CN113461782A - 孔雀石绿的抗原模拟表位、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及孔雀石绿的抗原模拟表位、制备方法及其应用。通过用噬菌体展示肽库技术，基于磁珠液相亲和淘选，从肽库中筛选出能与孔雀石绿单克隆抗体特异性结合的多肽(抗原模拟表位)，该抗原模拟表位具有与天然孔雀石绿分子相似的免疫反应特性，可作为传统的孔雀石绿竞争抗原或固相包被抗原替代物应用于孔雀石绿的免疫学检测。其氨基酸序列为HNTWFTELARTK。

Description

孔雀石绿的抗原模拟表位、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及孔雀石绿的抗原模拟表位、制备方法及其在免疫学分析领域的应用。

背景技术

孔雀石绿(Malachite green，MG)是一种有毒的人工合成有机化合物，它既是染料，也是杀菌和寄生虫的常用试剂。孔雀石绿能够抑制细胞分裂，从而产生效果显著的抗菌和杀菌作用，曾广泛应用于预防和治疗水产品的水霉病、鳃霉病和寄生虫病。由于孔雀石绿具有潜在的致癌、致畸、致突变的作用，我国目前已将孔雀石绿列为水产上的禁用药物。然而，基于利于驱动，不少商家仍在水产品中非法添加孔雀石绿，对消费者的身体健康带来严重危害。

基于抗原抗体特异性结合的免疫分析方法具有灵敏度高、检测方便、成本低廉等优势，在孔雀石绿等小分子化学污染物的快速检测中发挥着重要的作用。由于孔雀石绿属于小分子抗原，因此传统的双抗夹心免疫分析模式并不适合，目前检测孔雀石绿的免疫分析模式大多基于竞争模式，即在获得特异性识别孔雀石绿的抗体的基础上，采用化学合成的方法将孔雀石绿进行结构修饰后与载体蛋白(如牛血清白蛋白、HRP酶等)进行偶联，制备成全抗原(竞争抗原或固相包被抗原)应用于竞争免疫分析。

目前，基于化学合成方法的孔雀石绿全抗原制备仍然存在着诸多弊端：1)作为全抗原的合成原料，孔雀石绿标准品对人体具有毒性；2)孔雀石绿全抗原的化学合成制备过程繁杂，中间副产物多、从而造成全抗原的生产批次误差大、质量不均一，成为影响免疫学检测方法准确性的重要技术瓶颈；3)孔雀石绿全抗原的化学合成过程中，使用的有机试剂、中间产物及废水、废渣易对操作人员产生毒害并严重污染周边环境。鉴于此，开展孔雀石绿全抗原的无害化替代性制备研究，将其应用于免疫学检测体系，解决化学合成制备孔雀石绿全抗原过程中所面临的强毒性、高污染、批间误差大等关键问题，不仅具有重要的理论价值，也有显著的应用前景。

本发明通过用噬菌体展示肽库技术，基于磁珠液相亲和淘选，从肽库中筛选出能与靶分子(孔雀石绿单克隆抗体)特异性结合的多肽(抗原模拟表位)，该抗原模拟表位具有与天然孔雀石绿分子相似的免疫反应特性，可作为传统的孔雀石绿竞争抗原或固相包被抗原替代物应用于孔雀石绿的免疫学检测。

发明内容

本发明以孔雀石绿单克隆抗体为靶分子，将靶分子吸附于Protein G修饰的磁珠表面，投入噬菌体随机展示十二肽库，进行亲和淘选，获得了能与孔雀石绿抗体特异性结合的孔雀石绿抗原模拟表位，其氨基酸序列如下：

从噬菌体随机十二肽库中筛选的孔雀石绿抗原模拟表位，其氨基酸序列为：HNTWFTELARTK。

上述抗原模拟表位结构中，大写英文字母分别代表二十一种已知天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的一种，即H代表组氨酸残基，N代表天冬酰胺酸残基，T代表苏氨酸残基，W代表色氨酸残基，F代表苯丙氨酸残基，E代表谷氨酸残基，L代表亮氨酸残基，A代表丙氨酸残基，R代表精氨酸残基，K代表赖氨酸残基。

