CN101995467A - 孔雀石绿胶体金检测卡及其生产和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种孔雀石绿胶体金检测卡及其生产和使用方法，属于免疫学技术领域。该快速诊断卡包括外壳和试纸条，其特征在于：所述外壳壳体开有加样孔和观察窗，所述试纸条安放于外壳内，在PVC衬板的中部叠置硝酸纤维素膜，两端分别叠置吸水垫和样品垫，硝酸纤维素膜和吸水垫、样品垫相搭连，在样品区附置一段含有孔雀石绿单克隆抗体免疫胶体金复合物的膜，在硝酸纤维素膜上有一条含孔雀石绿包被抗原的检测带和一条含羊抗鼠IgG的质控带。本发明是一种快速、准确、灵敏的诊断卡，无需专门仪器，操作简单，能满足食品安全、渔业、检测机构的检测要求。

Description

孔雀石绿胶体金检测卡及其生产和使用方法

技术领域

本发明涉及一种孔雀石绿胶体金检测卡，属于免疫学技术领域。

背景技术

孔雀石绿作为一种杀真菌剂在渔业中被大量使用，带来了极大的危害。孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，又名碱性绿、严基块绿、孔雀绿，其既是杀真菌剂，又是染料，易溶于水，溶液呈蓝绿色；溶于甲醇、乙醇和戊醇。长期以来，渔民都用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿。科研结果表明，孔雀石绿在鱼体内残留时间非常长，且其具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用。鉴于此，许多国家均将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。我国于2002年5月也将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中。但是，因为其价格便宜，而且其治疗水霉病等的功效是其他药物所“不能替代”的，由于利益的驱动使得孔雀石绿并没有退出渔业市场。

从上世纪90年代开始，国内外学者陆续发现，孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿(隐性孔雀石绿)具有高毒素、高残留、高致癌和高致畸变、致突变等副作用。2005年6月，英国食品标准局向所有欧洲国家发布食品安全警报，在英国一家超市发现鱼体内含孔雀石绿。英国食品标准局发布消息说，孔雀石绿是一种对人体有极大副作用的化学制剂，任何鱼类都不允许含有这一物质，并且这种物质不应该出现在任何食品中。没过多久，国内就有媒体报道，在国内很多地方，尤其是河南、湖北等地的水产养殖和水产品运输过程中，孔雀石绿仍在被普遍使用。重庆市执法部门在某水产交易市场查获600多只含有孔雀石绿的甲鱼。有些地区则在鳗鱼制品中检出孔雀石绿。记者从我国鳗业工业委员会了解到，从今年7月1日起，日本政府开始对来自我国的鳗鱼产品强制检测孔雀石绿。所以，对于我国输日鳗鱼制品来说，又面临出口贸易壁垒的考验。农业部办公厅于2005年7月7日发布了关于组织查处“孔雀石绿”等禁用兽药的紧急通知，要求各地尽快组织开展孔雀石绿等禁用药物的专项整治工作。

孔雀石绿是小分子化合物，常用的检测方法有高效液相色谱分析法(HPLC)和气相色谱/质谱联用分析法(GC/MS)或液相色谱/质谱联用分析法(LC/MS)。这些方法普遍存在着仪器昂贵，方法复杂，操作烦琐，试剂消耗量大的局限性。20世纪80年代兴起的胶体金免疫层析检测，基于免疫学检测原理，操作简单快捷、结果清晰易于判断、无需复杂的实验技能和设备，特别适于现场检测。能够在第一时间检测水产品中孔雀石绿残留，对遏制孔雀石绿的非法使用具有重要意义。而国内外尚无该技术监控孔雀石绿的报道。

