covalentes entre el compuesto conector y el polipeptido diana.
Se debe observar que tales formaciones de enlaces y constrenimientos no se dan a conocer en los metodos de la tecnica anterior, tal como el entrecruzamiento. Primero, los entrecruzadores son tipicamente demasiado pequenos 55 y/o demasiado flexibles para contribuir al constrenimiento conformacional. Segundo, en el ejemplo especifico de entrecruzamiento conocido tratado mas arriba (p. ej., Roberts, patente de los EE.UU. n.o US 2003/0235852A1), el conector bivalente es pequeno (propilo) y muy flexible al haberse disenado a prop6sito, y no hay pruebas de que
produzca ninguna interacci6n no covalente ni imponga ningun constrenimiento conformacional mas alla de juntar dos restos dentro del polipeptido. En cualquier caso, este entrecruzador de la tecnica anterior es s6lo bivalente.
En este ejemplo demostramos que se pueden formar enlaces no covalentes ventajosos entre el compuesto conector y el polipeptido diana de la invenci6n.
5 La estructura de un inhibidor de la calicreina plasmatica humana generado con el metodo de la invenci6n (veanse los ejemplos anteriores) se resolvi6 por RMN. En la estructura propuesta, varios atomos de carbono del polipeptido se encuentran muy pr6ximos (� 4 �) a los atomos de carbono del compuesto conector. Esto sugiere que las interacciones no covalentes estan presentes, en este ejemplo son interacciones hidr6fobas, entre el nucleo y el polipeptido de la invenci6n.
10 Estas interacciones son:
Ser3 CB
- Rng C26 3,62 �
Ser3 CB
- Rng C2 4,0 �
Ser3 CB
- Rng CMe2 3,63 �
Cys2 CB
- Rng CMe2 2,56 �
Cys9 CB
- Rng C29 3,13 �
Cys9 CB
- Rng C9 3,32 �
Pro10 CG
- Rng CMe9 3,8 �
Pro10 CD
- Rng CMe9 3,13 �
Cys16 CB
- Rng C16 3,43 �
Cys16 CB
- Rng C26 3,79 �
Ademas, las interacciones hidr6geno-hidr6geno entre los atomos de hidr6geno del polipeptido y los atomos de hidr6geno del compuesto conector se detectaron mediante espectroscopia 1H-RMN NOESY.
Por lo tanto, se demuestra la existencia de varias clases de interacci6n no covalente entre el compuesto conector y el polipeptido diana de la invenci6n. �stas proporcionan ventajosamente mas constrenimiento conformacional a los 15 polipeptidos de la invenci6n.
Ejemplo �: Genotecas combinatorias de entidades �u�micas codificadas en fagos
Vision general
La tecnologia de exposici6n en fagos se ha demostrado previamente que es eficaz para fabricar anticuerpos terapeuticos a partir de genotecas combinatorias, pero es dificil de aplicar para fabricar moleculas pequenas 20 farmacol6gicas. Aqui describimos una estrategia con fagos para seleccionar imitadores de compuestos macrociclicos producidos por las peptido sintasas que no estan en ribosomas. Los repertorios de peptidos se disenaron con tres restos de cisteina reactivos, separados entre si por restos de aminoacidos aleatorios, y se fusionaron a la proteina del gen 3 de los fagos. La conjugaci6n con un compuesto conector (en este ejemplo tris(bromometil)benceno) a traves de las cisteinas reactivas gener6 repertorios de conjugados peptidicos con dos
25 lazos peptidicos anclados a un nucleo de mesitileno. La reiteraci6n de la selecci6n por afinidad produjo varios inhibidores enzimaticos; despues de mutagenesis adicionales y selecci6n, aislamos un inhibidor puntero (PK15) (KI = 1,5 mM) especifico de la calicreina plasmatica humana que interrumpi6 eficazmente la via de coagulaci6n intrinseca en el plasma humano ensayado ex vivo. Por consiguiente, demostr6 que esta estrategia proporciona medios poderosos para generar y detectar tales imitadores de macrociclos.
30 Antecedentes
El descubrimiento de nuevos ligandos de dianas receptoras, enzimaticas o nucleotidicas representa la primera etapa del desarrollo de farmacos terapeuticos. Para los farmacos basados en ligandos organicos pequenos, el escrutinio de alto rendimiento (HTS, por su nombre en ingles) ha demostrado ser una estrategia popular; se sintetizan (o se compran) grandes genotecas de compuestos y a cada compuesto se le ensaya la uni6n a las 35 dianas. Con el uso de robots se puede detectar de 105 a 106 compuestos al dia, pero las dianas relevantes suelen requerir mas quimica para mejorar su afinidad de uni6n y su especificidad de diana1,2. Para los farmacos basados en acidos nucleicos, peptidos o proteinas, los metodos de selecci6n biol6gica ofrecen una estrategia alternativa. Estos metodos (tales como la exposici6n en fagos, exposici6n en ribosomas, exposici6n de ARNm o tecnologias de aptameros de ARN/ADN) se basan en (a) crear una genoteca heterogenea en la que el fenotipo (fijaci6n a la 5 diana) de cada miembro de la genoteca esta conectado con su genotipo (el ADN o ARN codificante), y (b) un ciclo reiterativo en el que los miembros de la genoteca se seleccionan por la fijaci6n a la diana y luego se amplifican (mediante la replicaci6n en una celula hospedadora, o la copia in vitro del acido nucleico codificado). En cada ronda de selecci6n, los aglutinantes se enriquecen de este modo frente a los no aglutinantes. Se pueden realizar el escrutinio eficaz de genotecas muy grandes (de 109 a 1013 miembros) con unas pocas rondas de selecci6n y los 10 mejores casos se pueden refinar mediante mutaci6n y posterior selecci6n3. El metodo es muy poderoso y se ha utilizado para crear anticuerpos terapeuticos tales como HumiraTM 4,5. Se han intentado desarrollar varias veces metodos de selecci6n para aislar ligandos organicos pequenos. El ADN tipicamente se utiliza como una etiqueta que con facilidad se puede sintetizar, secuenciar, amplificar y/o hibridar. Por ejemplo, se pueden conjugar moleculas pequenas a un etiqueta unica de ADN6 (o bacteri6fago7), y los conjugados se mezclan juntos para crear 15 una genoteca de moleculas pequenas etiquetadas. Despues de seleccionar la genoteca contra la diana, las moleculas pequenas «relevantes» se pueden identificar mediante la secuencia de sus etiquetas (amplificadas). Alternativamente, las etiquetas de ADN se pueden introducir durante la sintesis de las colecciones combinatorias de entidades quimicas. Por ejemplo, las moleculas pequenas y una correspondiente etiqueta se sintetizan en paralelo sobre la misma perla8, o la hibridaci6n de la etiqueta se utiliza para gobernar la via de la sintesis9 quimica.
20 De tales colecciones, la via (y por lo tanto estructura) sintetica de las moleculas relevantes seleccionadas se pueden deducir de la secuencia de la etiqueta. A pesar de su ingeniosidad, estos metodos padecen una desventaja comun; la molecula pequena esta conectada a la etiqueta de ADN s6lo durante la primera ronda de selecci6n, lo que lo imposibilita la reiteraci6n de las rondas (y limitan la aplicaci6n a colecciones pequenas). Por lo tanto, la tecnica anterior presenta numerosas dificultades.
25 En este ejemplo demostramos que la invenci6n se puede utilizar para modificar quimicamente los peptidos sobre fago durante el procedimiento de selecci6n10,11 para crear imitaciones de compuestos monociclicos peptidicos. Recientemente se han descrito metodos para sujetar los peptidos por las cadenas laterales reactivas (p. ej., cisteinas) a los grupos funcionales de un armaz6n12 organico, y, por consiguiente, generar conjugados de peptidos policiclicos que comprenden un nucleo organico decorado con lazos peptidicos. Como las estructuras son
30 reminiscentes de los farmacos macrociclicos peptidicos, exploramos la posibilidad de crear y seleccionar genotecas de tales conjugados en fagos filamentosos (figura 9a). Mientras que los macrociclos peptidicos se hacen normalmente in vivo mediante peptido sintasas13,14 no ribos6micas, nuestra estrategia utiliza la sintesis ribos6mica in vivo y luego la conjugaci6n quimica ex vivo.
Resultados
35 Conjugaci6n ie un arraz6n organico a los peptiios expuestos en fagos
Utilizamos el compuesto organico pequeno tris-(bromometil)benceno (TBMB) como armaz6n (compuesto conector) al que anclar los peptidos que contienen tres restos de cisteina12,15 (figura 9a). La reacci6n se produce en disolventes acuosos a temperatura ambiente, y la simetria de rotaci6n ternaria de la molecula de TBMB asegura la formaci6n de un is6mero espacial y estructural unico.
40 Primero elaboramos las condiciones de reacci6n para conjugar el peptido
fusionado a los dominios D1-D2 solubles de la pIII del fago, y se analiza la masa molecular de los productos mediante espectrometria de masas. Sin embargo, fuimos incapaces de conjugar selectivamente los tres restos de cisteina del peptido con el TBMB, a la vez que se respetaban los puentes disulfuro entre D1 y D2 (C7-C36, C46-C53, C188-C201). Esto nos invit6 a aprovecharnos de una proteina del gen 3 sin puentes disulfuro desarrollada recientemente 45 por Schmidt F. X. y colaboradores16. La proteina de fusi6n peptido-D1-D2 (sin puentes disulfuro) se redujo con tris(carboxietil)fosfina (TCEP), se retir6 el TCEP y se anadi6 el TBMB. Fue suficiente una concentraci6n de TBMB de 10 IM para la reacci6n cuantitativa con la proteina de fusi6n del peptido a 30 oC en una hora, lo que dio predominantemente un producto con la masa molecular esperada (f masa esperada = 114 Da; figura 10a). No se detect6 ningun producto con la proteina D1-D2 (sin puentes disulfuro). Inesperadamente, encontramos que la 50 reacci6n del TBMB con las fusiones peptido-D1-D2 (sin puentes disulfuro) que contienen s6lo dos restos de cisteina ( ) produjeron un producto con una masa molecular coherente con la reacci6n de ambas cisteinas y el grupo amino ± del extremo amino del peptido (figuras 15A y 15b). De igual forma, la reacci6n del TBMB con las fusiones peptido-D1-D2 (sin puentes disulfuro) que tienen una cisteina y una lisina ) produjeron una masa molecular coherente con la reacci6n de la cisteina, el grupo amino 55 ± del extremo amino y el grupo amino I de la lisina (figuras 15c y 15d). Al haber identificado las condiciones adecuadas, hacemos reaccionar el TBMB con el fago (con p3 sin puentes disulfuro) que lleva el peptido
. Esto conduce a una pequena perdida (de 5 veces) de infectividad del fago (figura 10b).