本发明还涉及编码上述抗原模拟表位氨基酸序列的核苷酸序列，其序列为(5’-3’)：

CATAAT ACTTGGTTTACTGAGTTGGCTCGGACTAAG。

发明提及的孔雀石绿抗原模拟表位可通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有孔雀石绿抗原模拟表位(多肽)的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有孔雀石绿抗原模拟表位(多肽)的噬菌体粒子。化学合成是指依据抗原模拟表位的氨基酸序列，通过化学合成多肽的方式进行多肽合成。基因工程重组表达的方式是指将编码模拟表位的基因，通过克隆至表达载体，以多肽-融合蛋白的形式进行孔雀石绿抗原模拟表位的大量制备。

本发明还涉及所述孔雀石绿抗原模拟表位在免疫学检测分析中的应用。免疫学检测的类型包括酶联免疫吸附检测、免疫层析、均相免疫分析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型。

本发明孔雀石绿抗原模拟表位(HNTWFTELARTK)在应用时，可以把合成的模拟表位用于免疫学检测分析，将通过噬菌体扩增获得的展示有孔雀石绿抗原模拟表位(多肽)的噬菌体粒子直接用于分析检测，当然，也可以将孔雀石绿抗原模拟表位从噬菌体上切下来代替孔雀石绿标准品来进行免疫学检测分析。

还涉及孔雀石绿抗原模拟表位以固相抗原或竞争抗原在免疫学检测分析中的应用。

还涉及孔雀石绿抗原模拟表位作为固相抗原在免疫层析检测分析中的应用。

前述孔雀石绿抗原模拟表位可以替换天然的孔雀石绿标准品，并作为传统的孔雀石绿竞争抗原或固相包被抗原替代物应用于孔雀石绿的免疫学检测，该抗原模拟表位具有与天然孔雀石绿分子相似的免疫反应特性。

本发明的有益效果是：本发明孔雀石绿抗原模拟表位可以替换天然的孔雀石绿标准品，并作为传统的孔雀石绿竞争抗原或固相包被抗原替代物应用于孔雀石绿的免疫学检测。传统的孔雀石绿全抗原制备需要以天然的孔雀石绿为原料，基于化学合成的方式来制备，存在着操作毒害、环境污染、成本高、均一性差等缺陷。孔雀石绿抗原模拟表位具有和孔雀石绿单克隆抗体特异性结合的特性，并且其本质是一段氨基酸序列清晰的多肽，因此，该模拟表位可以通过生物合成的方式快速、大量、低成本的制备，制备方法具有无污染、环保绿色、批次均一等优势。

附图说明

图1基于抗原模拟表位的孔雀石绿间接竞争ELISA标准曲线。

实施例1：孔雀石绿抗原模拟表位的淘选与鉴定

1)孔雀石绿抗原模拟表位的亲和淘选：具体方法为：用10mM PBS(pH 7.2)稀释孔雀石绿单克隆抗体，并以终浓度200μg/mL投入至装有protein G修饰磁珠的10mL离心管中，37℃、轻微振荡孵育3小时。将孵育后的离心管至于磁力架中，静置15分钟，形成的孔雀石绿抗体-磁珠复合物会被磁力架吸附于管壁，弃去液体中游离的未结合抗体，用PBST(10mMPBS pH 7.4包含0.1％Tween-20(v/v))洗涤抗体-磁珠复合物3次后，加入300μl封闭液(3％BSA-PBS)37℃孵育1小时。1小时后弃封闭液，用PBST洗涤5次，再用PBS重悬抗体-磁珠复合物。