发明内容

针对上诉问题，本发明提供了一种孔雀石绿胶体金检测卡，该快速诊断卡检测快速、准确、稳定。

本发明的另一个目的是提供该胶体金检测卡的应用。

上述孔雀石绿胶体金检测卡的制备包括以下步骤：

(1)孔雀石绿半抗原的合成

(2)孔雀石绿免疫抗原的合成；

(3)孔雀石绿单克隆抗体的制备；

(4)胶体金颗粒的制备；

(5)胶体金标记孔雀石绿单克隆抗体；

(6)样品垫的制备，该垫附置一段胶体金标记孔雀石绿单克隆抗体的膜；

(7)孔雀石绿包被抗原的合成；

(8)孔雀石绿固相硝酸纤维素膜的制备，该膜包被一条含孔雀石绿包被抗原的检测带和一条包被羊抗鼠IgG的质控带；

(9)样品垫的处理：选择适当的封闭试剂、表面活性剂和(或)非离子型去污剂单独或以适当比例组合后均匀浸于玻璃纤维素膜，室温干燥备用；

(10)组装孔雀石绿胶体金检测卡，该检测卡用PVB作为背衬，在PVC衬板的中部叠置硝酸纤维素膜，两端分别叠置吸水垫和样品垫，硝酸纤维素膜和吸水垫、样品垫相搭连。

所述的半抗原具有式(I)所示结构：

所述的免疫抗原具有式(II)所示结构：

所述的包被抗原具有式(III)所示结构：

发明通过以下操作步骤进行孔雀石绿检测：

(1)取待检水产品可食部分用绞肉机绞碎后准确称取10.0g于50mL离心管中，加入提取剂，混匀振摇5分钟后取上清液4mL于50mL离心管中，加缓冲液3滴，然后稀释至25mL；

(2)分次把上清液加入层析柱中，用抽提装置从下口加压，加快流速，待完全流干后加4mL蒸馏水洗涤层析柱；

(3)将1mL衍生化试剂加到层析柱中完全流干后，再加入2mL蒸馏水洗涤层析柱，再用1mL洗脱液洗脱收集，加1滴缓冲液后振荡混匀得到待检液。

(4)将30μl待检液加入到加样孔中，放置5-10分钟内观察结果。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：价格便宜，检测费用低廉，检测速度快，整个检测过程只需要20-30分钟，操作简单，无需专门仪器，肉眼观测结果，结果稳定，能满足食品安全、屠宰、检测机构的检测要求，更方便于现场检测。

附图说明

图1孔雀石绿胶体金检测卡检测示意图

其中：

1为观测窗

2为加样孔

3为质控带

4为检测带

图2孔雀石绿胶体金检测卡结构图

其中

5为样品垫

6为胶体金标记孔雀石绿单克隆抗体玻璃纤维膜

7为吸水膜

8为纤维素膜

具体实施方式

实施例1孔雀石绿半抗原的合成

称取对羧基苯甲醛0.60g，溶解于20mL二氯甲烷中，室温条件下缓慢加入3倍过量的二氯亚砜。逐步升温至回流状态，反应4h。减压蒸馏出溶剂和过量的二氯亚砜。粗产物溶于20mL二氯甲烷中，冷却至0℃，快速磁力搅拌下缓慢加入10mL 15％的4-氨基丁酸水溶液。反应4h后升温至室温继续反应2h。调节pH＝6，有沉淀析出。过滤沉淀并用蒸馏水洗涤2遍，得产物4-(4-甲酰基苯甲酰氨基)丁酸0.35g。

取N，N-二甲基苯胺2.50g(20.0mmol)于50ml两口烧瓶中，缓慢滴加1.0-2.0ml的浓盐酸，磁力搅拌几分钟。然后在搅拌状态下，加入1.50g 4-(4-甲酰基苯甲酰氨基)丁酸。通氮气下，回流加热搅拌过夜。反应过程中溶液逐渐由浅黄色变为浅绿色。反应完成后，待反应完物冷却，缓慢向反应混合物中加入1.0mol/L的NaHCO3溶液，滴加过程中有大量气泡产生，同时有部分沉淀析出。待气泡消尽后，向两口烧瓶中加入乙酸乙酯萃取，搅拌使沉淀溶解，萃取获得有机相，然后用饱和NaCl洗涤，再用无水硫酸钠除水，减压旋蒸得目标粗产物。

粗产物用硅胶柱层析法进行纯化：取一定量的薄层层析硅胶(H级)于烧杯中，用适量的溶剂(石油醚)搅拌均匀。将硅胶-石油醚液装入筒形分液漏斗中，减压抽滤，用洗脱液洗脱，上部用双联球加压，待硅胶沉降平稳后，用5ml洗脱液溶解粗产物，缓缓从柱顶端加入柱内。用洗脱液(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶5)洗脱，用25ml三角瓶分步收集洗脱液，薄层层析法(TLC)跟踪检测，合并目标产物管，减压旋转蒸发浓缩，得到透明晶体物质。

