CN116640790A - 一种以驼源纳米抗体为靶标的针对赭曲霉毒素a的表位模拟肽及其筛选方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种以驼源纳米抗体为靶标的针对赭曲霉毒素A的表位模拟肽的筛选方法，属于免疫分析化学技术领域。本发明以抗OTA的驼源纳米抗体Nb为靶标筛选模拟表位肽，利用噬菌体展示技术从噬菌体环七肽库中筛选针对OTA的表位模拟肽，经过酸洗脱和竞争洗脱的多轮筛选方法，筛选得到针对赭曲霉毒素A的表位模拟肽。本发明所述靶标驼源纳米抗体Nb与传统mAb相比具有分子量低、产量高、成本低的特点。本发明的筛选方法筛选得到的表位模拟肽具有高特异性和亲和力，能够作为绿色、经济、高效的OTA化学偶联全抗原替代品，不仅能够降低检测成本，同时避免了OTA及相关有毒化学品对研究者健康和环境的危害，有利于实现OTA的绿色检测。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析化学技术领域，具体涉及一种以驼源纳米抗体为靶标的针对赭曲霉毒素A的表位模拟肽及其筛选方法和应用。
背景技术
赭曲霉毒素主要由曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)等真菌产生的对人体或动物机体造成毒害作用的次级代谢产物。其中，赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)的毒性最高、分布范围最广、对农副产品污染最严重。大量研究表明，OTA可以抑制蛋白质的合成，干扰代谢途径，破坏钙的平衡，并损害人类和动物的DNA，长期接触或暴露在存在OTA的环境中具有潜在的肾毒性、肝毒性、免疫毒性、致畸性、致癌性和致突变等毒性作用风险，严重威胁着人类和动物有机体的健康。与此同时，OTA的化学稳定性和热稳定性高，日常对农产品的加工处理难以将其完全除去。因此，开发快速、灵敏的OTA检测技术对于支持食品安全监管是非常必要的。
随着当代仪器分析技术的发展，具有高精度和高灵敏度的色谱法已经被检测机构和政府食品安全监管部门作为检测OTA的普遍方法，尤其是高效液相色谱法(HPLC)。进一步发展的高效液相色谱质谱联用(HPLC-MS)、高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS-MS)、气相色谱质谱联用(LC-MS)等的使用，使OTA检测更方便，更灵敏。然而，仪器分析方法具有仪器昂贵、样品前处理复杂以及对操作人员要求高的缺陷，限制了它们在基本监管机构或领域的广泛应用，无法实现快速检测食品中的有害物质。作为色谱法的替代品，免疫分析法具有快速、低成本和高灵敏度的优势，能够实现样品的高通量测试。以OTA为代表的常见小分子有毒物(真菌毒素、农药、兽药等)通常只具有一个抗原决定簇，在免疫检测中不可避免的会引入化学偶联全抗原。化学偶联全抗原合成过程复杂且涉及到大量的有毒物质，这对研究者和环境容易产生危害。因此，可以作为化学偶联全抗原替代品的表位模拟肽有效地避免了这些风险。
目前，表位模拟肽通常是以噬菌体展示技术为基础、单克隆抗体(mAb)为靶标来获取。由于mAb的获取步骤复杂且涉及到可能的动物伦理道德问题。选取其他靶标来筛选针对赭曲霉毒素A的表位模拟肽成为目前需要解决的问题
发明内容
本发明的目的在于提供一种以驼源纳米抗体为靶标的针对赭曲霉毒素A的表位模拟肽及其筛选方法和应用。
本发明提供了一种以驼源纳米抗体为靶标的针对赭曲霉毒素A的表位模拟肽的筛选方法，包括以下步骤：
1)将驼源纳米抗体和Ni-IDA琼脂糖磁珠混合，进行第一螯合，得到第一螯合物；将所述第一螯合物和噬菌体环形七肽库混合，进行第一孵育，得到第一结合物；将所述第一结合物置于磁场分离磁珠和液体，弃上清，对剩余磁珠依次进行第一洗涤和酸洗脱，调节所述酸洗脱后的洗脱液的pH至7～8，得到第一洗脱液；采用所述第一洗脱液转染大肠杆菌后依次进行扩增、纯化和滴度测定，调节产物中噬菌体的滴度为1012～1013pfu/mL，得到第一纯化物；
2)将驼源纳米抗体和Ni-IDA琼脂糖磁珠混合，进行第二螯合，得到第二螯合物；将所述第二螯合物和所述第一纯化物混合，进行第二孵育，得到第二结合物；将所述第二结合物置于磁场分离磁珠和液体，弃上清，对剩余磁珠依次进行第二洗涤和采用OTA标准品进行第一竞争洗脱，得到第二洗脱液；采用所述第二洗脱液转染大肠杆菌后依次进行扩增、纯化和滴度测定，调节产物中噬菌体的滴度为1012～1013pfu/mL，得到第二纯化物；