2)取100μl噬菌体肽库(噬菌体展示十二肽库，购自NEB公司，用PBS 10倍稀释噬菌体原液，约1.0×10¹¹pfu)，将其投入至加有孔雀石绿抗体-磁珠复合物的离心管中，37℃振荡孵育反应2小时。将孵育后的离心管至于磁力架中，静置15分钟，形成的噬菌体-孔雀石绿抗体-磁珠复合物会被磁力架吸附于管壁，弃去液体中游离的未结合噬菌体，用PBST洗涤10次。结合上的噬菌体用500ng溶于PBS的孔雀石绿标准品进行竞争洗脱(方法为：37℃振荡孵育反应15分钟)，之后3000g离心5分钟，收集上清，取10μl洗脱噬菌体测滴度，其余的用于感染20mL生长至对数前期的E.coli ER2738菌株进行扩增。第三天用PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体，并测定扩增后噬菌体的滴度。

3)在第二、第三轮的淘选过程中，投入的孔雀石绿单克隆抗体浓度分别为75μg/mL、50μg/mL，用于洗脱的孔雀石绿标准品分别为300、200ng，其余步骤第一轮。

4)阳性噬菌体克隆的鉴定：从第三轮淘选后测定噬菌体滴度的平板中随机挑取100个噬菌体斑，进行噬菌体的扩增，采用间接酶联免疫吸附检测方法进行阳性噬菌体克隆的鉴定，具体方法为：首先，用10mM PBS(pH 7.4)稀释孔雀石绿单克隆抗体，1μg/mL包被96孔酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST(10mM PBS,0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，用含有5％脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时；投入100μl噬菌体斑扩增液(1.0×10¹¹pfu)，以原始噬菌体肽库作为阴性对照，37℃孵育0.5小时；加入1:5000倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗100μL，37℃孵育0.5小时；加入100μLTMB底物液，避光显色5min，酶标仪读取450nm处的吸收值。选取OD₄₅₀大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克隆。

5)孔雀石绿抗原模拟表位的鉴定：采用间接ELISA方法确定筛选的阳性克隆对于孔雀石绿单克隆抗体的结合特性，具体方法：分别包被孔雀石绿单克隆抗体、庆大霉素单克隆抗体、氯霉素单克隆抗体、呕吐毒素单克隆抗体1μg/mL，300μl/孔包被酶标板，4℃孵育过夜；第二天用PBST(10mM PBS,0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，用含有5％脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育0.5小时；投入100μl噬菌体斑扩增液(1.0×10¹¹pfu)，以原始噬菌体肽库作为阴性对照，37℃孵育0.5小时；加入1:5000倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗100μL，37℃孵育0.5小时；加入100μL TMB底物液，避光显色5min，酶标仪读取450nm处的吸收值。

采用间接竞争ELISA的方法进行孔雀石绿抗原模拟表位的鉴定，具体方法为：用10mM PBS(pH 7.4)稀释抗孔雀石绿单克隆抗体，1μg/mL包被酶标板，4℃孵育过夜；第二天用PBST(10mM PBS,0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，用含有5％脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育0.5小时；投入50μL经间接ELISA鉴定为阳性且不与其它种类单克隆抗体结合的噬菌体克隆(1.0×10¹¹pfu)和50μL孔雀石绿标准品(浓度范围为0-10ng/ml)，37℃孵育0.5小时，PBST洗板后加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗100μL，37℃孵育0.5小时；PBST洗板后加入100μL TMB底物液，避光显色5min，读取OD₄₅₀。

间接ELISA结果显示：在筛选到的阳性克隆中，有一个噬菌体克隆(其氨基酸序列为HNTWFTELARTK)，其与孔雀石绿单克隆抗体的结合OD数值为1.8，与其它庆大霉素单克隆抗体、氯霉素单克隆抗体、呕吐毒素单克隆抗体的结合OD值均小于0.1，表明该噬菌体展示多肽与孔雀石绿单克隆抗体具有良好的结合特异性。