制备的半抗原结构为：

实施例2孔雀石绿免疫抗原的合成

取孔雀石绿半抗原0.1mmol溶于2mLDMF中，搅拌加入27.5mg DCC和14.4mg NHS。4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液，称取BSA 140mg溶于10mL浓度为0.1mol/L的PBS(pH8.0)中。加入DMF1mL，搅拌溶解制备B液，磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h。离心后，取上清夜，4℃下用生理盐水透析3d，每天更换3次透析液。得到的全抗原以1mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中。冻存于-20℃冰箱中。

制备的免疫抗原结构为：

实施例3实验动物免疫

用半抗原孔雀石绿免疫抗原分别免疫6周雌性balb/c鼠，每组3只。首次免疫注射时，分别100μg/mL的免疫抗原100μL，与等量弗氏完全佐剂充分乳化，腹腔直接注射。间隔两周后，取用样的抗原，与100μL不完全佐剂乳化，同样方法注射。

实施例4细胞融合

在细胞融合前1d或当天拉颈处死昆明鼠，浸泡在70％酒精中，体表消毒。用大头针固定昆明鼠在蜡板上，超净工作台上剪开腹部，用小镊子挑起腹膜，注入5mL RPMI-1640完全培养液，用手轻轻揉动腹腔，将其体内液体用无菌吸管移入75mL HAT完全培养液(75mL RPMI-1640完全培养液中加入0.75mL100×HAT液)中，反复2～3次。用吸管混匀，铺24孔板，每孔加0.5mL，置于37℃CO2培养箱中。

小鼠眼眶放血，收集血清，拉颈处死，70％酒精浸泡消毒体表，无菌取出脾脏，放入RPMI-1640基础培养液中，并小心剔除筋膜及脂肪，剪碎，置于不锈钢筛(100目)内，无菌研磨，释放出单个脾细胞，吸取含有脾细胞的液体置于50mL无菌离心管中，离心。

将骨髓瘤细胞和上述制备好的脾细胞以个数5∶1的比例加入同一50mL的离心管中，加入37℃温浴的RPMI-1640不完全培养液20mL，混合均匀，离心(1500r/min，6min)。除上清，用手指轻击离心管底部，使沉淀混匀如糊状。用移液管取37℃预热的PEG 1mL，滴入离心管，静置1min后，于37℃水浴中在2min内滴加RPMI-1640完全培养液10mL。1000r/min离心6min，弃去上清，加75mL HAT培养液，轻轻混匀，将混匀悬液分装于有饲养细胞的24孔板中，每孔0.5mL，于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中孵育。

实施例5杂交瘤细胞的培养和筛选

融合后6～9d，用HT培养液半量换液1次，在12～14d后根据增殖情况改用完全培养液。待细胞贴壁至占板孔1/3时，计杂交瘤细胞生长的孔数及细胞总数。取上清液，间接ELISA选择效价高和间接竞争ELISA选择药物抑制强的阳性杂交瘤细胞。

采用间接ELISA和间接竞争ELISA法进行阳性杂交瘤细胞筛选，显示阳性并出现竞争抑制反应的孔为产孔雀石绿抗体的孔，并可用于进一步的亚克隆。

无菌条件下，洗脱阳性孔内的细胞，用弯头吸管将细胞转移至预先以饲养细胞铺板的96孔培养板中，每个原始孔克隆成8孔，待细胞贴壁长满1/2～1/3孔底后，取上清液，间接ELISA检测。取呈阳性强的亚克隆，如此反复2～5次，待所克隆的8个孔上清液中抗体阳性率为100％时，挑取单细胞克隆，检测为全阳性者转移至24孔细胞培养板或25mL细胞培养瓶扩大培养，建株并以分装、冻存。提前一周注射0.5mL降植烷至Balb/c小鼠腹腔。取冻存细胞株，复苏后，经大量培养繁殖，收集细胞，用不完全培养基洗涤二次后，再用10mL不完全培养基悬浮，计数。将细胞(每只小鼠1mL，含3.1×10⁷个细胞)腹腔注射小鼠腹部，10～15d后，待小鼠腹部明显膨大时用16号注射器无菌采集腹水。2000r/min离心10min，去除上层脂肪和下层纤维蛋白及细胞，收集中层，取部分ELISA法测定其效价，其余分装-70℃冻存备用。