Creaci6n ie una genoteca ie peptiios policiclicos y selecci6n por afiniiai
Disenamos una genoteca de peptidos que contenian dos secuencias de seis aminoacidos aleatorios flanqueadas por tres cisteinas [Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys; figura 11a] para exposici6n en fagos (con p3 sin puentes disulfuro).
5 Se anadi6 un resto de alanina al extremo amino del peptido para garantizar que la secuencia senal se procesa correctamente. Se coloc6 un conector Gly-Gly-Ser-Gly entre la tercera cisteina y la proteina del gen 3. Como el fago (con p3 sin puentes disulfuro) tenia una infectividad 100 veces menor en comparaci6n con el tipo silvestre, se produjo una gran cantidad de particulas de fagos a partir de la genoteca (se estimaban 4,4 x 109 variantes). Un litro de cultivo incubado durante una noche a 30 oC producia tipicamente de 1011 a 1012 particulas infectantes.
10 Comprobamos la capacidad de uni6n e inhibici6n de las proteasas humanas catepsina G y calicreina plasmatica que tenia la genoteca de peptidos policiclicos. Unas 1012 particulas infectantes de fagos purificadas se modificaron quimicamente con TBMB y luego se incubaron con las proteinas diana biotiniladas. Despues de la captura sobre perlas magneticas con avidina o estreptavidina, los fagos enriquecidos se trataron en dos rondas mas de selecci6n, donde cada ronda comprendia amplificaci6n (mediante la infecci6n bacteriana), conjugaci6n quimica y
15 captura con las dianas biotiniladas. El titulo del fago se increment6 despues de la segunda y tercera rondas, lo que sugeria un enriquecimiento en los aglutinantes especificos. El ADN que codifica los peptidos se amplific6 por PCR a partir de la poblaci6n seleccionada de fagos en la tercera ronda, y se volvi6 a clonar para expresarlo en el periplasma como proteinas de fusi6n peptido-D1-D2 (D1-D2 sin puentes disulfuro) y para secuenciarlo. Esto revel6 secuencias consenso en uno o ambos lazos peptidicos (figuras 11b y 11c) y varios de ellos se expresaron,
20 purificaron, conjugaron con TBMB y se les ensay6 su actividad inhibidora de proteasas. Los mejores inhibidores de la calicreina plasmatica y de la catepsina G tenian una CI50 de 400 nM (PK2 y PK4) y 100 nM (CG2 y CG4), respectivamente, cuando se ensayaron como una fusi6n con D1-D2. Como realizamos el escrutinio de los clones seleccionados de fagos por su inhibici6n (en lugar de fijaci6n), no podemos afirmar si tambien se seleccionaran las moleculas que se fijaban a las proteasas, pero que no las inhibian. Sin embargo, el hallazgo de que una gran
25 mayoria de los clones verificados despues de la selecci6n de fagos mostr6 actividad inhibidora sugiere que se seleccionaron predominantemente los inhibidores.
Maiuraci6n ie la afiniiai ie los inhibiiores ie la calicreina plasratica hurana
La mayoria de las secuencias que se unian a la calicreina revelaron secuencias consenso en uno u otro de los lazos del peptido. Se crearon tres nuevas genotecas con una de las tres regiones consenso en un lazo y seis
30 aminoacidos aleatorios en el otro lazo (figura 12a). Se mezclaron las genotecas y se cribaron los fagos en condiciones rigurosas (de 1 nM a 200 pM de calicreina biotinilada). La secuencia aleatoria convergi6 a un nuevo consenso, y produjo clones con secuencias consenso en ambos lazos (figura 12b). Los ensayos de inhibici6n revelaron que la CI50 del mejor inhibidor (PK15) era de 20 nM cuando se ensayaba como una fusi6n con D1-D2.
Activiiai y especificiiai ie los inhibiiores sintetizaios quiricarente
35 Los peptidos sinteticos que corresponden a los cuatro inhibidores de la calicreina de la selecci6n primaria (PK2, PK4, PK6 y PK13) y al mejor inhibidor de la selecci6n por maduraci6n de la afinidad (PK15) se sintetizaron mediante sintesis quimica en fase s6lida. Los peptidos tenian un resto de alanina en el extremo amino y una glicina amidada en el extremo carboxilo para representar la carga y el entorno quimico de los peptidos expuestos en fagos. Los peptidos sinteticos conjugados con TBMB inhibian la actividad de la calicreina con al menos 250
40 veces mas potencia que los peptidos sin conjugar (tabla 1).
Tabla 1: Inhibidores peptidicos sintetizados quimicamente. Se muestra la secuencia de aminoacidos de cinco inhibidores (17-meros) de la calicreina plasmatica. La secuencia de los peptidos sinteticos procede de los clones PK2, PK4, PK6 y PK13 (aislados en selecciones de fagos con la genoteca 1) y del clon PK15 (un clon por maduraci6n de la afinidad aislado de la genoteca 2). Se indica la masa molecular y la actividad inhibitoria antes y
45 despues de la modificaci6n de los peptidos con el TBMB: Eran inhibidores mas de 10 veces mas potentes que los conjugados peptido-D1-D2 (tabla 1; figura 13); presumiblemente sea debido a la uni6n del resto peptidico conjugado con el resto D1-D2. La constante de inhibici6n aparente (Ki) del peptido conjugado PK15 (figura 9b) se calcul6 que era de 1,5 nM usando la ecuaci6n de
Clon original
Secuencia de aminoacidos Masa (Da) CI50 (nM)
Peptido lineal
Peptido biciclico Peptido lineal Peptido biciclico
PK2
1871,2 1985,3 > 10 000 28,6
PK4
1942,9 2055,9 7181 33
PK6
1974,8 2088,7 5707 21,2
PK13
1764,8 1879,1 > 10 000 39,1
PK15
1825 1939,4 > 10 000 1,7
5 Cheng y Prusoff17. La incubaci6n del conjugado PK15 con la calicreina conduce a la hidr6lisis de un enlace peptidico despues de una incubaci6n prolongada (escisi6n del 90% despues de 24 h a 37 oC), como se muestra por la ganancia de masa de 18 Da, pero la actividad inhibidora de las muestras escindidas y sin escindir resultaron ser similares (CI50 de 2,2 nM y 1,6 nM, respectivamente).
Tambien se analizaron los cinco inhibidores contra la calicreina plasmatica de rat6n (identidad de secuencia del
10 79%) o las serina proteasas hom6logas factor XIa (identidad de secuencia del 63%) y la trombina (identidad de secuencia del 36%). Ninguno inhibi6 a estas enzimas a la concentraci6n mas alta utilizada (10 IM).
Interrupci6n ie la via ie coagulaci6n intrinseca reiiante un inhibiior ie la calicreina plasratica hurana
La calicreina plasmatica humana desempena una funci6n clave en las primeras etapas de la via de coagulaci6n intrinseca al convertir el factor XII en el factor XIIa que entonces actua sobre la siguiente proteasa de la via.
15 Analizamos si el conjugado PK15 inhibia la activaci6n del factor XIIa en las muestras de plasma humano. La via se desencaden6 con caolin y la actividad del factor XIIa se midi6 con un sustrato colorimetrico. La actividad de XIIa cay6 a la mitad en presencia del conjugado PK15 a 160 nM (figura 16). En comparaci6n, para lograr el mismo efecto se necesit6 la aprotinina a 5 IM, un inhibidor bovino de 6 kDa de las serina proteasas que tambien se usa en la clinica como inhibidor de la calicreina plasmatica (Ki = 30 nM).
20 Deterrinaci6n ie la estructura iel peptiio PK15 roiificaio con TBMB
Se ley6 el espectro 2D por 1H-RMN del conjugado PK15 y fue posible alinear especificamente la secuencia con los desplazamientos quimicos en los espectros de TOCSY y de NOESY. En la figura 14 se muestra una conformaci6n del inhibidor calculada por las restricciones de distancias derivadas del NOESY. Los dos lazos del peptido estan dispuestos alrededor del nucleo de mesitileno al que estan unidos covalentemente, pero no interaccionan entre si.
25 Los lazos no se empaquetan densamente contra el nucleo, pero algunos atomos de carbono del polipeptido (Cys9 CB, Cys16 CA, Gly17 CA) estan a menos de 4 � de los atomos del nucleo molecular, lo que sugiere que deben existir algun tipo de interacci6n hidr6foba.
Discusion del ejemplo �
Hemos mostrado que la reacci6n del tris-(bromometil)benceno (TBMB)12 con las genotecas de peptidos ricos en
30 cisteina expuestos sobre bacteri6fagos filamentosos genera conjugados (complejos de acuerdo con la presente invenci6n) sobre los que se pueden realizar selecciones iterativas. Fue un desafio conjugar el peptido expuesto a la vez que se respetaba al fago, y tuvimos que variar la concentraci6n de los reactivos, la composici6n del solvente y la temperatura de reacci6n, y tambien usamos fagos que carecian de puentes disulfuro en la proteina del gen 3. A partir de una genoteca de >109 miembros y selecciones reiterativas conseguimos aislar inhibidores potentes de la
35 calicreina plasmatica humana (�2000 Da). Nuestro mejor inhibidor (PK15) con Ki = 1,5 nM interrumpe eficientemente la via de la coagulaci6n intrinseca en el plasma humano analizado ex vivo, y era muy especifico: no inhibia la calicreina plasmatica de rat6n ni las proteasas plasmaticas hom6logas humanas factor XIa y trombina.
Nuestro repertorio se construy6 a partir de peptidos de 17 restos con tres cisteinas, separadas entre si por seis aminoacidos aleatorios. Despues de la conjugaci6n con TBMB, se espera que los peptidos formen dos lazos de 40 seis restos unidos a un nucleo de mesitileno, como se confirm6 realmente gracias a la estructura del inhibidor de la calicreina PK15 resuelto mediante RMN (figura 14). Tales peptidos policiclicos deben tener ventajas tanto sobre los peptidos con puentes disulfuro como con los lineales. Las ventajas de los peptidos policiclicos sobre los peptidos con puentes disulfuro son que los enlaces covalentes azufre-carbono, una vez que se forman, son inertes para el intercambio18, y tambien son estables en un entorno reductor18. La ventaja de los peptidos policiclicos sobre los
peptidos constrenidos se espera que se unan mas estrechamente a las dianas (debido a la menor perdida de entropia conformacional). Nuestra revisi6n de la bibliografia sobre inhibidores peptidicos que se han aislado por exposici6n en fagos muestra que la mayoria contienen disulfuros y tienen constantes de inhibici6n del orden micromolar (tabla 3).
