CN111893577B - 基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法 - Google Patents

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Abstract

基于4‑羟基‑2,6‑二氟‑1,3,5‑苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法，涉及多肽环化方法。先利用DFB在中性或碱性条件下与含有半胱氨酸的多肽发生芳香亲核取代反应合成环肽；基于以上DFB分子与含巯基多肽的高效生物相容的反应性质，构建噬菌体环肽库；在噬菌体上展示含有半胱氨酸的多肽库，利用DFB对多肽库进行环化，筛选出具有特异性结合的环肽配体。反应体系无需加入有机溶剂或金属催化剂，无需高温高压等剧烈条件，适用于生物体系。通过对环肽反应的产率、反应速率、环肽产物稳定性等理想的反应快速、产率高且结构稳定的环肽方法。针对靶标进行筛选，得到具有高亲和力的环肽配体，为发展多肽药物等提供可能。

Description

基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体展示环肽库 的方法
技术领域
本发明涉及多肽环化方法，尤其是涉及一种基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法。
背景技术
多肽分子具有易于合成，与靶标亲和力强，选择性高等独特优势，因此被广泛应用于化学和生物医学领域。线性多肽在溶液中一般无稳定构象，在与靶标蛋白结合中表现出较弱的结合能力；其较为松散的结构易于暴露出更多的酶切位点，导致其易被蛋白酶酶解，限制了多肽在生物医学领域中的广泛应用。
通过环化将线性多肽的构象固定，不仅可以降低其构象自由度，减少其与靶标结合时的熵耗散，提升亲和性，还可以将部分酶切位点掩藏在环内部，降低其被酶解的概率，提升抗酶解稳定性。自然界中存在着的富含多个二硫键的多肽分子，比如芋螺毒素、动物防御素等依靠二硫键形成稳定的环结构，表现出优异的抗酶解稳定性以及特异性结合靶标的能力。(参见O.Saether,D.J.Craik，I.D.Campbell，K.Sletten,D.G.Norman.Biochemistry,1995,34,4147)。但是基于二硫键形成的环肽在还原环境中不稳定，易发生重排，且大部分不耐受酸碱和强氧化环境。相比于常见的利用二硫键构造的环肽，通过有机分子与多肽内氨基酸残基的偶联反应形成的硫醚键能够进一步提高环肽的稳定性。
噬菌体展示技术是一种基于生物定向进化原理的高通量筛选技术，将环化方法与生物分子定向进化技术结合正成为研究及应用的新趋势。目前，用于构建噬菌体环肽库的共价交联的方法主要集中于天然展示二硫键的噬菌体环肽库与利用翻译共修饰或翻译后修饰的方法展示碳硫键的噬菌体环肽库。后者在拓展结构多样且高质量的噬菌体环肽库中展现出巨大潜力，因此被广泛关注。噬菌体展示技术的突出特点是：(i)建立了在同一病毒颗粒内表型(展示多肽)与基因型(编码展示肽的DNA序列)之间的直接联系；(ii)巨大的库容量保证了展示多肽的多样性。经过3～5轮的体外筛选，特异性结合的噬菌体得到明显富集。通过挑取富集的单克隆菌落进行活化和基因测序，可获得噬菌体展示的多肽序列，其中重复或相似的片段称为“保守序列”。利用固相合成方法(SPPS)合成具有“保守序列”的多肽，通过荧光偏振
实验测定该多肽与靶标蛋白结合的亲和力，获得具有特异性结合能力的环肽配体。由于噬菌体展示反应体系的浓度极低，这进一步要求环化方法必须高效且选择性好。这些要求使得许多化学合成常用的环化方法并不适用于定向进化技术中。
在中性或碱性条件下，半胱氨酸残基的巯基具有良好的亲核进攻活性。利用巯基与芳香卤代烃的芳香亲核取代(SNAr)反应，可向多肽中引入一个或多个刚性苯环平面，将原本灵活的多肽固定在该平面的周围，降低了构象自由度，得到稳定的环肽构象，实现多肽稳定性与靶标亲和力的同步提升。Pentelute课题组利用十氟苯分子与多肽在碱性极性有机溶剂DMF中反应4.5h(参见Alexander M.Spokoyny,Yekui Zou,Jingjing J.Ling,Hongtao Yu,Yu-Shan Lin,and Bradley L.Pentelute,J.Am.Chem.Soc.2013,135,5946-5949)，可以得到稳定的单取代产物。该方法提出了基于芳香亲核取代反应，刚性全氟苯芳香烃与多肽中半胱氨酸形成共价键稳定的α-螺旋结构。然而，由于全氟苯分子溶解性差，因此反应必须在有机溶剂中进行，反应时间长，不适用于真实生物体系。