3)将驼源纳米抗体和Ni-IDA琼脂糖磁珠混合，进行第三螯合，得到第三螯合物；将所述第三螯合物和所述第二纯化物混合，进行第三孵育，得到第三结合物；将所述第三结合物置于磁场分离磁珠和液体，弃上清，对剩余磁珠依次进行第三洗涤和采用OTA标准品进行第二竞争洗脱，得到第三洗脱液；采用所述第三洗脱液转染大肠杆菌后依次进行扩增和滴度测定；
4)在转染有第三洗脱液的大肠杆菌的滴度平板中挑取大肠杆菌单菌落进行噬菌体克隆的扩增，得到扩增后的噬菌体培养物；
5)对所述噬菌体培养物进行Phage-ELISA鉴定，以阴性孔OD450/阳性孔OD450≥2.1作为阳性克隆的判断依据，鉴定得到阳性克隆并进行DNA测序，得到表位模拟肽；
步骤1)中所述驼源纳米抗体的工作浓度为10～20μg/mL；
步骤1)中所述噬菌体环形七肽库中噬菌体的添加量为1011～1012pfu；
步骤2)中所述驼源纳米抗体的工作浓度为4～8μg/mL；
步骤3)中所述驼源纳米抗体的工作浓度为0.5～2μg/mL；
步骤2)中所述OTA标准品的工作浓度为80～100ng/mL；
步骤3)中所述OTA标准品的工作浓度为1～10ng/mL。
优选的，步骤1)中所述第一洗涤的次数为5～10次；步骤1)中所述第一洗涤采用的试剂包括第一PBST；所述第一PBST以水为溶剂，包括以下浓度的组分：10mM PBS和体积浓度为0.05％～0.1％的Tween-20。
优选的，步骤1)中所述酸洗脱采用的试剂包括浓度为0.2M的Gly-HCl。
优选的，步骤2)中所述第二洗涤的次数为15～20次；步骤2)中所述第二洗涤采用的试剂包括第二PBST；所述第二PBST以水为溶剂，包括以下浓度的组分：10mM PBS和体积浓度为0.25％～0.3％的Tween-20。
优选的，步骤3)中所述第三洗涤的次数为20～25次；步骤2)中所述第三洗涤采用的试剂包括第三PBST；所述第三PBST以水为溶剂，包括以下浓度的组分：10mM PBS和体积浓度为0.5％～0.8％的Tween-20。
本发明还提供了以驼源纳米抗体为靶标的针对赭曲霉毒素A的表位模拟肽，包括第一环状短肽、第二环状短肽和第三环状短肽中的一种或几种；
所述第一环状短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述第二环状短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述第三环状短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了上述方案所述表位模拟肽的编码基因。
优选的，所述编码基因包括编码所述第一环状短肽的第一基因、编码所述第二环状短肽的第二基因和编码所述第三环状短肽的第三基因中的一种或几种；
所述第一基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述第二基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述第三基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了一种用于检测赭曲霉毒素A的试剂盒，包含上述方案所述的表位模拟肽。
本发明还提供了上述方案所述的表位模拟肽或者所述的编码基因或者所述的试剂盒在检测赭曲霉毒素A中的应用。
本发明提供了一种以驼源纳米抗体为靶标的针对赭曲霉毒素A的表位模拟肽的筛选方法。本发明以抗OTA的驼源纳米抗体Nb为靶标筛选模拟表位肽，利用噬菌体展示技术从噬菌体环七肽库中筛选针对OTA的表位模拟肽，经过酸洗脱和竞争洗脱的多轮筛选方法，筛选得到针对赭曲霉毒素A的表位模拟肽。本发明所述靶标驼源纳米抗体Nb与传统mAb相比具有分子量低、产量高、成本低的特点。本发明的筛选方法筛选得到的表位模拟肽具有高特异性和亲和力，能够作为绿色、经济、高效的OTA化学偶联全抗原替代品，直接用于OTA的检测或者利用基因工程技术将表位模拟肽与其他蛋白质构建融合蛋白用于其他免疫分析检测方法的建立，不仅能够降低检测成本，同时避免了OTA及相关有毒化学品对研究者健康和环境的危害，有利于实现OTA的绿色检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为以OTA表位模拟肽建立的直接竞争ELISA标准曲线，IC50值分别为0.300、0.283和0.277ng/mL，ΔAMax/IC50值分别为0.752、4.274和1.114；