5 Tabla 3: Inhibidores peptidicos seleccionados en fagos. Se indican la secuencia de los peptidos, la diana de la enzima y la afinidad de uni6n. Los restos de cisteina que forman puentes disulfuro estan subrayados.
Diana
Secuencia pept�dica Afinidad Referenci a
Antigeno prostatico especifico (PSA)
KD = 2,9 IM 1
Calicreina 2 humana
CI50 = 3,4 IM 2
Activador del plasmin6geno de tipo urocinasa (uPA)
Ki = 6,7 IM 3
Activador del plasmin6geno de tipo urocinasa (uPA)
Ki = 0,4 IM 4
Quimotripsina
Ki = 1 IM 5
TF-fVII
CI50 = 1,5 nM 6
Enzima convertidora de la angiotensina 2 (ACE2)
KI = 2,8 nM 7
ErbB-2
Ki = 30 IM 8
Ureasa
CI50 = 30 IM 9
Lipasa pancreatica
CI50 = 16 IM 10
�-Lactamasa
CI50 = 9 IM 11
DNasa II
KI = 0,2 IM 12
S6lo dos inhibidores peptidicos fueron tan potentes como la PK15; ambos contenian un puente disulfuro y al menos dos restos de tript6fano19-20. Esto sugiere que (a) la conformaci6n constrenida y la posibilidad de formar
10 interacciones hidr6fobas son clave para estas afinidades elevadas; (b) los peptidos constrenidos (y entrecruzados) tambien deben ser mas resistentes a la escisi6n y/o inactivaci6n que los peptidos lineales. De hecho, en nuestro trabajo se escindi6 uno de los lazos del inhibidor PK15 despues de la incubaci6n prolongada con la calicreina plasmatica humana, pero permaneci6 intacta y activa.
Los conjugados policiclicos se prestan a la ingenieria genetica y quimica. La masa molecular de la PK15 (1939,4
15 Da) es mayor que la de varios farmacos macrociclicos peptidicos (tabla 2), pero seria posible utilizar lazos mas cortos. Por ejemplo, alterando el espaciado de las cisteinas, se varia facilmente la longitud del lazo, o incluso se anaden segmentos extra a los extremos de los peptidos.
Tabla 2. Comparaci6n de tamanos de los farmacos macrociclicos.
Nombre
Tamano del ciclo o de los ciclos Masa molecular (Da) Aplicaci6n
Actinomicina
16,16 1255,42 Antineoplasico
Anfotericina B
38 924,08 Antimic6tico
Azitromicina
15 748,88 Antibi6tico
Caspofungina
21 1093,31 Antimic6tico
Ciclosporina
32 1202,61 Inmunodepresor
Daptomicina
31 1619,71 Antibi6tico
Eritromicina
14 733,93 Antibi6tico
Ixabepilona
16 506,70 Antineoplasico
Ocre6tido
20 1019,24 Hormona
Oxitocina
20 1007,19 Hormona
Polimixina B
23 1301,56 Antibi6tico
Rapamicina
29 914,17 Inmunodepresor
Rifabutina
27 847,01 Antibi6tico
Vancomicina
16, 16, 12 1449,30 Antibi6tico
Otras variaciones podrian incluir la mutagenesis de los lazos (como con la maduraci6n de la afinidad de PK15); la escisi6n proteolitica en uno o ambos lazos para generar segmentos peptidicos «ramificados» en las cisteinas; conjugaci6n quimica en los extremos del peptido naciente despues de la escisi6n de lazo21; o el uso de variaciones 5 en los nucleos organicos. Por ejemplo, un nucleo organico mas grande, o uno con mas grupos funcionales podria interaccionar mas extensivamente con los lazos o con la diana, y tambien se podrian utilizar para introducir funciones completamente nuevas, tales como la fluorescencia. Si se realizasen estas operaciones sobre el conjugado expuesto en fagos, se podrian seleccionar las variaciones mediante un proceso reiterativo. Dado que los conjugados peptidicos tambien son adecuados para la sintesis quimica, se podrian introducir sinteticamente mas
10 variaciones (tales como la sustituci6n mediante aminoacidos no naturales).
Los inhibidores de la calicreina plasmatica humana se han desarrollado clinicamente para el tratamiento del angioedema hereditario y para la intervenci6n quirurgica de derivaci6n coronaria, pero se ha demostrado que es dificil fabricar moleculas pequenas que sean especificas de la calicreina (revisado en22,23). El hecho de que nosotros obtengamos facilmente un inhibidor muy especifico y de gran afinidad mediante la selecci6n reiterativa de
15 conjugados peptidicos policiclicos sobre los fagos indica que esta estrategia esta bien encaminada.
Materiales y metodos
Modificaci6n quimica con TBMB de los repertorios peptidicos sobre los fagos
Las genotecas de peptidos en fagos que se basan en el plasmido fdg3p0ss2166 se clonaron y se produjeron como se describe mas adelante. Tipicamente, los fagos purificados con PEG a 1011-1012 u.t. se redujeron en 20 ml de 20 NH4HCO3 a 20 mM, pH 8 con TCEP a 1 mM a 42 oC durante 1 hora. Los fagos se centrifugaron a 4000 rpm en un filtro Vivaspin 20 (MWCO de 10 000) para reducir el volumen del tamp6n de reducci6n a 1 ml y se lav6 dos veces con 10 ml de tamp6n de reacci6n enfriado en hielo (NH4HCO3 a 20 mM y EDTA a 5 mM, pH 8). El volumen del fago reducido se ajust6 a 32 ml con tamp6n de reacci6n, y se le anadieron 8 ml de TBMB a 50 IM en ACN para obtener una concentraci6n final de TBMB de 10 IM. La reacci6n se incub6 a 30 oC durante 1 hora antes de que el
25 TBMB sin reaccionar se retirase mediante precipitaci6n del fago con un 1/5 de volumen de PEG al 20% y NaCl a 2,5 M en hielo y centrifugaci6n a 4000 rpm durante 30 minutos.
Selecci6n ie fagos con calicreina plasratica y catepsina G huranas
La calicreina plasmatica y la catepsina G humanas biotiniladas (5 a 20 Ig: el protocolo utilizado para la biotinilaci6n se puede encontrar mas adelante) se bloquearon por incubaci6n en 0,5 ml de tamp6n de lavado (Tris-HCl a 10 mM, pH 7,4, NaCl a 150 mM, MgCl2 a 10 mM y CaCl2 a 1 mM) que contenia SAB al 1% y Tween 20 al 0,1% durante 30 minutos. El fago modificado quimicamente (tipicamente 1010-1011 u.t. disueltos en 2 ml de 5 tamp6n de lavado) se bloquearon con la adici6n de 1 ml de un tamp6n de lavado que contenia SAB al 3% y Tween 20 al 0,3% e incubaci6n durante 30 minutos. Se pipetearon 3 ml de fagos bloqueados en 0,5 ml de antigeno bloqueado y se incubaron durante 30 minutos en una rueda giratoria a TA. Se bloquearon 50 Il de perlas magneticas de estreptavidina (Dynal, M-280 de Invitrogen, Paisley, Reino Unido) mediante la incubaci6n en 0,5 ml de tamp6n de lavado que contenia SAB al 1% y Tween 20 al 0,1% durante 30 minutos. Las perlas bloqueadas se 10 anadieron a la mezcla de fagos/antigenos y se incub6 durante 5 minutos a TA en una rueda giratoria. Se lavaron las perlas 8 veces con tamp6n de lavado que contenia Tween 20 al 0,1% y dos veces con tamp6n de lavado antes de la incubaci6n con 100 Il de glicina a 50 IM, pH 2,2, durante 5 minutos. Se transfirieron los fagos eluidos a 50 Il de Tris-HCl a 1 M, pH 8, para la neutralizaci6n, se incubaron con 50 ml de celulas TG1 a una DO600 = 0,4 durante 90 minutos a 37 oC, y las celulas se sembraron en placas grandes de cloranfenicol/2YT. Se realizaron dos rondas
15 adicionales de cribado con los mismos procedimientos. En la segunda ronda de selecci6n se utilizaron perlas magneticas revestidas de neutravidina para impedir el enriquecimiento en peptidos especificos de estreptavidina. Las perlas de neutravidina se prepararon haciendo reaccionar 0,8 mg de neutravidina (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.) con 0,5 ml de perlas magneticas activadas con tosilo (Dynal, M-280 de Invitrogen, Paisley, Reino Unido), de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
20 Escrutinio ie la activiiai inhibiiora en los clones seleccionaios
Los genes que codifican los peptidos seleccionados en la segunda y tercera rondas de biocribado se clonaron en un vector basado en pUC119 para la expresi6n de las proteinas de fusi6n peptido-D1-D2 (proteina D1-D2 sin puentes disulfuro; los procedimientos de clonaci6n y expresi6n se describen mas adelante). Los grupos sulfhidrilo oxidados de los peptidos se redujeron incubando la proteina (1 a 10 IM) con TCEP a 1 mM en NH4HCO3 a 20 mM, 25 pH 8, a 42 oC durante 1 hora. El reductor se retir6 mediante cromatografia de exclusi6n por tamanos en una columna PD-10 (Amersham Pharmacia, Upsala, Suecia) con el tamp6n de NH4HCO3 a 20 mM y EDTA a 5 mM, a pH 8. Los grupos tiol de las proteinas se hicieron reaccionar incubandolos con TBMB a 10 IM en tamp6n de reacci6n (NH4HCO3 a 20 mM, EDTA a 5 mM, pH 8, y ACN al 20%) a 30 oC durante 1 hora. Para la retirada del TBMB sin reaccionar y la concentraci6n, se filtr6 la proteina con un microcon YM-30 (Millipore, Bedford, MA). Se 30 determin6 la concentraci6n de los productos midiendo la absorbancia a 280 nm. Se midi6 la CI50 mediante la incubaci6n de diferentes concentraciones de las proteinas de fusi6n del peptido modificado (diluciones de 2 veces) con calicreina plasmatica humana (0,1 nM) o catepsina G (20 nM) y determinando la actividad residual en Tris-HCl a 10 mM, pH 7,4, NaCl a 150 mM, MgCl2 a 10 mM, CaCl2 a 1 mM, SAB al 0,1% y Trit6n-X100 al 0,01%. La actividad de la calicreina plasmatica humana se midi6 con el sustrato fluor6geno Z-Phe-Arg-AMC (Bachem,
35 Bubendorf, Suiza) a una concentraci6n de 100 IM en un lector de placas de fluorescencia Spectramax Gemini (excitaci6n a 355 nm, lectura de la emisi6n a 460 nm; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.). La actividad de la catepsina G humana se midi6 con el sustrato colorimetrico N-Suc-Ala-Ala-Phe-Pro-pNA (Bachem, Bubendorf, Suiza) a una concentraci6n de 1 mM con un lector de placas de absorci6n Spectramax (lectura a 410 nm; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.).