Peter Timmerman课题组发现1,3-二(溴甲基)苯分子可在1︰7ACN/NH4CO3溶液中，室温条件得到环肽产物(参见Peter Timmerman,*Joris Beld,Wouter C.Puijk,Rob H.Meloen,ChemBioChem 2005,6,821–824)。该方法反应耗时短，但体系需兑入有机溶剂辅助反应进行。随着现代催化科学的发展，将过渡金属催化的杂原子偶联反应用于多肽环化也成为时兴热点。Zachary T.Ball报道了一种基于硼酸的生物键合技术，利用有机金属镍(II)催化的半胱氨酸芳基化偶联反应实现多肽的环化(参见Kengo Hanaya,Jun Ohata,Mary K.Miller,Alicia E.Mangubat-Medina,Michael J.Swierczynski,David C.Yang,Reece M.Rosenthal,Brian V.Popp andZachary T.Ball，Chem.Commun.,2019,55,2841)。该类反应速度快，产率高，但步骤繁琐，且易存在催化剂残留的问题。
综上，本领域亟需发展反应迅速、条件温和、生物相容性好的多肽偶联反应，构建高质量噬菌体库，创造特异性结合能力好的环肽配体，为发展多肽药物、检测、诊疗提供更多可能。
发明内容
本发明的目的在于针对传统的基于二硫键环肽策略存在的还原性条件下不稳定等难题，同时针对现有基于有机分子环肽策略中存在的反应条件苛刻，溶解度低和化学毒性高等问题，提供生物相容好、反应条件温和、无需催化剂和有机溶剂，且反应迅速完全的高效、简单、绿色的一种基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法。
本发明包括以下步骤：
1)利用4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈(DFB)在中性或碱性条件下与含有半胱氨酸的多肽发生芳香亲核取代反应合成环肽；
2)基于以上4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈(DFB)分子与含巯基多肽的高效生物相容的反应性质，构建噬菌体环肽库；在噬菌体上展示含有半胱氨酸的多肽库，利用4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈(DFB)对多肽库进行环化，筛选出具有特异性结合的环肽配体。
在步骤1)中，所述合成环肽的具体方法可为：将含有半胱氨酸的多肽粉末溶于溶剂中得到多肽溶液A，将2,4,6-三氟苯-1,3,5-三腈粉末溶解得到溶液B；在中性或碱性缓冲溶液中，加入多肽溶液A与硫醇还原剂，使多肽充分还原后，加入溶液B，反应得到环肽产物，用高效液相色谱与质谱分析及表征产物；
所述含有半胱氨酸的多肽的序列为-CXnC-，其中C代表半胱氨酸，Xn代表n个随机氨基酸；所述溶剂可采用水、乙腈或二甲亚砜等中的一种；所述将2,4,6-三氟苯-1,3,5-三腈粉末溶解得到溶液B可将2,4,6-三氟苯-1,3,5-三腈粉末用乙腈溶解得到浓度为0.5mol/L的溶液B，用水稀释至50mmol/L、5mmol/L备用；所述硫醇还原剂可采用三(2-羧乙基)膦盐(TCEP)等，所述多肽溶液A与硫醇还原剂中还原剂与多肽的比例≥1︰1；所述中性或缓冲溶液为pH≥7.0磷酸盐或碳酸盐缓冲溶液；所述溶液B与多肽的比例≥1︰1；所述反应的温度可为20～50℃，反应的时间可为5min～12h。
在步骤2)中，所述在噬菌体上展示含有半胱氨酸的多肽库，利用4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈(DFB)对多肽库进行环化，筛选出具有特异性结合的环肽配体的具体方法可为：
(1)向滴度大于1013pfu/mL于氮端展示的含有两个半胱氨酸的噬菌体库中加入TCEP使终浓度为1mmol/L,还原噬菌体文库，加入溶液B使终浓度为1mmol/L，反应后加入PEG/NaCl(v︰v＝1︰5)溶液，置于冰上孵育以沉降噬菌体，沉降后离心，弃除上清液，取磷酸缓冲生理盐水重悬沉淀，即得到4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈修饰的噬菌体环肽库；
(2)对一元噬菌体环肽库进行筛选，洗涤除去未结合和低亲和的噬菌体，洗脱回收特异性结合的噬菌体并扩增，用于下一轮循环；经过多轮体外筛选，与靶蛋白结合的噬菌体得到有效富集；挑取菌落单克隆进行DNA测序，通过翻译测序结果得到与靶蛋白结合的氨基酸序列。
在步骤(1)中，所述硫醇还原剂可采用5mol/L三(2-羧乙基)膦盐(TCEP)等；所述PEG/NaCl加入总体积的1/5；冰上孵育的时间可为0.5～1h；所述离心的条件可为10000rpm离心10min；
在步骤(2)中，所述筛选以Keap1蛋白与Bcl-xl蛋白作为靶标蛋白进行筛选。所述多轮体外筛选可进行3～5轮体外筛选。