图2为以OTA表位模拟肽建立的化学发光免疫分析方法的竞争抑制标准曲线的IC50值0.086ng/mL，线性范围(IC80～IC20)0.060～0.146ng/mL，最低检测限LOD值为0.053ng/mL。
具体实施方式
本发明提供了一种以驼源纳米抗体为靶标的针对赭曲霉毒素A的表位模拟肽的筛选方法，包括以下步骤：
1)将驼源纳米抗体和Ni-IDA琼脂糖磁珠混合，进行第一螯合，得到第一螯合物；将所述第一螯合物和噬菌体环形七肽库混合，进行第一孵育，得到第一结合物；将所述第一结合物置于磁场分离磁珠和液体，弃上清，对剩余磁珠依次进行第一洗涤和酸洗脱，调节所述酸洗脱后的洗脱液的pH至7～8，得到第一洗脱液；采用所述第一洗脱液转染大肠杆菌后依次进行扩增、纯化和滴度测定，调节产物中噬菌体的滴度为1012～1013pfu/mL，得到第一纯化物；
2)将驼源纳米抗体和Ni-IDA琼脂糖磁珠混合，进行第二螯合，得到第二螯合物；将所述第二螯合物和所述第一纯化物混合，进行第二孵育，得到第二结合物；将所述第二结合物置于磁场分离磁珠和液体，弃上清，对剩余磁珠依次进行第二洗涤和采用OTA标准品进行第一竞争洗脱，得到第二洗脱液；采用所述第二洗脱液转染大肠杆菌后依次进行扩增、纯化和滴度测定，调节产物中噬菌体的滴度为1012～1013pfu/mL，得到第二纯化物；
3)将驼源纳米抗体和Ni-IDA琼脂糖磁珠混合，进行第三螯合，得到第三螯合物；将所述第三螯合物和所述第二纯化物混合，进行第三孵育，得到第三结合物；将所述第三结合物置于磁场分离磁珠和液体，弃上清，对剩余磁珠依次进行第三洗涤和采用OTA标准品进行第二竞争洗脱，得到第三洗脱液；采用所述第三洗脱液转染大肠杆菌后依次进行扩增和滴度测定；
4)在转染有第三洗脱液的大肠杆菌的滴度平板中挑取大肠杆菌单菌落进行噬菌体克隆的扩增，得到扩增后的噬菌体培养物；
5)对所述噬菌体培养物进行Phage-ELISA鉴定，以阴性孔OD450/阳性孔OD450≥2.1作为阳性克隆的判断依据，鉴定得到阳性克隆并进行DNA测序，得到表位模拟肽；
步骤1)中所述驼源纳米抗体的工作浓度为10～20μg/mL；
步骤1)中所述噬菌体环形七肽库中噬菌体的添加量为1011～1012pfu；
步骤2)中所述驼源纳米抗体的工作浓度为4～8μg/mL；
步骤3)中所述驼源纳米抗体的工作浓度为0.5～2μg/mL；
步骤2)中所述OTA标准品的工作浓度为80～100ng/mL；
步骤3)中所述OTA标准品的工作浓度为1～10ng/mL。
本发明提出了以驼源纳米抗体Nb为靶标，利用噬菌体展示技术从噬菌体环七肽库中筛选获得针对OTA的表位模拟肽的制备方案。
本发明首先将驼源纳米抗体和Ni-IDA琼脂糖磁珠混合，进行第一螯合，得到第一螯合物；将所述第一螯合物和噬菌体环形七肽库混合，进行第一孵育，得到第一结合物；将所述第一结合物置于磁场分离磁珠和液体，弃上清，对剩余磁珠依次进行第一洗涤和酸洗脱，调节所述酸洗脱后的洗脱液的pH至7～8，得到第一洗脱液；采用所述第一洗脱液转染大肠杆菌后依次进行扩增、纯化和滴度测定，调节产物中噬菌体的滴度为1012～1013pfu/mL，得到第一纯化物。
本发明对所述扩增、纯化和滴度测定的具体方法没有特殊限制，采用本领域公知的方法即可。下述方案中相同，不再赘述。
在本发明中，通过原核表达的驼源纳米抗体(Nanobody，Nb)Nb与传统mAb相比具有尺寸小、分子量低、产量高、成本低和特异性强的特点，由于其尺寸小更易与蛋白质裂隙中的表位结合。
在本发明中，所述Nb的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，自N端至C端具体为：
QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSTVGVNAMDMGWYRQAPGKQRELVAAIINGGGDTNLADSVKGRFTISRDGAKRTLYLQMNSLKPEDTAVYYCYVRSGVGLVYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQ。在本发明中，所述Nb优选的带有标签，标签位于Nb的C端；所述标签优选为6×His-tag；带有6×His-tag的Nb的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，自N端至C端具体为：
QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSTVGVNAMDMGWYRQAPGKQRELVAAIINGGGSTNLADSVKGRFTISRDGAKRTLYLQMNSLKPEDTAVYYCYVRSGVGLVYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQIKRASQPELAPEDPEDVEHHHHHH。
本发明对Nb和带有6×His-tag的Nb的合成方法没有特殊限制，采用本领域常规的分子生物学技术合成即可。
在本发明的具体实施过程中，利用Nb带有的6×His-tag与Ni2+的螯合作用，使得Nb与Ni-IDA琼脂糖磁珠结合。
在本发明中，所述Ni-IDA琼脂糖磁珠的粒径优选为30～150μm，购自于上海生工生物工程有限公司。
在将驼源纳米抗体和Ni-IDA琼脂糖磁珠混合前，本发明中优选的还包括采用PBS缓冲液对所述Ni-IDA琼脂糖磁珠进行洗涤，将洗涤后的洗涤置于磁场分离磁珠与液体，弃去上清；所述PBS缓冲液的浓度优选为10mM，pH优选为7.4；所述洗涤的次数优选为3次。
在本发明中，用于第一螯合的驼源纳米抗体的工作浓度优选为10～20μg/mL，更优选为15μg/mL。在本发明中，所述第一螯合的温度优选为20～30℃，更优选为25℃；所述第一螯合的时间优选为60min。在得到第一螯合物后，本发明优选的还包括对所述第一螯合物进行清洗；所述清洗采用的试剂优选为第一PBST。
在本发明中，用于第一孵育的噬菌体环形七肽库中噬菌体的添加量优选为1011～1012pfu，更优选为2×1011pfu。在本发明中，所述第一孵育的温度优选为20～30℃，更优选为25℃；所述第一螯合的时间优选为40min。在本发明中，所述第一孵育使噬菌体环七肽库与Nb发生抗原-抗体特异性反应，富集可以结合的噬菌体模拟表位肽。在本发明中，将所述第一结合物置于磁场分离磁珠和液体的时间优选为30s。在本发明中，所述第一洗涤的次数优选为5～10次，以除去游离或结合较弱的噬菌体肽；所述第一洗涤采用的试剂优选的包括第一PBST；所述第一PBST以水为溶剂，对剩余磁珠进行第二竞争洗脱包括以下浓度的组分：10mM PBS和体积浓度为0.05％～0.1％的Tween-20。在本发明中，所述酸洗脱采用的试剂优选的包括浓度为0.2M的Gly-HCl；所述Gly-HCl的pH优选为2.2；所述酸洗脱优选的包括将第一洗涤后的磁珠和Gly-HCl混合后，进行振荡，利用酸性环境将结合的噬菌体肽洗脱下来。在本发明中，所述振荡的温度优选为20～30℃，更优选为25℃；所述振荡的时间优选为8min。在所述酸洗脱后，本发明优选的包括将酸洗脱后的产物置于磁场分离1min磁珠和液体，收集液体，得到洗脱液。在本发明中，调节所述酸洗脱后的洗脱液的pH的试剂优选为浓度为1M的Tris-HCl；所述Tris-HCl的pH优选为9.1。
在本发明中，所述大肠杆菌优选为E.coli ER2738。
得到第一纯化物后，本发明将驼源纳米抗体和Ni-IDA琼脂糖磁珠混合，进行第二螯合，得到第二螯合物；将所述第二螯合物和所述第一纯化物混合，进行第二孵育，得到第二结合物；将所述第二结合物置于磁场分离磁珠和液体，弃上清，对剩余磁珠依次进行第二洗涤和采用OTA标准品进行第一竞争洗脱，得到第二洗脱液；采用所述第二洗脱液转染大肠杆菌后依次进行扩增、纯化和滴度测定，调节产物中噬菌体的滴度为1012～1013pfu/mL，得到第二纯化物。
在本发明中，用于第二螯合的所述驼源纳米抗体的工作浓度优选为4～8μg/mL，更优选为5μg/mL。
在本发明中，所述第二洗涤的次数优选为15～20次；所述第二洗涤采用的试剂优选的包括第二PBST；所述第二PBST以水为溶剂，优选的包括以下浓度的组分：10mM PBS和体积浓度为0.25％～0.3％的Tween-20。
在本发明中，用于第一竞争洗脱的所述OTA标准品的工作浓度优选为80～100ng/mL。在本发明中，采用OTA标准品进行第一竞争洗脱是为了获得性能更高、亲和力更佳的噬菌体模拟表位肽。
得到第二纯化物后，本发明将驼源纳米抗体和Ni-IDA琼脂糖磁珠混合，进行第三螯合，得到第三螯合物；将所述第三螯合物和所述第二纯化物混合，进行第三孵育，得到第三结合物；将所述第三结合物置于磁场分离磁珠和液体，弃上清，对剩余磁珠依次进行第三洗涤和采用OTA标准品进行第二竞争洗脱，得到第三洗脱液；采用所述第三洗脱液转染大肠杆菌后依次进行扩增和滴度测定。