40 Sintesis quirica ie peptiios biciclicos
Peptidos con una amina libre en el extremo amino y una amida en el extremo carboxilo se sintetizaron quimicamente a una escala a 25 mg mediante quimica en fase s6lida (JPT Peptide Technologies, Berlin, Alemania). Los peptidos brutos en 1 ml de NH4HCO3 al 70%, pH 8, y ACN al 30% (1 mM) se hicieron reaccionar con TBMB (1,2 mM) durante 1 hora a TA. El producto de reacci6n se purific6 mediante cromatografia liquida de
45 gran resoluci6n (HPLC) de fase inversa con una columna C18 y eluci6n en gradiente con una fase m6vil compuesta de una soluci6n de ACN y acido trifluoroacetico (TFA) acuoso al 0,1% a una velocidad de flujo de 2 ml/min. Los peptidos purificados se liofilizaron y disolvieron en DMSO o en un tamp6n de Tris-HCl a 50 mM, pH 7,8, y NaCl a 150 mM para las mediciones de actividad.
Clonaci6n y expresi6n ie las proteinas ie fusi6n peptiio-D12
50 Los dominios D1-D2 de la g3p (que comprende los restos de aminoacidos 2 a 217 de la fd-g3p madura) con y sin el peptido
fusionado al extremo amino se expresaron en E.coli. El vector de expresi6n basado en pUC119 con una secuencia lider y el gen de D1-D2 con una etiqueta de hexa-histidinas en el extremo carboxilo (aqui denominado pUC119H6D12) fue proporcionado generosamente por Phil Holliger del Laboratorio de Biologia Molecular (LMB) de Cambridge. Se clon6 un plasmido para la expresi6n de D1-D2 con el peptido en el extremo 55 amino mediante amplificaci6n por PCR del gen de D1-D2 con los cebadores pepd12ba (que codifica la secuencia peptidica) y d12fo y la ligaci6n en el vector pUC119H6D12 digerido con Sfil/Notl. El gen para la expresi6n de D1-D2
sin puentes disulfuro con un total de 20 aminoacidos se amplific6 por PCR a partir del vector fdg3p0ss21 con alguna de las parejas de cebadores d120ssba/d120ssfo, pepd120ssba/d120ssfo, P2cd120ssba/d120ssfo o P1cd120ssba/d120ssfo y se lig6 en Sfil/Notl en el pUC119H6D12 para la expresi6n del D1-D2 sin puentes disulfuro
5 Las 6 proteinas se expresaron en las celulas de E. coli TG1 a 30 oC durante 8 horas y se purific6 la fracci6n periplasmatica de manera escalonada mediante cromatografia de afinidad de Ni y filtraci6n en gel en una columna Superdex 75 en HN4HCO3, pH 7,4.
Analisis espectroretrico ie rasas ie las proteinas ie fusi6n peptiio-D12
La masa molecular de las proteinas (5 a 20 IM) antes y despues de la modificaci6n con TBMB se determin6
10 desnaturalizando las proteinas en 4 volumenes de MeOH al 50% y acido f6rmico al 1%, y mediante el analisis en un espectr6metro de masas de tiempo de vuelo con ionizaci6n por electropulverizaci6n (Micromass, Milford, MA, EE.UU.). Se obtuvieron las masas moleculares por desconvoluci6n de los espectros de masas de las proteinas con varias cargas utilizando la versi6n 4.1 de MassLynx.
Creaci6n ie la genoteca 1 ie peptiios en fagos
15 Los genes que codifican un peptido semialeatorio con la secuencia Ala-Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys, el conector Gly-Gly-Ser-Gly y los dos dominios sin puentes disulfuro D1 y D2 se clonaron en la orientaci6n correcta en el vector fagico fd0D12 para obtener la genoteca en fagos 1. El vector fd0D12, que carece de los genes de los dominios D1 y D2 del gen 3 y que tiene un segundo sitio de restricci6n SfiI que se cre6 previamente mediante la amplificaci6n por PCR del plasmido fdg3p0ss21 completo utilizando los cebadores ecoG3pNba y pelbsfiecofo. Los
20 genes que codifican el repertorio de peptidos y los dos dominios del gen 3 se crearon escalonadamente en dos PCR consecutivas. Primero, los genes D1 y D2 se amplificaron por PCR con los dos cebadores prepcr y sfi2fo con el vector fdg3p0ss21 como plantilla. Segundo, el ADN que codifica los peptidos aleatorios se anadi6 en una PCR con los cebadores sficx6ba y sfi2fo. La ligaci6n de 33 y 9 Ig del plasmido fd0D12 digerido con Sfil y el producto de PCR produjo 4,4 x 109 colonias en 12 placas de 20 x 20 cm de 2YT con cloranfenicol (30 Ig/ml). Se rasparon
25 colonias de las placas con medio 2YT, complementado con glicerol al 15% y se almacenaron a �80 oC. Se diluyeron las reservas en glicerol a una DO600 = 0,1 en cultivos de 1 l de 2YT/cloranfenicol (30 Ig/ml) y los fagos se expresaron a 30 oC durante una noche (12 a 16 horas).
Biotinilaci6n ie los antigenos
La calicreina plasmatica humana (activada con el factor XIIa) se compr6 a Innovative Research (Southfiled, MI,
30 EE.UU.) y se biotinil6 a una concentraci6n de 1,2 IM con un exceso molar de 5 veces de Sulfo-NHS-LC-biotina (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.) en PBS, pH 7,4, y DMSO al 5% a TA durante una hora. La proteina biotinilada se purific6 en una columna PD-10 con un tamp6n de NaAC a 50 mM, pH 5,5, y NaCl a 200 mM. La catepsina G humana se compr6 ya biotinilada a Lee Biosolutions (San Louis, MI, EE.UU.).
Subclonaci6n y escrutinio ie la expresi6n ie los clones seleccionaios ie fagos
35 El ADN plasmidico de los clones seleccionados despues de la segunda y tercera rondas de biocribado se amplific6 por PCR en un solo tubo con los cebadores 21seqba y flagfo, y se clon6 en el vector pUC119H6D12 en los sitios Sfil y Notl para la expresi6n periplasmatica de los peptidos fusionados a los dominios D1-D2 sin puentes disulfuro con una etiqueta FLAG y una etiqueta de hexa-histidinas en el extremo carboxilo. Los plasmidos ligados se electroporaron en las celulas TG1 y se sembraron en placas de 2YT/ampicilina (100 Ig/ml). Los clones que
40 expresaban la proteina recombinante se identificaron como sigue: el medio (2YT con ampicilina a 100 Ig/ml) en placas de 96 pocillos profundos (1 ml/pocillo) se inocul6 con celulas de colonias diferentes y se incub6 a 37 oC. Se indujo la expresi6n de las proteinas con IPTG a 1 mM cuando los cultivos eran turbios y se agitaron las placas a 300 rpm a 30 oC durante una noche. Se sedimentaron las celulas mediante centrifugaci6n a 3500 rpm durante 30 minutos, se lisaron y se lavaron con tamp6n de lavado que contenia lisozima a 1 mg/ml y se centrifugaron a 3500
45 rpm para sedimentar los residuos celulares. Los sobrenadantes se transfirieron a placas Polysorp de 96 pocillos (Nunc. Roskilde, Dinamarca) para la absorci6n inespecifica. Los pocillos se enjuagaron dos veces con tamp6n de lavado que contenia Tween 20 al 0,1% y se bloquearon con tamp6n de lavado que contenia SAB al 1% y Tween 20 al 0,1% durante 1 hora. El conjugado anti-FLAG M2-peroxidasa (Sigma-Aldrich, San Louis, MO, EE.UU.) se diluy6 1:5000 y se bloque6 en tamp6n de lavado que contenia SAB al 1% y Tween 20 al 0,1%, y se anadi6 a las placas
50 durante 1 hora. Se lavaron los pocillos (5 veces con tamp6n de lavado que contenia Tween 20 al 0,1% y una vez sin detergente) y la peroxidasa unida se detect6 con la soluci6n de TMB, su sustrato (eBiosciences, San Diego, EE.UU.). El ADN plasmidico de los clones que expresan la proteina se secuenci6 (GeneServices, Cambridge, Reino Unido).
Maiuraci6n ie la afiniiai ie los inhibiiores ie la calicreina plasratica hurana
Se crearon tres genotecas de peptidos en fagos esencialmente como la genoteca 1 (vease mas arriba), pero con los cebadores degenerados sficx6abc (genoteca 2), sficx6abb (genoteca 3) y sficx6aba (genoteca 4) en vez del sficx6ba. La electroporaci6n de las reacciones de ligaci6n en las celulas TG1 produjo 9,5 x 108 (genoteca 2), 1,1 x
5 109 (genoteca 3) y 1,2 x 109 (genoteca 4) transformantes. Los fagos de cada genoteca se produjeron en cultivos de 1 l, se purificaron, se agruparon y se hicieron reaccionar con TBMB. Se realizaron tres ciclos de cribado esencialmente como en las selecciones descritas en al apartado de materiales y metodos, pero con la calicreina plasmatica humana biotinilada a una concentraci6n inferior (1 nM en la primera y segunda rondas, 200 pM en la tercera ronda).