本发明提供小分子构建新型高质量噬菌体环肽库的方法以及利用噬菌体环肽库发展特异性结合靶标的环肽配体。本发明先利用4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈(DFB)在中性或碱性条件下与含有半胱氨酸的多肽发生芳香亲核取代反应，合成一元环肽或二元环肽。所得环肽性质稳定，耐受酸、碱、外部自由巯基、强氧化剂等环境。然后，在噬菌体上展示含有半胱氨酸的多肽库，利用DFB对多肽库进行环化，筛选出具有特异性结合的环肽配体。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)将4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈首次利用于多肽环化策略中，发现其与含有半胱氨酸具有良好的反应活性，反应条件温和，具有良好的生物相容性。反应体系无需加入有机溶剂或金属催化剂，无需高温高压等剧烈条件，适用于生物体系。通过对环肽反应的产率、反应速率、环肽产物稳定性等考察得到理想的反应快速、产率高且结构稳定的一元环肽方法。
(2)以4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体环肽库，并针对靶标进行筛选，得到具有高亲和力的一元环肽或二元环肽配体，为发展多肽药物、疾病检测和治疗提供可能。
附图说明
图1为本发明实施例1与巯基化合物反应机理图。
图2为本发明实施例1与巯基化合物色谱表征图。
图3为本发明实施例1与含有双半胱氨酸多肽反应机理图。
图4为本发明实施例1与含有双半胱氨酸多肽色谱表征图。
图5为本发明实施例1二级反应动力学常数拟合图。
图6为本发明实施例1环肽对酸碱、自由巯基稳定性图。
图7为本发明实施例1环肽抗氧化稳定性色谱表征图。
图8为本发明实施例2二元环肽反应机理。
图9为本发明实施例2色谱表征图。
图10为本发明实施例3构建一元环肽噬菌体文库筛选示意图。
图11为本发明实施例3噬菌体库侵染活性图。
图12为本发明实施例3以Keap1为靶标蛋白筛选的测序结果。
图13是本发明实施例3以Keap1为靶标蛋白筛选的环肽对Keap1的荧光偏振曲线图。
图14为本发明实施例3以Bcl-xl为靶标蛋白筛选的测序结果。
图15为本发明实施例3以Bcl-xl为靶标蛋白筛选的环肽对Bcl-xl的SPR传感图。
图16为本发明实施例3以Bcl-xl为靶标蛋白筛选的环肽对Bcl-xl荧光偏振饱和曲线图。
图17为本发明实施例3以Bcl-xl为靶标蛋白筛选的环肽对Bcl-2的SPR传感图。
图18为本发明实施例3以Bcl-xl为靶标蛋白筛选的环肽对Bcl-xl荧光偏振竞争曲线图。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。本发明实施例中对n＝2～13的多肽环化反应转化率进行考察。
实施例1
探究还原型谷胱甘肽(GSH)和4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈(DFB)在优选条件下的反应过程，与含有双半胱氨酸模型肽反应的动力学及产物表征。
1)配制0.5mol/L的还原型谷胱甘肽水溶液。在装有一定量的磷酸缓冲溶液(PB，100mmol/L，pH＝7.4)的离心管中加入4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈溶液，使其终浓度为50μmol/L，再加入0.5mol/L的还原型谷胱甘肽溶液，使其终浓度为5mmol/L。涡旋混合均匀后，放入37℃恒温摇床。反应5min、10min、1h后，分别取样品并加入V︰V＝1︰1的10％偏磷酸溶液猝灭反应。超高效液相色谱结果表明反应0～10min时以单取代产物为主产物，反应1h后形成稳定的二取代产物(图2)。
2)将序列为Ac-GCRGCGW-NH2的多肽溶于水。在装有一定量磷酸缓冲溶液(PB，100mmol/L，pH＝7.4)的离心管中加入多肽溶液，使其终浓度50μmol/L。加入三(2-羧乙基)膦盐溶液，使其终浓度为150μmol/L；最后加入4-羟基-2,6-二氟-1,3,5苯三腈溶液，使其终浓度为500μmol/L。涡旋混合均匀，放入37℃恒温摇床，反应30min后得到单环肽产物(图4)。
3)在含有还原剂三(2-羧乙基)膦盐的磷酸缓冲溶液(PB，100mmol/L，pH＝7.4)中按照1︰1的投料比，依次加入多肽与4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈，使其终浓度为50μmol/L，涡旋混合均匀，放入37℃恒温摇床，反应0min、5min、10min、15min、20min、30min、40min后取样20μL，加入20μL的10％偏磷酸溶液猝灭反应。使用高效液相色谱表征产物，积分原料色谱峰面积，拟合得到二级反应的动力学速率常数为9.19L·mol-1·s-1(图5)。