进一步采用间接竞争ELISA对上述噬菌体克隆进行鉴定，结果显示：投入的该噬菌体克隆(氨基酸序列：HNTWFTELARTK)能与孔雀石绿标准品竞争性结合包被于酶标板上的孔雀石绿单克隆抗体，并且呈现线性竞争阻断关系，标准曲线呈S型，线性相关性较好，IC₅₀为1.2ng/mL(图1)，鉴定该噬菌体展示的多肽为孔雀石绿的抗原模拟表位。

实施例2.孔雀石绿抗原模拟表位编码基因的测序及其氨基酸序列的确定

将经过间接竞争ELISA鉴定展示有孔雀石绿抗原模拟表位的噬菌体进行扩增，提取噬菌体的DNA测序模板。简要过程如下：进行噬菌体扩增，在第一步离心后，将800μL含噬菌体上清转入一新离心管。加入200μL PEG/NaCl沉淀噬菌体。离心后将沉淀重悬于100μL碘化物缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA,4M NaI)，加入250μlTE缓冲液(10mMTria-Hcl(pH8.0)，1mM EDTA)，加入等体积的无水乙醇，-20℃冰冻2小时，离心后再用70％乙醇洗涤沉淀(DNA测序模板)。沉淀最终重悬于20μL灭菌水，取2μL进行琼脂糖凝胶电泳分析；取5μL噬菌体模板进行DNA测序，其-96gIII测序引物为：5’-^HOCCC TCA TAG TTA GCG TAACG-3’。DNA测序结果为：CATAAT ACTTGGTTTACTGAGTTGGCTCGGACTAAG，依据密码子表可获得孔雀石绿抗原模拟表位的氨基酸序列为：HNTWFTELARTK

实施例3.孔雀石绿抗原模拟表位作为竞争抗原在ELISA中的应用

(1)样品提取

选取鳗鱼肉作为样品，采用国家标准GB/T 20361-2006《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法》中规定的样本提取方法，对鱼肉中的孔雀石绿进行提取，提取液用于下一步的ELISA检测。

(2)包被及封闭

用10mM PBS(pH 7.4)稀释孔雀石绿单克隆抗体，1μg/mL包被酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，用含有5％脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时后，用PBST洗板6次待用。

(3)标准曲线的建立

取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别投入50μL展示有孔雀石绿抗原模拟表位的噬菌体(1.0×10¹¹pfu)和一系列不同浓度的50μL孔雀石绿标准品，37℃孵育0.5小时。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗，37℃孵育0.5小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀。以孔雀石绿浓度对数为横坐标，结合率(加入孔雀石绿的孔的OD₄₅₀/未加入孔雀石绿的孔的OD₄₅₀×100％)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。

(4)样品的检测

取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别投入50μL展示有孔雀石绿抗原模拟表位的噬菌体(1.0×10¹¹pfu)和待测样品提取液，37℃孵育0.5小时。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗，37℃孵育0.5小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀，计算结合率，并根据标准曲线，倒推出样品中孔雀石绿的含量。

实施例4.孔雀石绿抗原模拟表位作为固相抗原在ELISA中的应用

(1)样品提取

选取鳗鱼肉作为样品，采用国家标准GB/T 20361-2006《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法》中规定的样本提取方法，对鱼肉中的孔雀石绿进行提取，提取液用于下一步的ELISA检测。

(2)包被及封闭

用10mM PBS(pH 7.4)稀释展示有孔雀石绿抗原模拟表位的噬菌体(2.0×10¹¹pfu)，100μL包被于酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST(10mM PBS,0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，用含有5％脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时后，用PBST洗板6次待用。

(3)标准曲线的建立

取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别投入50μL孔雀石绿单克隆抗体(0.5ng/ml)和一系列不同浓度的50μL孔雀石绿标准品，37℃孵育0.5小时。加入1:5000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育0.5小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀。以孔雀石绿浓度对数为横坐标，结合率(加入孔雀石绿的孔的OD₄₅₀/未加入孔雀石绿的孔的OD₄₅₀×100％)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。