10 Meiici6n ie la activiiai y ie la especificiiai ie los inhibiiores ie la calicreina plasratica hurana
Se determinaron las actividades inhibidoras (CI50) con la medici6n de la actividad residual de la enzima tras la incubaci6n (30 min, TA) con diferentes concentraciones del inhibidor (que oscila tipicamente de 10 IM a 0,5 nM). La actividad de la calicreina plasmatica humana (0,1 nM) y del factor Xla (0,8 nM; Innovative Research, Southfiled, MI, EE.UU.,) se midieron con Z-Phe-Arg-AMC (100 IM) y la actividad de la trombina humana (2 nM; Innovative 15 Research, Southfiled, MI, EE.UU.), con Boc-Phe-Ser-Arg-AMC (100 IM) en Tris-HCl a 10 mM, pH 7,4, NaCl a 150 mM, MgCl2 a 10 mM, CaCl2 a 1 mM, SAB al 0,1%, Triton X-100 al 0,01% y DMSO al 5%. La calicreina plasmatica recombinante de rat6n de R & D Systems (Minneapolis, MN, EE.UU.) con un peptido senal se activ6 proteoliticamente con termolisina a 0,5 mg/ml a 37 oC durante 1 hora. Se midi6 la actividad de la calicreina plasmatica de rat6n (3 nM) con Z-Phe-Arg-AMC (100 IM) en Tris-HCl a 50 mM, pH 7,5, CaCl2 a 10 mM, NaCl a
20 250 mM, SAB al 0,1%, Triton X-100 al 0,01% y DMSO al 5%. El inhibidor que tiene hidrolizado un lazo de uni6n se gener6 mediante la incubaci6n del peptido PK15 modificado con TBMB con la calicreina plasmatica humana a una proporci6n molar de 5:1 durante 24 horas a 37 oC y la posterior inactivaci6n por calor de la enzima a 60 oC (30 min). Se calcularon los valores de Ki aparentes de acuerdo con la ecuaci6n de Cheng y Prusoff.
Meiici6n ie la activaci6n iel factor �II en el plasra hurano
25 El plasma humano normal de donantes diferentes se adquiri6 a 3H Biomedical (Upsala, Suecia). El plasma se centrifug6 a 1500xg a 20 oC durante 15 minutos para obtener plasma pobre en plaquetas (PPP). Se conservaron las alicuotas del PPP en tubos de polipropileno a �80 oC. Se prepararon muestras de PPP de 60 Il con 5, 50, 500
o 5000 nM de aprotinina (Roche, Mannheim, Alemania) o el peptido PK15 modificado con TBMB. La activaci6n del factor XIIa se midi6 como sigue. Se anadieron 2 Ig de caolin a las muestras plasmaticas, se mezclaron bien y se 30 incubaron durante 20 minutos a 37 oC. Se diluyeron las muestras 250 veces en Tris-HCl a 50 mM, pH 7,8, y NaCl a 150 mM. La actividad de tipo calicreina plasmatica se midi6 con el sustrato crom6geno H-D-Pro-Phe-Arg-pNA (100 IM; Bachem, Bubendorf, Suiza) utilizando un lector de placas de absorci6n (absorci6n a 450 nm; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.). El mismo sustrato crom6geno tambien lo reconoce y modifica la calicreina plasmatica. Sin embargo, a las concentraciones requeridas del inhibidor para reducir la actividad del factor XIIa al
35 50% (160 nM para el peptido PK15 modificado con TBMB y 5 IM para la aprotinina), la calicreina plasmatica se inhibe esencialmente y no se puede medir con el sustrato.
Deterrinaci6n ie la estructura iel peptiio PK15 roiificaio con TBMB
Se disolvi6 1 mg del peptido PK15 modificado con TBMB en 550 Il de Tris-HCl deuterado a 10 mM, pH 6,6, NaCl a 150 mM, MgCl2 a 10 mM y CaCl2 a 1 mM para obtener una concentraci6n de inhibidor de 1 mM. Se leyeron los
40 espectros del inhibidor a 800 MHz (Bruker Advance con una criosonda de TCI). Las asignaciones espectrales se basaron en los espectros de TOCSY y de NOESY. Habia en total 199 restricciones NOE, 77 de las cuales eran entre residuos, y 122 intraresiduales. La estructura mostrada en la figura 6 es la estructura promediada de la estructura calculada para 50 conform6meros. Se utiliz6 el programa PyMOL para el analisis de la estructura y la visualizaci6n de los modelos moleculares.
Bibliograf�a para el apartado de materiales y metodos:
1.
Wu, P., Leinonen, J., Koivunen, E., Lankinen, H. y Stenman. U. H. Identification of novel prostate-specific antigen-binding peptides modulating its enzyme activity. Eur J Biocher 267, 6212-20 (2000).
2.
Hekim, C. et al. Novel peptide inhibitors of human kallikrein 2. J Biol Cher 281, 12555-60 (2006).
50 3. Hansen, M. et al. A urokinase-type plasminogen activator-inhibiting cyclic peptide with an unusual P2 residue and an extended protease binding surface demonstrates new modalities for enzyme inhibition. J Biol Cher 280, 38424-37 (2005).
4. Andersen, L. M., Wind, T., Hansen, H. D. y Andreasen, P. A. A cyclic peptidylic inhibitor of murine urokinasetype plasminogen activator: changing species specificity by substitution of a single residue. Biocher J 412, 447-57 (2008).
5 5. Krook, M., Lindbladh, C., Eriksen, J. A. y Mosbach, K. Selection of a cyclic nonapeptide inhibitor to alphachymotrypsin using a phage display peptide library. Mol Divers 3, 149-59 (1997).
6.
Dennis, M. S. et al. Peptide exosite inhibitors of factor Vlla as anticoagulants. Nature 404, 465-70 ( 2000).
7.
Huang, L. et al. Novel peptide inhibitors of angiotensin-converting enzyme 2. J Biol Cher 278, 15532-40 (2003).
8.
Karasseva, N. G., Glinsky, V. V., Chen, N. X., Komatireddy, R. y Quinn, T. P. Identification and characterization
10 of peptides that bind human ErbB-2 selected from a bacteriophage display library. J Protein Cher 21, 287-96 (2002).
9. Houimel, M., Mach, J. P., Corthesy-Theuloz, l., Corthesy, B. y Fisch, I. New inhibitors of �elicobacter pylori urease holoenzyme selected from phage-displayed peptide libraries. Eur J Biocher 262. 774-80 (1999).
10. Lunder, M., Bratkovic, T., Kreft, S. y Strukelj, B. Peptide inhibitor of pancreatic lipase selected by phage display 15 using different elution strategies. J Lipii Res 46, 1512-6 (2005).
11.
Sanschagrin, F. y Levesque, R. C. A specific peptide inhibitor of the class B metallo-beta-lactamase L-1 from Stenotrophoronas raltophilia identified using phage display. J Antiricrob Cherother 55, 252-5 (2005).
12.
Sperinde. J. J., Choi, S. J. y Szoka, F. C., Jr. Phage display selection of a peptide DNase II inhibitor that enhances gene delivery. J Gene Mei 3, 101-8 (2001).
Bibliograf�a del ejemplo �
1. H�ser, J. �igh-Throughput Screening in Drug Discovery (eds. Mannhold, R., Kubinyi. H. y Folkers, G.) (Wiley-VCH, Weinheim, 2006).
2. Bleicher, K. H., Bohm, H. J., Muller, K. y Alanine, A. I. Hit and lead generation: beyond high-throughput 25 screening. Nat Rev Drug Discov 2, 369-78 (2003).
3.
Marks, J. D., Hoogenboom, H. R., Griffiths, A. D. y Winter, G. Molecular evolution of proteins on filamentous phage. Mimicking the strategy of the immune system. J Biol Cher 267, 16007-10 (1992).
4.
Jespers, L. S., Roberts, A., Mahler, S. M., Winter, G. y Hoogenboom, H. R. Guiding the selection of human
antibodies from phage display repertoires to a single epitope of an antigen. Biotechnology �N �� 12, 899-903 30 (1994).
5.
Hudson, P. J. y Souriau, C. Engineered antibodies. Nat Mei 9. 129-34 (2003).
6.
Doyon, J. B., Snyder, T. M. y Liu, D. R. Highly sensitive in vitro selections for DNA-linked synthetic small molecules with protein binding affinity and specificity. J Ar Cher Soc 125, 12372-3 (2003).
7.
Woiwode, T. F. et al. Synthetic compound libraries displayed on the surface of encoded bacteriophage. Cher 35 Biol 10, 847-58 (2003).
8.
Brenner, S. y Lerner, R. A. Encoded combinatorial chemistry. Proc Natl Acai Sci USA 89, 5381-3 (1992).
9.
Halpin, D. R. y Harbury, P. B. DNA display ll. Genetic manipulation of combinatorial chemistry libraries for smallmolecule evolution. PLoS Biol 2, E174 (2004).
10.
Jespers, L., Bonnert, T. P. y Winter, G. Selection of optical biosensors from chemisynthetic antibody libraries. 40 Protein Eng Des Sel 17, 709-13 (2004).
11.
Jespers, L. S. A., Winter, G. P., Bonnert, T. P. y Simon, T. M. (PCT/GB94/01422).
12.
Timmerman, P., Beld, J., Puijk, W. C. y Meloen, R. H. Rapid and quantitative cyclization of multiple peptide 48
loops onto synthetic scaffolds for structural mimicry of protein surfaces. Cherbiocher 6, 821-4 (2005).
13.
Driggers, E. M., Hale, S. P., Lee, J. y Terrett, N. K. The exploration of macrocycles for drug discovery: an underexploited structural class. Nat Rev Drug Discov 7, 608-24 (2008).
14.
Wessjohann, L. A., Ruijter, E., Garcia-Rivera, D. y Brandt, W. What can a chemist learn from nature's 5 macrocycles� A brief, conceptual view. Mol Divers 9, 171-86 (2005).
15. Kemp, D. S. y McNamara, P. E. Conformationally restricted cyclic nonapeptides derived from L-cysteine and LL-3-amino-2-piperidino-6-carboxylic acid (LL-acp), a potent b-turn-inducing dipeptide analogue. Journal of Organic Cheristry 50, 5834-5838 (1985).
16.
Kather, I., Bippes, C. A. y Schmid, F. X. A stable disulfide-free gene-3-protein of phage fd generated by in vitro 10 evolution. J Mol Biol 354, 666-78 (2005).
17.
Cheng, Y. y Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (Ki) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biocher Pharracol 22, 3099-108 (1973).
18.
Cremlyn, R. J. An introiuction to organosulfur cheristry (Wiley, 1996).
19.
Huang, L. et al. Novel peptide inhibitors of angiotensin-converting enzyme 2. J Biol Cher 278, 15532-40 15 (2003).
20.
Dennis, M. S. et al. Peptide exosite inhibitors of factor Vlla as anticoagulants. Nature 404, 465-70 (2000).
21.