4)将序列为Ac-GCRGCGW-NH2的多肽(p1)与4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈(DFB)的环肽产物用高效液相色谱纯化，并用紫外分光光度计定量。取环肽产物(DFB-p1)加入1mol/L的盐酸溶液、100mmol/L磷酸盐缓冲溶液、250μmol/L谷胱甘肽溶液，使DFB-p1终浓度为50μmol/L。在37℃下反应96h后用高效液相色谱表征(图6)。
5)将序列为Ac-GCRGCGW-NH2的多肽(p1)与4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈(DFB)的环肽产物用高效液相色谱纯化，并用紫外分光光度计定量。取环肽产物(DFB-p1)加入400μmol/L的高碘酸溶液，使DFB-p1终浓度为50μmol/L。在37℃下反应0min、10min、20min、30min、1h、2h、4h、6h后用高效液相色谱表征(图7)。
在图1中，4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈(DFB)与大过量的巯基的化合物还原型谷胱甘肽(GSH)在中性条件下发生芳香亲核取代反应，将图1的反应过程用化学式表示，依次得到单取代产物与二取代产物。
在图2中，4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈(DFB)与大过量的巯基的化合物还原型谷胱甘肽(GSH)，反应条件为磷酸缓冲溶液(PB，100mmol/L，pH＝7.4)，反应时间分别为10min和1h，根据高效液相色谱质谱仪表征依次得到一取代产物(cal:[M+H]+＝493.3349，found:[M+H]+＝493.0941)与二取代产物(cal:[M+2H]2+＝390.8297，found:[M+2H]2+＝390.6076)。
在图3中，含有双半胱氨酸的多肽与4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈(DFB)环肽反应机理。
在图4中，多肽Ac-GCRGCGW-NH2(p1)，在磷酸缓冲溶液(PB，100mmol/L，pH＝7.4)里，使多肽终浓度为50μmol/L，与过量的4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈反应5min、30min后得到环肽产物(cal:[M+H]+＝944.3059，found:[M+H]+＝994.3218)。
在图5中，多肽Ac-GCRGCGW-NH2(p1)(50μmol/L)与4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈(50μmol/L)在37℃的磷酸缓冲溶液(PB，100mmol/L，pH＝7.4)中反应的动力学色谱图，通过拟合各个时间点得到的产物色谱峰的面积得到该反应的二级反应动力学常数。
在图6中，多肽Ac-GCRGCGW-NH2(p1)与4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈(DFB)分子的环肽产物经高效液相色谱纯化后，加入至盐酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液(pH＝8.0)、谷胱甘肽溶液中，在37℃下反应96h后，将反应产物用高效液相色谱表征。
在图7中，为多肽Ac-GCRGCGW-NH2(p1)与4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈(DFB)分子的环肽产物经高效液相色谱纯化后，加入高碘酸溶液中。在37℃下反应1～6h，用亚硫酸溶液猝灭氧化反应，用高效液相色谱进行反应产物分离。
实施例2
将序列为Ac-CGWDLCASCRVEGC-NH2的多肽(p7)溶于水。在含有还原剂三(2-羧乙基)膦盐的磷酸缓冲溶液(PB，100mmol/L，pH＝7.4)的离心管中加入多肽溶液，使其终浓度50μmol/L，加入4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈溶液，使其终浓度为100μmol/L。涡旋混合均匀，放入37℃恒温摇床，反应30min后，经高效液相色谱表征，得到三种连接方式不同的二元环肽产物(图8)