实施例6孔雀石绿单克隆抗体的制备和纯化

取腹水约3mL，加入2倍体积的0.06mol/L、pH 4.5醋酸钠缓冲液。将正辛酸(33μg/mL腹水)逐滴慢慢加入样品中，边加边搅拌，加完后继续搅拌30min，4℃下10000r/min离心30min，去沉淀(白蛋白和其它非IgG蛋白)。取上清经0.45μm微孔膜过滤，与1/10体积10×PBS混合(10×PBS：80gNaCl、2g KCl、11.5g Na2HPO4、2g KH2PO4、0.5845g EDTA、1000mL蒸馏水，pH 7.4)，用1mol/L NaOH溶液调pH值到7.4。上清冷却到4℃，加硫酸铵(0.277g/mL，使最终饱和度为45％)。搅拌30min，4℃下10000r/min离心30min，弃上清。用少量PBS溶液溶解沉淀，用50～100倍体积的PBS透析过夜，换液3次。透析后的溶液用PEG-6000适当浓缩，4℃下贮藏备用。

实施例7孔雀石绿包被抗原的制备

取孔雀石绿半抗原0.1mmol溶于2mLDMF中，搅拌加入27.5mg DCC和14.4mg NHS。4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液，称取BSA 140mg溶于10mL浓度为0.1mol/L的PBS(pH8.0)中。加入DMF1mL，搅拌溶解制备B液，磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h。离心后，取上清夜，4℃下用生理盐水透析3d，每天更换3次透析液。得到的全抗原以1mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中。冻存于-20℃冰箱中。

制备的包被抗原结构为：

实施例8胶体金颗粒的制备

取1％氯金酸溶液1ml，加99ml超纯水成终浓度0.01％的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1％柠檬酸三钠1.6ml一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积。

实施例8胶体金标记孔雀石绿单克隆抗体复合物的制备

当蛋白质的最适稳定量及标记的最佳pH值被确定以后便可进行标记。具体步骤如下：按最低稳定量的120％计算出所需待标记蛋白质的总量。在磁力搅拌下，将蛋白质溶液加入胶体金溶液中(pH已调至5.9～6.2)，加入蛋白质时应逐滴加入，1mg的蛋白质大约5min加完。分别取1ml胶体金-葡萄球菌A蛋白结合物液(实验组)和1ml胶体金原液(对照组)于试管中加10％氯化钠溶液0.1ml，室温静置1h，观察结果：如果对照组试管溶液由红色转为蓝色，甚至可以看到聚合物沉淀，而实验组溶液仍保持红色，无沉淀，方可继续下一步实验，否则需补加标记用蛋白葡萄球菌A蛋白。最后加入终浓度为0.2％的聚乙二醇(PEG MW20000)，继续搅拌30min。

实施例9样品垫的制备

保存液稀释胶体金标记单克隆孔雀石绿抗体复合物原液至工作浓度，按比例均匀浸于玻璃纤维素膜，-20℃冻存，冷冻真空干燥后，密封保存。

实施例10孔雀石绿包被抗原固相硝酸纤维素膜的制备：

取孔雀石绿包被抗原2mg/ml用0.01mol/L的PB缓冲液(pH 7.2)以250μg/ml间隔，经BIO-DOT型XYZ3000点样仪dispenser线形包被于硝酸纤维素膜的观察结果的测试反应区，定义为检测带，距离检测带5mm远的质控带用dispenser线形包被正常鼠IgG(2mg/ml)。37℃干燥2h，4℃密封保存(见图2)。

实施例12试纸条组装

用PVB作为背衬，在PVC衬板的中部叠置硝酸纤维素膜，两端分别叠置吸水垫和样品垫，硝酸纤维素膜和吸水垫、样品垫相搭连(见图2)。组装好的试纸条置于刻画有检测带和质控带标识的塑料外壳内。