Jackson, D. Y. et al. A designed peptide ligase for total synthesis of ribonuclease A with unnatural catalytic residues. Science 266, 243-7 (1994).
22.
Abbenante, G. y Fairlie, D. P. Protease inhibitors in the clinic. Mei Cher 1, 71-104 (2005). 20 23. Turk, B. Targeting proteases: successes, failures and future prospects. Nat Rev Drug Discov 5, 785-99 (2006).
24.
Melkko, S., Scheuermann. J., Dumelin, C. E. y Neri, D. Encoded self-assembling chemical libraries. Nat Biotechnol 22, 568-74 (2004).
25.
Li, S. y Roberts, R. W. A novel strategy for in vitro selection of peptide-drug coniugates. Cher Biol 10, 233-9 (2003).
25 26. Millward. S. W., Takahashi, T. T. y Roberts, R. W. A general route for post-translational cyclization of mRNA display libraries. J Ar Cher Soc 127, 14142-3 (2005).
27. Millward. S. W., Fiacco, S., Austin, R. J. y Roberts, R. W. Design of cyclic peptides that bind protein surfaces with antibody-like affinity. ACS Cher Biol 2, 625-34 (2007).
Todas la publicaciones mencionadas en la especificaci6n anterior se incorporan en la presente memoria por
30 referencia. Las distintas modificaciones y variaciones de los aspectos descritos y de las realizaciones de la presente invenci6n seran obvios para los expertos en la tecnica sin separarse del alcance de la presente invenci6n. Aunque la presente invenci6n se ha descrito en conexi6n con realizaciones preferentes especificas, se debe entender que la invenci6n, tal y como se reivindica, no debe estar indebidamente limitada a tales realizaciones especificas. De hecho, se pretende que se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones anejas las
35 diferentes modificaciones de los modos descritos para realizar la invenci6n, los cuales son obvios para los expertos en la tecnica.
LISTA DE SECUENCIAS
Secuencia de cebadores de ADN
5 Los sitios de restricci6n de nucleasa estan subrayados pepd12ba
d120ssfo
15 pepd120ssba
p2cd120ssba
plcd120ssba
ecoG3pNba
pelbsfiecofo
25 prepcrba
sficx6ba
flagfo
sficx6aba sficx6abb
sficx6abc
Las secuencias de peptidos son tal y como se describe en la secci6n de ejemplos Secuencias de cebadores de ADN del Ejemplo 8 Los sitios de restricci6n de nucleasa estan subrayados
pepd12ba
5'-CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCCTGTGGTC TGGCTGGGTTCCGGCTGTGGCAGAAAGAGTTG-3'
d12ba
5'-GAGTCATTCTGCGGCCGCATTGACAGGAGGTTGAGGCAGGTA-3'
d120ssba
5'-CATGCCATGACTCGGGGCCCAGCCGGCCATGGCTGAAACTGTTGAAAGTAG-3'
d120ssba
5'-GAGTCATTCTGCGGCCGGATTGACAAGGAGGTTGAGGCAGGTA-3'
pepd120ssba
5'-CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGTGTCCCTCTCGGCTGCCCTTCCGGCTGTCCTGGCTGAAACTGTTGAAAGTAG -3'
p2cd120ssba
5'-CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGGGCTCTGGCTTGCGGTTCCGGCTGTGCTGAAACGTTGAAAGTAG-3'
plod120ssba
5'-CTCGCGGCCTAGCCGCCATGGCATGGCAGCCCCCTCTGGAAAGGTTCCGGCTCTGGGTCTTGAAAGTA-3'
ocog3pttoo
5'-GCATGAATTCCAGTCAGTACGGCCTCGGGCGCCATGGCTTCTGGTACCCCGTTAAC-3'
po
5'GCATGAATTCCGATCCGAGCCGGTGGGCCCATAGGGAAAGGCAACTAAAGGAAT-3'
propotoo
5'-GGCGGTTCTGGCGTGAAACTCTTGAAAGTAG-3'
d121o
5'-GAAGCCATGGCCCCCGAGGCCCCCGAGCCGAGCATTGACAGG-3'
uficarbo
5'-TATGCGGCCCGCCCAGCCGCCATGGCTCGAGCGTGC5'-GAGTCATTCTGCGGCCGCATTGACAGGAGGTTGAGGCAGGTG-3'
nopto
5'-GATTCTGCGGCCGCATTGATAGGAGGTTGAGGCAGGTA-3'
dic
5'-TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCACCTGC GGCCGCATTGACAGGAG GCCCGCATTAATTGGACCCCGTGTGGCCGGCCCTTCTGGCCGCTG-3'
disc
5'-TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCACCTGCAGCGTTGTGGCGCCGTGGCCAGCGGCTGGC CTGTGGCGCCGTTCTGGCGCCTGG-3'
eficxdssba
5'TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGTGTCTAGCGATCGTTTTCGTAAT

Claims (20)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Complejo que comprende una particula de fago, comprendiendo dicha particula de fago
    (i) un acido nucleico que codifica un polipeptido;
    (ii) el polipeptido expresado por el acido nucleico de (i) y expuesto en la superficie del fago; 5 (iii) un compuesto conector unido a dicho polipeptido
    en el que dicho compuesto conector esta unido al polipeptido mediante al menos tres enlaces covalentes independientes.
  2. 2. Complejo de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que el compuesto conector tiene una simetria molecular que corresponde al numero de enlaces covalentes mediante los cuales se une al polipeptido.
    10 3. Complejo de acuerdo con la reivindicaci6n 2, en el que el compuesto conector posee simetria molecular ternaria y el compuesto conector esta unido al polipeptido mediante tres enlaces covalentes.
  3. 4. Complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto conector comprende un grupo quimico estructuralmente rigido.
  4. 5.
    Complejo de acuerdo con la reivindicaci6n 4, en el que el compuesto conector comprende 15 tris(bromometil)benceno (TBMB).
  5. 6. Complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho polipeptido comprende un resto de cisteina, y en donde al menos uno de dichos tres enlaces covalentes independientes para la uni6n de dicho compuesto conector al polipeptido comprende un enlace a dicho resto de cisteina.
  6. 7.
    Genoteca de polipeptidos codificados geneticamente, que comprende al menos dos complejos diferentes de 20 acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
  7. 8. Metodo para fabricar un complejo, comprendiendo dicho metodo
    (i)
    el aporte de una particula de fago que comprende un acido nucleico, y un polipeptido expresado por el acido nucleico y expuesto sobre la particula del fago;
    (ii)
    el aporte de un compuesto conector
    25 (iii) la uni6n de dicho compuesto conector a dicho polipeptido mediante la formaci6n de al menos tres enlaces covalentes entre dicho compuesto conector y el polipeptido.
  8. 9. Metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 8, en el que los grupos reactivos del polipeptido expuesto en la particula de fago estan reducidos, y en el que las particulas de fagos que exponen el polipeptido que comprende grupos reactivos reducidos se purifica por filtraci6n antes de la etapa (iii).
    30 10. Metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 9, en el que despues de la etapa de purificaci6n por filtraci6n se mantiene el polipeptido en el estado reducido para formar un enlace con el compuesto conector mediante la incubaci6n en tamp6n desgasificado y en presencia de un quelante.
  9. 11. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que la etapa (iii) comprende la
    incubaci6n del polipeptido y del compuesto conector juntos a 30 oC a pH 8 en tamp6n acuoso que comprende 35 acetonitrilo.
  10. 12.
    Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que el compuesto conector comprende tris-(bromometil)benceno (TBMB).
  11. 13.
    Metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 12, en el que el tris-(bromometil)benceno esta presente a 10 IM.
  12. 14. Metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 13, en el que el quelante es el acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), 40 el acetonitrilo esta presente al 20% y la etapa de incubaci6n (iii) se realiza durante 1 hora.
  13. 15.
    Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, comprendiendo dicho metodo la etapa adicional de (iv) escindir uno o mas enlaces de la cadena polipeptidica.
  14. 16.
    Metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 15, en el que dicha etapa de escisi6n comprende poner en contacto 52
    dicho polipeptido con una proteasa.
  15. 17.
    Complejo obtenido mediante el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16.
  16. 18.
    Metodo para identificar un complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es capaz de fijarse a un ligando, comprendiendo el metodo
    5 (i) el aporte de un complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores
    (ii) puesta en contacto de dicho complejo con el ligando, y
    (iii) selecci6n de los complejos que se fijan a dicho ligando.
  17. 19. Metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 18, que ademas comprende la determinaci6n de la secuencia del acido nucleico de dicho complejo.
    10 20. Metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 18, que ademas comprende la etapa de fabricar el complejo aislado con capacidad para fijarse a dicho ligando.
  18. 21. Metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 18, que ademas comprende la etapa de fabricar un conjugado entre el compuesto conector y el polipeptido que se aisla o identifica mediante un metodo de la invenci6n, comprendiendo dicha fabricaci6n la uni6n del compuesto conector al polipeptido, en donde dicho polipeptido se expresa
    15 recombinantemente o se sintetiza quimicamente.
  19. 22. Metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 21, que ademas comprende la etapa de extender el polipeptido en uno
    o mas del extremo amino o del extremo carboxilo del polipeptido.
  20. 23. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 21 o 22, que ademas comprende la etapa de conjugar a un polipeptido adicional dicho conjugado de polipeptido y compuesto conector.