图9为含有四个半胱氨酸多肽Ac-CGWDLCASCRVEGC-NH2(50μmol/L)，在磷酸缓冲溶液(PB，100mmol/L，pH＝7.4)中与过量的4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈，在37℃反应30min后得到三种连接方式不同的二元环肽产物(cal:[M+2H]2+＝936.7978，found:[M+2H]2+＝936.8109、936.8097、937.3117)。
实施例3
基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈修饰噬菌体文库，以Keap1与Bcl-xl为靶标蛋白筛选具有高亲和力的一元环肽配体。Keap1蛋白与Nrf2蛋白结合后导致Nrf2蛋白泛素化降解，使其无法发挥抗氧化功能。缺乏Nrf2蛋白可能导致脑、肺、神经相关的慢性疾病，甚至癌症。在损伤的细胞中，若能抑制Keap-Nrf2之间的相互作用，释放Nrf2，则可恢复其抗氧化功能，治疗相关疾病。Bcl-xl蛋白是B细胞淋巴瘤-2家族蛋白之一，通过抑制程序性细胞死亡和延长肿瘤细胞寿命、促进肿瘤细胞扩张，因此发展其抑制剂药物可以恢复癌细胞程序性凋亡。故选用上述两种蛋白作为靶标蛋白。
1)噬菌体展示方法的具体步骤如下：
a.构建噬菌体文库：将随机九肽的双链DNA插入噬菌粒载体pCantab 5E中sfi I与NotI酶切位点之间，电转导入宿主菌中，通过测定转化菌的个数计算库容量。
b.制备噬菌体库：取适量保存的噬菌体甘油菌加入2YT-Glu-Amp(2YT液体培养基中加入40％w/v的D-(+)-葡萄糖溶液与100mg/mL的氨苄青霉素溶液，使D-(+)-葡萄糖溶液的终浓度为2％w/v，氨苄青霉素溶液的终浓度为100μg/mL)液体培养基中，使OD600≈0.1。将上述样品置入37℃培养至OD600≈0.5；计算细菌数目，加入细菌数目20倍过量的辅助噬菌体M13KO7和终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素。在37℃恒温箱中静置孵育30min后取出，在37℃摇床中反应30min。在4℃下离心，用新鲜灭菌的2YT-Amp-Kana重悬沉淀，放入30℃培养9～12h。在4℃下离心10min，向上清液中加入PEG/NaCl，冰浴4～10h。在4℃下离心10min，用磷酸缓冲生理盐水(1×PBS)反复抽吸至沉淀全部溶解。在4℃下离心10min，向上清液中加入PEG/NaCl，静置冰浴1～3h，此时溶液中有白色沉淀析出。在4℃下离心10min，用磷酸缓冲生理盐水(1×PBS)重悬沉淀并以无菌滤膜针式过滤。
c.噬菌体滴度的测定：取待测液，用2YT液体培养基逐级稀释，使其浓度为10-1～10-10，按照10倍系列逐级递减。各取10～20μL的稀释液至100～200μL的对数生长期TG1中。混合均匀后，放入37℃恒温箱中静置孵育。取培养物均匀铺于2YT-Amp琼脂平板表面，待培养液被完全吸收，恒温培养9～12h，取出计数。
d.噬菌体库的修饰：向噬菌体库中加入终浓度为1mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐溶液。混合均匀，置于37℃反应30～60min。再体系中加入终浓度为1mmol/L的过膜除菌的4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈溶液。调节pH＝7.4，置于37℃反应60min。向上述反应溶液中加入PEG/NaCl，静置冰浴60min。此时溶液中有白色沉淀析出，离心10min，弃去上清液，用磷酸缓冲生理盐水(1×PBS)重悬沉淀。
e.封闭：取100μL的链酶亲和素包被磁珠于低吸附离心管中，用结合缓冲液静置于磁力架上1min，弃去上清液，重复3次洗涤。取100μL结合缓冲液重悬磁珠，分别取50μL于两个低吸附离心管中，标记一管为实验组，另一管为对照组。在实验组中加入生物素标记的靶标蛋白(投入量逐轮递减，第一轮筛选10μg，第二轮筛选5μg，第三轮筛选2μg)，对照组中加入与靶蛋白同体积的磷酸缓冲生理盐水(1×PBS)，将两管混合均匀，室温孵育15min，静置于磁力架上1min，弃去上清液。分别用结合缓冲液重悬磁珠混合均匀，在磁力架上静置1min，弃去上清液，重复3次洗涤。在两管中分别加入300μL的结合缓冲液及150μL的封闭缓冲液，混合均匀后置于室温孵育120min。同时，取修饰后待筛选的噬菌体库加入2mL结合缓冲液，使总体积为3mL。再加入1.5mL封闭缓冲液，室温孵育120min。
f.结合：将封闭后的噬菌体库平分于两个无菌离心管中，标记上实验组和对照组。分别加入实验组和对照组封闭后的磁珠，混合均匀，将两个离心管置于室温孵育30min。静置于磁力架上1min，弃去上清液。