实施例13检测卡检测的使用

取待检水产品可食部分用绞肉机绞碎后准确称取10.0g于50mL离心管中，加入提取剂，混匀振摇5分钟后取上清液4mL于50mL离心管中，加缓冲液3滴，然后稀释至25mL，分次把上清液加入层析柱中，用抽提装置从下口加压，加快流速，待完全流干后加4mL蒸馏水洗涤层析柱。将1mL衍生化试剂加到层析柱中完全流干后，再加入2mL蒸馏水洗涤层析柱，再用1mL洗脱液洗脱收集，加1滴缓冲液后振荡混匀得到待检液。将30μl待检液加入到加样孔，放置5-10分钟内观察结果。参看图1，如质控线(编号3)位置处出现红色条带，检测线(编号4)位置处不显色则样品为阳性；如质控线和检测线均出现红色条带，则样品为阴性；如质控线不显色则检测结果无效。

Claims (9)

1.孔雀石绿胶体金检测卡，其特征在于：其包括试纸条和外壳两部分，试纸条置于外壳内。

2.根据权利要求1所述的孔雀石绿抗体胶体金检测卡，其特征在于：所述的试纸条用PVB作为背衬，在PVC衬板的中部叠置硝酸纤维素膜，两端分别叠置吸水垫和样品垫，硝酸纤维素膜和吸水垫、样品垫相搭连，在样品区附置一段含有孔雀石绿单克隆抗体的膜，在硝酸纤维素膜上有一条含孔雀石绿抗原的检测带和一条含羊抗兔IgG的质控带。

3.根据权利要求1所述的孔雀石绿胶体金检测卡，其特征在于：所述的外壳壳体开有加样孔和观察窗。加样孔正对样品垫，观察窗正对硝酸纤维素膜。

4.孔雀石绿胶体金检测卡的生产方法，其特征在于由下列过程与步骤组成：

(1)孔雀石绿半抗原的合成

(2)孔雀石绿免疫抗原的合成；

(3)孔雀石绿单克隆抗体的制备；

(4)胶体金颗粒的制备；

(5)胶体金标记孔雀石绿单克隆抗体；

(6)样品垫的制备，该垫附置一段胶体金标记孔雀石绿单克隆抗体的膜；

(7)孔雀石绿包被抗原的合成；

(8)孔雀石绿固相硝酸纤维素膜的制备，该膜包被一条含孔雀石绿包被抗原的检测带和一条包被羊抗鼠IgG的质控带；

(9)样品垫的处理：选择适当的封闭试剂、表面活性剂和(或)非离子型去污剂单独或以适当比例组合后均匀浸于玻璃纤维素膜，室温干燥备用；

(10)组装孔雀石绿胶体金检测卡，该检测卡用PVB作为背衬，在PVC衬板的中部叠置硝酸纤维素膜，两端分别叠置吸水垫和样品垫，硝酸纤维素膜和吸水垫、样品垫相搭连。

5.根据权利要求4所述的孔雀石绿胶体金检测卡的生产方法，其特征在于所述的半抗原具有式(I)所示结构。

6.根据权利要求4所述的孔雀石绿胶体金检测卡的生产方法，其特征在于所述的免疫抗原具有式(II)所示结构。

7.根据权利要求4所述的孔雀石绿胶体金检测卡的生产方法，其特征在于所述的包被抗原具有式(III)所示结构。

8.孔雀石绿胶体金检测卡的使用方法，其特征在于将30μl待检液加入到微孔中，并充分吹打混匀，将试纸条插入到微孔中，放置5-10分钟内观察结果。

9.根据权利要求8所述的孔雀石绿胶体金检测卡的使用方法，其特征在于所述的待检液是由下列步骤处理得到：

(1)取待检水产品可食部分用绞肉机绞碎后准确称取10.0g于50mL离心管中，加入提取剂，混匀振摇5分钟后取上清液4mL于50mL离心管中，加缓冲液3滴，然后稀释至25mL；

(2)分次把上清液加入层析柱中，用抽提装置从下口加压，加快流速，待完全流干后加4mL蒸馏水洗涤层析柱；

(3)将1mL衍生化试剂加到层析柱中完全流干后，再加入2mL蒸馏水洗涤层析柱，再用1mL洗脱液洗脱收集，加1滴缓冲液后振荡混匀得到待检液。

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