    20 24. Metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 23, en el que dicha conjugaci6n se realiza
    (i)
    anadiendo otra cisteina al polipeptido despues de enlazarse con el compuesto conector, y
    (ii)
    conjugando dicho polipeptido a dicho polipeptido adicional mediante la formaci6n de puente disulfuro con dicha cisteina adicional.
    lazo al lazo al azar 1 azar 2
    secuencia lider peptido conector
    Mutante: Secuencia de aminoacidos: CI50 (nM):
    Mutante: Secuencia de aminoacidos: CI50 (nM):
    Genoteca 2 Genoteca 3 Genoteca 4
    secuencia lider
    peptido conector
    Mutante:
    Secuencia de aminoacidos: CI50 (nM):
    5( d j6 d 6
    Concentraci6n del inhibidor (nM)
    Actividad de tipo calicreina (pmol pNA/min � ml)
    Trombina (nM) Trombina (nM)
    aprotinina
    Tiempo (min) peptido PK15
    Tiempo (min)
    aprotinina peptido PK15
    Concentraci6n de inhibidor (nM)
    lazo al lazo al azar 1 azar 2
    secuencia lider peptido conector
    Mutante: Secuencia de aminoacidos: CI50 (nM):
    Mutante: Secuencia de aminoacidos: CI50 (nM):
    Genoteca 2 Genoteca 3 Genoteca 4
    secuencia lider
    peptido conector
    Mutante:
    Secuencia de aminoacidos: CI50 (nM):
    Concentraci6n del inhibidor (nM)
    A
    25424,80 25310,00
    masa
    25450,2025336,00
    masa
    masa
    aprotinina peptido PK15
    Concentraci6n de inhibidor (nM)
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Families Citing this family (139)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0913775D0 (en) 2009-08-06 2009-09-16 Medical Res Council Multispecific peptides
GB0914110D0 (en) * 2009-08-12 2009-09-16 Medical Res Council Peptide libraries
JP2013518558A (ja) * 2010-02-04 2013-05-23 メディカル リサーチ カウンシル 構造化されたペプチドプロセシング
JP2013518807A (ja) * 2010-02-04 2013-05-23 メディカル リサーチ カウンシル 多重特異性ペプチド
GB201012410D0 (en) 2010-07-23 2010-09-08 Medical Res Council Intracellular immunity
CN107058285A (zh) 2010-08-13 2017-08-18 米蒂生物系统有限公司 修饰肽的展示
GB201013980D0 (en) 2010-08-20 2010-10-06 Ecole Polytech Bicyclic uPA inhibitors
EP2726101B1 (en) 2011-06-30 2018-08-08 Genzyme Corporation Inhibitors of t-cell activation
GB201117428D0 (en) 2011-10-07 2011-11-23 Bicycle Therapeutics Ltd Structured polypeptides with sarcosine linkers
PT2764140T (pt) * 2011-10-07 2017-12-07 Bicycle Therapeutics Ltd Modulação da especificidade do polipéptida estruturado
US9958437B2 (en) 2012-02-03 2018-05-01 The Governors Of The University Of Alberta Method of quantifying peptide-derivative libraries using phage display
GB201202268D0 (en) 2012-02-09 2012-03-28 Medical Res Council Intracellular immunity
CN104507500A (zh) 2012-05-10 2015-04-08 麻省理工学院 流感中和药剂
CA2879994C (en) 2012-08-07 2023-03-21 Massachusetts Institute Of Technology Anti-dengue virus antibodies and uses thereof
DK3456734T3 (da) 2012-10-04 2022-04-19 Res Found Dev Serinproteasemolekyler og behandlinger
JP6408480B2 (ja) 2012-11-30 2018-10-17 ノバルティス アーゲー ジスルフィドを含むタンパク質から複合体を調製する方法
GB201306623D0 (en) * 2013-04-11 2013-05-29 Bicycle Therapeutics Ltd Modulation of structured polypeptide specificity
EP2999483B1 (en) * 2013-05-23 2018-10-31 Ohio State Innovation Foundation Chemical synthesis and screening of bicyclic peptide libraries
US10526375B2 (en) 2013-06-05 2020-01-07 Massachusetts Institute Of Technology Human Adaptation of H7 HA
MX368016B (es) 2013-08-14 2019-09-13 Univ Rice William M Derivados de uncialamicina, métodos de sintesis y su uso como agentes antitumor.
WO2015063465A2 (en) * 2013-10-28 2015-05-07 Bicycle Therapeutics Limited Novel polypeptides
BR112016017764A2 (pt) 2014-02-11 2017-10-10 Massachusetts Inst Technology anticorpo antidengue de amplo espectro
US10822604B2 (en) 2014-05-02 2020-11-03 Morphosys Ag Peptide libraries
GB201413086D0 (en) 2014-07-23 2014-09-03 Imp Innovations Ltd And Inst Pasteur Methods
CA2965380A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 The Governors Of The University Of Alberta Genetic encoding of chemical post-translational modification for phage-displayed libraries
KR20230133938A (ko) 2014-10-29 2023-09-19 바이시클러드 리미티드 Mt1-mmp에 특이적인 바이사이클릭 펩타이드 리간드
KR101693665B1 (ko) * 2014-11-13 2017-01-06 목포해양대학교 산학협력단 설치와 철거가 용이한 구조를 가지는 기초의 세굴방지장치 및 이를 이용한 기초의 세굴방지방법
MA41022A (fr) 2014-11-24 2017-10-03 Shire Human Genetic Therapies Ciblage lysosomial et utilisations correspondantes
JP6609099B2 (ja) 2014-12-10 2019-11-20 キヤノン株式会社 放射線検出装置、及び放射線検出シート
DK3237614T3 (da) 2014-12-22 2019-09-09 Lanthiopep Bv Nye fremgangsmåder til fremvisning af cyklisk peptider på overfladen af bakteriofagpartikler
US20160312212A1 (en) * 2015-04-23 2016-10-27 Roche Sequencing Solutions, Inc. Cow antibody scaffold polypeptide method and composition
JP2015214568A (ja) * 2015-07-13 2015-12-03 バイスクル・セラピューティクス・リミテッド 多重特異性ペプチド
DK3417058T3 (da) 2016-02-16 2021-11-15 Res Found Dev Sortase-modificerede molekyler og anvendelser deraf
GB201607827D0 (en) 2016-05-04 2016-06-15 Bicycle Therapeutics Ltd Bicyclic peptide-toxin conjugates specific for MT1-MMP
EP3467107B1 (en) 2016-06-07 2022-06-01 Kaneka Corporation Ribosome display complex and production method therefor
US11351222B2 (en) 2016-11-09 2022-06-07 Ohio State Innovation Foundation Di-sulfide containing cell penetrating peptides and methods of making and using thereof
WO2018098226A1 (en) 2016-11-22 2018-05-31 Ohio State Innovation Foundation Bicyclic peptidyl inhibitor of tumor necrosis factor-alpha
WO2018098282A2 (en) 2016-11-22 2018-05-31 Ohio State Innovation Foundation Cyclic cell penetrating peptides comprising beta-hairpin motifs and methods of making and using thereof
EP3544621A1 (en) 2016-11-27 2019-10-02 BicycleRD Limited Methods for treating cancer
US11192918B2 (en) 2016-12-06 2021-12-07 Stichting Voor De Technische Wetenschappen Multicyclic peptides and methods for their preparation
MX2019007367A (es) * 2016-12-23 2020-01-27 Bicycletx Ltd Ligandos de peptido para enlace a mt1-mmp.
CN110603261A (zh) * 2016-12-23 2019-12-20 拜斯科阿迪有限公司 具有新型键结构的肽衍生物
EP3565638B8 (en) 2017-01-06 2024-04-10 BicycleRD Limited Bicycle conjugate for treating cancer
GB201706477D0 (en) 2017-04-24 2017-06-07 Bicycle Therapeutics Ltd Modification of polypeptides
WO2018197893A1 (en) 2017-04-27 2018-11-01 Bicycletx Limited Bicyclic peptide ligands and uses thereof
EP3635115A1 (en) 2017-06-09 2020-04-15 Vib Vzw Glutamine dehydrogenase inhibitors for use in muscle regeneration
WO2019002842A1 (en) 2017-06-26 2019-01-03 Bicyclerd Limited BICYCLIC PEPTIDE LIGANDS WITH DETECTABLE FRACTIONS AND USES THEREOF
US11332526B2 (en) 2017-07-17 2022-05-17 Vib Vzw Targeting synaptogyrin-3 in tauopathy treatment
US11261214B2 (en) * 2017-08-04 2022-03-01 Bicycletx Limited Bicyclic peptide ligand specific for CD137
US20200291096A1 (en) 2017-08-14 2020-09-17 Bicyclerd Limited Bicyclic peptide ligand sting conjugates and uses thereof
US20200283482A1 (en) 2017-08-14 2020-09-10 Bicyclerd Limited Bicyclic peptide ligand prr-a conjugates and uses thereof
WO2019081714A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 Vib Vzw POSITIVE MACROPHAGES TO PODOPLANIN
GB201721265D0 (en) 2017-12-19 2018-01-31 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligands specific for EphA2
TWI825046B (zh) 2017-12-19 2023-12-11 英商拜西可泰克斯有限公司 Epha2特用之雙環胜肽配位基
EP3752200A1 (en) 2018-02-13 2020-12-23 Vib Vzw Targeting minimal residual disease in cancer with rxr antagonists
JP2021514953A (ja) 2018-02-23 2021-06-17 バイスクルテクス・リミテッド 多量体二環式ペプチドリガンド
MX2020010444A (es) 2018-04-04 2021-01-08 Bicycletx Ltd Complejos de péptidos bicíclicos en heterotándem.