g.洗涤：将结合后的实验组和对照组各用洗涤缓冲液(10mM Tris，150mM NaCl，10mMMgCl2，1mM CaCl2，0.1％v/v Tween-20，用HCl调pH值至7.4)洗涤8次，再用结合缓冲液洗涤1次。取200μL洗脱缓冲液重悬磁珠，混合均匀后，室温孵育5min，将上清液转移至装有50μL中和缓冲液的离心管中。
h.将上述洗脱的噬菌体以上述方法测定滴度(同c)、扩增、纯化，用于后续两轮筛选循环。对于环化的噬菌体实验组，每轮筛选前进行使用环化分子进行展示多肽的环化。将第三轮单克隆菌落接种于1mL的2YT-Amp液体培养基中，置于37℃恒温摇床反应9～12h后进行基因测序，将测序结果翻译为多肽序列(图12、图14)。
2)4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈对噬菌体侵染活性的影响：按照步骤d的修饰条件与方法，将过膜除菌的4-羟基-2,6-二氟-1,3,5苯三腈溶液加入三(2-羧乙基)膦盐溶液还原的噬菌体文库中，分别反应0h、1h、3h、5h、7h。向噬菌体溶液中加入PEG/NaCl，静置冰浴1h，此时溶液中有白色沉淀析出，离心10min，弃去上清液，用磷酸缓冲盐溶液(1×PBS)重悬沉淀，测定该噬菌体溶液的滴度(同步骤c)，以计算噬菌体数的对数值为纵坐标，以修饰时间为横坐标作柱状图(图11)。
3)荧光偏振饱和曲线：令每组样品总体积为300μL，以磷酸缓冲生理盐水(1×PBS)为缓冲体系，加入终浓度为50μmol/L荧光多肽FITC-[βA]-CEFLDWEMDGC-NH2，在上述溶液中加入靶标蛋白溶液使其终浓度为0～1μmol/L。将配置好的待测溶液室混合均匀，温孵育10min，依次加入96孔板中。根据FITC的吸光性质，以485nm激发，测量535nm的偏振荧光，通过Infinite 200PRO多功能酶标仪测其各向异性荧光强度，每组实验重复3次。利用Origin拟合荧光偏振饱和曲线(图16)。
4)荧光偏振竞争曲线：令每组样品总体积为300μL，以磷酸缓冲生理盐水(1×PBS)为缓冲体系，加入Keap1蛋白使其终浓度为300nmol/L。再加入荧光多肽FITC-[βA]-DEETGEF-OH使其终浓度为20nmol/L。最后加入0～10μmol/L的4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈环化的Ac-CPDRETGEMEC-NH2、Ac-CEDAETGEEVC-NH2作为竞争肽。根据FITC的吸光性质，以485nm激发，测量535nm的偏振荧光，通过Infinite 200PRO多功能酶标仪测其各向异性荧光强度，每组实验重复3次。利用Origin拟合荧光偏振竞争曲线(图13)。令每组样品总体积为300μL，以磷酸缓冲生理盐水(1×PBS)为缓冲体系，加入Bcl-xl蛋白使其终浓度为500nmol/L。再加入荧光多肽FITC-[βA]-CEFLDWEMDGC-NH2使其终浓度为50nmol/L。最后加入0～10μmol/L的4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈环化的Ac-CEFLDWEMDGC-NH2。根据FITC的吸光性质，以485nm激发，测量535nm的偏振荧光，通过Infinite 200PRO多功能酶标仪测其各向异性荧光强度，每组实验重复3次。利用Origin拟合荧光偏振竞争曲线(图18)。
5)表面等电子体共振(SPR)分析：使用Biacore T200进行SPR分析。使用标准化的胺基偶联方法将蛋白质(Sumo-Bcl-1和Sumo-Bcl-2)固定在芯片表面上。将蛋白质溶解在pH4.5的10mM乙酸盐缓冲液中，使其蛋白终浓度为(1μmol/L)。以含0.05％Tween 20和0.05mmol/L EDTA的磷酸盐缓冲液(1×PBS)作为运行缓冲液。用EDC和NHS的混合物激活流通池Fc2后，将靶标蛋白与之偶联使响应值达到1000RU，并用乙醇胺使过量的酯失活。未固定蛋白的流通池Fc1被用作参考通道。连续稀释的样品(对于DBF环化型多肽为0、80、160、320、640、1280、2560、5120和1280nM)，以30μL/min的流速通过流通池(Fc1和Fc2)。为了进行数据分析，所有的传感图均使用双重参考进行处理。使用1︰1结合模型和局部拟合分析环肽与靶标蛋白结合的动力学数据，以获得动力学速率常数(Ka和Kd)，通过Kd/Ka确定解离常数，通过重复测定确定了测定的可重复性(图15、图17)。
图10是构建一元环肽噬菌体文库筛选示意图。首先将含有两个半胱氨酸的氧化型噬菌体文库用终浓度为1mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐还原得到线性噬菌体文库，随后加入1mmol/L的4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈修饰噬菌体文库，利用PEG/NaCl冰浴沉降离心修饰上的噬菌体，将已修饰的噬菌体文库进行滴度测试，用于针对靶标蛋白筛选实验。挑取单克隆进行基因测序，得到一系列序列，进行后续分析。