(4)样品的检测

取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别投入50μL孔雀石绿单克隆抗体(0.1ng/ml)和一系列不同浓度的50μl待测样本提取液，37℃孵育0.5小时。加入1:5000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育0.5小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀。以孔雀石绿浓度对数为横坐标，结合率(加入样本孔的OD₄₅₀/未加入孔雀石绿的孔的OD₄₅₀×100％)为纵坐标，并根据标准曲线，倒推出样品中孔雀石绿的含量。

实施例5.孔雀石绿抗原模拟表位作为固相抗原在胶体金免疫层析分析中的应用

(1)样品提取

选取鳗鱼肉作为样品，采用国家标准GB/T 20361-2006《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法》中规定的样本提取方法，对鱼肉中的孔雀石绿进行提取，提取液用于下一步的检测。

(2)噬菌体及控制线的点阵

用10mM PBS(pH 7.4)稀释展示有孔雀石绿抗原模拟表位的噬菌体(3.0×10¹¹pfu)，用点阵仪或微量移液器将噬菌体划线于硝酸纤维素膜上(孔径0.2-0.45微米)，作为检测线；将1.0mg/ml的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，用点阵仪或微量移液划线于同一张硝酸纤维素膜上(位于检测线的上方，距离大于5毫米)，作为控制线。

(3)胶体金标记孔雀石绿抗体

将孔雀石绿抗体逐滴加入胶体金(直径18nm)溶液中，边滴边搅拌，30分钟后，取1％PEG加入上述溶液中，继续搅拌15分钟后加入十分之一体积的10％BSA溶液封闭，搅拌15分钟后，静置30分钟，离心后去上清，得到胶体金标记的孔雀石绿抗体溶液。

(4)胶体金检测卡的组装

将胶体金标记的孔雀石绿抗体点喷于胶金垫上(1.0mg/L)，将样品垫、胶金垫，点阵了检测线和控制线的硝酸纤维素膜和吸收纸进行组装，切成试纸条，装入检测卡中待用。

(5)样品的检测

将样品提取液加入样品垫中，静置10min，若样品中含有孔雀石绿且超过胶体金检测试纸的检测阈值，则检测线区域不显色，而控制线区域显色；若样品中不含有孔雀石绿且低于胶体金检测试纸的检测阈值，则检测线区域显色，控制线区域也显色。若控制线区域不显色，表明试纸条失效。

实施例6孔雀石绿抗原模拟表位的大量制备

(1)以噬菌体扩增的方式

将展示有孔雀石绿抗原模拟表位的噬菌体加入至20mL接种有ER 2738的培养物中，37℃220rpm振荡培养4.5h。将培养物转入另一离心管中，4℃8000rpm离心10min，将上清的上部80％转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃下静置3小时。4℃10000rpm离心PEG/NaCL静置溶液15min。弃上清，短暂离心后吸去残留上清液。加入1mL PBS进行重悬，即为噬菌体扩增液。

(2)以孔雀石绿抗原模拟表位-融合蛋白的方式进行制备

A.PCR扩增孔雀石绿抗原模拟表位的外源编码基因

PCR反应体系：(50μL)

PCR反应条件：

采用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物，微量核酸定量仪定量。孔雀石绿抗原模拟表位的编码基因序列：CATAAT ACTTGGTTTACTGAGTTGGCTCGGACTAAG。

B.外源编码基因及表达载体的双酶切

分别采用ACC65I和Eag I酶对外源编码基因和表达载体(pMAl-pIII，NEB公司，可表达MBP融合蛋白)进行双酶切。

C.酶切后产物的连接及转化

将质粒pMal-PIII和目的片段以1∶10(摩尔比)混匀，于16℃水浴连接12h，取10μL连接产物加至100μL感受态细胞DH5α中，充分混匀。冰浴30min后，42℃水浴热激90s，立即冰浴5min后补加800μL LB液体培养液，37℃，200rpm培养1h，8000rpm离心5min，吸去上清留取约300μL，涂布于LB-A固体(Amp)培养基中，37℃过夜培养，得到亚克隆阳性克隆。