在本发明中，用于第三螯合的驼源纳米抗体的工作浓度优选为0.5～2μg/mL，更优选为1～1.5μg/mL。
在本发明中，所述第三洗涤的次数优选为20～25次；所述第三洗涤采用的试剂优选的包括第三PBST；所述第三PBST以水为溶剂，优选的包括以下浓度的组分：10mM PBS和体积浓度为0.5％～0.8％的Tween-20。
在本发明中，用于第二竞争洗脱的OTA标准品的工作浓度优选为1～10ng/mL。在本发明中，采用OTA标准品进行第二竞争洗脱是为了获得性能更高、亲和力更佳的噬菌体模拟表位肽。
在采用所述第三洗脱液转染大肠杆菌后依次进行扩增和滴度测定时，本发明在转染有第三洗脱液的大肠杆菌的滴度平板中挑取大肠杆菌单菌落进行噬菌体克隆的扩增，得到扩增后的噬菌体培养物。
得到扩增后的噬菌体培养物后，本发明对所述噬菌体培养物进行Phage-ELISA鉴定，以阴性孔OD450/阳性孔OD450≥2.1作为阳性克隆的判断依据，鉴定得到阳性克隆并进行DNA测序，得到表位模拟肽。
本发明对所述Phage-ELISA鉴定的鉴定过程没有特殊限制，采用本领域的常规Phage-ELISA鉴定过程即可。
本发明使用酸洗脱和OTA竞争洗脱的方式，能够获得高特异性和亲和力的表位模拟肽。
本发明还提供了以驼源纳米抗体为靶标的针对赭曲霉毒素A的表位模拟肽，包括第一环状短肽、第二环状短肽和第三环状短肽中的一种或几种；
所述第一环状短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：CLTFPGETC；
所述第二环状短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：CLTFPGKTC；
所述第三环状短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：CMNFFHESC。
在本发明的表位模拟肽的分子结构中，大写英文字母分别代表已知天然L-型氨基酸或其D-型异构体的一种，即C代表半胱氨酸残基、L代表亮氨酸残基，T代表苏氨酸残基、F代表苯丙氨酸残基、P代表脯氨酸残基、G代表甘氨酸残基、E代表谷氨酸残基、K代表赖氨酸残基、M代表甲硫氨酸残基、N代表天冬酰胺残基、H代表组氨酸残基、S代表丝氨酸残基、Q代表谷氨酰胺残基、V代表缬氨酸残基、A代表丙氨酸残基、R代表精氨酸残基、D代表天冬氨酸残基、W代表色氨酸残基、Y代表酪氨酸残基、I代表异亮氨酸残基。
本发明的表位模拟肽可通过原核表达或人工合成获得并应用于无OTA标准品引入的OTA免疫分析法检测。本发明的表位模拟肽可作为替代品，代替OTA的化学偶联全抗原，不仅降低检测成本，同时避免了OTA及相关有毒化学品对研究者健康和环境的危害，有利于实现OTA的绿色检测。
本发明所述表位模拟肽可直接用于OTA的检测或者利用基因工程技术将表位模拟肽与其他蛋白质构建融合蛋白用于其他免疫分析检测方法的建立。
本发明还提供了上述方案所述表位模拟肽的编码基因。
在本发明中，所述编码基因优选的包括编码所述第一环状短肽的第一基因、编码所述第二环状短肽的第二基因和编码所述第三环状短肽的第三基因；
所述第一基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：TGTCTTACTTTTCCGGGGGAGACGTGC；所述第二基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：TGTCTTACTTTTCCGGGGAAGACGTGC；
所述第三基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：TGTATGAATTTTTTTCATGAGAGTTGC。
本发明还提供了一种用于检测赭曲霉毒素A的试剂盒，包含上述方案所述的表位模拟肽。
本发明还提供了上述方案所述的表位模拟肽或者所述的编码基因或者所述的试剂盒在检测赭曲霉毒素A中的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种以驼源纳米抗体为靶标的针对赭曲霉毒素A的表位模拟肽及其筛选方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1.OTA模拟表位的亲和淘选及鉴定
本发明以针对OTA的驼源纳米抗体Nb为靶标，利用Nb带有的6×His-tag(标签位于Nb的C端)与Ni2+的螯合作用，使得Nb与粒径30～150μm的Ni-IDA琼脂糖磁珠(上海生工生物工程有限公司)结合。继续加入噬菌体环七肽库，使能够模拟OTA表位的噬菌体环七肽与Nb结合，并使用酸洗脱或OTA竞争洗脱的方式，以期获得高特异性和亲和力的表位模拟肽。本发明共进行三轮严格筛选。具体方法为：