在图11中，对于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈修饰噬菌体文库对噬菌体侵染活性影响表征图。分别加入终浓度为100μmol/L、1mmol/L的4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈对噬菌体数量的影响。如图8所示，当4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈为100μmol/L反应7h时，噬菌体数仅在同一个数量级范围内波动，当其浓度增加10倍，达到1mmol/L反应7h时，噬菌体数仅下降一个数量级。而在优选的修饰条件下(1mmol/L，反应1h)，噬菌体数在同一数量级波动，即对噬菌体侵染活性不造成明显影响。
在图12中，挑选噬菌体筛选第3轮洗脱液中单克隆抗体测序的结果，并将测序结果翻译为氨基酸序列得到不同噬菌体单克隆上展示的多肽序列。针对靶蛋白Keap1筛选结果中可以明显观察到序列具有相似单元-PDA/PETGE-。
在图13中，挑选图7中筛选得到富集度最高的两条多肽序列(编号为keap1-M4、keap1-M9)，利用固相合成法合成Ac-CPDRETGEMEC-NH2与Ac-CEDAETGEEVC-NH2，使其终浓度为(50μmol/L)，在磷酸缓冲溶液(PB，100mmol/L，pH＝7.4)中，与4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈(500μmol/L)的环化产物经高效液相色谱纯化，进行荧光偏振竞争实验。在磷酸缓冲生理盐水(1×PBS)体系中，加入一系列浓度梯度(0～10μmol/L)的竞争肽与等量荧光多肽FITC-[βA]-DEETGEF-OH(20nmol/L)竞争Keap1(300nmol/L)，经在TECAN infinite 200PRO多功能酶标仪上测得各项异性数据处理得到各向异性值，拟合得到IC50分别为108.54nmol/L与126.42nmol/L。
在图14中，挑选噬菌体筛选第3轮洗脱液中单克隆抗体测序的结果，并将测序结果翻译为氨基酸序列得到不同噬菌体单克隆上展示的多肽序列。针对靶蛋白Bcl-xl筛选结果中可以明显观察到序列具有相似单元-FLDWE-。
在图15中，挑选出图11中筛选得到富集度最高的多肽序列(编号为bcl-xl-M1)，利用固相合成得到Ac-CEFLDWEMDGC-NH2。利用DFB环化后利用高效液相色谱纯化出环肽，进行表面等电子体共振分析(SPR)。使用1︰1结合模型和局部拟合分析该环肽与Bcl-xl蛋白结合的动力学数据，以获得动力学速率常数(Ka和Kd)，通过Kd/Ka确定解离常数，通过重复测定确定了测定的可重复性。
在图16中，挑选图11中筛选得到富集度最高的多肽序列，利用固相合成法得到FITC-[βA]-CEFLDWEMDGC-NH2。利用高效液相色谱纯化出还原型线性多肽、二硫键氧化型环肽、DFB环化型环肽(F-DFB-M1)，用于荧光偏振饱和曲线的测定。在磷酸缓冲生理盐水(1×PBS)体系中，加入等浓度的荧光多肽(50nmol/L)，与一系列浓度梯度的Bcl-xl蛋白，经在TECAN infinite 200PRO多功能酶标仪上测得各项异性数据处理得到各向异性值，得到荧光偏振饱和曲线图。
在图17中，挑选出图11中筛选得到富集度最高的多肽序列(编号为bcl-xl-M1)，利用固相合成得到Ac-CEFLDWEMDGC-NH2。利用DFB环化后利用高效液相色谱纯化出环肽，进行表面等电子体共振分析(SPR)。使用1︰1结合模型和局部拟合分析该环肽与Bcl-2蛋白结合的动力学数据，以获得动力学速率常数(Ka和Kd)，,通过Kd/Ka确定解离常数，通过重复测定确定了测定的可重复性。
在图18中，挑选图11中筛选得到富集度最高的多肽序列，利用固相合成法得到Ac--CEFLDWEMDGC-NH2。利用高效液相色谱纯化出DFB环化的环肽，进行荧光偏振竞争曲线的测定。在磷酸缓冲生理盐水(1×PBS)体系中，加入一系列浓度梯度(0～10μmol/L)的竞争肽与等量荧光多肽FITC-[βA]-CEFLDWEMDGC-NH2(20nmol/L)竞争Bcl-xl(500nmol/L)，经在TECAN infinite 200PRO多功能酶标仪上测得各项异性数据处理得到各向异性值，拟合得到IC50为1.047μmol/L。