EP3790890A4 (en) 2018-05-09 2022-03-02 Ohio State Innovation Foundation CYCLIC PEPTIDES OF CELL PENETRATION WITH ONE OR MORE HYDROPHOBIC RESIDUES
GB201808835D0 (en) * 2018-05-30 2018-07-11 Bicyclerd Ltd Ligands and methods of selecting binding targets for such
GB201810329D0 (en) * 2018-06-22 2018-08-08 Bicycletx Ltd Peptide ligands for binding to integrin avB3
GB201810316D0 (en) 2018-06-22 2018-08-08 Bicyclerd Ltd Peptide ligands for binding to EphA2
US11180531B2 (en) 2018-06-22 2021-11-23 Bicycletx Limited Bicyclic peptide ligands specific for Nectin-4
GB201810320D0 (en) * 2018-06-22 2018-08-08 Bicycletx Ltd Peptide ligands for binding to CD38
GB201810325D0 (en) * 2018-06-22 2018-08-08 Bicycletx Ltd Peptide ligands for binding to PSMA
GB201810327D0 (en) * 2018-06-22 2018-08-08 Bicycletx Ltd Peptide ligands for binding to IL-17
JP2021531295A (ja) * 2018-07-23 2021-11-18 ザ・ガバナーズ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・アルバータ 遺伝的にコードされた二環式ペプチドライブラリー
WO2020023620A1 (en) * 2018-07-25 2020-01-30 Trustees Of Boston College Methods and compositions of chemically modified phage libraries
US11655468B2 (en) 2018-07-25 2023-05-23 The Trustees Of Boston College Methods and compositions of chemically modified phage libraries
EP3870597A1 (en) 2018-10-23 2021-09-01 BicycleTx Limited Bicyclic peptide ligands and uses thereof
GB201819659D0 (en) 2018-12-03 2019-01-16 Vib Vzw Cancer regression by inducing a regeneration-like reponse
GB201820316D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligands specific for IL-17
GB201820288D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 Bicycle Tx Ltd Bicycle peptide ligaands specific for MT1-MMP
GB201820295D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligands specific for MT1-MMP
SG11202106081YA (en) 2018-12-13 2021-07-29 Bicycletx Ltd Bicyclic peptide ligands specific for mt1-mmp
GB201820320D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligands specific for FAPalpha
GB201820325D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligands specific for psma
JP2022514687A (ja) 2018-12-21 2022-02-14 バイスクルアールディー・リミテッド Ｐｄ－ｌ１に特異的な二環式ペプチドリガンド
CN113474045A (zh) 2018-12-21 2021-10-01 拜斯科技术开发有限公司 Pd-l1特异性的双环肽配体
GB201900530D0 (en) 2019-01-15 2019-03-06 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligands specific for CD38
GB201900528D0 (en) 2019-01-15 2019-03-06 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligands specific for integrin AVB3
GB201900529D0 (en) 2019-01-15 2019-03-06 Bicycletx Ltd Bicyclic peptide ligands specific for CD38
GB201900525D0 (en) 2019-01-15 2019-03-06 Bicycletx Ltd Bicyclic peptide ligands specific for caix
GB201900526D0 (en) 2019-01-15 2019-03-06 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligands specific for caix
GB201900527D0 (en) 2019-01-15 2019-03-06 Bicycletx Ltd Bicyclic peptide ligands specific for integrin avb3
WO2020165600A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Bicycletx Limited Bicyclic peptide ligand sting conjugates and uses thereof
EP3935069A1 (en) 2019-03-04 2022-01-12 Bicyclerd Limited Synthesis of bicycle toxin conjugates, and intermediates thereof
JP2022528887A (ja) 2019-04-02 2022-06-16 バイスクルテクス・リミテッド バイシクルトキシンコンジュゲートおよびその使用
SG11202111606TA (en) 2019-05-09 2021-11-29 Bicycletx Ltd Bicyclic peptide ligands specific for ox40
WO2020239945A1 (en) 2019-05-28 2020-12-03 Vib Vzw Cancer treatment by targeting plexins in the immune compartment
WO2020239934A1 (en) 2019-05-28 2020-12-03 Vib Vzw Cd8+ t-cells lacking plexins and their application in cancer treatment
TW202118770A (zh) 2019-07-30 2021-05-16 英商拜西可泰克斯有限公司 異質雙環肽複合物
AU2020325658A1 (en) 2019-08-07 2022-01-06 Gyros Protein Technologies AB A method for modification of peptides immobilized on a solid support by traceless reductively cleavable linker molecules
CN114787197A (zh) 2019-08-13 2022-07-22 拜斯科技术开发有限公司 修饰的多聚双环肽配体
GB201912320D0 (en) 2019-08-28 2019-10-09 Bicycletx Ltd PBP Binding Bicyclic Peptide Ligands
GB201914233D0 (en) 2019-10-02 2019-11-13 Bicyclerd Ltd Phage cyclisation assay
WO2021064428A1 (en) 2019-10-03 2021-04-08 Bicycletx Limited Heterotandem bicyclic peptide complexes
GB201914872D0 (en) 2019-10-15 2019-11-27 Bicycletx Ltd Bicyclic peptide ligand drug conjugates
IL293200A (en) 2019-11-27 2022-07-01 Bicycletx Ltd Bicyclic peptide ligands specific for epha2 and their use
GB201918559D0 (en) 2019-12-16 2020-01-29 Bicycle Tx Ltd Bicyclic peptide ligands specific for IL-17
CN114787177A (zh) 2019-12-16 2022-07-22 拜斯科技术开发有限公司 Il-17特异性的双环肽配体
CN110907422B (zh) * 2019-12-16 2021-07-06 吉林大学 基于Ti3C2的凝血酶适体传感器及其制备方法
GB201918557D0 (en) 2019-12-16 2020-01-29 Bicycle Tx Ltd Bicyclic peptide ligands specific for IL-17
GB201918558D0 (en) 2019-12-16 2020-01-29 Bicycle Tx Ltd Bicyclic peptide ligands specific for IL-17
GB202002705D0 (en) 2020-02-26 2020-04-08 Bicycletx Ltd Anti-infective bicyclic peptide conjugates
GB202002706D0 (en) 2020-02-26 2020-04-08 Bicycletx Ltd Pbp3 binding bicyclic peptide ligands
CN115768456A (zh) 2020-04-06 2023-03-07 拜斯科技术开发有限公司 Tslp特异性的双环肽配体
WO2021220011A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Bicycletx Limited Anti-infective bicyclic peptide conjugates
EP4149954A1 (en) 2020-05-15 2023-03-22 BicycleTX Limited Anti-infective bicyclic peptide ligands
JP2023529214A (ja) 2020-06-12 2023-07-07 バイスクルテクス・リミテッド エリスロポエチン産生肝細胞受容体ａ２（ｅｐｈａ２）の過剰発現を特徴とする疾患の治療
IL300248A (en) 2020-08-03 2023-03-01 Bicycletx Ltd peptide-based linkers
CN111893577B (zh) * 2020-08-06 2022-03-22 厦门大学 基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法
WO2022038158A1 (en) 2020-08-17 2022-02-24 Bicycletx Limited Bicycle conjugates specific for nectin-4 and uses thereof
WO2022063957A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Vib Vzw Biomarker for anti-tumor therapy
WO2022063947A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Vib Vzw Combination of p2y6 inhibitors and immune checkpoint inhibitors
GB202016331D0 (en) 2020-10-15 2020-12-02 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligand drug conjugates
AR126029A1 (es) 2020-11-13 2023-09-06 Bicycletx Ltd LIGANDOS DE PÉPTIDOS BICÍCLICOS ESPECÍFICOS PARA EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA 1 (TfR1)
CN117083287A (zh) 2021-01-08 2023-11-17 拜斯科技术开发有限公司 抗感染双环肽配体
CA3206846A1 (en) 2021-01-08 2022-07-14 Bicycletx Limited Anti-infective bicyclic peptide ligands
CA3217018A1 (en) 2021-01-08 2022-07-14 Bicycletx Limited Bicyclic peptide ligands specific for nk cells
CA3207009A1 (en) 2021-01-08 2022-07-14 Bicycletx Limited Anti-infective bicyclic peptide ligands
US20240091368A1 (en) 2021-01-08 2024-03-21 Bicycletx Limited Anti-infective bicyclic peptide ligands
CA3206529A1 (en) 2021-01-08 2022-07-14 Bicycletx Limited Heterotandem bicyclic peptide complexes
US20240083945A1 (en) 2021-01-08 2024-03-14 Bicycletx Limited Anti-infective bicyclic peptide ligands
EP4274597A1 (en) 2021-01-11 2023-11-15 BicycleTX Limited Methods for treating cancer
MX2023007788A (es) 2021-01-24 2023-11-17 Michael David Forrest Inhibidores de la atp sintasa, usos cosmeticos y terapeuticos.
US20240130999A1 (en) 2021-02-17 2024-04-25 Vib Vzw Inhibition of SLC4A4 in the Treatment of Cancer
JP2024509996A (ja) 2021-03-19 2024-03-05 バイスクルテクス・リミテッド Ｔｒｅｍ２に特異的な二環式ペプチドリガンド
WO2022199804A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Vib Vzw Nek6 inhibition to treat als and ftd
JP2024515306A (ja) 2021-04-20 2024-04-08 バイスクルテクス・リミテッド Ｐ－セレクチンに特異的な二環式ペプチドリガンド
CA3227511A1 (en) 2021-08-06 2023-02-09 Lætitia LINARES Methods for the treatment of cancer
WO2023031623A2 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Bicycletx Limited Synthesis of bicycle toxin conjugates, and intermediates thereof
GB202114279D0 (en) 2021-10-06 2021-11-17 Bicycletx Ltd Bicyclic peptide ligand drug conjugates
GB202114282D0 (en) 2021-10-06 2021-11-17 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligand drug conjugates
GB202116266D0 (en) 2021-11-11 2021-12-29 Bicycletx Ltd Novel use
GB202116263D0 (en) 2021-11-11 2021-12-29 Bicycletx Ltd Anti-infective bicyclic peptide ligands
CN114166924A (zh) * 2021-12-03 2022-03-11 中国医学科学院北京协和医院 尿液蛋白标志物在诊断遗传性血管水肿中的用途
WO2023139292A1 (en) 2022-01-24 2023-07-27 Cambridge Enterprise Limited Tau therapy
GB202206431D0 (en) 2022-05-03 2022-06-15 Bicycletx Ltd Bicyclic peptide ligands specific for transferrin receptor 1 (TfR1)
WO2024009108A1 (en) 2022-07-07 2024-01-11 Bicycletx Limited Anti-infective bicyclic peptide ligands

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9313509D0 (en) * 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
WO1998036743A1 (en) * 1997-02-21 1998-08-27 Cypros Pharmaceutical Corporation Neuroprotective poly-guanidino compounds which block presynaptic n and p/q calcium channels
JP4312403B2 (ja) 1999-07-20 2009-08-12 モルフォシス・アクチェンゲゼルシャフト （ポリ）ペプチド／タンパク質を、ジスルフィド結合を介してバクテリオファージ粒子に表示させる新規方法
WO2001023619A1 (en) 1999-09-29 2001-04-05 Xenoport, Inc. Compounds displayed on replicable genetic packages and methods of using same
AU2002258602A1 (en) 2001-03-21 2002-10-08 Xenoport, Inc. Compounds displayed on icosahedral phage and methods of using same
US20030235851A1 (en) 2002-04-19 2003-12-25 Roberts Richard W. Methods of using sense and/or nonsense suppression to make nucleic acid-peptide display libraries containing peptides with unnatural amino acid residues
EP1452868A2 (en) 2003-02-27 2004-09-01 Pepscan Systems B.V. Method for selecting a candidate drug compound
DK1844337T3 (da) * 2005-01-24 2013-09-30 Pepscan Systems Bv Bindingsforbindelser, immunogene forbindelser og peptidmimetika
EP1855723B1 (en) 2005-03-08 2013-05-22 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. Targeted drug-carrying bacteriophages
CA2659225A1 (en) * 2006-07-26 2008-01-31 Pepscan Systems B.V. Immunogenic compounds and protein mimics
AU2007336132A1 (en) * 2006-12-21 2008-06-26 Cytos Biotechnology Ag Circular CCR5 peptide conjugates and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU2009211253B2 (en) 2014-11-06
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