(1)OTA表位模拟肽的淘选：移取50μLNi-IDA琼脂糖磁珠值1.5mL无菌EP管中，10mMPBS(pH＝7.4)洗涤三次，置于磁场分离磁珠与液体，弃去上清。15μg/mL驼源纳米抗体Nb-PBS稀释液置于洗涤后的磁珠中，室温振荡60min。0.1％PBST(10mM PBS，0.1％Tween-20)清洗3次。将2×1011pfu的噬菌体环形七肽库加入以300μL PBS重悬的Ni-IDA琼脂糖磁珠中，室温振荡40min。置于磁场分离30s后弃上清，并用PBST洗涤10次。加入1mL Elution buffer(0.2M Gly-HCl，pH＝2.2)，室温振荡8min。置于磁场分离1min，将洗脱液迅速转移至另一装有150μL 1M Tris-HCl(pH＝9.1)的1.5mL无菌EP管中和洗脱液至pH＝7.4。
为了获得性能更高、亲和力更佳的噬菌体模拟表位肽，在第二、三轮中调整了部分筛选条件：第二、三轮驼源纳米抗体Nb的浓度分别为5μg/mL和1.5μg/mL；洗涤缓冲液PBST中Tween-20的浓度分别为0.25％和0.5％；洗涤次数分别为15次和20次；洗脱方式采用竞争洗脱，OTA标准品的浓度分别采用100ng/mL和10ng/mL。其余步骤同上。洗脱后的噬菌体用于感染E.coli ER2738进行扩增、纯化和滴度测定，扩增后的噬菌体用于下一轮筛选。
(2)噬菌体的扩增、纯化和滴度测定：接种1％过夜活化后的E.coli ER2738于20mLLB-Tet中，以37℃，220rpm的条件，振荡培养至对数前期。将洗脱后的噬菌体转移至上述对数前期菌中后，37℃，220rpm振荡培养至OD600＝0.5。将扩增后的菌体细胞转移至无菌50mL离心管中离心15min，将上清液转移至另一干净离心管，再次离心，以完全除去菌体细胞。转移上清体积的80％于无菌50mL离心管中，并加入1/5体积的20％(w/v)PEG/NaCl(PEG 8000，2.5M NaCl)，置于冰上静置沉淀6h。沉淀后，离心15min后，弃上清。短暂离心，以完全弃去上清。沉淀使用PBS重悬，并加入1/5体积的20％(w/v)PEG/NaCl，置于冰上静置沉淀60min。离心并弃上清。沉淀以200μLPBS重悬，即为扩增产物。对扩增后产物进行滴度的测定。
(3)噬菌体克隆的扩增：接种1％过夜活化后的E.coli ER2738于LB-Tet中，以37℃，220rpm的条件，振荡培养至对数前期。将对数前期菌以1mL/管分装至2mL无菌EP管中。从第三轮洗脱产物滴度测定的平板上随机挑取单一蓝斑菌落至上述培养基中，37℃，220rpm振荡培养至OD600＝0.5。以其余根据上述方法扩增噬菌体克隆。将扩增后的噬菌体培养物于4℃，10000g离心10min，收集上清液用于Phage-ELISA鉴定。
(4)噬菌体克隆的鉴定：在96孔酶标板中加入2μg/mL驼源纳米抗体Nb，4℃孵育过夜。3％脱脂奶粉37℃封闭1h。阴性孔中加入体积比1:1的噬菌体克隆上清液和5％甲醇-PBS，阳性孔中加入体积比1:1的噬菌体克隆上清液和终浓度100ng/mL OTA标准品，空白孔中5％甲醇-PBS，37℃孵育1h。加入0.1μg/mL的HRP标记的抗M13噬菌体单克隆抗体，37℃孵育1h。上述步骤结束后均使用0.05％PBST洗涤4次后再进行下一步操作。加入TMB底物液，37℃避光显色10min后加入1/2体积的2M H2SO4终止反应。读取OD450nm的值，判断是存在阳性克隆。能与驼源纳米抗体Nb结合，并且能被OTA标准品抑制的噬菌体，鉴定为OTA表位模拟肽。将特异性噬菌体克隆进一步扩增后，以测序引物-96gⅢ5‘-TCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’进行DNA测序。
实施例2.OTA表位模拟肽的标准曲线
(1)标准曲线的绘制：以2μg/mL驼源纳米抗体Nb包被96孔酶标板，4℃孵育过夜。3％脱脂奶粉37℃封闭1h。零值孔加入体积比1:1的噬菌体模拟表位肽和5％甲醇-PBS，实验孔加入体积比1:1的噬菌体模拟表位肽和不同浓度的OTA标准品，空白孔中加入5％甲醇-PBS，37℃孵育1h。0.1μg/mL的HRP标记的抗M13噬菌体单克隆抗体，37℃孵育1h。上述步骤结束后均使用0.05％PBST洗涤4次后再进行下一步操作。加入TMB底物液，37℃避光显色10min后加入1/2体积的2M H2SO4终止反应。读取OD450nm的值。采用式1计算不同OTA标准品浓度的结合率ΔA/A0