本发明基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈分子与多肽链中的巯基的反应构建环肽，并利用噬菌体展示技术筛选出针对靶标蛋白具有高亲和力配体的方法，发展了一种生物相容好，反应条件温和，无需有机溶剂、无需催化剂、高效的环肽策略，为构造高质量新型环肽噬菌体库提供了新方法，反应迅速完全的高效、简单、绿色的多肽环化方法。利用该分子与半胱氨酸的偶联反应构建高质量的新型噬菌体展示肽库，获得与靶标特异性结合的的一元环肽配体，为进一步检测和治疗等应用奠定了基础。本发明提出的一种兼备亲核反应活性与生物相容性的多官能团芳香族分子，为构建一元环肽、二元环肽提供了新的可能，并将其成功运用于噬菌体展示技术中。

Claims (7)

1.基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)利用4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈在中性或碱性条件下与含有半胱氨酸的多肽发生芳香亲核取代反应合成环肽；所述含有半胱氨酸的多肽的序列为-CXnC-，其中C代表半胱氨酸，Xn代表n个随机氨基酸；
所述合成环肽的具体方法为：将含有半胱氨酸的多肽粉末溶于溶剂中得到多肽溶液A，将2,4,6-三氟苯-1,3,5-三腈粉末溶解得到溶液B；在中性或碱性缓冲溶液中，加入多肽溶液A与硫醇还原剂，使多肽充分还原后，加入溶液B，反应得到环肽产物，用高效液相色谱与质谱分析及表征产物；
2)基于以上4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈分子与含巯基多肽的高效生物相容的反应性质，构建噬菌体环肽库；在噬菌体上展示含有半胱氨酸的多肽库，利用4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈对多肽库进行环化，筛选出具有特异性结合的环肽配体；
所述筛选出具有特异性结合的环肽配体的具体方法为：
(1)向滴度大于1013pfu/mL于氮端展示的含有两个半胱氨酸的噬菌体库中加入TCEP使终浓度为1mmol/L,还原噬菌体文库，加入溶液B使终浓度为1mmol/L，反应后加入PEG/NaCl溶液，置于冰上孵育以沉降噬菌体，沉降后离心，弃除上清液，取磷酸缓冲生理盐水重悬沉淀，即得到4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈修饰的噬菌体环肽库；
(2)对一元噬菌体环肽库进行筛选，洗涤除去未结合和低亲和的噬菌体，洗脱回收特异性结合的噬菌体并扩增，用于下一轮循环；经过多轮体外筛选，与靶蛋白结合的噬菌体得到有效富集；挑取菌落单克隆进行DNA测序，通过翻译测序结果得到与靶蛋白结合的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法，其特征在于在步骤1)中，所述溶剂采用水、乙腈或二甲亚砜中的一种；所述将2,4,6-三氟苯-1,3,5-三腈粉末溶解得到溶液B是将2,4,6-三氟苯-1,3,5-三腈粉末用乙腈溶解得到浓度为0.5mol/L的溶液B，用水稀释至50mmol/L、5mmol/L备用。
3.如权利要求1所述基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法，其特征在于在步骤1)中，所述硫醇还原剂采用三(2-羧乙基)膦盐(TCEP)；所述中性或缓冲溶液为pH≥7.0磷酸盐或碳酸盐缓冲溶液。
4.如权利要求1所述基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法，其特征在于在步骤1)中，所述多肽溶液A与硫醇还原剂中还原剂与多肽的比例≥1︰1；所述溶液B与多肽的比例≥1︰1。
5.如权利要求1所述基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法，其特征在于在步骤1)中，所述反应的温度为20～50℃，反应的时间为5min～12h。
6.如权利要求1所述基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法，其特征在于在步骤2)的第(1)部分中，硫醇还原剂采用5mol/L三(2-羧乙基)膦盐(TCEP)；所述PEG/NaCl加入总体积的1/5；冰上孵育的时间为0.5～1h；所述离心的条件为10000rpm离心10min。
7.如权利要求1所述基于4-羟基-2,6-二氟-1,3,5-苯三腈构建噬菌体展示环肽库的方法，其特征在于在步骤2)中的第(2)部分中，所述筛选以Keap1蛋白与Bcl-xl蛋白作为靶标蛋白进行筛选；所述多轮体外筛选是进行3～5轮体外筛选。
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