D.克隆转化

将上述步骤得到的亚克隆用天根试剂盒提取目的质粒，取10μL至100μL感受态细胞TB1中，充分混匀。冰浴30min后，42℃水浴热激90s，立即冰浴5min后补加800μL LB液体培养液，37℃，200rpm培养45min，8000rpm离心5min，吸去上清留取约300μL，涂布于LB-A固体(Amp)培养基中，37℃过夜培养，得到阳性克隆。

E.孔雀石绿抗原模拟表位-MBP融合蛋白的表达

将上述获得的阳性克隆子，从平板上挑一单菌落接种于5mL LB-A，0.2％蔗糖中，37℃，220r/min，振荡培养过夜，将过夜培养物按1％接种量(v/v)接种于50mL的LB-A，0.2％蔗糖培养基中，分别接种3瓶，37℃，220r/min振荡培养，当培养物细菌浓度OD600达到0.6时，向三瓶培养物中加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，220r/min振荡培养，将诱导物(IPEG溶液)于4℃，4000g，离心20min收集菌体沉淀，弃上清。重悬细胞于400mL 30mM Tris-HCl，20％蔗糖，pH 8.0(80mL/g细胞湿重)，加入EDTA至1mM，室温下震荡5-10min，8000g，4℃，离心20min，弃上清，沉淀重悬于400ml预冷的5mM MgSO4，冰上震荡10min，8000g，4℃，离心20min，保留上清，向上清液中加入8mL 1M Tris-HCl,pH 7.4，经MBP纯化柱纯化后获得孔雀石绿抗原模拟表位-MBP融合蛋白。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

序列表

<110> 力德力诺生物技术（北京）有限公司

南昌富泰力诺检测应用系统有限公司

<120> 孔雀石绿的抗原模拟表位、制备方法及其应用

<141> 2021-08-02

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

His Asn Thr Trp Phe Thr Glu Leu Ala Arg Thr Lys

1 5 10

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cataatactt ggtttactga gttggctcgg actaag 36

Claims (7)

1.孔雀石绿的抗原模拟表位，其特征在于：其氨基酸序列为HNTWFTELARTK。

2.编码权利要求1所述的孔雀石绿抗原模拟表位氨基酸序列的核苷酸序列。

3.权利要求2所述的核苷酸序列，具体的，其(5’-3’)对应核苷酸序列为：

CATAATACTTGGTTTACTGAGTTGGCTCGGACTAAG。

4.权利要求1所述抗原模拟表位的制备方法，其特征在于：通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备；所述噬菌体扩增是指将展示有孔雀石绿抗原模拟表位的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有孔雀石绿抗原模拟表位的噬菌体粒子；所述化学合成指依据模拟表位氨基酸序列，通过化学合成多肽的方式进行多肽合成；所述基因工程重组表达的方式是指将编码模拟表位的基因，通过克隆至表达载体，以多肽-融合蛋白的形式进行孔雀石绿抗原模拟表位的大量制备。

5.权利要求1所述抗原模拟表位在免疫学检测分析中的应用。

6.权利要求5所述抗原模拟表位在免疫学检测分析中的应用，其特征在于：尤其是，孔雀石绿抗原模拟表位以固相抗原或竞争抗原在免疫学检测分析中的应用。

7.权利要求6所述抗原模拟表位在免疫学检测分析中的应用，其特征在于：具体的，孔雀石绿抗原模拟表位作为固相抗原在ELISA中的应用，作为固相抗原在胶体金免疫层析分析中的应用，以及作为竞争抗原在ELISA中的应用。

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