式1中AX为加入不同浓度OTA标准品时OD450；AX0为零值孔的OD450；A空白为空白孔的OD450。以OTA浓度对数为横坐标，结合率ΔA/A0为纵坐标，依据式2建立直接竞争标准曲线。
y1＝A2+(A1-A2)/(1+(x1/x0)p)式2。
式2中与y1为ΔA/A0，x1为OTA浓度的对数值，A1、A2、X0和p均为S型曲线拟合后常数。
(2)结果：15号(氨基酸序列CLTFPGETC)、16号(氨基酸序列CMNFFHESC)、17号(氨基酸序列CLTFPGKTC)绘制的标准曲线的方程分别为y15＝0.03965+(0.93234-0.03965)/(1+(x/0.31101)1.81371)、y16＝-8.22701×10-5+(0.9835+8.22701×10-5)/(1+(x/0.28834)1.70231)、y17＝0.03965+(1.12751-0.03965)/(1+(x/0.22968)1.55435)。对应的IC50分别为0.300、0.283、0.277ng/mL，最大吸收光与IC50的比值，即ΔAMax/IC50分别为0.752、4.274、1.114，其中ΔAMax＝AX0-A空白。16号克隆的IC50最小，ΔAMax/IC50最大，因此其性能相较另外两个序列的表位模拟肽更佳。
(3)表位模拟肽在化学发光免疫分析方法中的应用：以2μg/mL，1驼源纳米抗体Nb包被96孔酶标板，4℃孵育过夜。3％脱脂奶粉37℃封闭1h。零值孔加入体积比1:1的噬菌体模拟表位肽和5％甲醇-PBS，实验孔加入体积比1:1的噬菌体模拟表位肽(16号)和不同浓度的OTA标准品，空白孔中只加入5％甲醇-PBS，37℃孵育1h。0.1μg/mL的HRP标记的抗M13噬菌体单克隆抗体，37℃孵育1h。上述步骤结束后均使用0.05％PBST洗涤4次后再进行下一步操作。加入ELISA Pico Chemiluminescent Substrate，避光反应2min测量化学发光强度。采用式3计算不同OTA标准品浓度的结合率ΔI/I0
式2中IX为加入不同浓度OTA标准品时化学发光强度；IX0为零值孔的化学发光强度；I空白为空白孔的化学发光强度。以OTA浓度对数为横坐标，结合率ΔI/I0为纵坐标，依次式4所示公式建立直接竞争标准曲线。
y2＝A2+(A1-A2)/(1+(x2/x0)p) 式4。
式4中与y2为ΔI/I0，x2为OTA浓度的对数值，A1、A2、X0和p均为S型曲线拟合后常数。
(4)结果：使用16号噬菌体表位模拟肽构建的检测OTA的化学发光免疫分析的标准曲线为y16＝-6.61328×10-4+(1.55925+6.61328×10-4)/(1+(x16/0.06151)2.20511)。R2为0.996，IC50为0.086ng/mL，线性范围IC20～IC80为0.146～0.060ng/mL，最低检测限LOD为0.053ng/mL。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种以驼源纳米抗体为靶标的针对赭曲霉毒素A的表位模拟肽的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将驼源纳米抗体和Ni-IDA琼脂糖磁珠混合，进行第一螯合，得到第一螯合物；将所述第一螯合物和噬菌体环形七肽库混合，进行第一孵育，得到第一结合物；将所述第一结合物置于磁场分离磁珠和液体，弃上清，对剩余磁珠依次进行第一洗涤和酸洗脱，调节所述酸洗脱后的洗脱液的pH至7～8，得到第一洗脱液；采用所述第一洗脱液转染大肠杆菌后依次进行扩增、纯化和滴度测定，调节产物中噬菌体的滴度为1012～1013pfu/mL，得到第一纯化物；
2)将驼源纳米抗体和Ni-IDA琼脂糖磁珠混合，进行第二螯合，得到第二螯合物；将所述第二螯合物和所述第一纯化物混合，进行第二孵育，得到第二结合物；将所述第二结合物置于磁场分离磁珠和液体，弃上清，对剩余磁珠依次进行第二洗涤和采用OTA标准品进行第一竞争洗脱，得到第二洗脱液；采用所述第二洗脱液转染大肠杆菌后依次进行扩增、纯化和滴度测定，调节产物中噬菌体的滴度为1012～1013pfu/mL，得到第二纯化物；
3)将驼源纳米抗体和Ni-IDA琼脂糖磁珠混合，进行第三螯合，得到第三螯合物；将所述第三螯合物和所述第二纯化物混合，进行第三孵育，得到第三结合物；将所述第三结合物置于磁场分离磁珠和液体，弃上清，对剩余磁珠依次进行第三洗涤和采用OTA标准品进行第二竞争洗脱，得到第三洗脱液；采用所述第三洗脱液转染大肠杆菌后依次进行扩增和滴度测定；
4)在转染有第三洗脱液的大肠杆菌的滴度平板中挑取大肠杆菌单菌落进行噬菌体克隆的扩增，得到扩增后的噬菌体培养物；
5)对所述噬菌体培养物进行Phage-ELISA鉴定，以阴性孔OD450/阳性孔OD450≥2.1作为阳性克隆的判断依据，鉴定得到阳性克隆并进行DNA测序，得到表位模拟肽；
步骤1)中所述驼源纳米抗体的工作浓度为10～20μg/mL；
步骤1)中所述噬菌体环形七肽库中噬菌体的添加量为1011～1012pfu；
步骤2)中所述驼源纳米抗体的工作浓度为4～8μg/mL；
步骤3)中所述驼源纳米抗体的工作浓度为0.5～2μg/mL；
步骤2)中所述OTA标准品的工作浓度为80～100ng/mL；
步骤3)中所述OTA标准品的工作浓度为1～10ng/mL。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤1)中所述第一洗涤的次数为5～10次；步骤1)中所述第一洗涤采用的试剂包括第一PBST；所述第一PBST以水为溶剂，包括以下浓度的组分：10mMPBS和体积浓度为0.05％～0.1％的Tween-20。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤1)中所述酸洗脱采用的试剂包括浓度为0.2M的Gly-HCl。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤2)中所述第二洗涤的次数为15～20次；步骤2)中所述第二洗涤采用的试剂包括第二PBST；所述第二PBST以水为溶剂，包括以下浓度的组分：10mMPBS和体积浓度为0.25％～0.3％的Tween-20。
5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤3)中所述第三洗涤的次数为20～25次；步骤2)中所述第三洗涤采用的试剂包括第三PBST；所述第三PBST以水为溶剂，包括以下浓度的组分：10mMPBS和体积浓度为0.5％～0.8％的Tween-20。
6.以驼源纳米抗体为靶标的针对赭曲霉毒素A的表位模拟肽，其特征在于，包括第一环状短肽、第二环状短肽和第三环状短肽中的一种或几种；
所述第一环状短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述第二环状短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述第三环状短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
7.权利要求6所述表位模拟肽的编码基因。
8.根据权利要求7所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因包括编码所述第一环状短肽的第一基因、编码所述第二环状短肽的第二基因和编码所述第三环状短肽的第三基因中的一种或几种；
所述第一基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述第二基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述第三基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
9.一种用于检测赭曲霉毒素A的试剂盒，其特征在于，包含权利要求6所述的表位模拟肽。
10.权利要求6所述的表位模拟肽或者权利要求7或8所述的编码基因或者权利要求9所述的试剂盒在检测赭曲霉毒素A中的应用。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117285640A (zh) * | 2023-09-28 | 2023-12-26 | 海南大学 | 一种鲨源赭曲霉毒素a抗独特型纳米抗体及其制备方法和应用 |
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2023
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